Introduction
An эпендимные клеточный монослой линии желудочковой системы головного мозга, обеспечивающей двунаправленную барьерные и транспортные функции между спинномозговой жидкости (ликвора) и интерстициальной жидкости (ISF) 1-3. Эти функции помогают держать мозг ядовито-бесплатно и в физиологического равновесия 2,3. У людей потери частей этой подкладке из-за травмы или болезни видимому, не приводит к регенеративной замены, как и в других эпителиальных накладок; а появляется потеря эпендимных охвата клетки приведет к перивентрикулярного астроглиоза с сетчатой астроцитов, охватывающих регионы лишена эпендимных клеток на поверхности желудочка. Серьезные последствия для важных CSF / обмена ИСБ и оформления механизмов можно было бы предсказать результат от потери этого эпителиального слоя 1,2,4-7.
Общей чертой человеческого старения увеличивается боковые желудочки (вентрикуломегалия) и связанный перивентрикулярная отек качестве наблюдателей,ред МРТ и жидкости-ослабленный восстановления инверсии MRI (МРТ / FLAIR) 8-14. Чтобы исследовать отношения между вентрикуломегалии и клеточной организации желудочка подкладке, посмертные последовательности человека МРТ были согласованы с гистологических препаратов бокового желудочка перивентрикулярного ткани. В случаях вентрикуломегалии существенные области глиозом заменил эпендимных покрытие клеток вдоль боковой стенки желудочка. Когда расширение желудочка не был обнаружен МРТ основе анализа объема, эпендимных клеток подкладка была цела и глиоз не был обнаружен по желудочка накладки 6. Это комбинаторный подход представляет первые комплексные документации подробно изменения в клеточной целостности бокового желудочка с помощью облицовки Wholemount препараты порциями или весь боковой стенки желудочка и 3D моделирование объемов желудочков 6. Некоторые заболевания (болезнь Альцгеймера, шизофрения) и травмы (черепно-мозговая травма)показать вентрикуломегалия как ранней нейропатологического функции. Денудации областей эпендимных клеток выстилки тем самым можно было бы предсказать мешать нормальной функции клеток эпендимных и компромисс гомеостатического баланса между CSF / ISF жидкости и растворенного обмена. Таким образом, более тщательное изучение изменений в желудочковой системе, ее клеточного состава, и следствие до основных или соседних структур головного мозга, в конечном счете начинают раскрывать больше о невропатологии, связанной с расширением желудочка.
Отсутствие мультимодальных данных изображений, и, в частности продольных последовательностей данных, вместе с ограниченным доступом к соответствующей образцы тканей гистологические делает анализ патологий головного мозга человека трудно. Моделирование фенотипы найдены в старения человека или заболевания часто может быть достигнуто с мышиных моделях и моделях животных стать одним из наших лучших средств для изучения вопросов о возбуждении заболеваний человека и прогрессии. Несколько исследований вздоровых молодых мышей описали цитоархитектуры из боковых стенок желудочка и нишу, лежащий в основе стволовых клеток 4,7-15. Эти исследования были расширены, чтобы включить 3D-моделирования и анализа сотовой стенок желудочков через 6,15 старения. Ни перивентрикулярная глиоз ни вентрикуломегалия наблюдаются у мышей в возрасте, а мыши обнаруживают относительно надежный subventicular зона (СВЗ) стволовых клеток нижележащих нишу на неповрежденной эпендимных клетки подкладка 6,15. Таким образом, бастующие видоспецифичны различия существуют как в общем обслуживание и целостности облицовки боковой желудочек в процессе старения 6,15. Поэтому, лучше всего использовать мышей, чтобы допросить условия, найденные в людях, различия между этими двумя видами необходимо охарактеризовать и соответствующим образом учитываться в любом моделирования парадигмы. Здесь мы представляем процедуры оценки продольные изменения в боковых желудочков и связанное перивентрикулярная ткани в обеих людях и мУз. Наши процедуры включают 3D-рендеринга и Волюметри обоих мыши и человека желудочков, и использование иммуногистохимического анализа вся гора препаратов перивентрикулярного ткани, чтобы охарактеризовать как сотовый организацию и структуру. Вместе эти процедуры обеспечивают средства для характеристики изменений в желудочковой системе и связанный перивентрикулярная ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры животных были одобрены Университета Коннектикута IACUC и соответствует руководящим принципам NIH. Человек ткани и анализ данных и процедуры были в соответствии с утвержденной и Университета Коннектикута IRB и соответствует руководящим принципам NIH.
1. Мышь: Анализ Перивентрикулярные клеточную целостность и 3D моделирования бокового желудочка
1.1) Подготовка мыши бокового желудочка Стеновые тотальных
- Подготовьте мышь боковой желудочек тотальных для иммуногистохимии (IHC), как описано ранее 16,17.
1.2) Иммуногистохимия для боковой анализа желудочка
- Fix и раздел мозга мыши ткани, как описано ранее 18,19.
