Introduction
Un ependimarias líneas monocapa de células del sistema ventricular del cerebro que proporciona funciones de barrera y de transporte bidireccionales entre el líquido cefalorraquídeo (LCR) y el líquido intersticial (ISF), 1-3. Estas funciones ayudan a mantener el cerebro tóxico-libre y en equilibrio fisiológico 2,3. En los seres humanos la pérdida de porciones de este revestimiento a través de una lesión o enfermedad no parece resultar en sustitución regenerativa como se encuentra en otros revestimientos epiteliales; más bien la pérdida de cobertura de la célula ependimal parece resultar en astrogliosis periventricular con una malla de los astrocitos que cubren regiones desnudas de las células ependimarias en la superficie ventrículo. Repercusiones graves a mecanismos CSF / cambio ISF y remoción importantes se prevé que el resultado de la pérdida de esta capa epitelial 1,2,4-7.
Una característica común de envejecimiento humano se amplía ventrículos laterales (ventrículomegalia) y edema periventricular asociado como observcado por resonancia magnética y la recuperación de la inversión a los fluidos atenuada resonancia magnética (MRI / FLAIR) 8-14. Para investigar la relación entre ventrículomegalia y la organización celular del revestimiento ventrículo, secuencias de RM humanos postmortem fueron emparejados con las preparaciones histológicas del tejido periventricular ventrículo lateral. En los casos de ventrículomegalia, áreas sustanciales de gliosis habían reemplazado la cobertura celular ependimaria lo largo de la pared del ventrículo lateral. Cuando la expansión ventrículo no se detectó por análisis de volumen a base de MRI, el revestimiento de células ependimarias estaba intacta y gliosis no se detectó a lo largo del revestimiento ventrículo 6. Este enfoque combinatoria representa la primera documentación que detalla los cambios globales en la integridad celular del revestimiento ventrículo lateral usando preparaciones wholemount de partes o toda la pared del ventrículo lateral y modelado 3D de los volúmenes ventriculares 6. Varias enfermedades (enfermedad de Alzheimer, la esquizofrenia) y lesiones (lesión cerebral traumática)mostrar ventrículomegalia como un rasgo neuropatológico temprano. Denudation de áreas del revestimiento de células ependimarias de ese modo se predijo para interferir con la función de las células ependimarias normal y comprometer el equilibrio homeostático entre CSF / fluido ISF y el intercambio de solutos. Por lo tanto, un examen más exhaustivo de los cambios en el sistema ventricular, su composición celular, y la consecuencia de las estructuras cerebrales subyacentes o vecinos en última instancia comenzará a revelar más sobre la neuropatología asociada con la ampliación ventrículo.
La falta de datos de imágenes multimodales y, en particular secuencias de datos longitudinales, junto con un acceso limitado a las correspondientes muestras de tejidos histológicos hace análisis de patologías cerebrales humanas difícil. Fenotipos de modelado que se encuentran en el envejecimiento o enfermedad humana a menudo se puede lograr con modelos de ratón y modelos animales se convierten en uno de nuestros mejores medios para explorar preguntas acerca de la iniciación de la enfermedad humana y la progresión. Varios estudios enratones jóvenes sanos han descrito la citoarquitectura de las paredes del ventrículo lateral y el nicho de células madre subyacente 4,7-15. Estos estudios se han ampliado para incluir el modelado 3D y análisis celular de las paredes del ventrículo a través del envejecimiento 6,15. Ni gliosis periventricular ni ventrículomegalia se observan en ratones de edad, en lugar ratones muestran una zona subventicular relativamente robusto (SVZ) nicho de células madre subyacente a una célula intacta ependimaria forro 6,15. Por lo tanto, existen diferencias específicas de especie sorprendentes tanto en el mantenimiento y la integridad del revestimiento del ventrículo lateral en general durante el proceso de envejecimiento de 6,15. Por lo tanto, a mejores ratones uso para interrogar condiciones que se encuentran en los seres humanos, necesitan ser caracterizado y considerado apropiadamente en cualquier paradigma de modelado diferencias entre las dos especies. A continuación, presentamos los procedimientos para evaluar los cambios longitudinales a los ventrículos laterales y el tejido periventricular asociado tanto en humanos como mOuse. Nuestros procedimientos incluyen representación 3D y volumetría de ambos ventrículos del ratón y humanos, y el uso de análisis inmunohistoquímico de las preparaciones de todo el montaje de tejido periventricular para caracterizar tanto la organización celular y la estructura. Juntos, estos procedimientos proporcionan un medio para caracterizar cambios en el sistema ventricular y el tejido periventricular asociado.
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Protocol
NOTA: Los procedimientos en animales fueron aprobados por la Universidad de Connecticut IACUC y se ajustan a las directrices del NIH. Tejido humano y el análisis de datos y procedimientos estaban en el cumplimiento y aprobados por la Universidad de Connecticut IRB y se ajustan a las directrices del NIH.
