Summary
البروتوكولات تصف اثنين في المختبر نظم اختبار السمية التنموية (UKK وUKN1) بناء على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والدراسات Transcriptome على. نظم اختبار التنبؤ البشري الخطر سمية التنموي، ويمكن أن تسهم في الحد من الدراسات على الحيوانات والتكاليف والوقت اللازم لاختبار السلامة الكيميائية.
Abstract
بروتوكولات فعالة للتمييز الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان إلى الأنسجة المختلفة في تركيبة مع فتحت التقنيات -omics آفاقا جديدة للفي التجارب المختبرية سمية الأدوية المحتملة. لتوفير أساس علمي متين لمثل هذه المقايسات، سيكون من المهم للحصول على معلومات كمية عن دوام التنمية وعلى الآليات التنظيمية الأساسية التي كتبها نهج بيولوجيا النظم. وهكذا تم ضبطها تحليلين هنا لهذه المتطلبات. في نظام اختبار UKK، وترك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) (أو الخلايا المحفزة الأخرى) للتمييز بشكل عفوي لمدة 14 يوما في الهيئات مضغي، للسماح توليد خلايا جميع الطبقات الجرثومية الثلاث. هذا النظام يلخص الخطوات الرئيسية في وقت مبكر من التطور الجنيني الإنسان، وأنه يمكن التنبؤ محددة البشري المبكر الجنينية / السمية المسخية، إذا تعرض الخلايا للمواد الكيميائية خلال التمايز. ويستند نظام اختبار UKN1 على HESC التفريق إلى populatأيون من الأديم الظاهر العصبي السلف (NEP) الخلايا لمدة 6 أيام. هذا النظام يلخص التطور العصبي في وقت مبكر ويتوقع العصابي المبكرة والتغييرات جينية الناجمة عن المواد الكيميائية. كلا النظامين، إلى جانب دراسات Transcriptome على ميكروأري، هي مناسبة لتحديد المؤشرات الحيوية سمية. وعلاوة على ذلك، فإنها يمكن أن تستخدم في تركيبة لتوليد إدخال البيانات لتحليل النظم البيولوجية. هذه النظم اختبار لديهم المزايا على دراسات السمية التقليدية التي تتطلب كميات كبيرة من الحيوانات. أنظمة الاختبار يمكن أن تسهم في الحد من تكاليف تطوير الأدوية وتقييم السلامة الكيميائية. الجمع بينهما يلقي الضوء بشكل خاص على المركبات التي يمكن أن تؤثر على النمو العصبي على وجه التحديد.
Introduction
قدرة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) على التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا فتحت عهدا جديدا في المختبر سمية الاختبار 1، والنمذجة المرض والطب التجديدي 2. وهبوا الخلايا الجذعية لديها القدرة على تكرار الذات، للحفاظ على دولتهم المحفزة، وعلى التمايز إلى خلايا متخصصة 3،4. خصائص HESC (القدرة على التفريق لجميع أنواع الخلايا الرئيسية) توجد أيضا في الخلايا المحفزة البشرية الأخرى الجذعية، مثل الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (hiPSC) أو الخلايا المولدة عن طريق التحويل النووي 5. على سبيل المثال، تم التفريق بين العديد من خطوط HESC مختلفة في الخلايا العصبية 6، 7 خلايا الكلى، وخلايا قمة العصبية 8، 12/09 العضلية، أو خلايا الكبد مثل الخلايا 13،14. وعلاوة على ذلك، يمكن HESC التفريق بصورة عفوية إلى خلايا كل الطبقات الجرثومية الثلاث 15-18 في الهيئات مضغي (EBS) 19،20. Eوينظم التطور الجنيني آرلي التي كتبها التعبير التفاضلية من الجينات المختلفة المتعلقة الطبقات الجرثومية المختلفة التي تم القاء القبض على مستوى مرنا من قبل transcriptomics باستخدام تكنولوجيا متطورة 15. وأسفرت هذه الجهود في إنشاء نماذج السمية أعضاء معينة على أساس HESC / hiPSC وتحليل transcriptomics (للمراجعة نرى 21،22). هذه النماذج لها مزايا أكثر من الاستخدام التقليدي للحيوانات المختبر لإجراء دراسات السمية، والدراسات قبل السريرية باستخدام الحيوانات المختبرية ليست دائما التنبؤية لسلامة الإنسان. والسميات المخدرات التي يسببها التي واجهتها في المرضى غالبا ما ترتبط عمليات الأيض أو الإشارات التي تختلف بين البشر وحيوانات التجارب. الفرق الأنواع قد حال دون الكشف موثوق في وقت مبكر من سمية النمو في البشر، والمخدرات سبيل المثال مثل الثاليدومايد 23،24 و 25،26 ثنائي إيثيل ستيلبوستيرول تم سحبها من السوق بسبب المسخية. ثاليلم يظهر domide أي سمية التنموية في الجرذان أو الفئران. أسفرت المواد الكيميائية البيئية مثل ميثيل الزئبق 27 في سمية النمو قبل الولادة مع الاحترام للجهاز العصبي في مختلف الأنواع، ولكن كانت مظاهر الإنسان من الصعب أن نموذج في الحيوانات. لمعالجة هذه المشكلة من القضايا خصوصية الأنواع، والعلماء الذين يعملون في إطار مشاريع مختلفة تعتمد على الخلايا الجذعية مثل ReProTect، ESNATS، DETECTIVE الخ منخرطون في تطوير نماذج مختلفة لسمية الجنينية، العصبية، عضلة القلب، الكبد وسمية كلوية استخدام المواد السامة الإنسان يشتبه في تؤثر على البشر. في إطار مشروع اتحاد الأوروبي 'الجنينية رواية استراتيجيات البديلة اختبار على الخلايا الجذعية (ESNATS)' وقد أنشئت خمسة أنظمة الاختبار. نظام واحد اختبار ما يسمى UKK (U niversitäts ك linikum K أعفرن) نظام اختبار يلتقط جزئيا في وقت مبكر التطور الجنيني الإنسان. في هذا يالييتم التمييز ystem خلايا H9 الجنينية البشرية في ثلاث طبقات جرثومية (أدمة، الأديم والأديم المتوسط) قد تم القبض على 15 والطبقة الجرثومية التوقيعات محددة transcriptomics ملف باستخدام منصة ميكروأري Affymetrix. وقد تم اختبار المواد السامة التنموية المختلفة مثل الثاليدومايد 28، حمض فالبرويك، ميثيل الزئبق 16،17، أو السيتوزين الأرابينوزيد 15 في هذا النظام، ولقد تم الحصول على مادة سامة محددة التوقيعات الجينات. في نظام الاختبار الثاني، ما يسمى (niversity U من K onsta ن ض) UKN1 نظام اختبار 1، تتمايز خلايا H9 إلى خلايا الأديم الظاهر العصبي السلف (NEP) لمدة 6 أيام. ويتضح ذلك من خلال التعبير عال من علامات الجينات العصبية مثل PAX6 وOTX2. وخلال التمايز لمدة 6 أيام، تعرضوا الخلايا السياسة الاقتصادية الجديدة لالتنموية العصبية المواد السامة مثل VPA، ميثيل الزئبق. كانت ملامح سمية محددة التنظيم دي transcriptomics obtaiنيد وكذلك باستخدام ميكروأري منصة Affymetrix 16،29.
