Abstract
Varige ændringer i hjernen eller "hjernens plasticitet" ligger til grund adaptive adfærd og hjerne reparation efter sygdom eller skade. Endvidere kan interaktioner med vores miljø fremkalde hjernens plasticitet. Stigende grad forskning forsøger at identificere, hvilke miljøer stimulerer hjernens plasticitet gavnlig til behandling af hjerne og adfærdsmæssige forstyrrelser. To miljømæssige manipulationer er beskrevet som at forøge eller formindske antallet af tyrosin hydroxylase immunpositive (TH +, den hastighedsbegrænsende enzym i dopamin (DA) syntese) neuroner i voksne mus midthjernen. Den første kategori omfatter parring han- og hunmus sammen kontinuerligt i 1 uge, hvilket øger midthjernen TH + neuroner med ca. 12% hos mænd, men nedsætter midthjernen TH + neuroner med ca. 12% hos kvinder. Den anden omfatter boliger mus uafbrudt i 2 uger i »beriget miljøer" (EE) indeholdende løbehjul, legetøj, reb, redemateriale, etc., som jegncreases midthjernen TH + neuroner med ca. 14% hos mænd. Derudover er en protokol beskrevet for samtidig infusion af medicin direkte ind i midthjernen under disse miljømæssige manipulationer til at identificere mekanismerne bag miljømæssigt induceret hjernens plasticitet. For eksempel er EE-induktion mere midthjernen TH + neuroner ophævet ved samtidig blokade af synaptisk input på midthjernen neuroner. Sammen indikerer disse data, at oplysninger om miljøet videresendes via synaptic input til midthjernen neuroner for at tænde eller slukke udtryk for 'Da' gener. Således passende miljømæssig stimulering eller narkotika målretning af de underliggende mekanismer, kan være nyttige til behandling af hjerne- og adfærdsmæssige lidelser forbundet med ubalancer i midthjernen DA (f.eks Parkinsons sygdom, opmærksomhed underskud og hyperactivity disorder, skizofreni, og stofmisbrug).
Introduction
DArgic signalering af neuroner i det ventrale tegmentalområde (VTA) og substantia nigra pars compacta (SNC) i midthjernen menes at være vigtige for belønning motiveret kognitive, følelsesmæssige og motoriske adfærd. Men for meget eller for lidt midthjernen DA signalering forårsager mange invaliderende symptomer i en række neurologiske lidelser (fx Parkinsons sygdom, opmærksomhed underskud og hyperactivity disorder, skizofreni, og stofmisbrug). Narkotika som hæver eller sænker DA signalering lindre disse symptomer, men de producerer også bivirkninger, der kan tilskrives dysreguleret signalering og off-target effekter. Lægemiddeleffektivitet også falder med tiden på grund af kompenserende reaktioner i hjernen. Udfordringen er derfor at genoprette normal midthjernen DA signalering på en mere målrettet og fysiologiske måde, og et yndet metode er ved at øge eller mindske antallet af midthjernen DA-neuroner.
Beviser har hobet for sevrelle årtier at ekspressionen af gener og proteiner involveret i metaboliske og DA menneskehandel og andre katekolaminer i modne voksne celler kan ændres (revideret i 1). I midthjernen, reducerer antallet af tyrosin hydroxylase immunpositive (TH +, den hastighedsbegrænsende enzym i DA syntese) neuroner stiger derefter efter neurotoksin administration 2,3, mens antallet af TH immunonegative (TH-) neuroner viser den modsatte mønster (dvs. stigninger derefter falder 3). Dette er i overensstemmelse med tab derefter få af "DA fænotype" af nogle celler. Har også vist Antallet af TH + og TH- SNC neuroner til at ændre sig i lige, men modsatte retninger efter forskellige behandlinger, som ændrer den elektriske aktivitet af disse celler 4,5. For eksempel infusion af små konduktans, calcium-aktiverede kalium (SK) kanal antagonist apamin i midthjernen i 2 uger nedsætter antallet af TH + og stiger (med samme beløb) Number af TH- snc neuroner 4,5. I modsætning hertil infusion af SK kanal agonist 1 EBIO forøger antallet af TH + og nedsætter (med samme beløb) antallet af TH- SNC neuroner 4,5. Lignende ændringer blev observeret efter en bred vifte af behandlinger rettet mod SNC neuronal aktivitet, herunder nogle, som målrettet afferente input 4. Denne tilsyneladende regulering af antallet af SNC DArgic neuroner af neuronal aktivitet og afferent input rejser muligheden for, at miljøet eller adfærd kan påvirke antallet af SNC neuroner. Indeed voksne mus udsat for forskellige miljøer har mere eller mindre midthjernen (SNC og VTA) TH + neuroner, og mindst nogle af disse miljø-inducerede ændringer ophæves ved samtidig blokade af synaptisk input i midthjernen 6. Formålet med denne meddelelse er at: (1) give yderligere oplysninger om, hvordan du gennemfører vores miljømæssige manipulationer og lægemiddelinfusioner; og (2) give yderligere oplysninger til støtte vores påstand om, at environment regulerer antallet af midthjernen DA-neuroner via afferent input.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle eksperimentelle forsøg med dyr blev godkendt af Florey Institut for Neurovidenskab og mental sundhed Animal etiske komité og i overensstemmelse med Australiens National Health og Medical Research Council offentliggjorde adfærdskodeks for pasning og anvendelse af dyr til videnskabelige formål (7 udgave, 2004).