1. Mouse: Análisis de periventricular celular Integridad y Modelado 3D del ventrículo lateral
1.1) Preparación del mouse laterales ventrículo Wall enteros Mounts
- Preparar ratón ventrículo montajes enteros laterales para inmunohistoquímica (IHC), como anteriormente descrita 16,17.
1.2) La inmunohistoquímica para el Análisis ventrículo lateral
- Fijar y el tejido cerebral sección de ratón como se describe anteriormente 18,19.
- Brevemente, los ratones ras transcardially con normalidad, solución salina temperatura ambiente, hasta que los órganos han despejado (indicado por una coloración pálida), seguido de temperatura ambiente 4% de paraformaldehído(PFA) en 0,1 M tampón fosfato salino (PBS) hasta que el tejido se ha endurecido.
- Retire el cerebro del cráneo. Use las tijeras de disección iris para cortar desde la base del cráneo largo de la sutura sagital.
- Expose cráneo y eliminar cerebro con fórceps. Sumergir el cerebro en el 4% PFA fijador durante la noche a 4 ° C. A continuación, lavar 3 veces durante 20 min con PBS.
- Preparar secciones seriadas para inmunohistoquímica y el análisis del volumen.
- Con un bisturí microquirúrgico, hacer una pequeña incisión longitudinal a lo largo de la corteza del hemisferio izquierdo para permitir la identificación del hemisferio izquierdo del hemisferio derecho cuando se immunostained secciones flotantes.
- EnCase cerebros en 3% de agarosa como soporte estructural añadido fijo durante vibratome seccionamiento. Caliente de agarosa al 3% en agua destilada (w / v) hasta que se disolvió completamente usando un microondas o una placa caliente.
- Con una hoja de afeitar, retire la sección de caudal del cerebro al cerebelo con unacorte coronal, dejando una superficie plana y uniforme. Aplicar pegamento a la etapa de los tejidos y posicionar el cerebro en la superficie recién cortada con los bulbos olfatorios hacia arriba.
- Cuando la solución de agarosa líquido se haya enfriado a una temperatura justo caliente al tacto, se aplican de manera uniforme sobre el cerebro para encerrar por completo todo el cerebro. Deje que la agarosa se solidifique.
- Sección de agarosa encerrado cerebro coronal en un vibratome a 50 micras secciones, con secciones colocadas en serie en una placa de 24 pocillos que contenía PBS con el fin de preservar el orden secuencial.
NOTA: Generalmente 12 pozos se utilizan para un cerebro, con la colección de tejidos a partir de 5 secciones antes de ver la aparición de los ventrículos laterales que comienzan con el pocillo A1, moviéndose numéricamente a través de B6 y en bicicleta de vuelta a A1. Esto permite que múltiples secciones distinguibles desde el mismo cerebro a procesar en el mismo pozo. Para el análisis del volumen del ventrículo lateral, la recogida de tejidos cesó cuando el ventrículo laterals y tercer ventrículo fusión, lo que resulta en aproximadamente 3 secciones por pocillo o 36 secciones total. - Aspirar el PBS utilizando una pipeta de transferencia fijada con una punta de micropipeta 20-200 l para garantizar que los artículos flotantes no son aspirados accidentalmente. Bloquear y permeabilizar secciones flotantes en 10% de suero, 0,1% Triton X-100 (TX) en PBS (PBS-TX) durante 1 hora a temperatura ambiente. Utilice 300 l de solución por pozo para cubrir las secciones de tejido-flotantes libres en una placa de 24 pocillos y ejercer todas las incubaciones de las secciones en una placa basculante.
- Aspirar la solución de bloqueo, y se incuban las secciones con anticuerpos primarios en PBS-TX durante la noche (al menos 12 h) a 4 ° C. Por las huellas de volumen del ventrículo utilizando secciones coronales, utilice anticuerpo anti-S100β para etiquetar células ependimarias.
- Solución de anticuerpo primario Aspirar y lavar las secciones 3 veces durante 10 minutos cada uno con PBS-TX.
- Incubar las secciones en la oscuridad durante 1 hora a tempera habitacióntura con anticuerpos secundarios fluorescentes, a concentraciones de 1: 1000 en 10% de suero, PBS-TX. Mantenga secciones en la oscuridad durante todas las etapas de incubación restantes.
- Aspirar solución de anticuerpo secundario e incubar las secciones con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol en PBS (DAPI, 10 mg / ml) durante 5 min a contratinción núcleos celulares. Aspirar la solución DAPI y enjuague secciones 3 veces durante 10 minutos cada uno con PBS.
- Mount secciones serialmente en portaobjetos utilizando la marca cortical para preservar la izquierda frente a la orientación hemisferio derecho. Air secciones secas en la oscuridad y luego cubreobjetos mediante la aplicación de una fina capa de medio de montaje a la diapositiva y coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio en la parte superior. Permitir diapositivas coverslipped secar durante la noche a temperatura ambiente.