رؤية جديدة لعلم السموم من القرن 21 تتوخى أن نظم اختبار لم تسفر ليس فقط الوصف المظهري مثل أمراض الأنسجة في الجسم الحي، أو التغييرات Transcriptome على في نهاية حضانات سمية على المدى الطويل. وتقترح بدلا من أن توفر فحوصات المعلومات الآلية 3، وأن هذه المعلومات يمكن تعيينها إلى ما يسمى مسارات النتيجة السلبية (اوب) التي توفر المبرر العلمي لآثار خطرة 30. لتوفير مثل هذه المعلومات، وأنظمة الاختبار يطبق يجب أن تكون عالية الجودة للرقابة 31، وعلى سبيل المثال التي وثقتها إجراءات التشغيل القياسية قوية. وعلاوة على ذلك، تحتاج ليتم تعيينها مع ارتفاع القرار التغيرات المعتمدة على الزمن. وهذا يتطلب أنظمة الاختبار مع التغيرات متزامنة 32. وقد تم تحسين أنظمة الاختبار UKN1 وUKK هو موضح هنا لهذه المتطلبات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ بروتوكول التالية باستخدام الجنينية البشرية خط الخلايا الجذعية (HESC) H9. وكان هذا الخط الخلية بشكل روتيني مثقف على الماوس المعطل ميتوتيكلي الخلايا الليفية الجنينية (MEFS) في وسائل الإعلام ثقافة HESC تستكمل مع bFGF ثم مثقف في وسائل الإعلام الخلايا الجذعية في 6 سم لوحات بيتري المغلفة مع مصفوفة الغشاء القاعدي مثل matrigel، للتخلص من MEFS. واستخدمت الخلايا H9 من> 80٪ لوحات متموجة لمزيد من المرور. استخدمت خلايا H9 مثقف على لوحات مصفوفة الغشاء القاعدي لتشكيل EBS. وقد تم تنفيذ كافة الإجراءات المذكورة في البروتوكول التالي باستخدام أساليب موحدة لممارسات زراعة الخلايا العقيم وجيدة.
الجزء 1. نظام اختبار UKK
1. الجنينية البشرية التثقيف الخلايا الجذعية
- تقسيم وصيانة H9 على الخلايا المغذية
- ماصة 2 مل 0.1٪ الجيلاتين في كل سم وحة 6 واحتضان لمدة 30 دقيقة في زراعة الخلايا incubator (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2). نضح حل الجيلاتين مع ماصة باستور معقمة.
- إضافة 2 مل المتوسطة MEF تحتوي على 0.1 × 10 6 MEF خلية / مل في الجيلاتين المغلفة اثنين من لوحات واحتضان لهم في حاضنة الثقافة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) O / N.
- في اليوم التالي، وإزالة الخلايا H9 قنينة من السائل خزان النيتروجين باستخدام ملقط وذوبان الجليد القارورة في 37 ° C حمام الماء باستخدام ملقط طويلة.
- إزالة قارورة من الحمام المائي، وحمام مع الايثانول 70٪، والهواء الجاف في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية لمدة 15 إلى 30 ثانية ونقل الخلايا إلى 15 مل الصقر الأنبوب.
- إضافة 9 مل من H9 مستنبت ببطء على الجدار الداخلي وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح طاف واعادة تعليق الخلايا في 6 مل الثقافة المتوسطة التي تحتوي على ROCK المانع (10 ميكرومتر، Y27632) وماصة بلطف لمزج. نضح MEF المتوسطة من 6 سم لوحة وإضافة 3 مل تعليق خلية في كل لوحة. تغيير المتوسطة على دعبد المنعم يوسف 3 وبعد ذلك كل يوم. ثقافة فرعية> 80٪ خلايا لوحة متموجة مع نسبة الانقسام 1: 3.
ملاحظة: عادة في 5-7 أيام يصبح لوحة متموجة. ويتم الحصول على مغذيات تستخدم من CF1 الفئران الجنين والمعطل عن التعرض للإشعاع γ.
- زراعة الخلية H9 على لوحات الطابق السفلي مصفوفة غشاء المغلفة
- ذوبان الجليد المتوسطة الخلايا الجذعية (5X) ملحق في RT وإضافة 100 مل إلى 400 مل المتوسطة القاعدية في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
- ذوبان الجليد مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد. إضافة حجم اقترح مصفوفة الغشاء القاعدي (راجع شهادة تحليل لكل دفعة) في 24 مل برود DMEM / F-12 متوسطة القاعدية لمدة اثني عشر 6 سم لوحات. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
- إضافة 2 مل في كل 6 سم لوحة. الحفاظ على لوحة في RT لمدة 1 ساعة. إزالة المتوسطة وإضافة 2 مل من المتوسط الخلايا الجذعية.
- إخراج أربع لوحات H9 متكدسة على MEFS. إزالة المستعمرات متباينة مع 1 مل ماصة تحت stereomicroscope أبقى في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
- نضحعلى المدى المتوسط وغسل الخلايا مع 4 مل PBS وإضافة 2 مل الجذعية المتوسطة خلية في كل لوحة. قطع المستعمرات غير متمايزة مع 26 G إبرة في ل6-9 قطع لكل منهما.
- بلطف جمع الخلايا في 50 مل أنبوب الصقر. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح طاف واعادة تعليق في 12 مل الجذعية المتوسطة الخلية. عد كتل عن طريق وضع 20 ميكرولتر على شريحة زجاجية تحت المجهر وضبط مستوى الصوت ل 150 كتل لكل مل. إضافة 2 مل من تعليق في كل 6 سم لوحة.
- نقل لوحات ذهابا وإيابا، وجنبا إلى جنب الاقتراحات لتوزيع أجمة موحد واحتضان لوحات في حاضنة الثقافة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2).
- إزالة المستعمرات متباينة، وإعطاء تغيير المتوسطة كل يوم بديل.
2. الهيئات مضغي (EBS) تشكيل
أداء جميع الإجراءات المذكورة أدناه وفقا الاحتياطات العقيم ومجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
- اليوم 0 & #8212؛ طلي من الخلايا H9 على لوحات أسفل V
- إعداد 5٪ كتلة من البوليمرات مثل Pluronic F 127 في برنامج تلفزيوني وتصفية من خلال فراغ مدفوعة نظام الترشيح باستخدام 0.22 ميكرون تصفية العقيمة.
- معطف V أسفل 96 لوحات جيدا مع 40 ميكرولتر من 5٪ كتلة كوبوليمر لكل بئر واحتضان في RT لمدة 45 دقيقة.
- إزالة متموجة الطابق السفلي لوحات مصفوفة الغشاء مع خلايا H9 من الحاضنة وإزالة المستعمرات متباينة مع 1 مل ماصة تحت stereomicroscope في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
- نضح المتوسطة وغسل الخلايا مع 4 مل PBS. إضافة 2 مل عشوائي المتوسطة التمايز (H9 مستنبت دون bFGF، RD المتوسطة) في كل لوحة. استخدام أداة مرور وقطع المستعمرات الخلية H9 في كتل من حجم موحد وشكل من خلال مراقبة تحت stereomicroscope في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية ثم كشط بلطف مع مكشطة الخلية.
- جمع كتل في 50 مل الصقر الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف واعادة تعليق سللتر في RD المتوسطة للحصول على كتل 1000 لكل مل.
- نضح كوبوليمر كتلة من لوحات أسفل V. صب كتل في العقيمة لوحة مربعة وبمساعدة من الأقنية ماصة إضافة 100 ميكرولتر من التعليق على كل جانب من V أسفل اللوحة.
- لتجميع قوة من كتل، الطرد المركزي لوحات أسفل V عند 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 400 ز س. احتضان لوحات في حاضنة الثقافة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لمدة أربعة أيام.
- اليوم 4 - مجموعة من EBS
- جمع EBS في لوحة مربعة معقمة من لوحات أسفل V باستخدام ماصة الأقنية واسعة تحمل 200 نصائح ميكرولتر.
- جمع EBS من معقمة لوحة مربعة في 15 مل الصقر أنبوب مع 10 مل العقيمة ماصة المصلية. السماح EBS ليستقر لمدة 2 دقيقة. نضح طاف ويغسل EBS مع 5 مل PBS.
- السماح EBS ليستقر لمدة 2 دقيقة ونضح طاف. إعادة تعليق EBS في 5 مل RD المتوسطة.
- ماصة من 10 مل المتوسطة RD في 10 سملوحات الجرثومية. نقل EBS في 10 سم لوحات الجرثومية.
- احتضان لوحات الجرثومية على شاكر الأفقي (المعاملة بالمثل حركة 50 / دقيقة) يوضع في حاضنة الثقافة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لفترة زمنية المطلوبة. إعطاء تغيير المتوسطة (15 مل RD المتوسطة) كل يوم بديل.