1. Miljømæssige Manipulationer
- Køn Parring
- Brug kønsmodne (> 8 uger gamle), alder-matchede han- og hunmus.
BEMÆRK: Vi bruger typisk C57BL / 6 mus, men har haft de samme resultater ved hjælp af schweiziske mus i denne protokol. Vi bruger typisk n = 8 mænd og n = 8 hunner for hvert forsøg, er opdelt i n = 2 han-han par (n = 4 mænd), n = 2 kvinder kvindelige par (n = 4 hunner) og N = 4 mandlige kvindelige par (n = 4 hanner og n = 4 kvinder). - Ved ankomsten i dyret bedriften facilitet, gruppe-house musene køn for> 3 dage at akklimatisere. Her og througHout køn parring, holde stimuli fremmede miljømæssige (f.eks omgivende temperatur, lys: mørke cyklus, mad, vand, håndtering og rengøring) konstant eller distribuere ligeligt til alle mus.
- Tilfældigt tildele hver mus til en han-han par, en hun-hun par, eller en han-hun par. Placer hvert par ind i et rent bur i isolation (2 mus / bur) med ad libitum adgang til mad og vand, og blot huse dem på denne måde kontinuerligt i 7 dage.
BEMÆRK: Rutinemæssig husdyrbrug er OK i denne periode, men skal fordeles ligeligt til alle mus. Sørg for at undgå parring af mandlige og kvindelige søskende.
- Brug kønsmodne (> 8 uger gamle), alder-matchede han- og hunmus.
- Miljøberigelse
- Brug kønsmodne (> 8 uger gamle), alderskategori mandlige eller kvindelige mus.
BEMÆRK: Vi anvender typisk n = 18 mus for hvert forsøg, opdelt i n = 6 / behandlingsgruppe. - Ved ankomsten i dyret bedriften facilitet holde dem gruppe-huse i samme standard opstaldet (SH) (f.eks (f.eks omgivende temperatur, lys: mørke cyklus, mad, vand, håndtering og rengøring) konstant eller distribuere ligeligt til alle mus.
- Til at begynde miljøberigelse, tilfældigt tildele hver mus til en af 3 grupper: SH; løbehjul (RW) eller miljø beriget (EE) og placere hver gruppe af mus sammen i en identisk ren bur med ad libitum adgang til mad og vand.
BEMÆRK: Her, større rotte-bedrift bure til alle grupper, der måler 27 cm bred, 42 cm lang og 16 cm dybe blev anvendt.- Desuden giver følgende forhold til hver gruppe: SH, der kun omfatter kuld (papir piller eller savsmuld) på gulvet; RW omfattende SH plus 2 kørende hjul; EE omfattende RW plus legetøj (reb, stiger, tunneler, og genstande såsom tomme papir håndklæde ruller og stykker silkepapir) med til at explore, leg, klatre, gemme sig, og reden.
- Huset dem på denne måde kontinuerligt i 14 dage.
BEMÆRK: Rutinemæssig husdyrbrug er OK i denne periode, men skal fordeles ligeligt til alle mus.
- Emne EE mus til yderligere "super-berigelse« (SE) ved at placere dem sammen til en større bur indeholder nye legetøj til 1 time / dag (samme time hver dag), 5 dage / uge.
BEMÆRK: Her blev en 46 cm bred, 69 cm lang, og 40 cm dyb plastbøtte anvendes.- Bevar nyhed ved at præsentere et andet sæt af legetøj hver session. Rene legetøj, der skal re-præsenteret for mus med sæbevand og 80% ethanol for at fjerne dufte.
- Efter hver SE session, returnere musene til deres EE bur. Håndtag SH og RW mus det samme som SE-mus (med undtagelse af SE selv) i hele denne periode (fx fjerne og returnere hver SH og RW musen fra og til sit bur).
- Brug kønsmodne (> 8 uger gamle), alderskategori mandlige eller kvindelige mus.
- Forberedelse
- Brug sterile osmotiske pumper og hjerne infusionssæt kits, som er kommercielt tilgængelige. Dagen før implantation, ved hjælp af aseptisk teknik, prime implantaterne ved at fylde hver pumpe, der forbinder rør og kanyle med sterilt lægemiddel eller køretøj opløsning (som beskrevet i vejledningen til pumperne). Forbinde dem sammen og inkuberes i sterilt saltvand natten over ved 37 ° C. Inkuber narkotikarelaterede og køretøjer fyldt implantater separat for at undgå krydskontaminering.
- Surgery.
BEMÆRK: Afhængigt af det land, hvor forsøgslederen er særlige dyreforsøg eller tilladelser kræves for at forfølge sådanne typer af kirurgi og postoperative eksperimenter.- Steriliseres alt kirurgisk udstyr og beskæftiger aseptisk teknik overalt. Bedøver en mus (fx anvendelse 1-2% isofluoran i luft) og placere den i en Stereotaxic headframe. Tjek anæstesidybden hele proceduren og administrere yderligere bedøvelse efter behov (f.eks manglende tilbagetrækning lemmer til skadelig pote knivspids indikerer tilstrækkelig anæstesi). Sikre øjne er beskyttet mod udtørring ved smøremiddel øjensalve, og at musen kropstemperatur forbliver normal hele proceduren.