- Вкратце, мышей флеш транскардиальную с нормальным, при комнатной температуре раствор, до тех пор, пока органы очистили (обозначено бледно окраски), а затем при комнатной температуре 4% параформальдегида(PFA) в 0,1 М фосфатном буферном солевом растворе (PBS) до ткани застыл.
- Удалить мозг из черепа. Используйте ножницы радужной оболочки глаза рассечение вырезать из основания черепа вдоль стреловидного шва.
- Expose черепа и удаления мозг щипцами. Погружают мозг в 4% PFA фиксатором течение ночи при 4 ° С. Затем промыть 3 раза в течение 20 мин с PBS.
- Подготовка серийных срезов для иммуногистохимического анализа и громкости.
- Использование микрохирургической скальпель, сделайте небольшой надрез в продольном направлении вдоль коры левого полушария, чтобы позволить идентификацию левого полушария от правого полушария, когда плавающие разделы иммуноокрашиванию.
- Накрыть фиксированной мозги в 3% агарозном для дополнительной структурной поддержки во время vibratome срезов. Теплый 3% агарозном в дистиллированной воде (вес / объем) до полного растворения с использованием либо микроволновую печь или горячую плиту.
- С бритвой, удалить хвостовой участок мозга в мозжечок скорональной вырезать, оставляя ровную и ровную поверхность. Применить супер клей на стадии ткани и поместите мозг на вновь сократить поверхность обонятельных луковиц, стоящих перед вверх.
- При жидкости раствор агарозы остынет до температуры чуть теплой на ощупь, применяются равномерно по мозгу, чтобы полностью накрыть весь мозг. Разрешить агарозном закрепить.
- Раздел агарозном заключен мозги коронки на vibratome в 50 мкм секций, с участков, расположенных последовательно в 24-луночный планшет, содержащий PBS, чтобы сохранить последовательном порядке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вообще 12 скважин используются для одного мозга, с коллекцией тканей, начиная 5 разделов до наблюдаем появление боковых желудочков, начиная с ячейки А1, двигаясь численно до B6 и езда на велосипеде А1. Это позволяет нескольким различимы разделы из того же мозга, который будет обработан в течение той же скважине. Для бокового желудочка анализа объема, сбор ткани прекратилось, когда боковой желудочекс и третий желудочек слияние, в результате чего примерно на 3 секции в скважине или 36 Всего форумов. - Аспирируйте PBS использованием передачи пипетки, прикрепленную с микропипетки наконечник в 20-200 мкл, чтобы убедиться, что плавающие разделы не случайно атмосферный. Блок и проницаемыми плавающей секции в 10% сыворотки, 0,1% Тритон Х-100 (ТХ) в PBS (PBS-TX) в течение 1 ч при комнатной температуре. Используйте 300 мкл раствора на лунку, чтобы покрыть разделы свободно плавающих ткани в 24-луночного планшета и выполнять все инкубации разделов на качающейся пластины.
- Аспирируйте блокирующий раствор и инкубировать секций с первичными антителами в PBS-TX в течение ночи (по крайней мере, 12 ч) при температуре 4 ° С. Для желудочка объемом следов с использованием корональные разделы, используйте анти-антитела S100β маркировать эпендимных клетки.
- Аспирируйте решение первичного антитела и промыть разделах 3 раза в течение 10 мин каждый с PBS-TX.
- Выдержите разделы в темноте в течение 1 часа при комнатной темпераТуре с люминесцентными вторичными антителами в концентрации 1: 1000 в 10% сыворотки, PBS-TX. Держите секций в темно для всех остальных этапов инкубации.
- Аспирируйте раствор вторичного антитела и инкубировать секций с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола в PBS (DAPI, 10 мкг / мл) в течение 5 мин, чтобы контрастное клеточные ядра. Аспирируйте решение DAPI и промыть разделах 3 раза в течение 10 мин каждый с PBS.
- Mount разделы серийно на слайды с помощью корковой знак, чтобы сохранить оставили против правого полушария ориентации. Воздух сухой секции в темноте, а затем покровное путем применения тонким слоем монтажных СМИ к слайду и аккуратно поместить стекло покровное на вершине. Разрешить coverslipped скользит высохнуть в течение ночи при комнатной температуре.
1.3) бокового желудочка Сегментация для 3D реконструкций
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните трассировку боковых желудочков с помощью программного обеспечения отображения на вертикальном эпифлуоресцентной microscoПЭ с автоматизированной стадии и цифровой камерой CCD для регистрации флуоресценции.
- Включите микроскопа оборудования флуоресценции и запуска программного обеспечения отображения в режиме флуоресценции. Откройте "Показать параметры", чтобы загрузить соответствующие панели инструментов и панели док-инструмента, необходимых для отслеживания. Функции> Показать параметры> Аксессуары и выберите 'Main' и панели инструментов "Маркер". В этом же меню, выберите 'Camera гистограмма', 'Многоканальный управления »,« Настройки камеры »и« Приобретение изображения в разделе' Панели инструментов Док.