ملاحظة: مطلوب التداول برفق بينما زراعة hESCs. حجم EBS يختلف في يوم 4. حدد EBS حجم موحدة (± 20٪) من خلال مراقبة تحت stereomicroscope لمزيد من التجربة. ما يقرب من 50٪ EBS شكلت مع هذه الطريقة هي موحدة في الحجم. نقل EBS على النتائج شاكر في شكل موحد.
3. السمسة الفحص لIC 10 تقدير
- نقل EBS على لوحات أسفل البصرية
- ذوبان الجليد 0.1٪ الجيلاتين في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ومعطف أسفل لوحات بصرية مع 50 ميكرولتر من الجيلاتين 0.1٪ لكل بئر باستخدام ماصة الأقنية. احتضان لوحات في RT ل45 دقيقة. بعد مرور فترة الحضانة نضح الجيلاتين من أسفل لوحات بصرية.
- اخراج EBS جمعها في يوم 4 في 10 سم لوحة الجرثومية التي تحتوي على RD المتوسطة.
- الحفاظ على لوحات أسفل البصرية في موقف يميل في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. نقل اثنين من حجم موحد من EBS في 100 ميكرولتر المتوسطة RD لكل بئر في الضوئية أسفل 96 لوحة جيدا من خلال مراقبة تحت stereomicroscope. إبقاء العمود ال 12 فارغة.
- احتضان لوحات في حاضنة الثقافة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لمدة 24 ساعة.
- التعرض للمخدرات من يوم 5 إلى 14 يوما
- تزن مجمع الاختبار وجعل أعلى تركيز في المذيبات المعروفة.
- أداء التخفيف نصف لوغاريتمي من مجمع الاختبار بشكل متسلسل حتى 8 التخفيفات في المذيبات التي تحتوي على أنابيب الصقر مرقمة مع A إلى H، وحافظ على أنبوب لا. I كما السيطرة على السيارة، أنبوب لا. J كما سيطرة سلبية (RD المتوسطة) وأنبوب لا. K كما إيجابي (70٪ من الإيثانول) السيطرة.
- ذوبان الجليد وسيلة RD في حمام مائي عند 37° C لمدة 15 دقيقة. إخراج 5 مل RD المتوسطة في كل من 11 أنابيب الصقر العقيمة المسمى 1-11.
- نقل 5 ميكرولتر من محلول من أنبوب A إلى أنبوب K في لأنبوب 1-11 على التوالي، ودوامة الأنابيب. تأخذ بها لوحة أسفل البصرية من الحاضنة وإزالة بعناية وسائل الإعلام مع استخدام ماصة الأقنية.
- إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام من أنبوب رقم 1-11 في الأعمدة كل من أسفل اللوحة الضوئية. إعطاء تغيير المتوسطة / المخدرات كل يوم بديل.
ملاحظة: للحصول على التخفيفات نصف لوغاريتمي تأخذ 6.48 ميكرولتر المذيبات في 7 أنابيب وصفت من 2 إلى 8. من أعلى أنبوب نقل تركيز NO.1 3 ميكرولتر إلى أنبوب NO.2، دوامة ومتسلسل نقل 3 ميكرولتر إلى أنبوب المقبل. الحفاظ على أنبوب NO.9 للسيطرة على السيارة وأنبوب NO.10 للسيطرة سلبية. أنبوب NO.11 70٪ من الإيثانول.
- يوم 14: التعرض ريسازورين ومضان قياس
- ذوبان الجليد المتوسطة RD في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تنفيذ كافة الإجراءات mentioن أدناه في غياب الضوء في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
- يستغرق 10 مل RD المتوسط في أنبوب 15 مل (A) وإضافة حجم الموصى بها من ريسازورين كاشف ومزيج من قبل pipetting. تأخذ بها لوحة أسفل البصرية من الحاضنة وإزالة بعناية جميع المتوسطة مع ماصة الأقنية.
- إضافة 100 ميكرولتر من المتوسطة من أنبوب A في كل بئر. احتضان لوحة في ثقافة الخلية الحاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لمدة 90 دقيقة.
- قياس مضان باستخدام مقياس الطيف الضوئي (560 تحويلة / 590 م).
- IC تحديد قيمة 10
- استيراد القيم في الرسم البياني لوحة المنشور بعد طرح القيم فارغة. مجموعة محور س كجرعة والعمودي باعتبارها وحدات مضان.
- تطبيع القيم إلى الحصول على النسبة المئوية على محور y و تحويل القيم (المحور السيني كما سجل مقياس). حساب IC 50 القيمة باستخدام الاستجابة للجرعة السيني (منحدر متغير) معلمة. حساب تسجيل IC 10 القيم باستخدام التاليةالمعادلة:
F = 10 logEC 50 = logECF - (1 / HillSlope) * سجل (F / (100-F))
Y = أسفل + (أعلى أسفل) / (1 + 10 ^ ((LogEC 50 -X) * HillSlope)) - الواجب اتخاذها تحديد القيم IC 10 لمزيد من الدراسات.
4. العلامات البيولوجية دراسة بناء على ميكروأرس
- اليوم 0 إلى يوم 5:
- تشكيل هيئة مضغي ونقل إلى 10 سم لوحات الجرثومية - اتبع الخطوات المذكورة في النقطة 2 لتشكيل هيئة مضغي.
ملاحظة: استخدام ثلاث مكررات البيولوجية لكل دراسة. تقسيم كل تكرار الدخول إلى قسمين البيولوجية - العلاج من تعاطي المخدرات في IC 10 التركيز والسيطرة على السيارة. إعداد تركيز الدواء 10000 أضعاف أعلى تركيز IC 10 في السيارة وهذا من إضافة 10 ميكرولتر إلى 100 مل RD المتوسطة مع كتل الخلايا H9 في 50 مل أنبوب إيبندورف تخلط جيدا والبذور على لوحات أسفل V. اتبع نفس الإجراء لمجموعة السيطرة على السيارة.
<li> بالنسبة إلى التعرض للمخدرات في يوم 5-14، وجمع EB's ونقلها في 10 سم لوحات الجرثومية في يوم 4 حسب الخطوات المذكورة في النقطة 2. نقل لوحات على شاكر الأفقي (المعاملة بالمثل حركة 50 / دقيقة) في حاضنة الثقافة الخلية (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لمدة 14 يوما. إعطاء تغيير المتوسطة كل يوم بديل. - تشكيل هيئة مضغي ونقل إلى 10 سم لوحات الجرثومية - اتبع الخطوات المذكورة في النقطة 2 لتشكيل هيئة مضغي.
- لجمع العينات، في يوم 14، وجمع EBS من 10 سم لوحات في ل15 مل الصقر أنبوب مع ماصة المصلية العقيمة. السماح EBS ليستقر لمدة 2 دقيقة. نضح طاف ويغسل EBS مع 5 مل PBS. السماح EBS ليستقر لمدة 2 دقيقة ونضح طاف. إعادة تعليق EBS في 1 مل من محلول RNAlater أو TRIzol الكاشف، دوامة وتخزين العينة عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
ملاحظة: تنفيذ جميع الإجراءات في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية حسب الممارسات المخبرية الجيدة. تدوير لوحات في حركة دائرية حول مركز لجمع كل EBS في المركز، ونضح المتوسط من المحيط بمساعدة العقيمة pastu الزجاجإعادة ماصة، إضافة 15 مل RD المتوسطة ثم إضافة 15 ميكرولتر من المخدرات / سيلة لمجموعة منها.
5. عزل الحمض النووي الريبي واختبار النزاهة
- RNA العزلة:
معظم الخطوات المذكورة أدناه هي التي يتعين القيام بها لتنقية الحمض النووي الريبي باستخدام RNeasy البسيطة عدة وفقا لدليل التعليمات. دائما استخدام أنابيب حرة نوكلياز، نصائح ماصة والماء. بينما كان يعمل مع TRIzol تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء السلامة الكيميائية وارتداء النظارات الواقية وكذلك القفازات الواقية الكيميائية.- ذوبان الجليد العينات على الجليد. إذا تم تخزين العينات في حل RNAlater، أنابيب الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل طاف وإضافة 1 مل TRIzol كاشف.