- Foretag en midtlinjeincision gennem huden startende fra mellem øjnene og efterbehandling 2 cm posteriort for bagkanten af kraniet. Blunt dissekere huden væk fra det underliggende fascia ned bagsiden af musen for at skabe en subkutan lomme stor nok til komfortabelt passer pumpen og forbinde rør, når kanylen er implanteret (studsen ikke bør bøjes efter færdiggørelse). Skrab rydde fascia fra over den dorsale del af kraniet.
- Ved hjælp af en ca. 1,5 mm i diameter dental burr, bore ned i kraniet på et passende stereotaktiske koordinater until et tyndt, fleksibelt lag af knogle tilbage. Skræl dette lag væk med fine pincet (dette undgår at beskadige underliggende dura mater og hjerne med dental burr). Sørg for kraniet renset for eventuelle blod og knoglefragmenter, og at der ikke er yderligere blødning.
- Med kanylen indehaves af en kanyle holder, placere pumpen og forbinde rør i det subkutane "lomme" overliggende musens ryg. Dernæst placere spidsen af kanylen på passende stereotaksiske koordinater og på overfladen af hjernen. Sænk forsigtigt kanylen ind i hjernen, men stoppe ca. 1 mm under den krævede dybde.
BEMÆRK: Den resterende dybde vil blive forhandlet efter påføring af det første lag af dental akryl. - Sikre igen overfladen af kraniet er ren og tør, derefter fremstille en lille mængde af dental akryl og anvende en tandstik til at udjævne det hele eksponerede område af kranium, herunder i Burr hul gennem kraniet omkring the kanyle. Før akryl hærder, sænke kanylespidsen den resterende dybde i målet.
- Forbered anden lille volumen af dental akryl og lag dette over det første, samt over den hvide plastik støtte til kanylen at fastsætte kanylen på plads. Gentag med yderligere lag af acryl som nødvendigt.
- Når akryl er hærdet, forsigtigt fjerne kanylen indehaveren og afbrød hvide plastik aftagelige kanyle fane ved hjælp af en skalpel opvarmet med en butan flamme. Endelig sutur huden lukket over hele implantatet.
- Post-kirurgisk behandling af dyr
- Anvend antiseptisk salve på huden margener og administrere en anti-inflammatorisk til mus (f.eks Meloxicam, 3 mg / kg sc). Fjern musen fra rammen, placere den under en varmelampe, og observere, indtil det kommer til bevidsthed. Må ikke returnere en mus, der har gennemgået operation for at selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
BEMÆRK: Experimental manipulationer som køn parring og miljø berigelse kan påbegyndes eller genoptages dagen efter operationen tidligst. - Overvåge deres kropsvægt, generelle adfærd og udseende dagligt. Behandl tegn på infektion (f.eks hævelse, rødme, pus) omkring kirurgiske snit med aktuelt antiseptisk salve. Behandl alle tegn sygdom, smerte, stress eller ubehag (f.eks tab af> 10% kropsvægt, social tilbagetrækning, manglende pleje, "ryste", bevægelse dysfunktion, kramper) med systemiske analgetika og / eller antibiotika som nødvendigt.
- Aflive mus hvis> 15% vægttab eller symptomer på sygdom, smerte, stress eller ubehag er ikke-nyttiggøres inden for 1 uge afhjælpende behandling.
- Anvend antiseptisk salve på huden margener og administrere en anti-inflammatorisk til mus (f.eks Meloxicam, 3 mg / kg sc). Fjern musen fra rammen, placere den under en varmelampe, og observere, indtil det kommer til bevidsthed. Må ikke returnere en mus, der har gennemgået operation for at selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
3. Brain Tissue Forberedelse, immunhistokemisk Processing, og Stereologi
- Perfusion
- Umiddelbart efter miljø- / narkotika manipulationer, forberede hjernen for at studere.
- Først administrere en overdosis af bedøvelsesmiddel til at dræbe mus (fx 100 mg / kg ip natriumpentobarbiton). Når bedøvet men før hjertet holder op med at slå, lægge musen på ryggen og binde eller pin ned begge forbenene.
- Ved hjælp af en skalpel skåret væk huden overliggende thorax derefter incise gennem musklen lige under brystkassen i bughulen. Placer en klemme på xiphoid proces af brystkassen og løfte brystkassen op og væk fra leveren udsætter membranen.
- Skær gennem membranen og gennem ribbenene sideværts på begge sider ved hjælp af store saks indtil brystkassen kan foldes tilbage over hovedet for at blotlægge lunger og hjerte. Med fin saks lave et lille snit i højre atrium som en udgang for blod og perfunderet løsninger, derefter skæres gennem bunden af den venstre ventricle og placere en kanyle op gennem den venstre ventrikel, venstre atrium, og ind i aorta.
- Spænd kanylen på plads og derefter pumpe varm (37 ° C) hepariniseret og 0,1 M phosphatpufret fysiologisk saltopløsning (PBS) gennem vaskulaturen, indtil opløsningen forlader højre atrium er helt fri for blod. Dernæst pumpe kold (4 ° C) fikseringsopløsning (såsom 4% paraformaldehyd i PBS) gennem vaskulaturen, indtil hele mus er godt fast. Fjern hjerne og sted i PBS med 30% saccharose i 2-3 dage, indtil hjernen dræn.
