Abstract
Cambios duraderos en el cerebro o la "plasticidad cerebral" subyacen a la conducta adaptativa y la reparación cerebral después de una enfermedad o lesión. Por otra parte, las interacciones con el medio ambiente pueden inducir plasticidad cerebral. Cada vez más, la investigación está tratando de identificar qué entornos estimular la plasticidad del cerebro beneficioso para el tratamiento de trastornos del cerebro y del comportamiento. Dos manipulaciones ambientales que se describen aumentar o disminuir el número de immunopositive tirosina hidroxilasa (TH +, la enzima limitante de la velocidad en la dopamina (DA) de síntesis) neuronas en el cerebro medio del ratón adulto. El primero comprende macho emparejamiento y ratones hembra juntos de forma continua durante 1 semana, lo que aumenta TH + neuronas del cerebro medio en aproximadamente 12% en los hombres, pero disminuye TH + neuronas del cerebro medio en aproximadamente un 12% en las mujeres. El segundo comprende los ratones de vivienda de forma continua durante 2 semanas en 'ambientes enriquecidos "(EE) que contienen ruedas corriendo, juguetes, cuerdas, material de nidificación, etc., que increases TH + neuronas del cerebro medio en aproximadamente un 14% en los hombres. Además, un protocolo se describe para infundir simultáneamente fármacos directamente en el cerebro medio durante estas manipulaciones ambientales para ayudar a identificar los mecanismos subyacentes plasticidad cerebral inducida por el medio ambiente. Por ejemplo, EE-inducción de más TH + neuronas del cerebro medio es abolida por el bloqueo simultáneo de entrada sináptica en las neuronas del cerebro medio. En conjunto, estos datos indican que la información sobre el medio ambiente se transmite a través de la entrada sináptica de las neuronas del cerebro medio para activar o desactivar la expresión de los genes 'da'. Por lo tanto, la estimulación ambiental apropiada, o fármaco que se dirige de los mecanismos subyacentes, podría ser útil para el tratamiento de trastornos cerebrales y conductuales asociados con desequilibrios en el cerebro medio DA (por ejemplo, la enfermedad de Parkinson, el déficit de atención e hiperactividad, esquizofrenia y drogadicción).
Introduction
DArgic de señalización por las neuronas en el área ventral tegmental (VTA) y substantia nigra pars compacta (SNc) del mesencéfalo se piensa que es importante para los comportamientos cognitivos, emotivos y de motor de recompensa-motivados. Sin embargo, la señalización DA mesencéfalo demasiado o demasiado poco causa muchos síntomas incapacitantes en una variedad de trastornos neurológicos (por ejemplo, enfermedad de Parkinson, déficit de atención e hiperactividad, esquizofrenia y drogadicción). Las drogas que aumentan o disminuyen DA señalización aliviar estos síntomas, sin embargo, también producen efectos secundarios atribuibles a la señalización desregulada y fuera de objetivo efectos. La eficacia del fármaco también disminuye con el tiempo debido a las respuestas compensatorias del cerebro. Por tanto, el reto es restaurar la señalización de DA del cerebro medio normal de manera más específica y fisiológica, y un enfoque preferido es aumentando o disminuyendo el número de neuronas DA del cerebro medio.
La evidencia ha ido acumulando para sevdécadas va- que la expresión de genes y proteínas implicados en el metabolismo y DA trata y otras catecolaminas en células adultas madura es modificable (revisado en 1). En el mesencéfalo, el número de immunopositive tirosina hidroxilasa (TH +, la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de las neuronas DA) disminuye luego aumenta después de la administración de neurotoxina 2,3, mientras que el número de TH immunonegative (TH) neuronas muestra el patrón opuesto (es decir, aumenta luego disminuye 3). Esto es consistente con la pérdida de entonces ganancia de la 'DA fenotipo' por algunas células. El número de neuronas TH + y TH SNc También se ha demostrado que cambiar en direcciones iguales pero opuestas después de diversos tratamientos que alteran la actividad eléctrica de estas células a 4,5. Por ejemplo, la infusión de la pequeña conductancia, potasio activado por calcio (SK) canal apamina antagonista en cerebro medio durante 2 semanas disminuye el número de TH + y aumenta (en la misma cantidad) la numbre de TH SNc neuronas 4,5. En contraste, la infusión de la SK agonista de canal de 1 EBIO aumenta el número de TH + y disminuye (en la misma cantidad) el número de neuronas TH SNc 4,5. Se observaron cambios similares después de una gran variedad de tratamientos dirigidos actividad neuronal SNc, incluyendo algunos que dirige impulsos aferentes 4. Esta aparente regulación del número de neuronas SNc DArgic por la actividad neuronal aferente de entrada y plantea la posibilidad de que el medio ambiente o el comportamiento pueden influir en el número de neuronas del SNC. De hecho ratones adultos expuestos a diferentes ambientes tienen más o menos cerebro medio (SNc y VTA) TH + neuronas, y al menos algunos de estos cambios inducidos por el medio ambiente se abolido por el bloqueo simultáneo de entrada sináptica en el cerebro medio 6. Los objetivos de esta comunicación son: (1) proporcionar más detalles sobre la forma de aplicar nuestras manipulaciones ambientales e infusiones de drogas; y (2) proporcionar más datos que apoyan nuestra afirmación de que el embiente regula el número de neuronas DA del cerebro medio, a través de los impulsos aferentes.
