Summary
프로토콜은 인간 배아 줄기 세포 및 사체 연구에 기초하여 두 개의 시험관 발생 독성 시험 시스템 (UKK 및 UKN1)를 설명한다. 테스트 시스템은 인간 발생 독성 위험을 예측하고, 동물 연구, 비용 및 화학 물질의 안전성 검사에 필요한 시간을 단축에 기여할 수있다.
Abstract
-omics 기술이 잠재적 인 약물의 체외 독성 시험에 대한 새로운 지평을 열어 효율적인 프로토콜은 조합의 다양한 조직으로 인간 만능 줄기 세포를 구별한다. 이러한 분석 용 고체 과학적 근거를 제공하기 위해서는, 현상시 코스 및 시스템 생물학 방법에 의해, 기본 규제 메커니즘 정량적 정보를 얻기 위해 중요하다. 두 분석 따라서 이러한 요구 사항 여기를 조정하고있다. UKK 테스트 시스템에있어서, 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) (또는 다른 다 능성 세포) 자발적 세 배엽 세포의 생성을 허용하도록, 배아 체에서 14 일 동안 분화하도록 남겨진다. 이 시스템은 초기 인간 배아 발달의 주요 단계를 되풀이되었습니다, 세포가 분화하는 동안 화학 물질에 노출 될 경우는, 인간 고유의 초기 배아 독성 / 기형을 예측할 수있다. UKN1 테스트 시스템의 populat에 hESC의 미분에 기초신경 외배엽 전구 이온 (NEP) 육일에 대한 세포. 이 시스템은 초기 신경 발달을 되풀이되었습니다 초기 발달 신경 독성 및 화학 물질에 의해 유발 후생 유전 학적 변화를 예측한다. 두 시스템은, 전 사체 마이크로 어레이 연구와 함께, 생체 독성을 확인하기에 적합하다. 또한, 이들은 시스템 생물학 분석 입력 데이터를 생성하도록 조합하여 사용될 수있다. 이 테스트 시스템은 동물의 대용량을 필요로하는 기존의 독성 연구에 비해 많은 장점을 갖는다. 테스트 시스템은 약물 개발 및 화학적 안전성 평가를위한 비용의 절감에 기여할 수있다. 이들의 조합은 특히 특별히 신경 발달에 영향을 미칠 수있는 화합물에 빛을 비춰.
Introduction
다양한 유형의 세포로 분화하는 인간 배아 줄기 세포 (hESC의)의 능력은 시험 관내 독성 시험 한 질병 모델링 및 재생 의학 (2)의 새로운 시대를 열었다. 줄기 세포는 자기 복제 할 수있는 능력, 자신의 만능 상태를 유지하고, 전문 세포 3,4로 분화에 부여된다. hESC의의 특성 또한 유도 인간 다 능성 줄기 세포 (hiPSC) 또는 핵 이식 (5)에 의해 생성 된 세포와 같은 다른 사람 다 능성 줄기 세포에서 발견되는 (용량은 모든 주요 세포 타입을 구별하기 위해). 예를 들어, 많은 다른 hESC의 라인은 세포 (13, 14)과 같은 신경 (6), 신장 세포 (7), 신경 능선 세포 (8), 심근 9-12, 또는 간세포로 분화되었다. 또한, hESC의 자발적 배아 체 (사채) (19, 20)의 세 가지 배엽 15 ~ 18의 세포로 분화 할 수 있습니다. 전자아 흘리 배아 개발은 마이크로 어레이 기술 (15)를 사용하여 transcriptomics하여 mRNA의 수준에서 포착 된 다른 배엽과 관련된 다양한 유전자의 발현에 의해 조절된다. 이러한 노력은 hESC의 / hiPSC 및 transcriptomics 분석 (검토를 위해 21, 22 참조)를 기반으로 장기 특정 독성 모델의 설립 귀착되었다. 이러한 모델은 실험 동물은 항상 인간의 안전을 예측하지 않습니다 사용하여 전임상 연구 등의 독성 연구를위한 실험 동물의 전통적인 사용에 장점을 가지고있다. 환자에서 발생하는 약물에 의한 부작용은 종종 인간과 실험 동물 사이에 차이가 신진 대사 또는 신호 처리와 관련이 있습니다. 종의 차이는 인간에서 발생 독성의 안정적인 조기 발견을 방지하고 있으며, 이러한 탈리도마이드 (23, 24) 및 디 에틸 25, 26 등의 인스턴스 의약품으로 인한 기형으로 시장에서 철수했다. Thalidomide 쥐 또는 마우스의 모든 발생 독성을 표시하지 않았습니다. 메틸 수은 (27) 등의 환경 화학 물질은 다양한 종류의 신경계에 대한 태아 발생 독성에 나 섰으나 인간의 표현은 동물 모델 어려운되었습니다. 종 특이성 문제의 문제를 해결하기 위해, 다른 프로젝트에서 일하는 과학자 등으로 의심되는 인간의 독성 물질을 사용하여 배아 독성, 신경 독성, 심독성, 간독성 및 신 독성에 대해 서로 다른 모델의 개발에 종사하는 ReProTect, ESNATS 형사 같은 줄기 세포를 기반으로 인간에 영향을 미친다. 