BEMÆRK: Andre typer af forberedelse væv kan anvendes afhængigt af ekspertise i den tilsvarende laboratorium.
- Umiddelbart efter miljø- / narkotika manipulationer, forberede hjernen for at studere.
- Fremstilling af fritflydende kryosektioner
- Skær serielle snit gennem hjernen regioner af interesse og samle disse i PBS.
BEMÆRK: Vi skærer 40 um tykke sektioner ved hjælp af en kryostat. Andre typer af væv sektionering kan anvendes afhængigt af ekspertise i de tilsvarenng laboratorium.
- Skær serielle snit gennem hjernen regioner af interesse og samle disse i PBS.
- Immunohistokemi
- Udfør standard immunhistokemi for proteiner af interesse. Inkuber sektioner i 5% normalt gedeserum og 0,3% Triton X-100 i PBS ved stuetemperatur i 30 minutter, derefter immunreagerer med polyklonale kanin-anti-TH (1: 400) ved 4 ° C i 48 timer, derefter polyklonalt biotinyleret gede-anti -rabbit (1: 1.000) ved stuetemperatur i 2 timer.
- Dernæst inkuberes i avidin-peroxidase (1: 500) ved stuetemperatur i 1 time, derefter i kobolt- og nikkel-intensiveret diamino-benzidin (0,5 mg / ml) ved stuetemperatur i 18-20 minutter; for den sidste 3-5 min af diamino-benzidin inkubation tilsættes hydrogenperoxid (0,01%) til at katalysere chromagen udfældning. Vask sektioner tre gange i 10 minutter hver i PBS før, efter og mellem hvert af de ovennævnte trin.
- Monter afsnittene om gelatinerede mikroskopobjektglas, luft tørre dem, så Nissl plet (neutral rød), dehydrere i alkohol, klar (X-3B), og dækglas.
- Anslår det samlede antal TH + og TH- Snc (og VTA og LC) neuroner hjælp uvildige stereologiske metoder. Sørg for, at stereologist er blind for den modtagne behandling. Ekskluder glia på grundlag af soma diameter <5 um og tæller kun de celler med en synlig kerne.
- Identificer Snc (og VTA og LC) ved de rumlige placeringer af TH + celler og anatomiske Seværdigheder / grænser i overensstemmelse med hjernen atlas over Paxinos og Watson 7. Tæl TH + celler i en kugleramme (55 x 55 um = 3025 um 2) med regelmæssige forudbestemte intervaller (x = 140 um, y = 140 um for SNC, x = 100 um, y = 100 um for VTA og LC) gennem hver kerne i hver fjerde afsnit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voksne mus udsat for disse miljømæssige manipulationer har ændret antallet af midthjernen (SNC og VTA), men ikke LC, TH + neuroner, og EE plus samtidig midthjernen infusion af enten picrotoxin eller bicucullin (GABA-receptor antagonister) afskaffer EE-induktion mere snc TH + neuroner. Disse data er tidligere udgivet i 6. De foreliggende data blev samlet i replikat eksperimenter udført som en del af den tidligere undersøgelse, men er ikke blevet offentliggjort andre steder.
Specifikt voksne hanmus, der er blevet parret med voksne hunmus har mere TH + SNC og VTA (midthjernen) neuroner end mænd parret med hanner, mens hunner parret med mænd har færre TH + SNC og VTA neuroner end kvinder parret med hunner (Figur 1 i 6). Et andet eksempel på dette er fastsat her i figur 1, som viser middelværdien ± SE antal TH + snc neuroner i han- og hunmus straks following køn parring. Hanner parret med hunner i 7 dage har ca. 12% flere TH + SNC neuroner end mænd parret med mænd (to blå søjler i figur 1). Derimod hunner parret med mænd har ca. 12% færre TH + SNC neuroner end kvinder parret med kvinder (to røde søjler i figur 1).
Antallet af TH + SNC og VTA neuroner øger også i voksne hanmus omfattet EE (figur 2 i 6) og EE-induktion mere SNC TH + neuroner ophæves ved samtidig blokade af midthjernen GABAA-receptorer (figur 3 i 6). Et andet eksempel på dette er fastsat her i figur 2, hvor EE med infusion køretøj resulterede i cirka 14% flere TH + SNC neuroner end SH med infusion køretøj (venstre to kolonner i figur 2). Men EE med GABAA-receptor antagonist infusion (enten 10 uM picrotoxin eller 51 M bicucullin) helt afskaffet denne stigning (højre to kolonner i figur 2). Bemærk, er disse data fra Snc kontralaterale til infusionskanylen, og er næsten identiske med de observerede virkninger i ipsilaterale SNC som blev rapporteret i 6.
Figur 1:. Virkninger af køn parring om antallet af SNC TH + neuroner Umiddelbart efter 7 dages køn parring (protokol 1.1) voksne mus blev perfunderet (3.1), blev deres midthjernen sektioneret (3.2), blev snit behandlet til tyrosinhydroxylase (TH , det hastighedsbegrænsende enzym i DA syntese) immunhistokemi (3.3), og antallet af TH + SNC neuroner blev estimeret ved anvendelse stereologi (3.4). Afbildet her er middelværdien ± SE antal SNC TH + neuroner i hanmus parret med hanmus (n = 4 hanmus fra n = 2 han-han par, lyseblå colUMN), mænd parret med kvinder (n = 6 hanmus fra 6 mænd kvindelige par, mørkeblå kolonne), hunner parret med kvinder (n = 8 hunmus fra n = 4 kvindelige kvindelige par, lyserød kolonne), og hunner parret med mænd (n = 6 hunmus fra n = 6 mand-kvinde par, mørk rød søjle). Parring med det modsatte køn resulterede i en stigning i antallet af SNC TH + neuroner hos mænd, men et fald i antallet af SNC TH + neuroner hos kvinder (p <0,001 Envejs ANOVA; * p <0,05 Tukey parvise multiple sammenligninger).