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Protocol
NOTA: Todos los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el Instituto Florey del Comité de Ética de Salud Animal Neurociencia y Salud Mental y se ajustan a Nacional de Salud de Australia y el Consejo de Investigación Médica publica código de prácticas para el cuidado y uso de animales para fines científicos (7ª edición, 2004).
1. Las manipulaciones ambientales
- El emparejamiento de Género
- Use la madurez sexual (> 8 semanas de edad), hombres de la misma edad y ratones hembras.
NOTA: normalmente utilizamos ratones C57BL / 6, pero hemos tenido los mismos resultados utilizando ratones Swiss en este protocolo. Utilizamos típicamente n = 8 hombres y n = 8 hembras para cada experimento, dividida en n = 2 pares entre varones (n = 4 machos), n = 2 pares hembra-hembra (n = 4 mujeres), y n = 4 parejas hombre-mujer (n = 4 machos y 4 hembras = n). - A su llegada a las instalaciones de confinamiento de los animales, el grupo de la casa los ratones por género para> 3 días para aclimatarse. Aquí y througHout el emparejamiento de género, a mantener los estímulos ambientales extraños (por ejemplo, la temperatura ambiente, la luz: oscuridad ciclo, alimentos, agua, manejo y limpieza) constante o distribuir por igual a todos los ratones.
- Aleatoriamente asignar cada ratón a un par macho-macho, un par hembra-hembra, o un par masculino-femenino. Coloque cada par en una jaula limpia en el aislamiento (2 ratones / jaula) con acceso ad libitum a comida y agua, y simplemente alojarlos en esta manera de forma continua durante 7 días.
NOTA: la cría de animales de rutina está bien durante este periodo, pero se debe distribuir por igual a todos los ratones. Tenga cuidado de evitar el emparejamiento de camada masculinos y femeninos.
- Use la madurez sexual (> 8 semanas de edad), hombres de la misma edad y ratones hembras.
- Enriquecimiento Ambiental
- Utilice (> 8 semanas de edad), hombres o mujeres ratones de la misma edad sexualmente maduros.
NOTA: Por lo general utilizamos n = 18 ratones para cada experimento, divididos en grupo n = 6 / tratamiento. - A su llegada a las instalaciones de confinamiento de los animales ellos mantener encuentra alojada en grupo en la norma idéntica (SH) (por ejemplo, (por ejemplo, la temperatura ambiente, la luz: oscuridad ciclo, alimentos, agua, manejo y limpieza) constante o distribuir por igual a todos los ratones.
- Para comenzar con el enriquecimiento ambiental, asignar aleatoriamente cada ratón a uno de los 3 grupos: SH; rueda de correr (RW), o el medio ambiente enriquecido (EE) y coloque cada grupo de ratones juntos en una jaula limpia idéntica con acceso ad libitum a comida y agua.
NOTA: Aquí, jaulas más grandes de ratas celebración para todos los grupos, que miden 27 cm de ancho, 42 cm de largo y 16 cm de profundidad se utilizaron.- Además, proporcionará las siguientes condiciones ambientales para cada grupo: SH comprende sólo la basura (pellets de papel o serrín) en el suelo; RW comprende SH más 2 ruedas de funcionamiento; EE comprende RW además de juguetes (cuerdas, escaleras, túneles, y objetos como rollos y trozos de papel de seda de toallas de papel vacío) con el que a explore, jugar, trepar, esconderse, y el nido.
- Casa ellos de esta manera de forma continua durante 14 días.
NOTA: la cría de animales de rutina está bien durante este periodo, pero se debe distribuir por igual a todos los ratones.
- Ratones EE Sujeto a 'super-enriquecimiento' adicional (SE) colocándolos juntos en una jaula más grande que contiene nuevos juguetes para 1 hora / día (la misma hora cada día), 5 días / semana.
NOTA: Aquí, se utilizó una tina de plástico 46 cm de ancho, 69 cm de largo y 40 cm de profundidad.- Mantener la novedad al presentar un conjunto diferente de juguetes cada sesión. Limpie los juguetes que se van a volver a ser presentados a los ratones con agua jabonosa y etanol al 80% para eliminar los olores.