유럽 컨소시엄 프로젝트 '배아 줄기 세포 기반 소설 대체 시험 전략 (ESNATS)'에서 다섯 테스트 시스템이 설정되어있는 것. 하나의 테스트 시스템 소위 UKK (U niversitäts K linikum K OLN) 테스트 시스템은 부분적 초기 인간 배아 발달을 캡처한다. 이 S에서템 인간 배아 H9 세포는 세 배엽 (외배엽, 내배엽과 중배엽) 15 배엽 특정 서명 어피 메트릭스 마이크로 어레이 플랫폼을 사용하여 프로파일 transcriptomics에 의해 포착 된 것으로 차별화된다. 탈리도마이드 (28), 발 프로 산, 메틸 수은 16,17 또는 시토신 아라 비노 시드 (15)과 같은 다양한 발달 독성 물질이 시스템에서 테스트되었고, 독성 특정 유전자 서명은 얻어졌다. 제 2 테스트 시스템에서, 테스트 시스템이므로 1 UKN1 (K onsta N Z의 U의 niversity)라고 H9 세포를 6 일 동안 신경 외배엽 전구 세포 (NEP)로 분화된다. 이는 같은 PAX6와의 Otx2 같은 신경 유전자 마커의 높은 발현에 의해 입증된다. 분화 동안 육일을 위해, NEP 세포는 이러한 VPA, 메틸 수은과 같은 발달 신경 독성 물질에 노출되어있다. 독성 물질 별 탈 규제 transcriptomics 프로필 obtai되었습니다어피 메트릭스 마이크로 어레이 플랫폼 16,29를 사용하여뿐만 아니라 네드.
21 세기의 독성에 대한 새로운 비전은 테스트 시스템은 장기 독성 물질의 배양의 끝에 생체 내에서 조직 병리학, 또는 사체 변경과 같은 표현형 설명을 생성 할뿐만 아니라 것을 상상한다. 오히려 분석법 기계론 3 정보를 제공하고 있음이 정보는 소위에 매핑 될 수 있다는 것을 시사 불리한 결과 경로 (AOP) 유해 효과 (30)에 대한 과학적 근거를 제공 할 것이다. 그러한 정보를 제공하기 위해 적용된 테스트 시스템은 높은 품질의 강력한 표준 작업 절차 문서화 인스턴스로서, 31으로 제어되어야한다. 또한, 시간에 따른 변화는 높은 해상도로 매핑 할 필요가있다. 이 동기화 변경 32 테스트 시스템을 필요로한다. 여기에 설명 된 UKN1 및 UKK 테스트 시스템은 이러한 요구 사항에 최적화되어있다.
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Protocol
다음 프로토콜은 인간 배아 줄기 세포주 (hESC의) H9를 사용하여 수행 하였다. 이 세포주는 정기적으로 hESC의 배양 배지에서 mitotically 불 활성화 된 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)의 bFGF와 보충 및 MEFs에 없애, 같은 마트 리겔로 기저막 매트릭스로 코팅 6cm 페트리 접시에 줄기 세포 미디어에서 배양에서 배양 하였다. > 80 % 융합 성 플레이트로부터 H9 세포는 상기 통로에 사용 하였다. 기저막 매트릭스 플레이트상에서 배양 된 H9 세포 사채 형성을 위해 사용 하였다. 다음과 같은 프로토콜에 언급 된 모든 절차는 무균 좋은 세포 배양 방법에 대한 표준 방법을 사용하여 수행되었다.
제 1 부 UKK 테스트 시스템
1. 인간 배아 줄기 세포 배양
- 분할 및 피더 세포에 H9의 유지 보수
- 각 6cm 판에 피펫 2 ml의 0.1 % 젤라틴 및 세포 배양 incub에서 30 분 동안 품어ATOR (37 ° C에서 5 % CO 2). 멸균 파스퇴르 피펫 대기음 젤라틴 용액.
- 두 젤라틴 코팅 된 플레이트에 0.1 × 106 MEF 세포 / ml를 함유하는 2 ml의 MEF 매체를 추가하고, 세포 배양 인큐베이터 (37 ℃, 5 % CO 2) O / N에이를 부화.
- 다음날, 집게를 사용하여 H9 세포를 액체 질소 저장 탱크로부터 제거하고, 바이알 긴 집게를 사용하여 37 ° C의 수욕 바이알을 해동.
- 15 ~ 30 초 동안 바이오 안전성 캐비닛에 물 목욕, 70 % 에탄올로 목욕을, 건조 공기에서 유리 병을 제거하고 15 ㎖의 팔콘 튜브에 세포를 전송합니다.
- 5 분 동안 200 XG에서 세포를 천천히 내벽 H9 배지 9 ml에 첨가하고 원심 분리기.