- Соблюдайте начало желудочков, основанных на сильном S-100β флуоресценции, которая маркирует эпендимных клетки, которые выстилают боковой желудочек. Определить первый кусок ткани, содержащий боковые желудочки.
- Создайте новый файл данных и назначить опорную точку для сценического движения, нажав в окне изображения выше левого бокового желудочка. Посмотрите на небольшойРазрез ориентироваться слева от правого полушария. Держите опорную точку в последовательной месте по отношению к боковых желудочков через отслеживание файлов, чтобы помочь при импорте контуров для последовательного восстановления.
- Выберите подходящий тип контура предварительно от контура выпадающего меню, например, "левого бокового желудочка. Используйте уникальный цвет для каждого из левого и правого боковых желудочков кальки. Если изменения в названия контура и цвета требуется, перейдите к Функции> Настройки> Показать контуры, а затем изменить имена контурных цветов или выбрать "Добавить контура Тип".
- С контура в "левого бокового желудочка 'выбран, нажмите по апикальной поверхности футеровки эпендимных начать контур трассировки. Проследите желудочек, продолжая последовательно нажмите по апикальной поверхности.
- Для нерегулярных областях, требующих больше изящества, нажмите и удерживайте левую кнопку мыши для того, чтобы проследить свободной рукой. Нажмите Ctrl + Z, или пойти тО Опции> Undo, чтобы отменить предыдущую точку контура. Перемещение кальку окно, используя клавиши со стрелками или путем точки контура от экрана и позволяет окно автоматически центрироваться. Чтобы закончить желудочек трассировки правой кнопкой мыши и выберите "Закрыть" Контур.
- Выберите новый цвет контура (тип контура) для правого бокового желудочка с помощью выпадающего меню. Проследите правый желудочек, как в шаге 1.3.4 для левого.
- Если изменения в названия контура и цвета требуется, щелкните правой кнопкой мыши на контуре и выберите Изменить контура Тип, чтобы выбрать подходящий цвет.
- Добавить маркеры вдоль средней линии, чтобы помочь в выравнивании серийные контуры для 3D реконструкции. Чтобы добавить маркеры, выберите соответствующий маркер (используйте 'X') на панели инструментов Маркеры слева и нажать на кнопку еще их на экране трассировки. Импорт маркеры вместе с контурами для каждого раздела тканей следа.
- Чтобы сохранить ткани следы, выберите Файл> СохранитьФайл данных Как и создать новую папку и имя файла. Количество обводка [слайд #] - [#] ткани для легкой идентификации следов от серийных срезов. Например, секция с третьими ткани на втором слайде имеет имя файла "2-3" в пределах каталога для каждого мозга.
- Повторите шаги 1.3.4 1.3.9 для каждого последовательного части мозговой ткани, чтобы проследить желудочки через весь мозг, за исключением регионов желудочка стены адгезии.
- Если желудочек имеет область адгезии, суб-сегмента передней области от тех спинной и брюшной к адгезии сайта. Создать два новых типа контура для каждого желудочка (например, «Спинной левого желудочка" и "Брюшной левого желудочка"). На первом тканей срез с адгезией, проследить боковой желудочек и с оригинальной боковой желудочек контура и новой спинных и брюшных контуров для обеспечения полной реконструкции желудочка может быть создан.
- В разделах позади в ventriclстены адгезии е, создать множество новых цветов контурных для задней части каждого желудочка (например, «Задний левый желудочек"). Дважды проследить этот первый воссоединился раздел как с текущей адгезии и новых видов задняя контура.
1.4) бокового желудочка 3D реконструкция
- Выравнивание и составить последовательный контур прорисовки мыши боковых желудочков генерировать 3D реконструкций и объемные данные.
- Открыть 3D программа реконструкции. Нажмите Файл> Открыть и выберите файл контурную первый серийный прослеживается разделе. Импорт горизонталей прорисовки левой и правого желудочка, а также любые дополнительные маркеры.
- Чтобы выбрать контуры, нажмите кнопку "Выбрать объекты" (значок курсора) и выберите два желудочка и маркеры, удерживая клавишу "Ctrl". Чтобы установить Z позицию контуров, щелкните правой кнопкой мыши и выберите "Изменить Z позиции. Установите первый кусочек ткани в 0 мкм. <LI> Чтобы сохранить реконструкцию, выберите Файл> Сохранить файл данных как. Сохранить после каждого импорта файлов, так что если допущена ошибка восстановления, как легко, как перегрузка предыдущий файл.
- Чтобы добавить следующий ткани ломтик реконструкции, нажмите Файл> Добавить к изображению. Выберите файл .DAT, который будет добавлен и флажок "Объединить".
- Следуйте шаг 1.4.3 снова настроить Z позицию импортированного файла трассировки. Выберите только добавленных левые и правые контуры в главном окне, чтобы избежать перемещения других следов. Установка каждого последующего файла трассировки до 50 мкм из Z позиции предыдущего контура в течение 50 мкм секций. (Первый контур: г = 0, второй контур: г = 50, третий контур: г = 100, и т.д.)