- Después de cada sesión de SE, devolver los ratones a su jaula EE. SH Mango y ratones RW igual que los ratones SE (a excepción de SE en sí) a lo largo de este período (por ejemplo, eliminar y volver cada SH y el ratón RW desde y hacia su jaula).
- Utilice (> 8 semanas de edad), hombres o mujeres ratones de la misma edad sexualmente maduros.
- Preparación
- Utilice bombas osmóticas estériles y kits de infusión de cerebro, que están disponibles comercialmente. El día antes de la implantación, utilizando una técnica aséptica, primos los implantes llenando cada bomba, tubo y la cánula de conectar con una solución de fármaco o vehículo estéril (como se describe en las instrucciones suministradas con las bombas). Conectarlos entre sí y se incuba en solución salina estéril durante la noche a 37 ° C. Incubar implantes drogas y vehículos llenos por separado para evitar la contaminación cruzada.
- Cirugía.
NOTA: En función del país del experimentador, se requieren permisos o autorizaciones de experimentación de animales especiales para perseguir ese tipo de cirugía y experimentos postoperatorias.- Esterilizar todo el equipo quirúrgico y emplear una técnica aséptica en todo. Anestesiar el ratón (por ejemplo, utilizando 2.1% isofluorano en el aire) y colocarlo en un estéreocastillete otaxic. Compruebe la profundidad de la anestesia durante todo el procedimiento y administrar más anestésico si es necesario (por ejemplo, ausencia de retirada extremidad para pizca pata nociva es indicativo de una anestesia adecuada). Asegurar los ojos están protegidos de la desecación por pomada ocular lubricante, y que la temperatura corporal del ratón sigue siendo normal durante todo el procedimiento.
- Hacer una incisión en la línea media a través de la piel a partir de entre los ojos y acabado de 2 cm por detrás del borde posterior del cráneo. Blunt diseccionar la piel lejos de la fascia subyacente en la parte posterior del ratón para crear un subcutánea 'bolsillo' lo suficientemente grande como para caber cómodamente la bomba y el tubo de conexión una vez se implanta la cánula (el tubo de conexión no debe estar doblada sobre la terminación). Raspe borrar la fascia de más de la cara dorsal del cráneo.
- El uso de una fresa dental de aproximadamente 1,5 mm de diámetro, profundizar en el cráneo en el estereotáxica apropiado coordina uasta una capa delgada, flexible de restos óseos. Peel esta capa de distancia utilizando unas pinzas finas (esto evita dañar la duramadre subyacente y el cerebro con la fresa dental). Asegúrese de que el cráneo se limpió de cualquier fragmento de sangre y hueso, y no que hay más sangrando.
- Con la cánula en manos de un portador de cánula, coloque la bomba y el tubo de conexión en el 'bolsillo' subcutánea que recubre la parte posterior del ratón. A continuación, la posición de la punta de la cánula en las coordenadas estereotáxicas apropiadas y en la superficie del cerebro. Baje con cuidado la cánula en el cerebro, pero dejar de aproximadamente 1 mm de cortos de la profundidad requerida.
NOTA: La profundidad restante se negoció después de la aplicación de la primera capa de acrílico dental. - Asegúrese de nuevo la superficie del cráneo esté limpia y seca, y luego preparar un pequeño volumen de acrílico dental y usar un palillo de dientes para alisarlo sobre toda el área expuesta de cráneo, incluidos en la rebaba-agujero a través del cráneo alrededor ªe cánula. Antes de que el acrílico se endurece, baje la cánula de punta la profundidad restante en el objetivo.
- Se prepara otro pequeño volumen de acrílico dental y la capa de esto sobre el primero, así como sobre el soporte plástico blanco para la cánula, para fijar la cánula en su lugar. Repita con capas adicionales de acrílico como necesario.
- Una vez que el acrílico ha endurecido, retirar con cuidado el soporte de cánula y cortar el plástico pestaña cánula extraíble blanco con una hoja de bisturí calentado con una llama de butano. Por último, suturar la piel cerrado sobre todo el implante.
- Tratamiento post-quirúrgico de los Animales
- Aplicar ungüento antiséptico a los márgenes de la piel, y administrar un anti-inflamatorio para el ratón (por ejemplo, Meloxicam, 3 mg / kg sc). Retire el ratón desde el marco, colocarla bajo una lámpara de calor, y observar hasta que se recupera la conciencia. No devuelva un ratón que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente.