Figur 2: Virkninger af miljø berigelse med midthjernen GABAA-receptor blokade af antallet af SNC TH + neuroner Umiddelbart efter 14 dages miljø berigelse (protokol 1.2) med samtidig infusion af enten bærer, GABAA-receptorantagonist s.icrotoxin (10 uM) eller GABAA-receptor antagonist bicucullin (5 uM) i den venstre midthjernen (protokol 2) blev voksne hanmus perfunderet (3.1), blev deres midthjernen sektioneret (3.2) blev snit behandlet for tyrosin hydroxylase ( TH, det hastighedsbegrænsende enzym i DA syntese) immunhistokemi (3.3), og antallet af TH + neuroner i den rigtige (kontralaterale) SNC blev estimeret ved anvendelse af stereologi (3.4). Afbildet her er middelværdien ± SE antal snc TH + neuroner i standard huse (SH) hanmus med infusion køretøj (n = 6, lyseblå kolonne), miljø beriget (EE) hanner med infusion køretøj (n = 6, første mørkeblå kolonne), EE hanner med picrotoxin infusion (n = 6, andet mørkeblå kolonne), og EE hanner med bicucullin infusion (n = 6, tredje mørkeblå spalte). EE resulterede i en stigning i antallet af SNC TH + neuroner, men dette blev afskaffet ved infusion af picrotoxin eller bicucullin i kontralaterale midthjernen (p <0,001 Envejs ANOVA; * P <0,001 Tukey parvise multiple sammenligninger).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miljømæssige manipulationer
Motivationen bag udformningen af disse miljømæssige manipulationer (køn parring og miljøberigelse) var at afgøre, om miljøet, og / eller adfærd foranlediget af miljøet, er forbundet med ændringer i antallet af midthjernen DA-neuroner. Fokus var derfor på at levere miljøer og stimulerende adfærd, der er tilbøjelige til at engagere midthjernen DA signalering. Disse omfattede parring med det modsatte køn, og miljøberigelse omfattende adgang til rindende ruller, tove, stiger, tunneler og objekter til at udforske, lege, klatre, gemme sig, og reden. Begge disse miljøer burde fremme belønning motiveret kognitive, emotionelle og motoriske adfærd, som er blevet forbundet med akut stigninger i midthjernen DA neuronal udledning og Da frigivelse (f.eks 8). Vores hypotese var de også forbundet med længere levetid ændringer i midthjernen DA signalering brburde om ved ændringer i antallet af midthjernen DA-neuroner. Her og andre steder 6 er beviser, der fremlægges, at dette er tilfældet.
Vores undersøgelser begyndte at bruge kønnet parring protokol (1.1), fordi det omfatter en kerne primal og væsentlig belønning motiveret adfærd (dvs. samleje). Desuden er reproduktive, pair-bonding, og social adfærd er kendt for at fremkalde analoge ændringer i andre neurokemiske systemer (fx ændringer i tæthed af oxytocin, vasopressin og corticotrophin-releasing hormon-celler i hypothalamus 9). Faktisk efter 7 dages uafbrudt parring med det modsatte køn, viser vi her og andre steder 6, at mænd har cirka 10% mere TH + midthjernen neuroner mens kvinder har ca. 10% færre TH + midthjernen neuroner [Note: Disse virkninger omfatter Snc (denne undersøgelse og 6) og VTA 6, men ikke locus coeruleus 6, hvor TH hjælper syntetisere noradrenalin].Dette støtter den opfattelse, at antallet af midthjernen DA neuroner i den voksne hjerne ikke er fast, men ændringer afhængigt af miljø, adfærd eller miljø / adfærd interaktioner. Andre beviser argumenterer disse ændringer som følge af ændringer i ekspression af TH-genet og protein i bevarede midthjernen neuroner, i modsætning til DA neurogenese eller degeneration. (1) DA neurogenese i den voksne mus midthjernen enten foregår slet ikke 10-14, eller ved hastigheder meget lavere end kan redegøre for tilføjelse af ca. 500 nye snc DA neuroner i en uge 15,16. (2) Undersøgelser kvantificere ændringer i antallet af SNC neuroner efter to uger infusioner af forskellige lægemidler rettet mod den elektriske aktivitet i midthjernen neuroner har konsekvent vist lige (igen ca. 10%), men modsatrettede ændringer TH + og TH- celler, hvilket resulterer i nogen nettoændring i det samlede celleantal 4,5. Dette er i overensstemmelse med reguleringen af TH proteinniveauer over eller under immunhistokemisk theectable niveauer uden addition eller subtraktion af neuroner. (3) Mange undersøgelser har rapporteret aktivitet-afhængige ændringer i TH-gen og protein-ekspression i celler over en tidshorisont på flere timer 17-23, og det samme er blevet rapporteret i midthjernen 4.