- Чтобы настроить X, Y позиции отдельных контуров и маркеров, нажмите "Включить перевод с помощью мыши 'кнопку, и тащить контуры по согласованию с предыдущими контурами тканей. Держите оба левые и правые контуры текущей трассы выбранДля синхронного движения.
- Чтобы повернуть следы по часовой стрелке или против часовой стрелки, чтобы выстроиться средней линии маркеров, выберите кнопку 'оси вращения. Чтобы перевернуть контуры всей Y-оси (если слева контур справа) выберите оба импортные контуры и маркеры, щелкните правой кнопкой мыши, выберите 'Set' Угол поворота, и введите "180" в "Y ротации".
- Убедитесь, что желудочки и средней линии маркеры лучше выровнены перед сохранением файла реконструкции, как в шаге 1.4.4.
- Повторите шаги 1.4.5 1.4.9 для каждого последующего ткани ломтик, пока все не были импортированы и правильно выровнены.
- Для просмотра объема данных последовательного реконструкции, нажмите анализ> "Маркеры и область Анализ" и выберите "3D Контур Сводка". Выберите все контуры в левой панели, а затем нажмите кнопку "3D визуализация" для отображения окончательного восстановления 3D.
2. Человеческий Анализ Перивентрикулярные клеточную целостность и 3D моделирования бокового желудочка
2.1) Анализ данных МРТ человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы перечислены для создания 3D-реконструкции изображения и объемного количественного боковых желудочков и оценить объемные изменения с течением времени, используя продольный анализ наложения. Важно отметить, что последовательность в сборе МР данных (например, машины и силой магнита, толщины сечения, ориентации и разрешение) и обработки после приобретения крайне важные критерии для включения наборов данных 20.
- Желудочковая Сегментация
ПРИМЕЧАНИЕ: ИТК / мгновенного используется для сегмента желудочки от T1-взвешенных МРТ высокого разрешения. В качестве альтернативы, другой бесплатной программы, такие как Freesurfer могут быть использованы.- Открыть ИТК / мгновенного, Файл> Открыть изображение в градациях серого. Выберите нужный файл и открыть как .nii файла (NITFI файла).
- Прокрутка каждого Анатomical самолет, отметив желудочковая аномалии (суженный регионы, большие или малые временные рога, и т.д.). В основной панели инструментов нажмите кнопку "Snake ROI Tool". Нажмите кнопку "Segment 3D". Выберите опцию 'Интенсивность региона.
- Нажмите кнопку "Предварительная обработка изображения». Выберите «выше», чтобы включить регионы ниже определенного порога интенсивности, с тем чтобы подчеркнуть ROI в белом. Запишите максимальную интенсивность использования ползунка. Установите порог до 15% от максимальной интенсивности (запись этого значения). Установите параметр гладкость до 10. Нажмите "OK", затем "Далее".
- Добавить 10-12 небольшой размер (2) 'пузыри' на каждой желудочка: два в передней фронтальной рога, семь равномерно распределенных по верхней поверхности боковой желудочек тела, один в затылочной рога и один в височной рога бокового желудочка. "Выберите Параметры" и установить силу кривизны до 0,4. Нажмите Play, чтобы начать символ эволюции активное контур,
- Нажмите кнопку "Обновить" Mesh для визуализации поверхности; проверить 'Auto-Update'. Стоп сегментации, когда все области бокового желудочка включены в области интереса (ROI). Избегайте включения третьего желудочка. Нажмите кнопку "Готово".
- Вручную редактировать файл, если необходимо, чтобы удалить нежелательные области с помощью следующих методов (как правило, необходимо, чтобы стереть третий желудочек утечки). Вручную использовать '3D' скальпеля инструмент для удаления избытка регионы или вручную с помощью 'Кисть' инструмент с 'Clear Этикетка "в качестве активного чертежа метки, чтобы стереть любую включение пределами ROI.
- Сохранить результаты сегментации как .nii изображения (формат файла "NIFTI ').
- Чтобы получить общий объем желудочка, выберите 'Сегментация> Громкость »и статистики; получить общий объем желудочка, используя набор метку цвета.
- Продольный Представление боковых желудочков От MRIScans
ПРИМЕЧАНИЕ: ИспользованиеПрограммное обеспечение Манго, продольные трансформирования накладываются на качественно и количественно продемонстрировать изменения в объеме желудочка в пределах субъектов с течением времени.- Открыть Манго. Нажмите Файл> Загрузить ROI в момент времени первый ROI (базового) как зеленый. Файл> Загрузить ROI второй момент времени ROI как красный. Сохранить продольную накладку, выбрав Файл> Сохранить как; назначить каждое изображение как 'файла name_ [Первая точка возрастной время] - [точка возрастной второй раз] .nii ".