NOTA: Expmanipulaciones erimental como el emparejamiento entre los géneros y el enriquecimiento medio ambiente se pueden iniciar o reanudar el día después de la cirugía a la mayor brevedad. - Controlar su peso corporal, el comportamiento y el aspecto general diaria. Tratar signos de infección (por ejemplo, hinchazón, enrojecimiento, pus) alrededor de las incisiones quirúrgicas con ungüento antiséptico tópico. Tratar cualquier signos de enfermedad, el dolor, el estrés o malestar (por ejemplo, pérdida de> 10% del peso corporal, el aislamiento social, la falta de preparación, "esponjar", disfunción del movimiento, convulsiones) con analgésicos y / o antibióticos sistémicos como necesario.
- La eutanasia a los ratones si la pérdida de peso> 15% o síntomas de la enfermedad, el dolor, el estrés o malestar no son recuperables dentro de 1 semana de tratamiento curativo.
- Aplicar ungüento antiséptico a los márgenes de la piel, y administrar un anti-inflamatorio para el ratón (por ejemplo, Meloxicam, 3 mg / kg sc). Retire el ratón desde el marco, colocarla bajo una lámpara de calor, y observar hasta que se recupera la conciencia. No devuelva un ratón que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente.
3. Tejido Cerebral Preparación, producción inmunohistoquímica, y Estereología
- Perfusión
- Inmediatamente después de manipulaciones / drogas ambientales, preparar el cerebro para el estudio.
- Primera administrar una sobredosis de anestesia para matar los ratones (por ejemplo, 100 mg / kg ip de sodio pentobarbital). Una vez anestesiado, pero antes de que el corazón deja de latir, poner el ratón sobre su espalda y corbata o precisar ambas extremidades anteriores.
- Usando un escalpelo cortó la piel que recubre el tórax entonces incise a través del músculo justo debajo de la caja torácica en la cavidad abdominal. Coloque una abrazadera en el proceso xifoides de la caja torácica y levantar la caja torácica hacia arriba y lejos del hígado exponer el diafragma.
- Corte a través del diafragma y por medio de las costillas lateralmente en ambos lados con grandes tijeras hasta que la caja torácica se puede plegar hacia atrás la cabeza para exponer los pulmones y el corazón. Con unas tijeras finas hacen una pequeña incisión en la aurícula derecha como un punto de salida para la sangre y soluciones perfundidos, luego se corta a través de la base de la Ventri izquierdaCLE y colocar una cánula a través del ventrículo izquierdo, la aurícula izquierda, y en la aorta.
- Sujetar la cánula en su lugar a continuación, la bomba caliente (37 ° C) heparinización y 0,1 M tampón fosfato salino fisiológico (PBS) a través de la vasculatura hasta que la solución que sale de la aurícula derecha es totalmente libre de sangre. A continuación, la bomba de frío (4 ° C) solución de fijación (tales como 4% de paraformaldehído en PBS) a través de la vasculatura hasta que todo el ratón está bien fijado. Retire el cerebro y el lugar en PBS con 30% de sacarosa durante 2-3 días hasta que los sumideros cerebrales.
NOTA: Otros tipos de preparación de tejidos podrían aplicarse en función de la experiencia en el laboratorio correspondiente.
- Inmediatamente después de manipulaciones / drogas ambientales, preparar el cerebro para el estudio.
- Preparación de criosecciones de flotación libre
- Cortar secciones de serie a través de las regiones cerebrales de interés y recoger estos en PBS.
NOTA: Cortamos 40 micras de espesor secciones usando un criostato. Otros tipos de seccionar los tejidos podrían aplicarse en función de la experiencia en el corresponding de laboratorio.
- Cortar secciones de serie a través de las regiones cerebrales de interés y recoger estos en PBS.
- La inmunohistoquímica
- Realizar inmunohistoquímica estándar para proteínas de interés. Incubar las secciones en 5% de suero normal de cabra y 0.3% de Triton X-100 en PBS a temperatura ambiente durante 30 min, a continuación, inmunorreaccionan con policlonal de conejo anti-TH (1: 400) a 4 ° C durante 48 horas, a continuación, policlonal de cabra anti biotinilado -rabbit (1: 1000) a temperatura ambiente durante 2 hr.
- A continuación, se incuban en avidina-peroxidasa (1: 500) a temperatura ambiente durante 1 hora, a continuación, en cobalto y diamino-bencidina níquel-intensificado (0,5 mg / ml) a temperatura ambiente durante 18-20 min; para el último 3-5 min de la incubación diamino-bencidina añadir peróxido de hidrógeno (0,01%) para catalizar la precipitación cromógeno. Lavar las secciones tres veces durante 10 minutos cada uno en PBS antes de, después de, y entre cada uno de los pasos anteriores.
- Montar las secciones en portaobjetos gelatinizados, aire los seque, luego mancha Nissl (rojo neutro), deshidratar en alcohol, claro (X-3B), y tapar.
- Estimar el número total de neuronas TH + y TH SNc (LC y VTA) y usando métodos estereológicos imparciales. Asegúrese de que el stereologist es ciega al tratamiento recibido. Excluir glia sobre la base de diámetro soma <5 micras y contar sólo aquellas células con un núcleo visible.