1.3) Segmentación ventrículo lateral para reconstrucciones 3D
NOTA: Realizar el seguimiento de los ventrículos laterales utilizando software de mapas en una microsco epifluorescencia verticalPE con una etapa automatizada y una cámara CCD digital para la detección de fluorescencia.
- Encienda el equipo microscopio de fluorescencia y lanzar software de mapas en el modo de fluorescencia. Abrir "Opciones de visualización" para cargar las barras de herramientas adecuadas y paneles de herramientas de acoplamiento necesarios para el rastreo. Opciones> Opciones de visualización> Accesorios y seleccione la 'principal' y barras de herramientas "marcador". En el mismo menú, seleccionar 'Cámara histograma', 'multicanal de Control "," Ajustes de la cámara ", y" Adquisición de imágenes "en" paneles de herramientas de acoplamiento.
- Observe inicios de los ventrículos basado en fuerte fluorescencia S-100β que etiqueta las células ependimarias que recubren el ventrículo lateral. Identificar la primera pieza de tejido que contiene los ventrículos laterales.
- Crear un nuevo archivo de datos y designar un punto de referencia para el movimiento etapa haciendo clic en la ventana de imagen por encima del ventrículo lateral izquierdo. Busque el pequeñoincisión para orientar la izquierda desde el hemisferio derecho. Mantenga el punto de referencia en un lugar coherente en relación con los ventrículos laterales a través de rastreo de archivos para ayudar al importar contornos para la reconstrucción de serie.
- Seleccione el tipo adecuado contorno preestablecido en el contorno del menú desplegable, por ejemplo, 'Left Lateral ventrículo. Use un color único para cada uno de los trazados ventrículo lateral izquierdo y derecho. Si se requieren cambios en el nombre de contorno y color, vaya a Opciones> Preferencias de visualización> contornos, a continuación, modifique los nombres de los colores de contorno o seleccionar "Añadir Tipo Contour '.
- Con contorno de la "Izquierda Lateral ventrículo 'seleccionado, haga clic en a lo largo de la superficie apical de la mucosa ependimaria para comenzar el contorno rastro. Trazar el ventrículo al continuar haga clic sucesivamente a lo largo de la superficie apical.
- Para las áreas irregulares requieren más delicadeza, haga clic y mantenga pulsado el botón izquierdo del ratón con el fin de rastrear la mano libre. Presione Ctrl + Z, o ir to Opciones> Deshacer para deshacer el punto de contorno anterior. Mueva la ventana de rastreo utilizando las teclas de flecha o haciendo punto un contorno fuera de la pantalla y permitiendo la ventana para centrar automáticamente. Para terminar el ventrículo trazando click derecho y seleccione "Cerrar contorno".
- Seleccione un nuevo color de contorno (tipo contorno) para el ventrículo lateral derecho usando el menú desplegable. Trazar el ventrículo derecho como en el paso 1.3.4 para la izquierda.
- Si se requieren cambios en el nombre de contorno y color, haga clic derecho en el contorno y seleccione Cambiar Contour Tipo para seleccionar el color apropiado.
- Añadir marcadores a lo largo de la línea media para ayudar en la alineación de los contornos de serie para la reconstrucción 3D. Para agregar los marcadores, seleccione el marcador apropiado (use la 'X') de la barra de herramientas de marcadores de la izquierda y haga clic para colocar en la pantalla de rastreo. Marcadores de importación junto con los contornos de cada sección de tejido rastro.
- Para guardar el rastro de tejido, seleccione Archivo> GuardarArchivo de datos de medida y crear una nueva carpeta y nombre de archivo. Número de los trazados [diapositiva #] - [#] tejido para una fácil identificación de las huellas de cortes seriados. Por ejemplo, la tercera sección de tejido en la segunda diapositiva tiene el nombre del archivo '2-3' en el directorio para cada cerebro.
- Repita los pasos 1.3.4 al 1.3.9 para cada sección de serie de tejido cerebral para localizar a los ventrículos a través de todo el cerebro, con exclusión de las regiones de la adhesión de la pared del ventrículo.
- Si el ventrículo tiene una región de adhesión, sub-segmento de la región anterior de los dorsal y ventral al sitio de la adhesión. Crear dos nuevos tipos de contorno para cada ventrículo (por ejemplo, 'Dorsal ventrículo izquierdo' y 'ventral del ventrículo izquierdo'). En la primera lámina de tejido con la adhesión, rastrear el ventrículo lateral tanto con el contorno original ventrículo lateral y el nuevo dorsal y ventral contornos para asegurar una reconstrucción completa ventrículo puede ser creado.
- En las secciones posterior a un ventriclla adhesión de la pared e, crear un conjunto de nuevos colores de contorno para la parte posterior de cada ventrículo (por ejemplo, 'posterior del ventrículo izquierdo'). Haga doble rastrear esta primera sección de re-unido tanto con la adhesión actual y nuevos tipos de contorno posterior.