- 기음 뜨는와 바위 억제제를 포함하는 6 ml의 배양액에서 세포 (10 μM, Y27632)과 섞어 부드럽게 피펫을 다시 일시 중지합니다. 기음 MEF의 6cm 판에서 중간 및 각 플레이트에 3 ㎖의 세포 현탁액을 추가합니다. D에 매체를 변경3 다음 매일 님. 분할 비율 하위 문화> 80 % 합류 판 세포 1 : 3.
참고 : 일반적으로 5~7일에 플레이트가 합류하게된다. 사용 공급기는 CF1 마우스 배아에서 얻은 방사선을 γ에 노출 불 활성화된다.
- 기저막 매트릭스 코팅 된 플레이트에 H9 세포 배양
- 해동 줄기 세포 배지 (5 배) 실온에서 보충 및 바이오 안전성 캐비닛에 100 ㎖ ㎖의 400에 기초 배지를 추가합니다.
- 얼음에 해동 기저막 행렬. 기저막 행렬의 제안 볼륨을 추가 열두 6cm 판에 대한 DMEM / F-12 기초 배지 냉각 (24) 용액에 (각 배치에 대한 분석 증명서 참조). 로 pipetting 아래로 섞는다.
- 각 6cm 판 2 ML을 추가합니다. 1 시간 동안 실온에서 판을 보관하십시오. 매체를 제거하고 줄기 세포 배지 2 ㎖를 추가합니다.
- MEFs에 네 개의 합류 H9 판을 꺼냅니다. 바이오 안전성 캐비닛에 보관 실체 현미경 1 ML의 피펫 팁과 차별화 된 식민지를 제거합니다.
- 대기음매체와 4 ml의 PBS로 세포를 씻어 각 플레이트 세포 매체 줄기 ㎖로 2를 추가합니다. 6-9 개 각각에 26 G 바늘 미분화 식민지를 잘라.
- 조심스럽게 50 ㎖ 팔콘 튜브에 세포를 수집합니다. 5 분 동안 200 XG에 원심 분리기.
- 뜨는을 기음과 세포 매체 줄기 ㎖로 (12)에 다시 일시 중지합니다. 현미경 유리 슬라이드에 20 μl를 넣어 덩어리를 계산하고 ml의 당 150 덩어리의 볼륨을 조정합니다. 각 6cm 판에서 정지 2 ㎖를 추가합니다.
- 덩어리 균일 분포에 대해 전후 및 좌우 운동을 플레이트를 이동하고, 세포 배양 인큐베이터 (37 ℃, 5 % CO 2)에 플레이트를 배양.
- 차별화 된 식민지를 제거하고 매체 변화마다 다른 일을 제공합니다.
2. 배아 체 (사채) 형성
무균주의 사항에 따라 및 바이오 안전성 캐비닛에 아래에 언급 된 모든 절차를 수행합니다.
- 일 0 & #8212; V 바닥 플레이트 상 H9 세포 도금
- 이러한 PBS에 플루로 닉 F 127으로 5 %의 블록 공중 합체를 제조하고 0.22 ㎛의 멸균 필터를 이용하여 진공 여과 구동 시스템을 통해 필터링.
- 웰당 5 %의 블록 공중 합체의 40 μl를 96 웰 플레이트 바닥과 45 분 동안 RT에서 배양 코트 V.
- 인큐베이터에서 H9 세포와 합류 지하실 막 매트릭스 플레이트를 제거하고 바이오 안전성 캐비닛에 실체 현미경 1 ML의 피펫 팁과 차별화 된 식민지를 제거합니다.
- 매체를 대기음 4 ml의 PBS로 세포를 씻어. 각각의 판에 (bFGF를, RD 매체없이 H9 배양 배지) 2 ml의 임의의 차별화 매체를 추가합니다. 통로 도구를 사용하여 바이오 안전성 캐비닛에 실체 현미경 관찰에 의해 균일 한 크기와 모양의 덩어리에서 H9 세포 식민지를 절단하고 부드럽게 세포 스크레이퍼로 긁어.
- 5 분 200 XG에 50 ㎖ 팔콘 튜브와 원심 분리기의 덩어리를 수집합니다. 뜨는을 기음과 CEL을 다시 중단RD 매체에 난 ml의 1,000 덩어리를 얻을 수 있습니다.
- V 바닥 판으로부터 블록 공중 합체를 대기음. 멸균 사각형 접시에 덩어리를 붓고 멀티 채널 피펫의 도움으로 V 바닥 판의 각 웰에 서스펜션의 100 μl를 추가합니다.
- 덩어리의 힘 집계를 들어, 원심 분리기 400 x g에서 4 분 4 ° C에서 V 바닥 판. 나흘 세포 배양 인큐베이터 (37 ℃, 5 % CO 2)에 플레이트를 인큐베이션.
- 4 일 - 사채의 컬렉션
- 멀티 채널 피펫 넓은 구멍 200 μL 정보를 사용하여 V 바닥 판에서 멸균 사각형 접시에 EBS을 (를) 수집합니다.
- 10 ml의 멸균 혈청 피펫으로 15 ㎖의 팔콘 튜브에 멸균 사각형 접시에서 EBS을 (를) 수집합니다. 사채가 2 분 동안 정착하도록 허용합니다. 뜨는을 대기음, 5 ml의 PBS로 EBS을 (를) 씻는다.