- Identificar la SNC (y VTA y LC) por las localizaciones espaciales de células TH + y referencias anatómicas / límites de acuerdo con el atlas del cerebro de Paxinos y Watson 7. Contar + células TH dentro de un marco de cuenta (55 x 55 micras = 3,025 micras 2) a intervalos predeterminados regulares (x = 140 m, y = 140 m para SNc; x = 100 m, y = 100 m para VTA y LC) a través de cada núcleo en cada cuarta sección.
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Representative Results
Los ratones adultos sometidos a estas manipulaciones ambientales han alterado los números de cerebro medio (SNC y VTA), pero no LC, neuronas TH +, y EE más infusión cerebro medio concurrente de ambos picrotoxina o bicuculina (GABA antagonistas del receptor) suprime EE-inducción de más SNc TH + neuronas. Estos datos fueron publicados previamente en 6. Los datos actuales se compilaron en replicar experimentos realizados como parte de ese estudio previo, pero no se han publicado en otros lugares.
En concreto, los ratones machos adultos que se han vinculado con ratones hembras adultas tienen más TH + SNc y VTA (cerebro medio) neuronas que en los hombres emparejados con los varones, mientras que las hembras apareadas con machos tienen menos neuronas TH + SNc y VTA que las hembras apareadas con hembras (Figura 1 en 6). Otro ejemplo de ello es que aquí en la Figura 1, que muestra la media ± SE número de neuronas TH + SNc en ratones machos y hembras inmediatamente fosi- emparejamiento de género. Los machos apareados con hembras durante 7 días tienen aproximadamente un 12% más de neuronas TH + SNc que los machos emparejados con los varones (dos columnas azules en la Figura 1). Por el contrario, las hembras apareadas con machos tienen aproximadamente un 12% menos de TH + SNc neuronas que las hembras apareadas con hembras (dos columnas de color rojo en la Figura 1).
El número de neuronas TH + SNc y VTA también aumenta en ratones macho adulto sujeto a EE (Figura 2 en 6), y EE-inducción de más SNc neuronas TH + es abolida por el bloqueo simultáneo de los receptores GABA A del cerebro medio (Figura 3 en 6). Otro ejemplo de esto se proporciona aquí en la Figura 2, donde EE con infusión de vehículo resultó en aproximadamente 14% más neuronas TH + SNc que SH con la infusión del vehículo (de izquierda dos columnas en la figura 2). Sin embargo, EE con GABA A infusión antagonista del receptor (ya sea 10 picrotoxin M o 51; M bicuculina) completamente abolido este aumento (derecha dos columnas en la Figura 2). Tenga en cuenta, estos datos son de la contralateral SNc a la cánula de infusión, y son casi idénticos a los efectos observados en la SNc ipsilateral que se informaron en 6.
Figura 1:. Efectos de emparejamiento de género sobre el número de SNc TH + neuronas Inmediatamente después de 7 días de emparejamiento de género (protocolo 1.1) ratones adultos fueron perfundidos (3,1), su cerebro medio se seccionó (3.2), las secciones se procesaron para la tirosina hidroxilasa (TH , se estimó que la enzima limitante en la síntesis de DA) inmunohistoquímica (3,3), y el número de neuronas TH + SNc usando estereología (3,4). Traza aquí son la media ± SE número de SNc neuronas TH + en ratones machos emparejados con ratones machos (n = 4 ratones machos a partir de n = 2 pares varón-varón, col azul claroUMN), los machos apareados con hembras (n = 6 ratones machos a partir de pares 6 macho-hembra, columna azul oscuro), hembras apareadas con hembras (n = 8 ratones hembra a partir de n = 4 pares hembra-hembra, columna de color rojo claro), y hembras apareadas con machos (n = 6 ratones hembra de n pares = 6 varones y mujeres, la columna de color rojo oscuro). Vinculación con el sexo opuesto se tradujo en un aumento del número de SNc neuronas TH + en los hombres, pero una disminución en el número de SNc neuronas TH + en las mujeres (p <0,001 ANOVA de una vía; * p <0,05 Tukey de comparaciones múltiples por parejas).