- يسحن العينات باستخدام إبرة 24 G و 1 مل حقنة. ما يقرب من 15 مرة سحن كافية لتعطيل EBS، جدار الخلية والأغشية البلازما.
- إضافة 200 ميكرولتر من كلوروفورم في كل عينة. دوامة لخلط محتويات موحد. نبذفي 12000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة الأعمدة تدور RNeasy مصغرة، 1.5 مل الأنابيب ووصفها بشكل صحيح.
- جمع طاف في أنابيب 1.5 مل (في حين جمع طاف لا تخل منتصف أو الطبقة السفلية). إضافة حجم مساو من المبرد 70٪ من الإيثانول. خلط المحتويات عن طريق الهز لطيف.
- تطبيق 700 ميكرولتر من الأنابيب إلى أعمدة تدور مصغرة منها وأجهزة الطرد المركزي لهم في 12000 x ج لمدة 20 ثانية في RT. تنفيذ كافة خطوات إضافية في RT.
- تجاهل الترشيح وتطبيق حل المتبقية إلى الأعمدة المعنية وأجهزة الطرد المركزي لهم في 12000 x ج لمدة 20 ثانية. تجاهل الترشيح.
- تطبيق 350 ميكرولتر من العازلة RW1 إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي لهم في 12000 x ج لمدة 20 ثانية. تجاهل الترشيح وتطبيق 10 ميكرولتر من الدناز و 70 ميكرولتر RDD العازلة إلى العمود.
- في احتضان RT لمدة 15 دقيقة. تطبيق 350 ميكرولتر من العازلة RW1 إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي لهم في 12000 x ج لمدة 20 ثانية. تجاهل الترشيح. تطبيق 500 ميكرولتر منRPE الاحتياطي اغسل إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي لهم في 12000 x ج لمدة 20 ثانية. تجاهل الترشيح. تطبيق جديد 500 ميكرولتر من غسل العازلة RPE إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي لهم في 12000 x ج لمدة 2 دقيقة. تجاهل الترشيح.
- تحويل الأعمدة الجديدة 2 مل أنابيب جمع وأجهزة الطرد المركزي لهم في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة. نقل الأعمدة إلى المسمى أنبوب 1.5 مل جمع وتطبيق 22 ميكرولتر من المياه المجانية نوكلياز. أنابيب الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة.
- إزالة أنبوب جمع ووضعها على الجليد. تحديد الحمض النووي الريبي باستخدام نظام الكهربائي الآلي.
- تركيز الحمض النووي الريبي، والنقاء واختبار النزاهة.
لنقاء RNA وسلامة اختبار استخدام النظام الآلي الكهربائي وعدة منها 33.
6. دراسات ميكروأري
- أداء النسخي باستخدام التجارية المتاحة رقائق مجموعة الإنسان. لإعداد هدف RNA، تجزئة، التهجين 34 ومجموعةتلطيخ رقاقة والغسيل 35 استخدام مجموعات التجارية المتاحة.
- أداء مجموعة رقاقة المسح الضوئي والتحقق من جودة التحكم باستخدام محطة FLUIDICS القياسية، والماسحات الضوئية مجموعة وبرامج التشغيل القياسية (36). لتحليل التعبير الجيني استيراد الملفات التي تم إنشاؤها من الماسحات الضوئية لمعيار البرمجيات التجارية المتاحة 37، نفذ تصحيح الخلفية، تلخيص والتطبيع مع تحليل دقيق متعدد مجموعة (RMA).
- للحصول على قائمة من الجينات وأعرب تفاضلي (DEG و) أداء اتجاه واحد تحليل ANOVA. من هذه القائمة تصفية الجينات على أساس تغيير أضعاف (± 2) والتي تسيطر عليها روزفلت ف القيمة (<0.05). الحصول على مدير تحليل المكون (PCA)، تدفئة الخريطة، وما إلى ذلك باستخدام هذا البرنامج.
جزء النظام 2. UKN 1 اختبار
1. صيانة HESC
- البذر من MEFS
- لتمايز استخدام NSCB # 8534 (H9) خط الخلية. ثقافة مLLS على الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS) كما الخلايا المغذية. معطف T25 قارورة مع 4 مل من 0.1٪ الجيلاتين واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C.
- MEFS ذوبان الجليد في 37 ° C حمام المياه ونقل الخلايا في درجة حرارة ما قبل DMEM / 10٪ FBS.
- تدور 3.5 دقيقة مع 500 x ج، وإزالة طاف واعادة تعليق الخلايا للحصول على 1 × 10 7 خلية / مل. MEFS لوحة 4 × 10 4 / سم 2 في قوارير T25 على الجيلاتين. اختياريا، استخدم MEFS لاليومين المقبلين. نوعية دفعات MEF هي مسألة حاسمة جدا للصيانة HESC. لذلك فإنه من المستحسن لتوضيح أفضل شركة وطريقة التحضير للخلايا H9. نستخدم PMEF P3.
- تقسيم وصيانة H9
- إضافة 1 مل dispase قبل تحسنت في T25 قارورة H9 واحتضان 9 دقيقة عند 37 ° C.
- إضافة 2 مل غسل المتوسطة إلى dispase الخلايا المعالجة والماصة 5 مرات صعودا ونزولا مع الماصة 5 مل وحل الخلية نقل إلى أنبوب الصقر.
- غسل القارورة مع 9 مل غسل المتوسطةوإضافة خلايا للآخرين. تدور 3.5 دقيقة مع 500 x ج، وإزالة طاف واعادة تعليق الخلايا في 10 مل HESC المتوسطة.
- تدور 3.5 دقيقة مع 500 x ج، وإزالة طاف واعادة تعليق الخلايا في 4 مل HESC المتوسطة. إضافة 0.5 مل تعليق خلية و 4.5 مل HESC المتوسطة وصفيحة في الجديدة (PBS غسلها) T25 قارورة مع MEFS. تغيير كامل المتوسطة HESC (5 مل) من القارورة في كل يوم.
2. تمايز HESC نحو خلايا الأديم الظاهر العصبي السلف (NEP)
- إعداد HESC المتوسطة وKCM المتوسطة. معطف واحد صحن 10 سم مع الجيلاتين (0.1٪ في PBS) في T25 القارورة واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C. إزالة المتوسطة من HESC وإضافة accutase ما يكفي لتغطية الجزء السفلي بأكمله من القارورة (1 مل لكل قارورة T25)، واحتضان 25-30 دقيقة عند 37 ° C.
- إعداد مصفوفة غشاء الطابق السفلي لوحات مغلفة خلال accutase الحضانة. إضافة الباردة DMEM / F12 لالمجمدة الغشاء القاعدي مصفوفة بيليه وحلها 01:20. مرشح الغشاء القاعدي المحاليل مصفوفةنشوئها من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر. إضافة حل تصفيتها لوحة، والجزء السفلي كله أن تكون مشمولة (1 مل لكل 6 جيدا مطلوب)، واحتضان لمدة 2 ساعة على RT.
- بعد فترة الحضانة إزالة الغشاء القاعدي مصفوفة طاف والخلايا البذور على الآبار المغلفة. بعد الخطوة accutase (2.1) وقف رد فعل من إضافة 1.5 مل HES المتوسطة. تتخلص الخلايا من القارورة، إضافة 8 مل HESC المتوسطة وإنتاج حل وحيد الخلية من قبل pipetting مع 10 مل الماصة بدقة. تصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر.
- خلايا تدور 3 دقائق مع 500 x ج، وإزالة طاف واعادة تعليق الخلايا في 10 مل من HESC. خلايا تدور مرة أخرى 3 دقائق مع 500 x ج، وإزالة طاف واعادة تعليق الخلايا في HESC تحتوي على ROCK المانع Y-27632 بتركيز نهائي من 10 ميكرومتر.
- إزالة طاف من الجيلاتين المغلفة طبق. تعليق خلية لوحة على الجيلاتين المغلفة طبق لإزالة MEFS وترك في الحاضنة لمدة بالضبط 1 ساعة.