- Откройте ИТК-SNAP. Повторно комбинированный ROI как «исходном изображении», выбрав сегментации> Load From Image> объединенного файла ROI. Для получения данных продольные объем выполните следующую: сегментация> Громкость и статистика> Метка 1 (красный) = объем расширения; Этикетка 2 (зеленый) = объем стеноз; Этикетка 3 (синий) = базовый объем.
2.2) Человеческий Перивентрикулярная Подготовка ткани и анализ
- Инструкции по технике безопасности для работы с человеческой ткани
- Получить appropетел обучение технике безопасности (например,., ГКИ, конечно).
- Соблюдайте стандартные (универсальные) меры предосторожности. Надевайте перчатки. Изменить перчатки, прежде чем прикасаться любой общее оборудование или поверхностей, которые не одноразовые. Добавьте все детали обычно обрабатываются при работе с человеческой ткани с "использование человеческих тканей" обозначений.
- Следуйте практики обеззараживания для всех элементов, контактирующих тканей человека. Bleach все загрязненных жидкостей в течение как минимум 24 часов до утилизации, лечения загрязненных поверхностей с отбеливателем пропитанной полотенцем (например, скамейка верхней) или путем размещения объекта непосредственно в отбеливателем (например, щипцы).
- Подготовить план на случай непредвиденных обстоятельств для контакта с человеческой ткани непосредственно на кожу, которая может включать замачивания бумажное полотенце в хлорной и проведение на пораженный участок (5-10 мин).
- Используйте соответствующую утилизацию отходов для всех элементов, контактирующих с человеческой тканью.
- Боковой желудочек Всего горе Подготовка
- Вeginning с интактной полушарии (фиксировали в 10% формалине и тщательно промывают 0,1 М PBS), нарезать 1,5 см Коронарные срезы через всю полусферу, используя большой нож.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы фиксации требуют предварительной проверки антител. - Разделы маркировки спереди назад, начиная с первой секции, содержащей боковой желудочек. Используйте систему маркировки буквенно-цифровой, называя ломтики с буквами (спереди назад) и подразделе с числами (сверху вниз). Избегайте нарушая эпендимных поверхность.
- Использование микрохирургической скальпель, рассекают стенку желудочка 1 см глубоко, поддерживая одну непрерывную раздел всей боковой стенке. Разделите стены, как нужно создавать соответствующего размера разделов для окрашивания хорошо. Выемка раздел на противоположной стороне стенки желудочка для выявления превосходной / низший ориентацию.
- Выполнение извлечение антигена путем инкубации срезов ткани в 10 мМ натрий-цитратном буфере (рН 6,0) при 100 ° С в течение 10-20 мин с использованием двойного boileг (оптимальное время инкубации определяют эмпирически). Промыть 3 раза в PBS / 0,1% Triton X-100 (PBS-TX).
- Блок в 10% лошадиной сыворотки с помощью PBS / PBS-TX в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Инкубируйте с первичными антителами в течение 48 ч при 4 ° С. Для визуализации желудочка облицовки, immunostain тотальных со следующими комбинациями антитела: анти-мыши β-катенин (1: 250); козий анти-GFAP (1: 250); кролика против AQP4 (1: 400).
- Выполните все последующие шаги в темноте. Промыть 3 раза ткани в PBS, инкубируют со вторичными антителами (1: 500) в течение 24 ч при 4 ° С или 2 ч при комнатной температуре, и промыть еще 3 раза в PBS. Инкубируйте ткани в DAPI в течение 7 мин при комнатной температуре с последующим с еще 3 полоскания в PBS.
- Подготовьте ткань для окончательного вскрытия, покрывая воском нижнюю тарелку с парафином. Заполните блюдо с PBS, поместите ткань в чашке с использованием тонких щипцов, избегая контакта с эпендимных стене.
- Под микроскопом рассекает, твердо ВХСУRe ткани на боковых помощью штифтов. С 22,5 ° микрохирургических колотой ножом, создать единые тонких срезов (примерно 300 мкм) из боковой стенки желудочка. Для больших участков или участков с затрудненным кривизны, нарезать кубиками небольших до резки в заключительной части для монтажа и примечания месте.
- Осторожно положите расчлененный раздел эпендимы стороной вверх на слайде с использованием тонких щипцов, принимая к сведению регионального местоположения и ориентации на слайде. Обложка ткани с тонким слоем aquapolymount, заботясь, чтобы избежать пузырей. Поместите покровное над ткани, добавить дополнительные aquapolymount, как нужно заполнить пробелы в покровное.
- Поместите установлены секции в темное и сухое в течение 2-3 дней при комнатной температуре. Хранить в slidebox при 4 ° С.
- Вeginning с интактной полушарии (фиксировали в 10% формалине и тщательно промывают 0,1 М PBS), нарезать 1,5 см Коронарные срезы через всю полусферу, используя большой нож.