1.4) Reconstrucción lateral del ventrículo 3D
- Alinear y compilar trazados de contorno de serie de los ventrículos laterales del ratón para generar reconstrucciones en 3D y datos volumétricos.
- Programa de reconstrucción 3D Abrir. Haga clic en Archivo> Abrir y seleccione el archivo de contorno de la sección primera serie trazada. Importe los trazados de contorno del ventrículo izquierdo y derecho, así como cualquier marcador agregado.
- Para seleccionar contornos, haga clic en el botón "Seleccionar objetos" (icono de cursor) y seleccionar los dos ventrículos y marcadores mediante la celebración de 'Ctrl'. Para establecer la posición Z de los contornos, haga clic derecho y seleccione 'Modificar Z Posición'. Establezca la primera rebanada de tejido a 0 m. <li> Para guardar la reconstrucción, seleccione Archivo> Guardar archivo de datos como. Guardar después de cada archivo de importación, por lo que la recuperación si se comete un error es tan fácil como volver a cargar el archivo anterior.
- Para agregar el siguiente trozo de tejido para la reconstrucción, haga clic en Archivo> Append para Mostrar. Seleccione el archivo .DAT que se adjunta, y marque la casilla 'Merge'.
- Siga el paso 1.4.3 para ajustar de nuevo la posición Z del archivo de rastreo recién importado. Seleccione sólo los contornos recién añadidos izquierdo y derecho en la ventana principal para evitar mover las otras huellas. Ajuste cada archivo de rastreo sucesiva a 50 m de la posición Z del contorno anterior de 50 micras secciones. (Primera contorno: z = 0, segundo contorno: z = 50, tercer contorno: z = 100, etc.)
- Para ajustar la posición X, Y de contornos y marcadores seleccionados, haga clic en el 'Habilitar traducción con el ratón' botón y arrastre los contornos para alinear con los contornos de tejidos anteriores. Mantenga tanto los contornos izquierdo y derecho de la traza actual seleccionadospara permitir el movimiento síncrono.
- Para girar las huellas hacia la derecha o hacia la izquierda para alinear los marcadores de la línea media, seleccione el botón "Z-eje de rotación". Para voltear contornos de todo el eje Y (si el contorno izquierdo está a la derecha), seleccione los dos contornos y marcadores importados, haga clic derecho, seleccione 'Set Ángulo de rotación ", y entrar en' 180 'en la' Y la rotación '.
- Asegúrese de que los marcadores ventrículos y la línea media están mejor alineados antes de guardar el archivo de la reconstrucción, como en el paso 1.4.4.
- Repita los pasos 1.4.5 al 1.4.9 para cada rebanada de tejido posterior hasta que todos hayan sido importadas y debidamente alineados.
- Para ver los datos de volumen de la reconstrucción de serie, haga clic en Análisis> 'Marcadores y Análisis Región' y seleccione '3D Contour Resumen'. Seleccionar todos los contornos en el panel de la izquierda y luego haga clic en el botón "Visualización 3D" para mostrar la reconstrucción 3D final.
2. humano: Análisis de periventricular celular Integridad y Modelado 3D del ventrículo lateral
2.1) Análisis MRI de datos Human
NOTA: Los Protocolos se enumeran para crear reconstrucciones de imágenes en 3D y cuantificación volumétrica de los ventrículos laterales y evaluar los cambios volumétricos en el tiempo utilizando análisis de superposición longitudinal. Es importante tener en cuenta que la consistencia en la recopilación de datos MR (por ejemplo, máquina y la fuerza del imán, espesor de la sección, la orientación y la resolución) y el procesamiento post-adquisición son extremadamente importantes criterios para la inclusión de conjuntos de datos 20.
- Segmentación ventricular
NOTA: ITK / de disparo se utiliza para segmentar los ventrículos de alta resolución de las imágenes de RM potenciadas en T1. Alternativamente, otro software freeware tales como FreeSurfer se puede utilizar.- Abrir ITK / Snap, Archivo> Abrir imagen en escala de grises. Seleccione el archivo deseado y abierta como un archivo .nii (archivo NITFI).
- Desplazarse a través de cada anatplano omical, anomalías ventriculares observando (regiones estenosadas, cuernos temporales grandes o pequeños, etc.). En el cuadro de herramientas principal, haga clic en 'Herramienta ROI de la serpiente'. Haga clic en 'Segmento 3D'. Seleccione la opción 'Intensidad Región'.
- Haga clic en 'preproceso Imagen'. Seleccione 'Above', para incluir regiones por debajo de un umbral de intensidad determinado con el fin de poner de relieve el ROI en blanco. Anote la intensidad máxima usando la barra deslizante. Establecer el umbral de 15% de la máxima intensidad (registro de este valor). Ajuste el parámetro suavidad a 10. Haga clic en 'Aceptar', luego 'Next'.