ملاحظة: خلال هذه الخطوة سوف MEFS الصورةettle على لوحة جيلاتين المغلفة، في حين أن HESC لا يمكن أن نعلق على الجيلاتين. ولهذا لا بد من الحصول على التمايز خالية من وحدة التغذية. بل هو خطوة حاسمة كنتائج حضانة طويلة جدا في كتل HESC وحضانة قصيرة جدا في إزالة عدم الكفاءة في MEFS. بعد 45 دقيقة من الحضانة وينبغي التحقيق لوحة لMEFS استقر بالفعل وكتل HESC. - عندما تعلق MEFS، وغسل بلطف الخلايا غير ملتصقة (HESC) من بعد الحضانة مع وسيلة بالفعل في لوحة. إذا تم استخدام العديد من T25 للحصول على المزيد من الخلايا، والخلايا وحيدة الآن يمكن الجمع. غسل لوحة واحدة مع HESC المتوسطة.
- خلايا تدور 3 دقائق مع 500 x ج، وإزالة طاف واعادة تعليق الخلايا في حوالي 4 مل KCM تحتوي على 10 ميكرومتر ROCK المانع Y-27632 و 10 نانوغرام / مل FGF-2.
- عدد الخلايا في عدادة الكريات باستخدام التريبان الأزرق. لوحة 18 × 10 3 خلية / سم 2 على الطابق السفلي مصفوفة غشاء المغلفة لوحات في KCM تحتوي على 10 ميكرومتر ROCK المانع Y-27632 و10 نانوغرام / مل FGF-2 (لمدة 6 استخدام من 1.5 مل لكل بئر). لا بد من لوحة الخلايا في كثافة اليمنى لتمييزها بنجاح في NEPS.
- بعد 24 ساعة، تغيير المتوسط إلى KCM الطازجة التي تحتوي على 10 ميكرومتر ROCK المانع Y-27632 و 10 نانوغرام / مل FGF-2. بعد مزيد من 24 ساعة، وتغيير المتوسط إلى KCM الطازجة تحتوي على 10 نانوغرام / مل FGF2.
- 72 ساعة بعد البذر الخلايا، ويبدأ التمايز عن تغير المتوسط نحو KSR المتوسطة. ويشار إلى هذه النقطة الوقت لكيوم والتمايز 0 (DoD0). إضافة مواد الاختبار هو ممكن الآن.
- على DoD1 وDoD2 يتم تغيير المتوسطة تماما كما في DoD0. تغيير المتوسطة المقبل هو في DoD4 التي تحتوي على 25٪ N2-S و 75٪ KSR. في DoD6 يتم إيقاف التمايز ويتم حصاد الخلايا لتحليلها.
3. لونين مناعي (رقاقة) من HESC وNEP
- إعداد نوى
- إضافة 500 ميكرولتر accutase إلى كل 6 كذلك التي ينبغي تحليلها واحتضان لمدة 25-30 دقيقة. فصول التوجيه الجامعيخلايا الإقليم الشمالي في غرفة نويباور باستخدام التريبان الأزرق.
- Resuspend الخلايا في 1٪ الفورمالديهايد في DMEM / F12 لتشعبي. إضافة تريس الرقم الهيدروجيني 7.5 إلى تركيز النهائي من 125 ملي بعد 10 دقيقة لوقف تشعبي.
- خلايا تدور 3 دقائق مع 500 x ج في 4 ° C، وإزالة طاف واعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني الباردة.
- خلايا تدور 3 دقائق مع 500 x ج في 4 ° C، وإزالة طاف واعادة تعليق الخلايا في 1 مل L1- العازلة / 1 × 10 6 خلايا.
- احتضان لمدة 5 دقائق على الجليد. تدور 5 دقائق مع 800 x ج في 4 ° C، وإزالة طاف واعادة تعليق النوى في 1 مل L2- العازلة / 2 × 10 6 خلايا.
- صوتنة ومراقبة الجودة
- يصوتن حتى تتولد أن شظايا الحمض النووي من 300-700 طول مضت. تدور 1 دقيقة مع 10000 x ج في 4 ° C. نقل طاف لأنبوب جديد. شظايا بحاجة إلى الحجم الصحيح، وإلا فإن مناعي ستكون غير فعالة، فضلا عن QPCR اتباعها.
- إزالة 50 ميكرولتر لد المزيج مع 50 ميكرولتر L2 عازلة للتحقق من كفاءة صوتنة عن طريق تشغيل agarose هلام.
- عكس تشعبي من قبل الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات و 500 دورة في الدقيقة. عينات حمولة 1: 5 مع أورانج G صبغ التحميل على 1.5٪ هلام الاغاروز وتشغيل 45 دقيقة في 110 V في المخزن 1X TBE. مراقبة حجم جزء (يجب أن يكون بين 300-700 بي بي).
- مناعي لونين
- تمييع عينات 1: 5 في المخزن تخفيف وقسامة 1 مل لكل IP في أنابيب صلكنزد.
- إزالة 5٪ (حجم) من العينة المخففة لونين (الخطوة 3.3.1) وتخزينها في 4 ° C ب "إدخال".
- احتضان عينات مع الأجسام المضادة من اختيارك ومع غير محددة مفتش O / N عند 4 درجات مئوية على محور دوار.
- إضافة 50 ميكرولتر البروتين A / G سيفاروز الخرز على كل عينة بعد مناعي. احتضان عينات 3 ساعة على 4 درجات مئوية على محور دوار. تدور 1 دقيقة مع 1500 x ج في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف.
- تغسل حبات مع الغسيل 1 مل. تدور 1 دقيقة مع 1500 x ج في4 ° C وإزالة طاف. كرر الخطوة g لح. تغسل مع 1 مل النهائي عازلة الغسيل. خلال خطوات الغسيل يجب أن لا تفقد أي من الخرز، لأن هذا يغير كمية شطافة مباشرة.
- الطرد المركزي 1 دقيقة مع 1500 x ج في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف. إضافة 125 ميكرولتر شطف العازلة واحتضان 15 دقيقة مع 65 ° C في 1000 دورة في الدقيقة على شاكر.
- تدور 1 دقيقة مع 1500 x ج ونقل طاف لأنبوب جديد كرر الخطوة ك و ل. إضافة 200 العازلة شطف ميكرولتر لإدخال (3.3.2). إضافة بروتين K وريبونوكلياز لكل عينة واحتضان 30 دقيقة مع 37 درجة مئوية في 500 دورة في الدقيقة على شاكر وبعد 4 ساعات مع 65 درجة مئوية في 500 دورة في الدقيقة على شاكر.
ملاحظة: للحصول على استخراج DNA استخدام التجاري متاح رقاقة الحمض النووي النظيفة والمكثف كيت 38.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التعرض للزئبق الميثيل في UKK نظام اختبار
تم إجراء فحص السمية الخلوية مع H9 EBS للحصول على IC 10 قيمة (الحد من قابلية بنسبة 10٪) لسمية الخلايا من ميثيل الزئبق (الشكل 1). أجرينا أيضا (منصة affymetrix) دراسة العلامات البيولوجية ميكروأري القائمة. تعرضوا للH9 EBS إلى ميثيل الزئبق (0.25 و 1 ميكرومتر) لمدة 14 يوما. في يوم 14، وقد تم جمع العينات باستخدام TRIzol وتم عزل الحمض النووي الريبي. تم تنفيذ النسخي باستخدام U133 الجينوم البشري بالإضافة إلى 2.0 رقائق مجموعة. وقد تم تحليل البيانات مع Partek الجينوم جناح TM 6.6. تم الحصول على نظرة عامة بيانات الأولى مبدأ تحليل المركبات (الشكل 2A)، وتوليد الرسوم البيانية فين (الشكل 2B) وبناء خرائط الحرارة (الشكل 2C). يمثل تحليل المكون الرئيسي التوزيع العام للالتعبير الجيني وتصور بوضوح segregأوجه من ميثيل الزئبق 1 ميكرومتر من السيطرة على السيارة وميثيل الزئبق 0.25 ميكرومتر مجموعة (PC # 25.2) (الشكل 2A). تم الحصول على قائمة من الجينات وأعرب تفاضلي (DEG) بعد المعالجة الإحصائية (في اتجاه واحد ANOVA)، وتنقية البيانات باستخدام أضعاف تغيير قطع من ± 2 و(طريقة Benjamini-هوشبرج) ف قيمة لتصحيح تعدد <0.05 (الجدول 1). أسفرت العلاج 1 ميكرومتر ميثيل الزئبق في 276 DEGs و 0.25 ميكرومتر في 31 DEGs (الشكل 2B). وأظهرت خريطة الحرارة التي ميثيل الزئبق 1 ميكرومتر العلاج أساسا إلى انخفاض التعبير الجيني (الشكل 2C). تم الحصول على معلومات عن الجينات ممثلة تمثيلا زائدا حيث الأنطولوجيا باستخدام أداة المعلوماتية الحيوية DAVID ويمثل الجدول 2 تمثيل زائد بشكل كبير فئات GO الجين الذي يحتوي على أكثر من 5 الجينات. تم التعرف على عوامل النسخ التنظيم أسفل المتعلقة بتطوير الجهاز العصبي. SEPP1، DDIT4، AK4، FRZB (تطور الدماغ)، PITX (تطوير نواة العصبية) وERBB3، UGT8، APOB، APOA1 (تطوير النظام العصبي) تم تنظيم أسفل بطريقة تعتمد على الجرعة للعلاج ميثيل الزئبق (الجدول 3).