Spørgsmålet er derfor, hvad er mekanismerne bag ændringer i ekspression af TH-genet og protein i bevarede midthjernen neuroner. Mulighederne omfatter kønshormoner, der kan ligge til grund både baseline forskelle i antallet af TH + midthjernen neuroner i hanner og hunner, såvel kønsspecifikke ændringer (stigninger i hanner og fald hos kvinder) efter parring rapporteret her og tidligere 6. En anden mulighed er aktivitet-afhængig regulering af TH-ekspression. SNC og VTA neuroner (både DA og ikke-DA) modtager synaptisk input overvejende fra striatum, hypothalamus, nucleus subthalamicus, og frontal cortices 24. I forbindelse med køn parring, disse indgangekunne reguleres ved sensomotoriske adfærd, lugtesansen, feromoner, stress, stofskifte, eller reproduktion. Aktivitet-afhængig regulering af TH-ekspression kunne medieres via calcium- eller neuropeptid signalveje påvirker genet og proteinekspression (f.eks 1).
For at hjælpe skelne mellem sex steroid versus aktivitet-afhængige mekanismer bag virkningerne af køn parring af antallet af midthjernen DA neuroner vi ansat protokollen miljø berigelse (1.2), som bedre kontrol mod den potentielle påvirkning af kønshormoner og måske også andre hormoner ( f.eks feromoner, stress, reproduktion), og for den potentielle indflydelse af afferent drevet neuronal aktivitet. Den relevante faktor her er de forskellige grupper var meget mere ens med hensyn til køn (alle mænd), hormoner, social status og stress. Selvom social status og stress stadig kan variere mellem grupperne (fx en mere dominerende og aggressiv mandi en gruppe), er det usandsynligt dette altid vil være den samme gruppe (fx EE), og virkningerne af EE er nu blevet gentaget flere gange 6. I EE, størrelsen af stigningen i midthjernen TH + neuroner var den samme som i køn parring protokol (sammenlign mænd i figur 1 & 2 foreliggende undersøgelse, og figur 1 og 2 i 6). Endvidere blev EE-inducerede stigning i SNC TH + neuroner induceret af miljøberigelse helt afskaffet ved samtidig blokade af midthjernen GABAA-receptorer (figur 2 denne undersøgelse og figur 3 i 6), som giver ca. 70% af alle afferent input til midthjernen DA neuroner 25. Sammen indikerer disse data afferent drevet neurale aktivitet er mindst lige så potent en indflydelse på antallet af midthjernen DA neuroner hormoner.
Yderligere indsigt i de miljømæssige factors regulerer antallet af midthjernen TH + neuroner kommer fra sammenligning af virkningerne af RW og EE. RW omfatter et godt lært eller banal motorisk aktivitet (kører på hjulene), mens EE omfatter et tilsvarende beløb af en sådan aktivitet, om end af større variation (dvs. diverse legetøj, men uændret gennem de 14 dage), plus løbende eksponering for nye legetøj i SE komponent (1.2.4). Vores tidligere offentliggjorte data 6 afslørede enten ingen eller små stigninger i SNC og VTA TH + neuroner i RW sammenlignet med SH-mus, men meget større stigninger i EE (+ SE) mus. Dette fremhæver sensorisk stimulation, kognition, nyhed og / eller indlæring og hukommelse som mere potente regulatorer af antallet af midthjernen DA neuroner end banale fysisk aktivitet alene.
EE har været brugt i udstrakt grad til at inducere terapeutiske virkninger og forbedre hjernens reparation i forskellige dyremodeller af hjernesygdomme såsom Alzheimers, Huntingtons og Parkinsons sygdom 26. Den nastilling af sådanne miljømæssige manipulationer er, at de varierer meget mellem laboratorier (som gør "standard opstaldede" forhold), men der er centrale aspekter af EE protokoller, der er bemærkelsesværdige og har været tidligere diskuteret 27. EE giver øget miljømæssig nyhed og kompleksitet i forhold til standard boliger, for at øge niveauet af sensorisk stimulation, kognitiv aktivitet og motion. Ved udformningen EE eksperimenter, er man nødt til at overveje etologiske faktorer, herunder de sensoriske og kognitive evner af dyrene og deres instinktive drev. Da mus (og rotter) er nataktive, med ringere visuelle evner til mennesker men fremragende somatosensoriske og olfaktoriske acuities bør objekterne berigelse afspejle de medfødte instinkter og kapacitet forsøgsdyrene. Derfor er det nyhed, form, tekstur og lugten af de objekter, der kan være særligt fremtrædende til mus. Vurderinger af den relative styrke af gnavere 'Motibemærkninger til en række berigelse objekter har ført til anbefalinger om optagelse af tyggetabletter objekter for at give mulighed for at udøve de grundlæggende, arts-typiske adfærd 28,29. Levering af redemateriale anses for at være et grundlæggende element i den berigelse protokol og mus vil instinktivt rive eventuelle genstande af papir eller pap, hvilket giver mulighed for sensorisk, kognitive og motoriske aktiviteter 30,31. Det er også vigtigt, at der i et eksperiment med flere EE bure, svarende nye og komplekse karakter genstande findes, for at minimere variansen i EE-gruppen, og lignende kontrol af miljøparametre bør udøves for SH-gruppe. Ideelt set skal antallet af mus pr bur være den samme mellem EE og SH-grupper (medmindre virkningerne af social gruppe størrelse vil specifikt undersøgt), og ingen "food godbidder" bør anvendes i EE, som enhver kosten forskelle mellem grupperne kunne forvirre tHan fortolkning af virkningerne af den kognitive aktivitet og motion, som EE øger 12. Andre vigtige overvejelser er varigheden af udsættelse for en beriget miljø og den alder, hvor berigelse påbegyndes. Mens differentiel ekspression af gener er blevet vist efter kun 3 timer i et beriget miljø 32, kan det være nødvendigt længere eksponering for strukturelle og funktionelle ændringer at forekomme 33,34. Endvidere kan berigelse-induceret plasticitet forstærkes under postnatal kritiske udviklingsmæssige perioder 35.