Figura 2: Efectos del enriquecimiento medio ambiente con GABA mesencéfalo un bloqueo del receptor sobre el número de neuronas TH + SNc siguientes Inmediatamente 14 días de enriquecimiento medio ambiente (protocolo 1.2) con la infusión simultánea de cualquiera de los vehículos, el GABA Un antagonista del receptor p.icrotoxin (10 mM), o el GABA A bicuculina antagonista del receptor (5 mM) en el cerebro medio a la izquierda (protocolo 2), se perfundieron los ratones machos adultos (3,1), su cerebro medio se seccionó (3.2), las secciones se procesaron para la tirosina hidroxilasa ( TH, la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de DA) inmunohistoquímica (3,3), y el número de neuronas TH + en la derecha (contralateral) SNc se estimaron utilizando estereología (3,4). Traza aquí son la media ± SE número de SNc neuronas TH + en estándar alojada (SH) ratones machos con la infusión del vehículo (n = 6, columna azul claro), el medio ambiente enriquecido (EE) hombres con la infusión del vehículo (n = 6, primera de color azul oscuro columna), EE varones con infusión picrotoxina (n = 6, segunda columna azul oscuro), y los machos de EA con la infusión bicuculina (n = 6, tercera columna azul oscuro). EE resultó en un incremento en el número de SNc neuronas TH +, pero esto fue abolida por infusión de picrotoxina o bicuculina en el cerebro medio contralateral (p <0,001 ANOVA de una vía; * P <0,001 Tukey de comparaciones múltiples por parejas).
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Discussion
Manipulaciones ambientales
La motivación detrás del diseño de estas manipulaciones ambientales (emparejamiento de género y de enriquecimiento ambiental) fue determinar si el medio ambiente y / o la conducta motivada por el medio ambiente, se asocia con cambios en el número de neuronas DA mesencéfalo. La atención se centró por tanto en proporcionar entornos y estimular comportamientos que son propensos a participar señalización DA mesencéfalo. Estos maridaje incluido con el sexo opuesto, y el enriquecimiento ambiental que comprende el acceso a la ejecución de las ruedas, cuerdas, escaleras, túneles, y objetos para explorar, jugar, trepar, esconderse, y el nido. Ambos de estos ambientes deben fomentar comportamientos cognitivos, emotivos y de motor de recompensa-motivado, que se han asociado con incrementos agudos en la descarga neuronal del cerebro medio DA y la liberación de DA (por ejemplo, 8). Nuestra hipótesis fue que también se asocian con cambios más duraderos en el cerebro medio br señalización DAdebe por cambios en el número de neuronas DA del cerebro medio. Aquí y en otros lugares 6, se presenta evidencia de que este es realmente el caso.
Nuestras investigaciones se iniciaron mediante el protocolo de sincronización de género (1,1), ya que cuenta con un comportamiento primigenio y esencial núcleo recompensa motivados (es decir, la cópula). También,, par de unión reproductiva, y los comportamientos sociales se sabe que inducen cambios análogos en otros sistemas neuroquímicos (por ejemplo, cambios en la densidad de la oxitocina, la vasopresina y las células de la hormona liberadora de corticotropina en el hipotálamo 9). De hecho, después de 7 días de apareamiento continuo con el sexo opuesto, se muestra aquí y en otros lugares 6 que los hombres tienen aproximadamente un 10% más de TH + neuronas del cerebro medio, mientras que las hembras tienen aproximadamente un 10% menos de las neuronas del cerebro medio [Nota TH +: Estos efectos incluyen SNc (presente estudio y 6) VTA y 6, pero no el locus coeruleus 6, donde TH ayuda a sintetizar noradrenalina].Esto apoya la idea de que el número de neuronas DA mesencéfalo en el cerebro adulto no es fijo, sino que cambia en función de las interacciones ambiente, comportamiento, o el medio ambiente / comportamiento. Otra evidencia sostiene estos cambios son provocados por cambios en la expresión del gen TH y proteínas en las neuronas del cerebro medio existentes, a diferencia de la neurogénesis DA o degeneración. (1) DA la neurogénesis en el cerebro medio del ratón adulto se produce o no en absoluto 10-14, o en tasas mucho más bajas que puede dar cuenta de la adición de aproximadamente 500 nuevas neuronas DA SNc en una semana 15,16. (2) Los estudios que cuantifican los cambios en el número de neuronas SNc siguientes 2 semanas infusiones de varios fármacos dirigidos a la actividad eléctrica de las neuronas del cerebro medio han revelado consistentemente iguales (de nuevo aproximadamente un 10%), pero opuestos cambios TH + células TH y, lo que resulta en un cambio neto en el 4,5 número total de células. Esto es coherente con la regulación de los niveles de proteína TH encima o por debajo inmunohistoquímicamente detniveles ectable sin adición o sustracción de las neuronas. (3) Muchos estudios han reportado cambios dependientes de la actividad en el gen TH y expresión de proteínas dentro de las células a través de una escala de tiempo de varias horas 17-23, y el mismo ha sido reportado en el mesencéfalo 4.