- 사채가 2 분 동안 정착 뜨는을 대기음하도록 허용합니다. 5 ml의 RD 매체에서 EBS을 (를) 다시 일시 중지합니다.
- 10cm에서 밖으로 피펫 10 ML의 RD 매체세균 판. 10cm 세균 판에서 EBS을 (를) 전송합니다.
- (50 / 분 왕복 운동) 세포 배양 인큐베이터 (37 ℃, 5 % CO 2)에 필요한 시간 기간 동안 유지 수평 진탕 기에서 세균 접시를 부화. 매체 변화 (15 ml의 RD 매체) 모든 다른 일을주십시오.
참고 : 부드러운 핸들링이 요구되는 인간 배아 줄기 세포를 배양한다. 사채의 크기는 더 실험 실체 현미경 관찰에 의해 균일 한 크기의 사채 (± 20 %)을 선택 하루 4. 다릅니다. 이 방법으로 형성된 약 50 % 사채의 크기가 균일하다. 균일 한 모양의 통 결과에 사채의 전송.
3. 세포 독성 분석 IC (10) 결정을위한
- 광학 바닥 판에 사채의 전환
- 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 당 0.1 % 젤라틴의 50 μL와 15 분 코트 광학 바닥 판 37 ℃에서 물을 욕조에 0.1 % 젤라틴을 녹여. RT에서 번호판을 품어45 분. 부화 후 광학 바닥 판에서 젤라틴을 대기음.
- RD 매체를 포함 10cm 세균 판에 4 일에 수집 된 EBS을 (를) 꺼냅니다.
- 바이오 안전성 캐비닛에 기울어 진 위치에 광학 바닥 판을 보관하십시오. 전송 실체 현미경 하에서 관찰하여 광학 바닥 96 웰 플레이트에 웰 당 100 μL RD 매체에 사채의이 균일 한 크기. 빈 12 일 열을 유지합니다.
- 24 시간 동안 세포 배양기 (37 ℃, 5 % CO 2)에 플레이트를 인큐베이션.
- 14 일까지 5 일에서 약물 노출
- 시험 화합물을 달아 알려진 용매에 가장 높은 농도를 확인합니다.
- 더 튜브를 유지, 직렬 H에로 번호 팔콘 튜브를 포함하는 용매 8 희석까지 시험 화합물의 절반 로그 희석을 수행한다. I 차량 제어 튜브 없음 등. J 부정적인 제어 (RD 매체) 및 튜브 등. (70 % 에탄올) 제어와 같은 긍정적 인 K.
- 37 ℃에서 수욕 RD 매체 해동15 분 동안 C를 °. 1-11 레이블 (11) 멸균 팔콘 튜브에 5 ML의 RD 매체 각을 가져 가라.
- 이전 5 각각 11 관 (1)에 튜브 K에 튜브에서 솔루션의 μL와 튜브를 소용돌이. 인큐베이터에서 광학 바닥 판을 꺼내 조심스럽게 멀티 채널 피펫을 사용하여 용지를 제거합니다.
- 광학 바닥 판의 각각의 컬럼에 11 튜브 번호 1에서 미디어 200 μl를 추가합니다. 중 / 약 변화마다 다른 일을주십시오.
주 : 반 로그 희석 직렬 튜브 2 호, 소용돌이와에 가장 높은 농도 튜브 1 번 전송 3 μL 8. 2에서 표시된 7 관에서 용매 6.48 μL를 가지고 다음 튜브에 3 μl를 전송. 부정적인 제어를위한 차량 제어 및 튜브 10 번에 대한 관 9 번을 유지합니다. 튜브 11 호 70 % 에탄올이다.
- 일 14 : 레사 주린 노출과 형광 측정
- 15 분 동안 37 ℃의 물을 욕조에 해동 RD 매체. 모든 절차 mentio를 수행N 아래 바이오 안전성 캐비닛에서 빛의 부재.
- 15 ML 튜브 (A)에 10 ml의 RD 매체를 가지고 레사 주린 시약의 권장 용량을 추가하고 피펫으로 혼합한다. 인큐베이터에서 광학 바닥 판을 꺼내 조심스럽게 멀티 채널 피펫 모든 매체를 제거합니다.
- 각 웰에 관에서 매체의 100 μl를 추가합니다. 90 분 동안 세포 배양기에서 배양 판 (37 ℃, 5 % CO 2)를 부화.
- 형광 사용하여 분광 광도계 (560 예 / 590 엠)을 측정한다.
- IC 10 값 결정
- 빈 값을 뺀 그래프 패드 프리즘의 값을 가져옵니다. 형광 단위로 투여 및 Y 축으로 설정 X 축.