UKN نظام اختبار 1
يستخدم هذا البروتوكول التمايز المزدوجة inhibiton لل Smad 6 لتوليد السكان نقية من NEP في غضون ستة أيام من التمايز. وتتميز الخلايا الناتجة عن طريق التنظيم تتكون من جينات العصبية السلائف PAX6 وOTX2. علامات الخلايا الجذعية OCT4 وNANOG تنظم باستمرار خلال التمايز نحو NEP (الشكل 3A). يرجع ذلك إلى التفريق متزامن للغاية ومتجانس، فمن الممكن أيضا الحصول على معلومات عن التعديلات هيستون خلال هذه المرحلة المبكرة من التنمية. نحن تكييفها بروتوكول لونين المناعية هطول الأمطار (رقاقة) باستخدام الخلايا إما في بداية تمايز أو بعد 6 أيام منالتمايز. وكان التحول من مواقع مثيلة في مناطق المروج من PAX6 وOTX2 واضح من هذه الدراسات (الشكل 3B). مواقع مثيلة التحقيق هيستون 3 يسين 4 trimethylation (H3K4me3) وهيستون 3 يسين كانت 27 trimethylation (H3K27me3) ديناميكية للغاية خلال التمايز. أيضا على مستوى البروتين لائحة أولى من Oct4 يمكن ملاحظة (الشكل 4). ولوحظ التنظيم يصل من Pax6 والعصبية علامة الخلية الجذعية Nestin المناعي المجهري على مستوى البروتين (الشكل 4). أظهر السكان خلية تمايز متجانسة ونقية بعد ستة أيام من التمايز. وبالتالي فإن الثقافات يمكن استخدامها بسهولة لتحليل الحمض النووي الريبي والبروتينات. يوفر النظام أيضا إمكانية لاختبار المواد وتأثيرها على التطور العصبي في وقت مبكر 16،29.
الشكل 1. السمسة الفحص (التمايز H9) لميثيل الزئبق. وقد تم إجراء الفحص وفقا لبروتوكول لتحديد قيمة IC 10 لميثيل الزئبق.
الشكل 2. تحليل ممثل الجينات التفاضلي أعرب الناجم عن 0.25 و 1 ميكرومتر ميثيل الزئبق بعد تطبيق نظام اختبار UKK. وعولج hESCs مع 0.25 و 1 ميكرومتر ميثيل الزئبق وفقا لنظام اختبار UKK. أعرب تحليل الفرق وقد تم إجراء محاضر في 14 يوما EBS متباينة باستخدام Partek الجينوم جناح TM 6.6 البرمجيات. (A) تحليل المكونات الأساسية (3-Dimenional) من البيانات ميكروأري. (B) فين الحصول عليها من تحليل ميكروأري التعبير الجيني. ويوضح الرسم البياني عددالجينات عن طريق التضمين العلاج ميثيل الزئبق (تغيير أضعاف> ± 2، قيمة P <0.05). (C) التجميع الهرمي للبيانات التعبير الجيني (أضعاف تغيير> ± 2، قيمة P <0.05). وقمع الجينات أعرب غاية في السيارة المجموعة الضابطة التي كتبها 1 ميكرومتر علاج ميثيل الزئبق. أسفرت العلاج 1 ميكرومتر ميثيل الزئبق في 233 محاضر مع انخفاض التعبير و43 تحقيقات مع ارتفاع التعبير كما قارن لمجموعة السيطرة على السيارة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم التعبير 3. الجينات ونمط مثيلة هيستون خلال التمايز من HESC نحو NEP للحصول على جميع التجارب، تم التفريق HESC إلى خلايا الأديم الظاهر العصبي السلائف (NEP). أخذت (A) عينات في دتم تحديد المنعم يوسف 6 من التمايز، ونسخة مستويات الجينات علامة التمايز العصبية التي كتبها RT-QPCR. البيانات (التعبير الجيني النسبي إلى HESC) هي وسائل ± SEM من 5 التجارب. تم إعداد (B) عينات للمناعي لونين (رقاقة) في يوم 6 من التمايز. وقد أجريت رقاقة مع الأجسام المضادة المحددة لH3K4me3 أو H3K27me3 أو السيطرة مفتش. ونظرا للعوامل إثراء تسلسل المروج كنسبة مئوية المدخلات لH3K4me3 (الرمادي) وH3K27me3 (أسود). البيانات هي وسائل ± SEM من 3 الاستعدادات خلية مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم التعبير 4. البروتين خلال التمايز من HESC نحو NEP. تم إصلاح الخلايا وملطخة للعلامة الخلية الجذعيةOct4 (الأخضر) في اليوم 0 التمايز (DoD0) وعلامات NEP Pax6 (الحمراء)، وNestin (الأخضر) في يوم 6 من التمايز (DoD6). يشير الشريط على نطاق و50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. قائمة من الجينات وأعرب تفاضلي (> ± 2 أضعاف، قيمة P <0.05) للعلاج ميثيل الزئبق مقابل السيطرة على السيارة في EBS القديمة خلال 14 يوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الجدول.
الجدول 2. قائمة الفئات GO المخصب بدرجة كبيرة ومختارة (قيمة p <0.05،> 5 الجينات) مع تران dysregulatedمخطوطات لميثيل الزئبق مقابل السيطرة على السيارة في EBS القديمة خلال 14 يوم.