Así pues, la pregunta que surge es ¿cuáles son los mecanismos de cambios en la expresión del gen TH y proteínas en las neuronas del cerebro medio existentes subyacentes. Las posibilidades incluyen esteroides sexuales, que pueden ser la base tanto de las diferencias iniciales en número de neuronas TH + del mesencéfalo en hombres y mujeres, como así también cambios específicos de género (aumentos en los machos y disminuye en las mujeres) tras el emparejamiento informó aquí y anteriormente 6. Otra posibilidad es la actividad dependiente de la regulación de la expresión de TH. SNc y VTA neuronas (tanto DA y no-DA) reciben entrada sináptica predominantemente del cuerpo estriado, hipotálamo, núcleo subtalámico, y frontal cortezas 24. En el contexto de emparejamiento de género, estas entradaspodría ser regulada por el comportamiento sensoriomotor, el olfato, feromonas, el estrés, el metabolismo o la reproducción. La regulación dependiente de la actividad de la expresión de TH podría ser mediada a través de señalización de calcio o neuropéptido que afectan a las vías de genes y expresión de la proteína (por ejemplo 1).
Para ayudar a distinguir entre los esteroides sexuales frente a mecanismos dependientes de la actividad subyacentes a los efectos de la vinculación entre los géneros en el número de neuronas DA del cerebro medio que emplean el protocolo de enriquecimiento medio ambiente (1,2), que mejores controles contra la posible influencia de los esteroides sexuales y quizás también otras hormonas ( por ejemplo, las feromonas, estrés, reproducción), y por el potencial de influencia de la actividad neuronal aferente impulsada. El factor relevante aquí es los diferentes grupos eran mucho más similares en términos de género (todos varones), hormonas, estatus social y el estrés. Aunque la condición social y el estrés todavía pueden diferir entre los grupos (por ejemplo, un macho más dominante y agresivoen un grupo), es poco probable que este siempre sería el mismo grupo (por ejemplo, EE), y los efectos de EE ahora se han replicado varias veces 6. En EE, la magnitud del aumento de las neuronas TH + del mesencéfalo era el mismo que en el protocolo de emparejamiento de género (comparar los machos en las Figuras 1 y 2 presente estudio, y las Figuras 1 y 2 en 6). Por otra parte, el aumento inducido por EE-en SNc neuronas TH + inducidos por el enriquecimiento ambiental fue completamente abolida por el bloqueo simultáneo de los receptores de GABA del cerebro medio (Figura 2 presente estudio y la Figura 3 en 6), que proporcionan alrededor del 70% de todos los impulsos aferentes al mesencéfalo DA Neuronas 25. Juntos, estos datos indican la actividad neuronal aferente impulsado es al menos tan potente influencia sobre el número de neuronas DA del cerebro medio como hormonas.
Una mayor comprensión de los impactos ambientales factors regulan el número de neuronas TH + del mesencéfalo proviene de la comparación de los efectos de RW y EE. RW comprende una actividad motora bien aprendida o banal (que se ejecuta en las ruedas), mientras que EE comprende una cantidad similar de tal actividad, aunque de mayor variedad (es decir, varios juguetes, pero sin cambios a lo largo de los 14 días), además de la exposición continua a nuevos juguetes en el componente SE (1.2.4). Nuestros datos previamente publicados 6 revelaron no o pequeños aumentos en las neuronas SNc y VTA TH + RW en comparación con los ratones SH, pero aumenta mucho mayores en EE (+ SE) ratones. Esto pone de relieve la estimulación sensorial, la cognición, la novedad y / o aprendizaje y la memoria como reguladores más potentes de el número de neuronas DA del cerebro medio que la actividad física banal solo.
EE se ha utilizado ampliamente para inducir efectos terapéuticos y mejorar la reparación del cerebro en diversos modelos animales de enfermedades del cerebro, como el Alzheimer, la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Parkinson 26. La natura de tales manipulaciones ambientales es que varían ampliamente entre los laboratorios (al igual que las condiciones 'normales alojados'), sin embargo hay aspectos clave de los protocolos de EA que son dignos de mención y han sido previamente discutidos 27. EE proporciona una mayor novedad y complejidad relativa a la vivienda estándar del medio ambiente, así como para mejorar los niveles de estimulación sensorial, la actividad cognitiva y el ejercicio físico. En el diseño de experimentos EE, es necesario considerar factores etológicos, incluyendo las habilidades sensoriales y cognitivas de los animales y sus impulsos instintivos. Como los ratones (y ratas) son nocturnos, con capacidad visual inferiores a los humanos pero excelente somatosensorial y agudeza olfativa, los objetos de enriquecimiento deben reflejar los instintos innatos y capacidades de los animales de experimentación. Por lo tanto, es la novedad, la forma, la textura y el olor de los objetos que pueden ser particularmente relevante para los ratones. Las evaluaciones de la fuerza relativa de moti roedoresvaciones para una variedad de objetos de enriquecimiento han dado lugar a recomendaciones para la inclusión de objetos masticables para permitir la posibilidad de ejercer, en especies típicas conductas fundamentales 28,29. El suministro de material de nidificación se considera que es un componente fundamental del protocolo de enriquecimiento y ratones instintivamente romper objetos de papel o de cartón, proporcionando así oportunidades para actividades sensoriales, cognitivas y motoras 30,31. Es importante también que en un experimento con varias jaulas de EE, se proporciona la novedad equivalente y la complejidad de los objetos, para minimizar la varianza dentro del grupo de EE, y el control similar de parámetros ambientales debería ser ejercida por el grupo SH. Lo ideal es que el número de ratones por jaula deben ser los mismos entre EE y grupos SH (a menos que los efectos del tamaño de grupo social se están investigando específicamente) y no 'golosinas' deben ser utilizados en EE, como las diferencias en la dieta entre los grupos podría confundir tque la interpretación de los efectos de la actividad cognitiva y el ejercicio físico que mejora EE 12. Otras consideraciones clave son la duración de la exposición a un ambiente enriquecido y la edad en que comienza el enriquecimiento. Mientras que la expresión diferencial de genes se ha demostrado después de sólo 3 horas en un ambiente enriquecido 32, períodos de exposición más largos pueden ser necesarios para cambios estructurales y funcionales que se produzca 33,34. Por otra parte, la plasticidad inducida por el enriquecimiento puede ser mejorada durante períodos críticos de desarrollo postnatal 35.