- Y 축에 대한 백분율을 구하고 값 (로그 스케일로서 X 축)을 변환하는 값을 정규화한다. S 자형 투여 량 - 반응 (가변 슬로프) 파라미터를 이용하여 IC 50 값을 계산한다. 다음을 사용하여 IC 10 값을 계산하는 로그식 :
F = 10 logEC 50 = logECF - (1 / HillSlope) * 로그 (F / (100-F))
Y = 아래 + (상위 - 하위) / (1 + 10 ^ ((LogEC 50 -X) * HillSlope)) - 결정 IC (10) 값은 추가 연구를 위해 할 수 있음.
4. 바이오 마커 연구 마이크로 어레이 기반으로
- 하루 5 일 0 :
- 배아 체 형성과 전달에 10cm 세균 판 - 배아 체 형성을위한 점 2에 언급 된 단계를 수행합니다.
참고 : 각 연구에 대한 세 가지 생물학적 복제를 사용합니다. IC (10) 농도와 차량 제어에 약물 치료 - 각 생물이 부분에 복제를 나눈다. 차량에 약물 농도를 IC (10) 농도 위의 10,000 배를 준비하고이 50 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 H9 세포 덩어리와 100 ㎖ RD 매체에 10 μl를 추가에서 잘 혼합 및 V 바닥 판에 씨앗. 차량 제어 그룹에 대해 동일한 절차를 수행합니다.
<14 일 5에 약물 노출에 대한 리>, EB's를 수집하고 점에 언급 된 단계에 따라 4 일에 10cm에 세균 판을 전송할 수평 셰이커 (왕복 운동 50 / 분)에서의 플레이트 (2) 전송 세포 배양 인큐베이터 (37 ℃에서 5 % CO 2) 14 일간. 매체 변화마다 다른 일을주십시오. - 배아 체 형성과 전달에 10cm 세균 판 - 배아 체 형성을위한 점 2에 언급 된 단계를 수행합니다.
- 시료 채취를 들어, 14 일에, 멸균 혈청 학적 피펫 15 ㎖의 팔콘 튜브에 10cm 플레이트에서 사채를 수집합니다. 사채가 2 분 동안 정착하도록 허용합니다. 뜨는을 대기음, 5 ml의 PBS로 EBS을 (를) 씻는다. 사채가 2 분 동안 정착 뜨는을 대기음하도록 허용합니다. 1 ML의 RNAlater 솔루션 또는 트리 졸 시약, 소용돌이에 EBS을 (를) 다시 중단하고 추가 처리까지 -80 ° C에서 샘플을 저장합니다.
참고 : 좋은 실험실 관행에 따라 바이오 안전성 캐비닛에 모든 절차를 수행합니다. 멸균 유리 pastu의 도움으로 주변에서 매체를, 중앙에 모든 EBS을 (를) 가져 대기음에 중심을 원 운동의 판을 회전피펫 재, 15 ml의 RD 매체를 추가 한 다음 각각의 그룹에 대한 약물 / 차량의 15 μl를 추가합니다.
5. RNA의 분리 및 무결성 테스트
- RNA 분리 :
아래에 언급 된 단계의 대부분은 사용 설명서에 따라 분리하고, RNeasy 미니 키트를 사용하여 RNA의 정제를 위해 수행되어야한다. 항상 뉴 클레아 무료 튜브, 피펫 팁과 물을 사용합니다. 트리 졸 작업하는 동안 화학 물질 안전 후드의 모든 절차를 수행하고 보호 안경뿐만 아니라 화학 보호 장갑을 착용하십시오.- 얼음에 샘플을 해동. 샘플 RNAlater 용액에 저장되어있는 경우, 4 ℃에서 5 분 동안 12,000 XG에서 튜브를 원심 분리. 뜨는을 취소하고 1 ml의 트리 졸 시약을 추가 할 수 있습니다.
- 24 G 바늘 및 1 mL의 주사기를 사용하여 샘플을 씹다. 약 15 시간의 분쇄 사채, 세포벽 및 세포막의 파괴에 충분하다.
- 각 샘플에 클로로포름 200 μl를 추가합니다. 소용돌이 균일 내용을 혼합합니다. 원심 분리기4 ℃에서 15 분 동안 12,000 XG에. 하고, RNeasy 미니 스핀 컬럼, 1.5 ml의 튜브를 제거하고 적절하게 레이블을 붙입니다.
- (상층 액을 수집하는 중간 또는 하단의 레이어를 방해하지 않지만)를 1.5 ml의 튜브에 뜨는을 수집합니다. 냉장 70 % 에탄올의 동일한 볼륨을 추가합니다. 부드럽게 흔들어 내용을 섞는다.
- 각각의 미니 스핀 컬럼에 튜브에서 700 μl를 적용하고 실온에서 20 초 동안 12,000 XG에 그들을 원심 분리기. 실온에서 모든 추가 단계를 수행합니다.
- 여과 액을 버리고 각각의 컬럼에 남아있는 솔루션을 적용하고 20 초 동안 12,000 XG에 그들을 원심 분리기. 여과 액을 버린다.
- 컬럼에 RW1 버퍼 350 μl를 적용하고 20 초 동안 12,000 XG에 그들을 원심 분리기. 여과 액을 취소하고 열 10의 DNase의 μL, 70 μL RDD 버퍼를 적용합니다.