- Иммуногистохимия и Гистологический анализ
- Использование конфокальной микроскопии для просмотра флуоресцентного иммуногистохимии, установлен в фокальной плоскости изображения на поверхности желудочка, как определено с использованием Oе β-катенин (маркер для верхушечные слипчивых соединительных белков эпендимных клеток). Очертить регионы эпендимных охвата клетки и поверхности астроглиоза (GFAP окрашивания на поверхности желудочка).
- Для документа и фотомонтаж всей поверхности желудочка, использовать перекрывающихся изображений, чтобы покрыть всю поверхность. Чтобы создать монтаж последовательных изображений, откройте Adobe Photoshop. Используйте Файл> Автоматизация> Photomerge> Интерактивная макета выберите изображения для наложения, ручной настройки, если это необходимо.
- Создайте новый слой, чтобы проследить монтаж генерировать мультфильм представительство нетронутыми покрытия Эпендима клеток или желудочка поверхности глиозом. Повторите для каждого слайда или ROI. Составьте все разделы реконструировать карту стенки желудочка и ссылка на соответствующий регион на реконструкцию МРТ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Контур отслеживания мыши боковых желудочков на основе иммуноокрашиванию 50 мкм корональных секций и 3D реконструкций (рис 3) позволяет получить сведения об объеме, чтобы быть собраны в различных экспериментальных парадигм, используя мышь в качестве модельной системы для болезни или травмы. Решающее значение для этой процедуры является исключение тех регионах, где боковые стенки желудочка прилипают друг к другу. По subsegmenting регионы желудочков и назначение другого цвета для каждого региона (рис 3C), смежные разделы могут быть соблюдены и региональных и общий объем может быть рассчитана из скомпилированных подсегментов.
Подобные исследования могут быть выполнены с использованием МРТ головного мозга вместе с полуавтоматической сегментации (ИТК-SNAP) боковых желудочков для 3D визуализации. Для прямого сопряжения объемов желудочков и анализа перивентрикулярного ткани, до или после вскрытия МРТ на сегменты и выровнены для создания 3D-реконструкции (
Рисунок 1: Выполнение бокового желудочка сегментации, используя ИТК / оснастку Snake ROI Tool (A) "Пузыри 'добавляются боковых желудочков. (Б) "Пузыри" расширить в ходе эволюции активной контура. (С) Сегментация завершается, когда весь боковой желудочек заполняется. (Принимаются меры, чтобы избежать 3-й желудочек).
Рисунок 2: Человек рассечение стенки бокового желудочка (
Рисунок 3: Трассировка и 3D реконструкция мыши боковых желудочков (корональной разделе мозга мыши в том числе боковых желудочков, изложенных в S100β-иммунореактивных клеток эпендимных (*, боковых желудочков; кронштейн, область адгезив. Сион; Шкалы, 500 мкм). (Б) мыши боковые желудочки прослеживаются как «контуров» и расположены в подсегменты разделах, за исключением регионов внутрижелудочкового адгезии от вмешательства объемного анализа. (С) 3D реконструкция боковой желудочек контуров. Желтый, контур всему объему мозга, охватывающей область интереса, содержащей боковые желудочки.
Рисунок 4: МРТ на основе бокового желудочка сегментация () МРТ собраны. (Б) бокового желудочка определяется как ROI (красный). (С) 3D-реконструкция изображения позволяет для объемного количественного и качественного визуализации бокового желудочка.
объявления / 52328 / 52328fig5highres.jpg "/>
Рисунок 5: Оценка продольного расширения желудочка продольного магнитно-резонансную томографию с нескольких точек могут быть выровнены и обложил визуализировать и количественно желудочка расширение объема внутри субъектов в течение долгого времени.
Рисунок 6: Иммуногистохимическое оценки и региональное картирование человеческого боковой поверхности желудочка (а) участки интактных клеток эпендиме, изложенной окрашивания β-катенина, показывают булыжник вид (звездочка) и разграничены пунктиром из областей астроглиоза на поверхности желудочка (GFAP + окрашивание). (B) Последовательные конфокальные изображения накладываются, чтобы создать региональную монтаж и прослежены с помощью Adobe Photoshop для мультфильма представления клеточной организации на поверхности желудочка. (С) МультфильмИзображение монтаж отображается желудочка поверхности на соответствующих МРТ основана реконструкцию 3D желудочка. (Масштаб бар (), 40 мкм; Масштаб бар (B), 1 мм)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представляем инструменты и протоколы, которые могут быть использованы для оценки целостности системы желудочков мозга у мышей и человека. Эти инструменты, однако, может также применяться к другим структурам головного мозга или органов и систем, которые подвергаются изменениям в связи с травмой, болезнью или в процессе старения 14,21,22. Стратегии представлены использует преимущества программного обеспечения, что позволяет выравнивание поперечного сечения и продольных последовательностей МРТ для создания объема 3D представления конкретных регионов или сооружений, представляющих интерес. Продольный последовательности МРТ позволяют сборник изменений 3D объема, которые происходят в течение долгого времени и может быть расширена, чтобы включить общий объем мозга, для бокового желудочка в общей объемных соотношениях мозга, и / или другие структуры мозга (например, гипоталамический-ядерных 23 или мозолистого тела трактов белого вещества с помощью диффузионно-взвешенной визуализации тензор). Вместе всесторонний анализ структурных изменений головного мозга может быть выполнена. В конечном счете,оценить возрастные и болезни, связанные с изменениями в структурах мозга коллекция мультимодальных методов визуализации необходимо, чтобы обеспечить наиболее точную картину состояния здоровья мозга 24. Документация и составление критических структурных данных, вместе с изменчивостью субъект-субъектному и диапазона изменчивости через субъектов, в идеале можно было бы использовать для создания ультра-высокого поля МРТ атласы в лучшем направляющей клинического диагноза ткани в здоровья или болезни.