- Añadir 10-12 pequeño (tamaño 2) 'burbujas' de cada ventrículo: dos en el cuerno frontal anterior, siete espaciados uniformemente a lo largo de la superficie superior del cuerpo del ventrículo lateral, uno en el cuerno occipital y uno en el cuerno temporal del ventrículo lateral. 'Seleccione Parámetros' y establecer la fuerza de curvatura de 0,4. Haga clic en el símbolo de reproducción para comenzar la evolución contorno activo.
- Haga clic en 'Actualizar Mesh' para visualizar la superficie; comprobar 'Auto-Update'. Deje de segmentación cuando todas las áreas del ventrículo lateral se incluyen en la región de interés (ROI). Evitar la inclusión del tercer ventrículo. Haga clic en "Finalizar".
- Editar manualmente la imagen si es necesario para eliminar regiones no deseadas por los siguientes métodos (normalmente necesitará borrar tercera fuga ventrículo). Utilizar manualmente la herramienta '3D bisturí' para eliminar el exceso de regiones o de forma manual utilice la herramienta "Pincel" con "Borrar Etiqueta 'como la etiqueta dibujo activo para borrar cualquier inclusión allá de retorno de la inversión.
- Guardar los resultados de segmentación como una imagen .nii (formato de archivo 'NIfTI').
- Para obtener volumen total ventrículo, seleccione 'Segmentación> Volumen' y Estadística; obtener el volumen total del ventrículo usando etiqueta de color set.
- Representación longitudinal lateral Ventrículos De MRIScans
NOTA: El usoSoftware Mango, ROI longitudinales se superpone demostrar cualitativa y cuantitativamente los cambios en el volumen del ventrículo dentro de los sujetos a través del tiempo.- Abrir Mango. Haga clic ROI Archivo> Cargar del punto de tiempo primero ROI (línea de base) a GREEN. Archivo> ROI de carga del segundo punto de tiempo de retorno de la inversión a RED. Guardar superposición longitudinal al seleccionar Archivo> Guardar como; asignar a cada imagen como 'name_ archivo [primera edad punto de tiempo] - [edad punto segunda vez] .nii'.
- Abra ITK-SNAP. Vuelva a abrir el retorno de la inversión combinada como "imagen en escala de grises", mediante la selección de Segmentación> Cargar desde Imagen> archivo ROI combinado. Para obtener los datos de volumen longitudinales corren el siguiente: Segmentación> Volumen y estadísticas> Label 1 (rojo) = volumen de expansión; Etiqueta 2 (verde) = volumen de la estenosis; Etiqueta de volumen 3 (azul) = base.
2.2) periventricular Human Tissue Preparación y análisis
- Instrucciones de seguridad para trabajar con el tejido humano
- Obtener appropentrenamiento de seguridad piados (por ejemplo., por supuesto patógenos transmitidos por la sangre).
- Observar (universales) precauciones de seguridad estándar. Usar guantes. Cambie los guantes antes de tocar cualquier equipo o superficies comunes que no son desechables. Etiquetar ningún artículo rutinariamente manejados cuando se trabaja con el tejido humano con designaciones 'uso de tejido humano.
- Siga las prácticas de descontaminación de todos los elementos en contacto el tejido humano. Bleach todos los líquidos contaminados por un mínimo de 24 horas antes de su eliminación, el tratamiento de superficies contaminadas con un blanqueador empapada toalla (por ejemplo, mesa de trabajo) o mediante la colocación de objetos directamente en lejía (por ejemplo fórceps).
- Preparar plan de contingencia para el contacto con el tejido humano directamente sobre la piel, que puede incluir remojar una toalla de papel en lejía y la celebración en la zona afectada (5-10 min).
- Utilice de recuperación apropiado para todos los elementos que entran en contacto con el tejido humano.
- Lateral ventrículo Todo Preparación Monte
- Beginning con un hemisferio intacto (fijado en formalina al 10% y se enjuaga a fondo con PBS 0,1 M), cortar 1,5 cm de espesor secciones coronales a través de todo el hemisferio utilizando cuchillo de grandes dimensiones.
NOTA: Todos los protocolos de fijación requieren la verificación de anticuerpos antes. - Secciones Label adelante hacia atrás a partir de la primera sección que contiene el ventrículo lateral. Utilice un sistema de etiquetado alfanumérico, etiquetando las rodajas con letras (anterior a posterior) y el inciso con los números (de arriba abajo). Evite interrumpir superficie ependimarias.
- El uso de bisturí microquirúrgico, diseccionar pared ventricular 1 cm de profundidad, manteniendo una sección continua para toda la pared lateral. Subdividir pared según sea necesario para crear secciones de tamaño apropiado para la tinción también. Sección de Notch en el lado opuesto de la pared del ventrículo para identificar la orientación superior / inferior.