- 실온에서 15 분 동안 인큐베이션. 컬럼에 RW1 버퍼 350 μl를 적용하고 20 초 동안 12,000 XG에 그들을 원심 분리기. 여과 액을 버린다. 500 μl를 적용RPE는 열을 버퍼 20 초 동안 12,000 XG에이를 원심 분리 세척 할 것. 여과 액을 버린다. 다시 열을 RPE 세척 버퍼의 500 μl를 적용하고 2 분 동안 12,000 XG에 그들을 원심 분리기. 여과 액을 버린다.
- 새로운 2 ㎖의 수집 튜브에 열을 이동하고 1 분 동안 12,000 XG에 그들을 원심 분리기. 레이블 1.5 ml의 수집 튜브에 열을 전송하고 클레아 무료 물을 22 μl를 적용합니다. 1 분 동안 12,000 XG에서 튜브를 원심 분리기.
- 포집 관을 제거하고 얼음에 넣어 두 었어요. RNA는 자동화 된 전기 영동 시스템을 이용하여 정량화.
- RNA 농도, 순도 및 무결성 테스트.
RNA의 순도 및 무결성에 사용하는 자동화 된 전기 시스템과 각각의 키트 (33)을 테스트.
6. 마이크로 어레이 연구
- 상용 가능한 인간 어레이 칩을 사용 전사 프로파일 링을 수행합니다. RNA 대상 준비, 조각, 하이브리드 (34)와 배열칩 염색, 세척 35 사용 가능한 상용 키트.
- 표준 플루이 딕스 스테이션 및 스캐너 어레이 표준 운영 소프트웨어 (36)를 사용하여 어레이 칩 검사 및 품질 제어 검사를 수행한다. 유전자 발현 분석을위한 표준을 사용할 수 상용 소프트웨어 (37) 스캐너에서 생성 된 파일을 가져, 강력한 멀티 어레이 분석 (RMA)과 배경 보정, 요약 및 정상화를 수행합니다.
- 차등 발현 유전자의 목록을 얻기위한 (DEG의) 하나의 방법 ANOVA 분석을 수행합니다. 이 목록에서 배 변화 (± 2) 루즈 벨트 제어 P 값 (<0.05)를 기반으로 유전자를 필터링 할 수 있습니다. 이 소프트웨어를 사용하는 등의 주성분 분석 (PCA), 열지도를 얻습니다.
제 2 부 UKN 1 테스트 시스템
hESC의 1. 유지 보수
- MEFs에의 시드
- 차별화 NSCB 번호 8534 (H9) 세포주를 사용합니다. 문화 CE피더 세포로 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)에 대한 재편. 0.1 % 젤라틴의 용액과 함께 4 코트 T25 플라스크에 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다.
- 37 ℃ 수조에서 해동 된 MEFs 및 미리 예열 DMEM / 10 % FBS에 세포를 옮긴다.
- 500 XG 3.5 분간 스핀 상청액을 제거하고 1 × 107 세포 / ml를 수득 세포를 일시 중지 재. 젤라틴에 T25 플라스크에 4 × 104 / ㎠ 플레이트 MEFs에. 선택적으로, 다음 이틀 동안 MEFs에 사용합니다. MEF 배치의 품질 hESC의 유지 보수를위한 아주 중요한 문제입니다. 그러므로 H9 세포에 최고의 회사 및 그 제조 방법을 규명하는 것이 바람직하다. 우리는 PMEF (P3)를 사용합니다.
- 분할 및 H9의 유지 보수
- T25 플라스크 H9 당 1 ml의 사전 예열 디스 파제를 추가하고 37 ° C에서 9 분을 품어.
- 2 ml를 처리 한 세포와 피펫 5 회까지와 팔콘 튜브에 5 ML의 피펫 및 전송 세포 솔루션 다운 디스 파제하는 매체를 세척 추가합니다.
- 9 ml의 매체를 씻어 플라스크를 씻어그리고 다른 사람에 셀을 추가 할 수 있습니다. 500 XG 3.5 분 스핀 뜨는을 제거하고 10 ml의 hESC의 배지에서 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 500 XG 3.5 분 스핀 뜨는을 제거하고 4 ml의 hESC의 배지에서 세포를 다시 일시 중지합니다. MEFs에와 새 (PBS 세척) T25 플라스크에 0.5 ml의 세포 현탁액 4.5 ml의 hESC의 매체와 플레이트를 추가합니다. 매일 플라스크의 전체 hESC의 매체 (5 ㎖)을 변경합니다.
신경 외배엽 전구 세포으로 hESC의 2. 차별화 (NEP)
- hESC의 매체와 KCM 매체를 준비합니다. 코트 한 10cm의 T25 플라스크 당 젤라틴 (PBS 0.1 %)와 요리와 37 ℃에서 30 분 동안 품어. hESC의에서 매체를 제거하고 플라스크의 전체 바닥 (T25 플라스크 당 1 ml)에 커버하고 37 ℃에서 25 분 30을 배양 할 수있는 충분한 accutase를 추가합니다.