Несколько важных шагов важно отметить, чтобы уменьшить сбора и обработки изменчивости внутри и между наборами данных, подлежащих. В идеале, чтобы получить подобранные последовательности данных, же томограф и последовательность типа следует использовать на протяжении всего исследования. Посмертный ткани мозга часто меняя качества; Критические факторы, такие как причина смерти, посмертной интервала, качество перфузии, и продолжительности в фиксатора все может повлиять на эффективность окрашивания и необходимостьАнтиген поиска протокол. Кроме того, размер человеческого мозга требуется несколько секций фрагмент с каждого среза, требующего дальнейшей обработки, чтобы получить ткань, содержащую интерес областей. Поэтому, очень важно, чтобы расположение и ориентация каждой секции четко обозначены и записал. В конечном счете, основной проблемой анализа посмертных тканей, что именно - это посмертных - и, следовательно, обеспечивает только мгновенный снимок ткани в конце жизни. Улучшенные мультимодальные методы визуализации необходим для анализа в реальном времени изменений в структурах головного мозга и морфо-функциональной информации с клеточной резолюции.
Исследования мыши позволяют допрос человека переменной условия по переменной и не представляют многие трудности, найденных при работе с человеческой тканью. Исследования мыши, используемые для моделирования человеческого болезни или травмы в результате анализа причинно-следственных структурной динамики может предложить усовершенствования для болезни модели валidation. Тем не менее, следует отметить, видовые различия конкретных. В нашем анализе боковых желудочков, важно отметить, что у мышей, сохраняют активное нишу стволовых клеток вдоль боковой стенки боковых желудочков и стволовых клеток опосредованного восстановительного ремонта футеровки желудочка происходит в случаях скромных эпендимных гибели клеток, так как найти в старых мышей, или когда ограничены эпендимных оголение клеток происходит в результате воздействия на эпендимы для нейраминидазы 19. В отличие от этого, люди не выдерживают надежную нишу стволовых клеток вдоль боковых стенок желудочков 25-27 и мало, если таковые имеются, регенерация, скорее всего. В отличие от мышей в возрасте, в возрасте люди показывают огромный астроглиоз на поверхности желудочка, связанной с расширением желудочка 6. Этот уровень денудации и «рубцов» желудочка облицовки могут быть смоделированы у мышей с помощью нейраминидазы оголять желудочка прокладку эпендимных клеток 6,28. Кроме того, важно, чтобы распознать йна вивария-поддерживается мышей не испытывают инфекции, болезни или травмы, представляя много различных историю болезни от большинства человеческих существ. Кроме того, мыши, как правило, не показывают возраст-ассоциированных заболеваний нейродегенеративных, вентрикуломегалия или перивентрикулярная глиоза. Поэтому, чтобы соблюдать эти фенотипы они должны быть смоделированы. В конце концов, ни одна модель животное не может полностью повторять онтогенез, патофизиологии, и симптоматическое сложность заболевания человека и должны быть признаны и должным образом доведены эти ограничения.
В целом, мы представляем методы и протоколы для оценки боковые объемы желудочка мыши и человека. Желудочки может быть оказана в 3D и продольный анализ позволяет компиляцию изменений пространственно-временных громкости. Кроме того, с помощью парного ткани мозга показано, как сотовая функции могут быть связаны с изменениями в объемах желудочка. Последние результаты, демонстрирующие повышенный уровень аквапорин-4 выражении в районах periventricuLAR глиоз предложить отек вдоль поверхности желудочка. Поэтому будущие исследования спаривания FLAIR-МРТ с ткани гистологии улучшит наше понимание CSF и межуточный обмен жидкости, и обеспечивают важную информацию о состоянии системы желудочка и как его ухудшение влияет на различные функции мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 21600-069 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Use at 4% in PBS, 4 °C |
| Normal Horse Serum | Life Technologies | 16050 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Triton X-100 (TX) | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.1% in PBS (v/v) |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Imager.M2 | |
| Camera | Hamamatsu | ORCA R2 | |
| Microscope Stage Controller | Ludl Electronic Products | MAC 6000 | |
| Stereology software | MBF Bioscience | Stereo Investigator 11 | |
| Stereology software | ImageJ/NIH | NIH freeware | |
| 3D Reconstruction software | MBF Bioscience | Neurolucida Explorer | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | |
| MRI Software | |||
| Freesurfer | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Segmentation and Volume | |
| ITK-Snap | http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php | Segmentation and Volume | |
| Multi-image Analysis GUI (Mango) | http://ric.uthscsa.edu/mango/ | Longitudinal overlay | |
| Whole Mount Equipment | |||
| 22.5° microsurgical straight stab knife | Fisher Scientific | NC9854830 | |
| parafilm | |||
| wax bottom dissecting dish | |||
| pins | |||
| fine forceps | |||
| aquapolymount | |||
| Dissecting Microscope | Leica | MZ95 | |
| Whole Mount Antibodies | |||
| mouse anti-b-catenin | BD Bioschiences, San Jose, CA, USA | 1:250 | |
| goat anti-GFAP | Santa Cruz Biotechnology | 1:250 | |
| rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4) | Sigma-Aldrich | 1:400 | |
| Coronal Antibodies | |||
| Anti-S100β antibody | Sigma-Aldrich | 1:500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D-1306 | 10 µg/ml in PBS |
References
- Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 55-73 (2010).