- Realizar la recuperación de antígeno mediante incubación de las secciones de tejido en 10 mM de tampón de citrato de sodio (pH 6,0) a 100 ° C durante 10-20 min utilizando un doble boiler (tiempo de incubación óptimo se determina empíricamente). Enjuagar 3 veces en PBS / 0,1% Triton X-100 (PBS-TX).
- Bloquear en 10% de suero de caballo usando PBS / PBS-TX durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Incubar con anticuerpos primarios durante 48 horas a 4 ° C. Para visualizar revestimiento de la pared del ventrículo, immunostain montajes enteros con las siguientes combinaciones de anticuerpos: ratón anti-β-catenina (1: 250); de cabra anti-GFAP (1: 250); conejo anti-AQP4 (1: 400).
- Realice todos los pasos posteriores en la oscuridad. Enjuague tejido 3 veces en PBS, se incuban con anticuerpos secundarios (1: 500) durante 24 horas a 4 ° C o 2 horas a temperatura ambiente, y enjuague otras 3 veces en PBS. Incubar el tejido en DAPI durante 7 min a temperatura ambiente seguido con otros 3 enjuagues en PBS.
- Preparar el tejido para la disección final cubriendo un plato inferior de cera con parafilm. Rellene plato con PBS, coloque el tejido en el plato con unas pinzas finas, evitando hacer contacto con la pared ependimarias.
- Bajo el microscopio de disección, con firmeza secure tejido en sus patas laterales utilizando. Con un cuchillo puñalada microquirúrgica 22,5 °, crear secciones delgadas uniformes (aproximadamente 300 micras de espesor) de la pared del ventrículo lateral. Por grandes sectores o secciones con curvatura difícil, cortado en cubos más pequeños antes de cortar en secciones finales para el montaje y la ubicación nota.
- Coloque cuidadosamente lado epéndimo sección diseccionado para arriba sobre portaobjetos utilizando unas pinzas finas, tomando nota de la ubicación y la orientación regional sobre la diapositiva. Cubra el tejido con una capa delgada de aquapolymount, teniendo cuidado de evitar burbujas. Coloque el cubreobjetos sobre el tejido, agregue aquapolymount adicional si es necesario para llenar cualquier vacío bajo cubreobjetos.
- Coloque secciones montadas en seco y oscuro durante 2-3 días a temperatura ambiente. Almacenar en slidebox a 4 ° C.
- Beginning con un hemisferio intacto (fijado en formalina al 10% y se enjuaga a fondo con PBS 0,1 M), cortar 1,5 cm de espesor secciones coronales a través de todo el hemisferio utilizando cuchillo de grandes dimensiones.
- La inmunohistoquímica y análisis histológico
- Usando microscopía confocal para ver inmunohistoquímica fluorescente, definir el plano focal de formación de imágenes en la superficie ventrículo, según lo determinado por el uso of β-catenina (marcador de adherentes apical proteínas de unión de las células ependimarias). Delinear las regiones de cobertura de células ependimarias y astrogliosis superficie (tinción GFAP en la superficie ventrículo).
- Documentar y el montaje de toda la superficie del ventrículo, utilice imágenes superpuestas para cubrir toda la superficie. Para crear montaje de imágenes en serie, abra Adobe Photoshop. Utilice Archivo> Automatizar> Photomerge diseño> Interactivo para seleccionar imágenes para superponer, haciendo ajustes manuales si es necesario.
- Crear nueva capa de rastrear montaje para generar la representación de dibujos animados de la cobertura celular epéndimo intacta o gliosis superficie ventrículo. Repita el procedimiento para cada diapositiva o ROI. Compilar todas las secciones para reconstruir el mapa de la pared del ventrículo y el enlace a la región correspondiente en la reconstrucción de resonancia magnética.
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Representative Results
Contorno de trazado de los ventrículos laterales del ratón sobre la base de inmunoteñidas 50 micras secciones coronales y reconstrucciones en 3D (Figura 3) permite que los datos de volumen para ser recogidos en diferentes paradigmas experimentales utilizando el ratón como sistema modelo para la enfermedad o lesión. Fundamental para este procedimiento es la exclusión de las regiones donde las paredes del ventrículo lateral se adhieren el uno al otro. Por subsegmenting regiones de los ventrículos y la designación de un color diferente para cada región (Figura 3C), secciones contiguas pueden cumplirse y el volumen regional y total puede calcularse a partir de subsegmentos compilados.
Estudios similares se pueden realizar utilizando imágenes por resonancia magnética del cerebro, junto con la segmentación semiautomático (ITK-SNAP) de los ventrículos laterales para representaciones en 3D. Para emparejar directa de los volúmenes ventriculares y análisis de tejido periventricular, pre o post-mortem imágenes por resonancia magnética son segmentados y alineados para crear reconstrucciones 3D (
Figura 1: Realizar la segmentación ventrículo lateral utilizando la herramienta ROI Serpiente ITK / de disparo (A) 'Bubbles' se añade a los ventrículos laterales. (B) 'Bubbles' expanda durante la evolución contorno activo. (C) La segmentación es completa cuando se llena toda ventrículo lateral. (Hay que tener cuidado para evitar el ventrículo 3º.)