- accutase 배양 동안 기저막 매트릭스 코팅 된 플레이트를 준비합니다. 냉동 기저막 매트릭스 펠렛에 차가운 DMEM / F12 키를 추가하고 1:20 해결. 필터 기저막 매트릭스 SOLU40 μm의 셀 스트레이너를 통해 기. 판에 필터링 솔루션을 추가, 전체 바닥 커버 (6 웰 당 1 ml의 필요) 및 실온에서 2 시간 동안 배양해야합니다.
- 잠복기 후 코팅 우물에 지하 막 매트릭스 뜨는 종자 세포를 제거합니다. accutase 단계 (2.1) 후 1.5 ml의 HES 매체를 첨가하여 반응을 중지합니다. 플라스크에서 세포를 긁어 hESC의 8 mL의 배지를 첨가하고 잘 10 ㎖ 피펫과 피펫에 의해 단일 세포 용액을 제조. 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터 세포.
- 스핀 셀 500 XG 3 분, 상등액을 제거하고 hESC의 10ml에 세포를 다시 일시. 스핀 세포는 다시 3 분 XG 500, 상등액을 제거하고 ROCK 억제제 Y-27632 10 μM의 최종 농도로 함유 hESC의 세포를 일시 중지 재.
- 젤라틴 코팅 접시의 상층 액을 제거합니다. 젤라틴 코팅 접시에 플레이트 세포 현탁액은 MEFs에를 제거하고 정확히 1 시간 동안 인큐베이터에두고있다.
참고 :이 단계에서 MEFs에 의지의ettle hESC의 젤라틴을 첨부 할 수없는 반면, 젤라틴 코팅 된 판에. 따라서이 공급이없는 미분을 구하는 것이 중요하다. 그것은 MEFs에의 비효율적 인 제거에 같은 중요한 단계 hESC의 대단히 짧은 시간에 너무 오래 배양 결과와 너무 짧은 배양이다. 배양 45 분 후 판은 이미 정착 MEFs에와 hESC의 대단히 짧은 시간에 대해 조사해야합니다. - MEFs에 부착되면, 조심스럽게 접시에 이미 매체와 배양 후 오프 비 부착 세포 (hESC의)을 씻는다. 여러 T25보다 세포를 얻기 위해 사용된다면, 하나의 세포가 이제 결합 될 수있다. hESC의 매체에 한 번 판을 씻으십시오.
- 스핀 세포 500 XG 3 분, 상층 액을 제거하고 / ㎖ FGF-2 10 μm의 바위 억제제 Y-27632, 10 NG를 포함 약 4 ML의 KCM의 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 트리 판 블루를 사용하여 혈구 세포를 계산합니다. 포함 KCM의 판을 코팅 기저막 행렬에 플레이트 (18) × 103 세포 / ㎠ 10 μm의 바위 억제제 Y-27632과10 NG / ㎖ FGF-2 (6 잘 잘 당 1.5 ml에 용). 그것은 네프에 성공적으로 차별화 할 수있는 권리 밀도의 세포를 판 것이 중요하다.
- 24 시간 후, 10 μm의 ROCK 저해제 Y-27632 10 NG / ㎖ FGF-2 포함 신선한 KCM에 매체를 변경합니다. 또한 24 시간 후, 10 NG / ㎖ FGF2를 포함하는 신선한 KCM에 매체를 변경합니다.
- 세포를 파종 후 72 시간은 차별화 KSR 매체에 대한 매체 변화에 의해 시작됩니다. 이 시점은 분화 0 (DoD0)의 일이라고한다. 시험 물질의 첨가는 현재 가능하다.
- DoD1과 DoD2의 매체는 정확히 DoD0에로 변경됩니다. 다음 매체 변화는 DoD4 25 % N2-S 75 % KSR를 포함이다. DoD6에서 분화가 정지 및 세포 분석을 위해 수확.
hESC의 및 NEP 3. 염색질 면역 침전 (칩)
- 핵의 준비
- 분석하고 25-30 분 동안 배양한다 각 6도에 accutase 500 μl를 추가합니다. COU트리 판 블루를 사용하여 노이 바 우어 챔버에서 NT 세포.
- 가교에 대한 DMEM / F12 1 % 포름 알데히드에 재현 탁 세포. 가교를 10 분간 중지 한 후, 125 mM의 최종 농도 트리스 pH가 7.5을 추가한다.
- 스핀 세포 4 ° C에서 500 XG와 3 분, 상층 액을 제거하고 차가운 PBS로 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 스핀 세포 4 ° C에서 500 XG 3 분 / 1 × 10 6 세포를 버퍼 L1- 1 ml의 세포를, 상층 액을 제거하고 다시 일시 중지합니다.
- 얼음에 5 분 동안 품어. 스핀 4 ° C에서 800 XG와 5 분, 상층 액을 제거하고 / 2 × 10 6 세포를 버퍼 L2-1 ml의 핵을 일시 중지 다시.