- Johanson, C., et al. The distributional nexus of choroid plexus to cerebrospinal fluid, ependyma and brain: toxicologic/pathologic phenomena, periventricular destabilization, and lesion spread. Toxicol Pathol. 39, 186-212 (2011).
- Roales-Bujan, R., et al. Astrocytes acquire morphological and functional characteristics of ependymal cells following disruption of ependyma in hydrocephalus. Acta Neuropathologica. 124, 531-546 (2012).
- Cserr, H. F. Physiology of the choroid plexus. Physiol Rev. 51, 273-311 (1971).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4, 147ra111 (2012).
- Shook, B. A., et al. Ventriculomegaly associated with ependymal gliosis and declines in barrier integrity in the aging human and mouse brain. Aging Cell. , (2013).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342, 373-377 (2013).
- Fazekas, F., et al. Pathologic correlates of incidental MRI white matter signal hyperintensities. Neurology. 43, 1683-1689 (1993).
- Meier-Ruge, W., Ulrich, J., Bruhlmann, M., Meier, E. Age-related white matter atrophy in the human brain. Ann N Y Acad Sci. 673, 260-269 (1992).
- Resnick, S. M., Pham, D. L., Kraut, M. A., Zonderman, A. B., Davatzikos, C. Longitudinal magnetic resonance imaging studies of older adults: a shrinking brain. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 23, 3295-3301 (2003).
- Sener, R. N. Callosal changes in obstructive hydrocephalus: observations with FLAIR imaging, and diffusion MRI. Comput Med Imaging Graph. 26, 333-337 (2002).
- Sze, G., et al. Foci of MRI signal (pseudo lesions) anterior to the frontal horns: histologic correlations of a normal finding. AJR Am J Roentgenol. 147, 331-337 (1986).
- Tisell, M., et al. Shunt surgery in patients with hydrocephalus and white matter changes. Journal of Neurosurgery. 114, 1432-1438 (2011).
- Valdes Hernandez Mdel, C., et al. Automatic segmentation of brain white matter and white matter lesions in normal aging: comparison of five multispectral techniques. Magn Reson Imaging. 30, 222-229 (2012).
- Shook, B. A., Manz, D. H., Peters, J. J., Kang, S., Conover, J. C. Spatiotemporal changes to the subventricular zone stem cell pool through aging. The Journal of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 32, 6947-6956 (2012).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Luo, J., Daniels, S. B., Lennington, J. B., Notti, R. Q., Conover, J. C. The aging neurogenic subventricular zone. Aging Cell. 5, 139-152 (2006).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. J Neurosci. 28, 3804-3813 (2008).
- Marcus, D. S., Fotenos, A. F., Csernansky, J. G., Morris, J. C., Buckner, R. L. Open access series of imaging studies: longitudinal MRI data in nondemented and demented older adults. J Cogn Neurosci. 22, 2677-2684 (2010).
- Giorgio, A., De Stefano, N. Clinical use of brain volumetry. J Magn Reson Imaging. 37, 1-14 (2013).
- Caspers, S., et al. Studying variability in human brain aging in a population-based German cohort-rationale and design of 1000BRAINS. Front Aging Neurosci. 6, 149 (2014).
- Keuken, M. C., et al. Ultra-high 7T MRI of structural age-related changes of the subthalamic nucleus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 4896-4900 (2013).
- Marti-Bonmati, L., Sopena, R., Bartumeus, P., Sopena, P. Multimodality imaging techniques. Contrast Media Mol Imaging. 5, 180-189 (2010).
- Bergmann, O., et al. The age of olfactory bulb neurons in humans. Neuron. 74, 634-639 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Wang, C., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21, 1534-1550 (2011).
- Carmen Gomez-Roldan, D. el, M,, et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507, 1571-1587 (2008).