Figura 2: La disección de la pared del ventrículo lateral Humano (
Figura 3: Seguimiento y reconstrucción 3D de los ventrículos laterales del ratón (una sección del cerebro del ratón coronal incluyendo ventrículos laterales, esbozados por células ependimarias S100β inmunorreactivas (*, Ventrículos laterales; soporte, región de adhe. sión; barra de escala, 500 micras). (B) mouse ventrículos laterales se trazan como "contornos" y dispuestos como secciones sub-segmentado, con exclusión de las regiones de la adhesión intraventricular de interferir con el análisis volumétrico. (C) la reconstrucción 3D de los contornos del ventrículo lateral. Amarillo, contorno del volumen total del cerebro que abarca la región de interés que contiene los ventrículos laterales.
Figura 4: segmentación ventrículo lateral basado en resonancia magnética (A) Imágenes de RM se ensamblan. (B) ventrículo lateral se define como ROI (rojo). Imagen de reconstrucción (C) 3D permite la cuantificación volumétrica y visualización cualitativa de ventrículo lateral.
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Figura 5: Evaluación de la expansión del ventrículo longitudinal longitudinal resonancias magnéticas desde múltiples puntos se puede alinear y sobrepuesto para visualizar y cuantificar ventrículo expansión de volumen dentro de los sujetos con el tiempo.
Figura 6: Evaluación inmunohistoquímica y la cartografía regional de la superficie lateral del ventrículo humana (A) Áreas de células epéndimo intactas, esbozado por la tinción de β-catenina, muestran una apariencia de adoquines (asterisco) y están delimitados por una línea de puntos de las regiones de astrogliosis en la superficie del ventrículo (GFAP + tinción). (B) confocal de imágenes en serie se superponen para generar un montaje regional y rastrear el uso de Adobe Photoshop para una representación de dibujos animados de la organización celular en la superficie ventrículo. (C) de la historieta deimagen montaje se asigna a la superficie en el ventrículo ventrículo 3D reconstrucción MRI basado correspondiente. (Barra de escala (A), 40 micras; barra de escala (B), 1 mm)
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Discussion
Presentamos herramientas y protocolos que pueden utilizarse para evaluar la integridad del sistema ventricular del cerebro en ratones y en seres humanos. Estas herramientas, sin embargo, pueden también ser aplicados a otras estructuras cerebrales o sistemas de órganos que sufren cambios debido a una lesión, enfermedad, o durante el proceso de envejecimiento 14,21,22. Las estrategias presentadas toma ventaja de software que permite la alineación de secuencias de RM transversales y longitudinales para generar representaciones de volumen 3D de regiones o estructuras de interés específicos. Longitudinal secuencias de resonancia magnética permiten recopilación de los cambios de volumen en 3D que se producen con el tiempo y se puede ampliar para incluir el volumen total del cerebro, de ventrículo lateral con proporciones totales de volumen cerebral, y / u otras estructuras del cerebro (por ejemplo, núcleo subtalámico 23 o cuerpo calloso tractos de sustancia blanca utilizando imágenes de tensor de difusión ponderada). En conjunto, un análisis exhaustivo de los cambios estructurales del cerebro se puede realizar. En última instancia,para evaluar los cambios relacionados con la edad y las enfermedades relacionadas a las estructuras del cerebro una colección de técnicas de imagen multimodales son necesarios para proporcionar la imagen más precisa del estado de la salud del cerebro 24. Documentación y recopilación de datos estructurales críticos, junto con sujeto-sujeto variabilidad y el rango de variabilidad entre los sujetos, idealmente podrían ser utilizados para generar ultra-alta de campo atlas de resonancia magnética a mejor diagnóstico clínico guía de tejido en salud o enfermedad.
Varios pasos críticos son importantes tener en cuenta con el fin de disminuir la adquisición y procesamiento de la variabilidad entre y dentro de los conjuntos de datos temáticas. Idealmente para obtener secuencias de datos combinados, el mismo escáner de resonancia magnética y la secuencia tipo se debe utilizar durante todo el estudio. Tejido cerebral postmortem es a menudo de calidad variable; factores críticos, tales como la causa de la muerte, el intervalo postmortem, la calidad de la perfusión, y la longitud de tiempo en fijador todos pueden afectar la tinción eficacia y la necesidad de unaprotocolo de recuperación de antígeno. Además, el tamaño del cerebro humano requiere múltiples secciones de la rebanada con cada rebanada que requiere manipulación adicional para obtener tejido que contiene las regiones de interés. Por lo tanto, es fundamental que la ubicación y la orientación de cada sección están claramente marcados y registrados. En última instancia, el problema principal con el análisis de tejido postmortem es precisamente que - es postmortem - y por lo tanto sólo proporciona una vista instantánea del tejido al final de la vida. Se requiere mejoradas técnicas de imagen multimodal para el análisis en tiempo real de los cambios en las estructuras cerebrales e información morfo-funcional con resolución celular.