Osmotisk pumpe og hjerne infusionskanylen implantater til lægemiddelinfusioner
Den osmotiske pumpe og kanylen implantater er meget effektiv til at levere lægemidler direkte ind i hjernen. Med erfaring, implantatet kirurgi tager ca. 1 time pr mus. Dental akryl alene er tilstrækkelig til at løse kanylen på plads i længere perioder (Bemærk: Vi er gået op til 28 dage i other eksperimenter); Der er ikke behov for yderligere fastgørelse hardware såsom knogleskruer. Det er vigtigt at sikre, at der er masser af slæk i røret, der forbinder pumpen og kanylen for at tillade maksimal hoved og hals fleksion uden at lægge for meget stress på tilslutningerne. Dette er især tilfældet for langfristede infusioner, hvor væksten af bindevæv omkring pumpen kan forankre den på plads og derved reducere fleksibiliteten af implantatet. Hvor det er muligt, mus er også single-opstaldet efter operationen for at forhindre housemates skader implantatet gennem ridser, trække eller bider. Dosen af lægemiddel er i høj grad bestemt af den tilsatte mængde til pumpen. Men i den forbindelse opmærksomheden bør også være opmærksom på pumpens strømningshastighed, den kemiske stabilitet af lægemidlet ved 37 ° C, og hastigheden af diffusion af lægemidlet fra kanylen gennem hjernen. Aktuelt tilgængelige pumper fra vores leverandør kan opretholde infusion i op til 6 uger på en strømningshastighed på 0,15 pi / time; den hurtigeest tilgængelig gennemstrømningshastighed er 10 pi / time men varede kun 1 uge. Længere infusionstider kan opnås ved at udføre yderligere mindre kirurgi for at erstatte udtømte pumper med fuld pumper på bagsiden af forbindelsesrøret (dvs. uden at forstyrre den implanterede kanyle). Den rumlige udstrækning af methylenblåt (1% methylenblåt, MW 320, i 0,9% NaCl) diffusion fra en kanylespids implanteret 0,3 mm over den venstre SNC midtvejs langs dens mediolateral aspekt måltes at strække sig fra den laterale kant af midthjernen bare tværs midterlinjen mediolaterally og hele dorsoventral omfang midthjernen (efter 2 ugers infusion). Dette er meget mere udbredt end en lille kerne som SNC, og udbredelsen af narkotika kan være større (eller mindre) afhængigt af dens MW, kemisk stabilitet, buffering, etc. Faktisk kan man udlede fra de nuværende data (figur 2), som både picrotoxin og bicucullin nåede den kontralaterale SNC i biologisk aktiv Concentrations.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane | Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia | AHN3640 | |
| ALZET Osmotic pump 1002 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004317 | |
| ALZET Brain infusion kit 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004760 | |
| ALZET cannula holder 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0008860 | |
| Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| Vertex Self Curing (dental acrylic powder) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| METACAM (Meloxicam) | Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia | L10100 | |
| Sodium Pentobarbitone | Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia | 571177 | |
| Normal goat serum | chemicon-temecula, CA | S26-Litre | |
| Triton X-100 | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | 1.08603.1000 | |
| Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | AB152 | |
| Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit | Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060 | EO432 | |
| Avidin peroxidase | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | A3151-1mg | |
| Diamino-benzidine | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | D-5637 | |
| Stereo Investigator | MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495 | n/a |
References
- Aumann, T., Horne, M. Activity-dependent regulation of the dopamine phenotype in substantia nigra neurons. Journal of neurochemistry. 121, 497-515 (2012).
- Sauer, H., Oertel, W. H. Progressive degeneration of nigrostriatal dopamine neurons following intrastriatal terminal lesions with 6-hydroxydopamine: a combined retrograde tracing and immunocytochemical study in the rat. Neuroscience. 59, 401-415 (1994).
- Stanic, D., Finkelstein, D. I., Bourke, D. W., Drago, J., Horne, M. K. Timecourse of striatal re-innervation following lesions of dopaminergic SNpc neurons of the rat. The European journal of neuroscience. 18, 1175-1188 (2003).
- Aumann, T. D., et al. Neuronal activity regulates expression of tyrosine hydroxylase in adult mouse substantia nigra pars compacta neurons. Journal of neurochemistry. 116, 646-658 (2011).
- Aumann, T. D., et al. SK channel function regulates the dopamine phenotype of neurons in the substantia nigra pars compacta. Experimental neurology. 213, 419-430 (2008).