La bomba de infusión de cerebro y los implantes cánula osmóticos para infusiones de fármacos
La bomba y la cánula implantes osmóticos son muy eficaces para la entrega de fármacos directamente en el cerebro. Con la experiencia, la cirugía de implante dura aproximadamente 1 hora por ratón. Acrílico dental por sí sola es suficiente para fijar la cánula en su lugar por períodos extendidos (Nota: Hemos ido hasta 28 días en Oexperimentos ther); no hay necesidad de hardware adicional de fijación tales como tornillos óseos. Es importante asegurarse de que hay un montón de holgura en el tubo que conecta la bomba y la cánula para permitir la cabeza máxima y la flexión del cuello, sin poner demasiada tensión en las conexiones. Esto es particularmente cierto para las infusiones a largo plazo, donde el crecimiento de tejido conectivo alrededor de la bomba puede anclar en su lugar, reduciendo así la flexibilidad del implante. Siempre que sea posible, los ratones también son alojados individualmente después de la cirugía para prevenir compañeros de casa que dañan el implante a través del rascado, tirar o morder. La dosis de fármaco se determina en gran medida por la cantidad añadida a la bomba. Sin embargo, en esta atención respecto también debe ser pagado a la tasa de flujo de la bomba, la estabilidad química del fármaco a 37 ° C, y la velocidad de difusión del fármaco desde la cánula a través del cerebro. Actualmente bombas disponibles de nuestro proveedor pueden mantener la infusión durante un máximo de 6 semanas a un caudal de 0,15 l / h; el ayunoest disponible-caudal es de 10 l / h, pero dura sólo de 1 semana. Tiempos de infusión más largas pueden ser alcanzados mediante la realización de cirugías menores adicionales para reemplazar las bombas de empobrecido con bombas llenas en la parte posterior del tubo de conexión (es decir, sin perturbar la cánula implantada). La extensión espacial de azul de metileno (1% de azul de metileno, 320 MW, en 0,9% de NaCl) de difusión desde una punta de la cánula implantada 0,3 mm por encima de la mitad de camino SNc la izquierda a lo largo de su aspecto mediolateral se midió para extenderse desde el borde lateral del mesencéfalo sólo a través de la línea media mediolateral, ya lo largo de toda la extensión dorsoventral del cerebro medio (después de 2 semanas de la infusión). Esto es mucho más extendida de lo que un pequeño núcleo como SNc, y la propagación de las drogas puede ser mayor (o menor) en función de su MW, estabilidad química, tampón, etc. De hecho, se puede inferir de los datos actuales (Figura 2) que tanto picrotoxina y bicuculina llegaron a la contralateral SNc en concentrati biológicamente activaons.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane | Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia | AHN3640 | |
| ALZET Osmotic pump 1002 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004317 | |
| ALZET Brain infusion kit 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004760 | |
| ALZET cannula holder 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0008860 | |
| Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| Vertex Self Curing (dental acrylic powder) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| METACAM (Meloxicam) | Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia | L10100 | |
| Sodium Pentobarbitone | Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia | 571177 | |
| Normal goat serum | chemicon-temecula, CA | S26-Litre | |
| Triton X-100 | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | 1.08603.1000 | |
| Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | AB152 | |
| Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit | Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060 | EO432 | |
| Avidin peroxidase | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | A3151-1mg | |
| Diamino-benzidine | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | D-5637 | |
| Stereo Investigator | MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495 | n/a |
References
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