| GO الأجل | عد | قيمة P | الجينات |
| تنظيم موت الخلايا المبرمج | 18 | 0.0068 | ARHGEF3، TBX3، ERBB3، MITF، BNIP3، CDH1، IGF2، IFI16، HGF، GCH1، AMIGO2، SERPINB9، KRT18، MSX1، ETS1، VEGFA، PERP، IGFBP3 |
| تنظيم تكاثر الخلايا | 17 | 0.0123 | RBP4، LYN، TBX3، ERBB3، MITF، IGF2، KDR، RERG، MSX1، ADM، ETS1، VEGFA، BNC1، ADAMTS1، FABP1، IGFBP3، FIGF |
| التنمية الأوعية الدموية | 12 | 0.0001 | PLAT، APOB، HAND1، TBX3، EPAS1، FOXF1، LEPR، VEGFA، COL3A1، LOX، FIGF، KDR |
| تطوير نظام الهيكل العظمي نانوغرام> | 12 | 0.0008 | RBP4، MSX1، LGALS3، TBX3، HOXB6، COL3A1، STC1، IGF2، POSTN، FRZB، IGFBP3، AHSG |
| التنمية القلب | 11 | 0.0001 | RBP4، ACTC1، MSX1، HAND1، TBX3، ADM، PKP2، ERBB3، GATA6، COL3A1، ADAMTS1 |
| عملية التمثيل الغذائي الجلوكوز | 9 | 0.0003 | PDK1، RBP4، LDHA، PGM5، PYGL، HK2، PFKP، IGF2، PGK1 |
| التنمية الرئة | 7 | 0.0008 | RBP4، EPAS1، GATA6، FOXF1، VEGFA، LOX، KDR |
| التنمية ظهارة | 7 | 0.0386 | F11R، FREM2، GATA6، FOXF1، VEGFA، DSP، KDR |
| التنمية الأديم المتوسط | 5 | 0.0088 | HAND1، TBX3، FOXF1، VEGFA، SNAI2 |
| مصطلح | الجينات الرمز | أضعاف التغيير * | |
| 0.25 ميكرومتر ميثيل الزئبق مقابل VC | 1 ميكرومتر ميثيل الزئبق مقابل VC | ||
| التنمية الدماغ | SEPP1 | -2.17 | -4.13 |
| DDIT4 | -1.20 | -3.11 | |
| AK4 | -1.41 | -3.08 | |
| FRZB | -1.29 | -2.19 | |
| تطوير نواة الخلايا العصبية | البروتين Pitx2 | -2.08 | -4.90 |
| تطوير النظام العصبي | ERBB3 | -1.86 | -2.89 |
| UGT8 | -1.67 | -2.14 | |
| APOB | -3.59 | -5.72 | |
| APOA1 | 2.63 | -2.90 | |
| VEGFA | -1.28 | -3.06 | |
* قيمة P <0.05
الجدول 4. تكوين سائل الإعلام والثقافة.
| الأب رقم | متوسطة / اسم مؤقت | تركيب | |||
| كمية | | ||||
| 1 | MEF المتوسطة | DMEM عالية الجلوكوز | |||
| FCS | 10٪ | ||||
| بنسلين | 100 وحدة / مل | ||||
| الستربتومايسين عقار طبي | 100 ميكروغرام / مل | ||||
| L-الجلوتامين | 2 مم | ||||
| 2 | H9 الثقافة المتوسطة | DMEM F12 | |||
| KOSR | 20٪ | ||||
| NEAA | 1٪ | ||||
| Glutamax | 1X | ||||
| β المركابتويثانول | 0.1 ملم | ||||
| بنسلين | 100 وحدة / مل | ||||
| الستربتومايسين عقار طبي | 100 ميكروغرام / مل | ||||
| bFGF | 4 نانوغرام / مل | 3 | RD المتوسطة | H9 مستنبت دون bFGF | |
| 4 | غسل المتوسطة | DMEM / F12 | |||
| خروج المغلوب المصل Replacment | 20٪ | ||||
| 1X GlutaMAX | 1X | ||||
| MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية | |||||
| HEPES | 15 ملي | ||||
| β المركابتويثانول | 90 ميكرومتر | ||||
| 5 | KCM المتوسطة | DMEM | |||
| FBS | 10٪ | ||||
| المحتضنة لمدة 24 ساعة على MEFS | |||||
| 6 | خروج المغلوب المصل استبدال (KSR) | ||||
| خروج المغلوب استبدال المصل | 15٪ | ||||
| 1X GlutaMAX | |||||
| 1X MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية | |||||
| β المركابتويثانول | 15 ميكرون | ||||
| رأس | 35 نانوغرام / مل | ||||
| Dorsomorphin | 600 نانومتر | ||||
| SB431542 | 10 ميكرومتر | ||||
| 7 | N2-S | DMEM / F-12 | |||
| Apotransferin | 100 ميكروغرام / مل | ||||
| جلوكوز | 1.55 ملغ / مل | ||||
| بوتريسين | 10 ملي | ||||
| عنصر السيلينيوم | 500 ميكرومتر | ||||
| Progesteron | 20 ميكرومتر | ||||
| GlutaMAX | 200 ميكرومتر | ||||
| 25 ميكروغرام / مل | |||||
| 8 | L1 العازلة | تريس درجة الحموضة 8 | 50 ملي | ||
| EDTA | 2 مم | ||||
| NP-40 | 0.10٪ | ||||
| الغليسيرول | 10٪ | ||||
| 9 | L2 مؤقت | تريس درجة الحموضة 8 | 50 ملي | ||
| EDTA | 10 ملي | ||||
| SDS | 1٪ | ||||
| 10 | شطف العازلة | NaHCO 3 | 100 ملي | ||
| SDS | 1٪ | ||||
| 11 | غسل العازلة | تريس | 20 ملي | ||
| EDTA | 2 مم | SDS | 0.10٪ | ||
| NP-40 | 0.50٪ | ||||
| كلوريد الصوديوم | 150 ملي | ||||
| 12 | النهائي الاحتياطي اغسل | تريس | 20 ملي | ||
| EDTA | 2 مم | ||||
| SDS | 0.10٪ | ||||
| NP-40 | 0.50٪ | ||||
| كلوريد الصوديوم | 500 ملي | ||||
| 13 | الخلايا الجذعية متوسطة | mTESAR TM المتوسطة القاعدية | 400 مل | ||
| mTESAR TM الملحق | 100 مل | ||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأساليب التقليدية لاختبار السمية وتشمل الدراسات على الحيوانات واسعة مما يجعل اختبار مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. وعلاوة على ذلك، لوجود خلافات بين الأنواع الدراسات قبل السريرية سلامة الحيوانات غير صالحة دائما للتنبؤ تأثيرات سمية الأدوية المحتملة ذات الصلة للبشر. على الرغم من أن الرئيسيات غير البشرية هي الأكثر قابلية للتنبؤ، لا يزال أخلاقية قوية، والمطالب الإجتماعية والإقتصادية ترفع بسرعة عن طريق المجتمعات الحديثة لتطوير حساسة وقوية في اختبار المختبر النظام ذات الصلة لسلامة الإنسان.
قدرة فريدة من hESCs في التفريق في جميع أنواع الخلايا الجسدية، وبالتالي تلخص العمليات التنموية البشرية في الجسم الحي في تركيبة مع النهج علم الوراثة السمي حساسة وقد اقترح كبديل للمناهج التقليدية لاختبار سلامة العقاقير 6،21. تحت مشروع "ESNATS" تم تطوير "UKK" نظام اختبار للتنبؤسمية الجنينية التنموية على أساس transcriptomics التنميط. في هذا النظام تم متباينة HESC في لهيئات مضغي لمدة 14 يوما. الوقت الشخصي transcriptomics الحركية التي تم الحصول عليها يظهر التعبير عالية من التمايز علامة محددة إلى ثلاث طبقات جرثومية أدمة، الأديم والأديم المتوسط يوم 14 التي تلخص جزئيا في وقت مبكر التطور الجنيني الإنسان. وبناء على هذه النتائج، قد تعرضت المخدرات ماسخة المعروف خلال التمايز لمدة 14 يوما، وقد تم الحصول على التفاضلي أعرب الشخصي الجينات. لافت، والتوقيعات الجينات المرتبطة تأثيرات ماسخة الثاليدومايد لوحظ في البشر، يمكن توقع من قبل هذا النظام الاختبار 28. نتائج تمثيلية للميثيل الزئبق في UKK عرض نظام التنظيم تعتمد على التركيز باستمرار من عوامل النسخ المتعلقة بتطوير الجهاز العصبي. تم اختبار أخرى التنموية العصبية السامة أيضا في هذا النظام والجهود جارية لتحديدنزلات-علامات toxico عبر المركبات على مستوى مرنا والتحقق منها على مستوى البروتين. البروتوكول اختبار UKK المقدمة هنا يعطي التوجيهي الأساسي لإجراء التجربة مع الإنسان H9 الخلايا الجذعية الجنينية للتعرف على توقيع transcriptomic لسمية التنموية.