Los estudios del ratón permiten interrogatorio de la condición variable humana por variable y no presentan muchas de las dificultades que se encuentran cuando se trabaja con el tejido humano. Estudios en ratones utilizados para modelar enfermedades humanas o lesiones mediante el análisis de la dinámica estructural causales pueden ofrecer mejoras para la enfermedad en modelos valdación. Sin embargo, deben tenerse en cuenta las diferencias específicas de las especies. En nuestro análisis de los ventrículos laterales, es importante señalar que los ratones conservan un nicho de células madre activo a lo largo de la pared lateral de los ventrículos laterales y se derivan de reparación regenerativa mediada por células del ventrículo revestimiento se produce en los casos de pérdida de células ependimarias modesto, como encontrado en ratones de edad o cuando se limita la denudación de células ependimarias se produce a través de la exposición de la epéndimo de la neuraminidasa 19. En contraste, los seres humanos no mantienen una robusta nicho de células madre a lo largo de las paredes del ventrículo lateral 25-27 y poca, si alguna, la regeneración es probable. En contraste con los ratones de edad, seres humanos de edades comprendidas muestran extensa astrogliosis en la superficie ventrículo asociado con la expansión ventrículo 6. Este nivel de denudación y 'cicatrices' de las paredes del ventrículo puede modelarse en ratones usando neuraminidasa de desnudar el revestimiento ventrículo de células ependimarias 6,28. Además, es importante reconocer THen ratones vivero mantenido no experimentan infecciones, enfermedad o trauma, presentando una historia clínica muy diferente de la mayoría de los seres humanos. Además, los ratones típicamente no muestran enfermedad neurodegenerativa asociada a la edad, ventriculomegalia o gliosis periventricular. Por lo tanto, para observar estos fenotipos que tienen que ser modelado. Al final, hay un modelo animal puede recapitular plenamente la ontogenia, fisiopatología, y la complejidad sintomática de las enfermedades humanas y estas limitaciones deben ser reconocidas y debidamente comunicada.
En resumen, presentamos las técnicas y protocolos para evaluar los volúmenes ventriculares laterales en ratón y humano. Ventrículos pueden ser prestados en 3D y análisis longitudinal permite la compilación de los cambios de volumen espacio-temporales. Además, el uso de tejido cerebral emparejado demostramos cómo las características celulares se puede vincular a los cambios en los volúmenes ventriculares. Resultados recientes que demuestran niveles de Aquaporin-4 expresión aumentaron en áreas de periventricugliosis lar sugieren edema largo de la superficie ventrículo. Por lo tanto las investigaciones futuras emparejamiento FLAIR-RM con la histología del tejido mejorarán nuestra comprensión de la CSF y el intercambio fluido intersticial, y proporcionar información crítica acerca de la salud del sistema ventricular y cómo su deterioro afecta a diversas funciones cerebrales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 21600-069 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Use at 4% in PBS, 4 °C |
| Normal Horse Serum | Life Technologies | 16050 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Triton X-100 (TX) | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.1% in PBS (v/v) |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Imager.M2 | |
| Camera | Hamamatsu | ORCA R2 | |
| Microscope Stage Controller | Ludl Electronic Products | MAC 6000 | |
| Stereology software | MBF Bioscience | Stereo Investigator 11 | |
| Stereology software | ImageJ/NIH | NIH freeware | |
| 3D Reconstruction software | MBF Bioscience | Neurolucida Explorer | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | |
| MRI Software | |||
| Freesurfer | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Segmentation and Volume | |
| ITK-Snap | http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php | Segmentation and Volume | |
| Multi-image Analysis GUI (Mango) | http://ric.uthscsa.edu/mango/ | Longitudinal overlay | |
| Whole Mount Equipment | |||
| 22.5° microsurgical straight stab knife | Fisher Scientific | NC9854830 | |
| parafilm | |||
| wax bottom dissecting dish | |||
| pins | |||
| fine forceps | |||
| aquapolymount | |||
| Dissecting Microscope | Leica | MZ95 | |
| Whole Mount Antibodies | |||
| mouse anti-b-catenin | BD Bioschiences, San Jose, CA, USA | 1:250 | |
| goat anti-GFAP | Santa Cruz Biotechnology | 1:250 | |
| rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4) | Sigma-Aldrich | 1:400 | |
| Coronal Antibodies | |||
| Anti-S100β antibody | Sigma-Aldrich | 1:500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D-1306 | 10 µg/ml in PBS |
References
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