- Aumann, T. D., Tomas, D., Horne, M. K. Environmental and behavioral modulation of the number of substantia nigra dopamine neurons in adult mice. Brain and behavior. 3, 617-625 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic Press. (2001).
- Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends in neurosciences. 30, 203-210 (2007).
- Sun, P., Smith, A. S., Lei, K., Liu, Y., Wang, Z. Breaking bonds in male prairie vole: long-term effects on emotional and social behavior, physiology, and neurochemistry. Behavioural brain research. 265, 22-31 (2014).
- Aponso, P. M., Faull, R. L., Connor, B. Increased progenitor cell proliferation and astrogenesis in the partial progressive 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease. Neuroscience. 151, 1142-1153 (2008).
- Frielingsdorf, H., Schwarz, K., Brundin, P., Mohapel, P. No evidence for new dopaminergic neurons in the adult mammalian substantia nigra. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10177-10182 (2004).
- Lie, D. C., et al. The adult substantia nigra contains progenitor cells with neurogenic potential. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6639-6649 (2002).
- Chen, Y., Ai, Y., Slevin, J. R., Maley, B. E., Gash, D. M. Progenitor proliferation in the adult hippocampus and substantia nigra induced by glial cell line-derived neurotrophic factor. Experimental neurology. 196, 87-95 (2005).
- Yoshimi, K., et al. Possibility for neurogenesis in substantia nigra of parkinsonian brain. Ann Neurol. 58, 31-40 (2005).
- Shan, X., et al. Enhanced de novo neurogenesis and dopaminergic neurogenesis in the substantia nigra of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced Parkinson's disease-like mice. Stem Cells. 24, 1280-1287 (2006).
- Zhao, M., et al. Evidence for neurogenesis in the adult mammalian substantia nigra. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7925-7930 (2003).
- Baker, H., Kawano, T., Margolis, F. L., Joh, T. H. Transneuronal regulation of tyrosine hydroxylase expression in olfactory bulb of mouse and rat. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 3, 69-78 (1983).
- Black, I. B., Chikaraishi, D. M., Lewis, E. J. Trans-synaptic increase in RNA coding for tyrosine hydroxylase in a rat sympathetic ganglion. Brain research. 339, 151-153 (1985).
- Zigmond, R. E., Chalazonitis, A., Joh, T. Preganglionic nerve stimulation increases the amount of tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion. Neuroscience letters. 20, 61-65 (1980).
- Biguet, N. F., Rittenhouse, A. R., Mallet, J., Zigmond, R. E. Preganglionic nerve stimulation increases mRNA levels for tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion. Neuroscience letters. 104, 189-194 (1989).
- Richard, F., et al. Modulation of tyrosine hydroxylase gene expression in rat brain and adrenals by exposure to cold. Journal of neuroscience research. 20, 32-37 (1988).
- Schalling, M., Stieg, P. E., Lindquist, C., Goldstein, M., Hokfelt, T. Rapid increase in enzyme and peptide mRNA in sympathetic ganglia after electrical stimulation in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4302-4305 (1989).
- Liaw, J. J., He, J. R., Barraclough, C. A. Temporal changes in tyrosine hydroxylase mRNA levels in A1, A2 and locus ceruleus neurons following electrical stimulation of A1 noradrenergic neurons. Brain research. Molecular brain research. 13, 171-174 (1992).
- Watabe-Uchida, M., Zhu, L., Ogawa, S. K., Vamanrao, A., Uchida, N. Whole-brain mapping of direct inputs to midbrain dopamine neurons. Neuron. 74, 858-873 (2012).
- Tepper, J. M., Lee, C. R. GABAergic control of substantia nigra dopaminergic neurons. Progress in brain research. 160, 189-208 (2007).
- Hannan, A. J. Environmental enrichment and brain repair: harnessing the therapeutic effects of cognitive stimulation and physical activity to enhance experience-dependent plasticity. Neuropathology and applied neurobiology. 40, 13-25 (2014).
- Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).
- Chmiel, D. J., Noonan, M. Preference of laboratory rats for potentially enriching stimulus objects. Laboratory animals. 30, 97-101 (1996).
- Hanmer, L. A., Riddell, P. M., Williams, C. M. Using a runway paradigm to assess the relative strength of rats' motivations for enrichment objects. Behavior research methods. 42, 517-524 (2010).
- Burrows, E. L., McOmish, C. E., Hannan, A. J. Gene-environment interactions and construct validity in preclinical models of psychiatric disorders. Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatry. 35, 1376-1382 (2011).
- Van de Weerd, H. A., Van Loo, P. L. P., Van Zutphen, L. F. M., Koolhaas, J. M., Baumans, V. Strength of preference for nesting material as environmental enrichment for laboratory mice. Applied Animal Behaviour Science. 55, 369-382 (1998).
- Rampon, C., et al. Effects of environmental enrichment on gene expression in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12880-12884 (2000).
- Eckert, M. J., Abraham, W. C. Effects of environmental enrichment exposure on synaptic transmission and plasticity in the hippocampus. Current topics in behavioral neurosciences. 15, 165-187 (2013).
- Sztainberg, Y., Chen, A. An environmental enrichment model for mice. Nature protocols. 5, 1535-1539 (2010).
- Sale, A., Berardi, N., Maffei, L. Environment and brain plasticity: towards an endogenous pharmacotherapy. Physiological reviews. 94, 189-234 (2014).