الإجراء الأمثل معيار عملية (SOP) للتمايز الخلايا الجذعية المحفزة وفقا لبروتوكول UKN1 يسمح تمايز قوية ومتزامنة من HESC إلى NEP. بالفعل بعد ستة أيام من التمايز، يتم إنشاء خلية السكان متجانسة مع مستويات التعبير PAX6 عالية. الخلايا تنمو في الثقافات ملتصقة، والتي تسمح تحليلها من قبل المناعية. يتطلب تحليل Immunocytochemical مع ارتفاع القرار، وبواسطة المجهر متحد البؤر أن الخلايا التي تزرع على الأسطح الزجاجية رقيقة. هذا من الممكن لهذه الثقافات إذا تم المغلفة الزجاج على النحو الأمثل، ولكن لا بد من الإشارة إلى أن الخلايا تنمو كثيفة جدا، في أكثر من طبقة واحدةبعد ستة أيام. ولذلك، التحليل الروتيني من علامات نسب محددة يتم تنفيذها بسهولة أكبر عن طريق RT-QPCR، الشذرة أو لطخة غربية. وهناك ميزة كبيرة لتحليل الكيمياء الحيوية من الثقافات هي عالية الغلة من الخلايا التي يمكن تحقيقها من خلال هذا البروتوكول التمايز من السكان انطلاق صغير من HESC. عيب واحد من هذا البروتوكول هو التكلفة العالية للمكملات المتوسطة (على سبيل المثال، رأس) المطلوبة لإجبار التمايز العصبي متجانسة. عيب آخر لبعض التطبيقات قد يكون أن بعض الجزيئات الصغيرة (مثبطات كيناز) يجب أن تكون موجودة في مستنبت كجزء من البروتوكول. وبالتالي، بعض مسارات إشارة لا يمكن فحص السمية، وتغير الظروف الثقافة أيضا تغيير التمايز 29.
ميزة الجمع بين نظام الاختبار هو فهم أفضل للDNT. في حين UKK تغطي مجموعة واسعة وتأثير سلبي على أوائل تشكيل طبقة الجرثومية يمكن التحقيق فيها، UKN1 جميعالدودة الحلزونية للتحقيق في آليات مزيد من العصبية محددة مثل علم التخلق. على الرغم من أن نظم الاستزراع اثنين المعروضة هنا قد ثبت أنه عامل تنبؤ العصابي لعدد قليل من المواد السامة نموذج 16، لا يزال هناك حاجة لإصدارات إنتاجية أعلى من البروتوكولات التي تسمح للفحص عدد كبير من neurotoxicants التنموية المحتملة. وعلاوة على ذلك، هناك حاجة إلى مزيد من العمل لتحديد والتحقق من صحة العلامات المشتركة للسمية على مستوى مرنا أو البروتين، ونمكن لهم كجزء من قبل السريرية تقييم سلامة الدواء.
ويتم استثمار أكثر من 20 مليار دولار امريكى سنويا من قبل الصناعات الدوائية لاكتشاف الأدوية 39. كدليل على المفهوم، وضعنا في نظم اختبار السمية المختبر على أساس HESC وtranscriptomics التي قد تكون مناسبة للتنبؤ الآثار السمية ذات الصلة الإنسان من المركبات الدوائية المحتملة بطريقة فعالة من حيث التكلفة وأقل استهلاكا للوقت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
| mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
| V bottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
| Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Kits | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
| Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of equipment | |||
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Genechip Hybridisation Oven - 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of softwares | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |
|||
References
- Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
- Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceutical Biotechnology. Current Pharmaceutical Biotechnology. 12 (11), 1760-1773 (2011).
- Leist, M., Hartung, T., Nicotera, P. The dawning of a new age of toxicology. ALTEX. 25 (2), 103-114 (2008).
- Kuegler, P. B., et al. Markers of murine embryonic and neural stem cells, neurons and astrocytes: reference points for developmental neurotoxicity testing. ALTEX. 27 (1), 17-42 (2010).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. , (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of Developmental Toxicants and Signaling Pathways in a Functional Test Based on the Migration of Human Neural Crest Cells. Environmental Health Perspectives. 120 (8), 1116-1122 (2012).
- Bosman, A., et al. Molecular and Functional Evidence of HCN4 and Caveolin-3 Interaction During Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells and Development. 22 (11), 1717-1727 (2013).
- Sartiani, L., et al. Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach. Stem Cells. 25 (5), 1136-1144 (2007).
- Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation. 76 (9), 958-970 (2008).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (2), 200-206 (2013).
- Subramanian, K., et al. Spheroid Culture for Enhanced Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-Like Cells. Stem Cells and Development. 23 (2), 124-131 (2014).
- Sivertsson, L., Synnergren, J., Jensen, J., Bjorquist, P., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells Cultured in a Perfused Three-Dimensional Bioreactor. Stem Cells and Development. 22 (4), 581-594 (2013).
- Jagtap, S., et al. Cytosine arabinoside induces ectoderm and inhibits mesoderm expression in human embryonic stem cells during multilineage differentiation. British Journal of Pharmacology. 162 (8), 1743-1756 (2011).
- Krug, A. K., et al. Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach. Archives of Toxicology. 87 (1), 123-143 (2013).
- Leist, M., et al. Test systems of developmental toxicity: state-of-the art and future perspectives. Archives of Toxicology. 87 (12), 2037-2042 (2013).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Molecular medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Khoo, M. L. M., et al. Growth and differentiation of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells: Effect of glucose and basic fibroblast growth factor. Biology of Reproduction. 73 (6), 1147-1156 (2005).
- Son, M. Y., Kim, H. J., Kim, M. J., Cho, S. Physical Passaging of Embryoid Bodies Generated from Human Pluripotent Stem Cells. Plos One. 6 (5), (2011).
- Winkler, J., Sotiriadou, I., Chen, S., Hescheler, J., Sachinidis, A. The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology. Current medicinal chemistry. 16 (36), 4814-4827 (2009).
- Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17 (8), 759-766 (2010).
- Miller, M. T., Stromland, K. Teratogen update: Thalidomide: A review, with a focus on ocular findings and new potential uses. Teratology. 60 (5), 306-321 (1999).
- Newman, C. G. H. Teratogen Update - Clinical Aspects of Thalidomide Embryopathy - A Continuing Preoccupation. Teratology. 32 (1), 133-144 (1985).
- Stern, L. In vivo assessment of the teratogenic potential of drugs in humans. Obstetrics and gynecology. 58 (5 Suppl), 3S-8S (1981).
- Lynch, H. T., Reich, J. W. Diethylstilbestrol, Genetics, Teratogenesis, and Tumor Spectrum in Humans. Medical Hypotheses. 16 (3), 315-332 (1985).
- Satoh, H. Behavioral teratology of mercury and its compounds. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 1-9 (2003).
- Meganathan, K., et al. Identification of Thalidomide-Specific Transcriptomics and Proteomics Signatures during Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Plos One. 7 (8), (2012).
- Balmer, N. V., et al. Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome. Human Molecular Genetics. 21 (18), 4104-4114 (2012).
- Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M., Hartung, T. Developmental neurotoxicity - Challenges in the 21st Century and In Vitro Opportunities. ALTEX. 31 (2), 129-156 (2014).
- Leist, M., Efremova, L., Karreman, C. Food for thought ... considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX. 27 (4), 309-317 (2010).
- Zimmer, B., et al. Coordinated waves of gene expression during neuronal differentiation of embryonic stem cells as basis for novel approaches to developmental neurotoxicity testing. Cell Death and Differentiation. 18 (3), 383-395 (2011).
- Experion RNA StdSens Analysis Kit for RNA analysis by Electrophoresis. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000976B%20%20RNA%20STDSENS%20MANUAL.PDF (2014).
- Affymetix GeneChip 3 IVT Express Kit for Target RNA preparation, Fragmentation and hybridization. , Available from: http://microarray.csc.mrc.ac.uk/downloads/3'%20IVT%20Express%20Manual.pdf (2014).
- Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit. , Available from: http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1 (2014).
- Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1 (2014).
- Partek Genomics Suite. , Available from: http://www.partek.com/pgs (2014).
- ChIP DNA Clean and Concentrator. , Available from: http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/pcr-dna-clean-up-concentration/chip-dna-clean-concentrator (2014).
- Kraljevic, S., Stambrook, P. J., Pavelic, K. Accelerating drug discovery. EMBO Reports. 5 (9), 837-842 (2004).