- 초음파 및 품질 관리
- 300-700 bp의 길이의 DNA 단편이 생성되도록 초음파 처리. 4 ℃에서 10,000 XG로 1 분 스핀. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 조각 그렇지 않으면 면역 비효율적뿐만 아니라 다음 qPCR에있을 것입니다, 정확한 크기가 필요합니다.
- 50 μL를 제거50 μL의 L2 버퍼 D 믹스 아가 로스 젤을 실행하여 초음파의 효율성을 확인합니다.
- 4 시간 500 rpm으로 65 ℃에서 배양 가교 역으로 수행하십시오. 로드 샘플 1 : 1.5 % 아가로 오스 겔에 오렌지 G 로딩 염료와 5는 1X TBE 버퍼에 110 V에서 45 분을 실행합니다. 제어 조각 크기 (300-700 BP 사이에 있어야한다).
- 염색질 면역 침전
- 샘플을 희석 한 5를 희석액과 분취 량 내 IP 당 1 ml의 실리콘 화 튜브.
- "입력"으로 4 ° C에서 희석 염색질 샘플 (단계 3.3.1) 및 저장소에서 5 % (부피)를 제거합니다.
- 회 전자에 4 ° C에서 불특정 IgG의 O / N 선택과 함께 항체와 샘플을 품어.
- 면역 후 각 시료 50 μL 단백질 A / G 세 파로스 구슬을 추가합니다. 회 전자에 4 ° C에서 샘플 3 시간을 품어. 4 ° C에서 1,500 XG로 1 분 스핀과 상층 액을 제거합니다.
- 1 ml의 세척 구슬 씻으십시오. 회전 1 분 1,500 XG에와4 ° C와 뜨는을 제거합니다. 시간에 단계를 반복 G. 1 ml의 최종 세척 버퍼로 씻으십시오. 이 직접 용출액의 양을 변경하기 때문에 세정 단계 동안 사용하면, 비드 중 하나를 잃지 않을 것이다.
- 원심 분리기 1 ~ 4 ° C에서 1,500 XG와 분, 상층 액을 제거합니다. 125 μL 용출 버퍼를 추가하고 통에 1,000 rpm에서 65 ° C와 15 분 품어.
- 1,500 XG로 1 분 스핀과 새로운 튜브의 단계를 반복 K와 L에 뜨는을 전송합니다. 입력 (3.3.2)에 200 μL 용출 버퍼를 추가합니다. 각 샘플에 테 K와의 RNase를 추가하고 통에 500 rpm에서 37 ℃로 30 분을 품어, 그 후 4 시간 통에 500 rpm에서 65 ° C와.
참고 : DNA 추출 사용 상용 가능한 칩 DNA 깨끗하고 집중 키트 (38)하십시오.
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Representative Results
UKK 테스트 시스템 중의 메틸 수은 노출
세포 독성 분석은 IC 10 값 메틸 수은의 세포 독성 (10 % 가능성의 감소) (도 1)를 얻었다 H9 EB를 행 하였다. 우리는 또한 마이크로 어레이 기반 (어피 메트릭스 플랫폼) 바이오 마커 연구를 시행 하였다. H9 사채는 14 일 동안 메틸 수은 (0.25 및 1 μM)에 노출되어있다. 14 일째에, 샘플 TRIZOL를 사용하여 수집되었고,이 RNA를 분리 하였다. 전사 프로파일 링은 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이 칩을 사용하여 수행 하였다. 데이터는 PARTEK 게놈 스위트 TM 6.6로 분석되고있다. 첫 번째 데이터 개요는 주성분 분석 (도 2A), 벤 다이어그램의 생성 (도 2b)과 히트 맵의 구성 (도 2c)에 의해 수득 하였다. 주성분 분석은 유전자 발현의 전체적인 분포를 나타내고 명확 segreg 시각화차량 제어에서 메틸 수은 1 μm의 메틸 수은 (# 25.2 PC) 0.25 μm의 그룹 (그림 2A)의 ATION. 차별적으로 발현 된 유전자의리스트 (DEG)이 후에 얻었다 통계 처리 (일방 ANOVA) 및 ± 2 배 변화 컷오프 및 다중 - 정정 (Benjamini-호흐 베르크 방법) p 값을 사용하여 데이터를 필터링 <0.05 (표 1). 1 μm의 메틸 수은 처리는 276 DEGs 31 DEGs (그림 2B) 0.25 μm의 결과. 열지도는 메틸 수은 1 μm의 치료는 주로 유전자 발현 (그림 2C)을 감소 것을 보여 주었다. 부풀려 유전자 온톨로지 용어에 대한 정보는 데이비드 생물 정보학 도구를 사용하여 구 하였다. 표 2는 5 개 이상의 유전자를 포함 크게 부풀려 GO 유전자 범주를 나타냅니다. 신경 시스템 개발과 관련된 아래로 조절 전사 인자가 확인되었다. SEPP1, DDIT4, AK4, FRZB (두뇌 개발), (PI)TX (신경 핵 개발)과 ERBB3, UGT8,으로 ApoB, APOA1 (신경 시스템 개발은) 메틸 수은 처리 (표 3)에 대한 용량 의존적으로 하향 조정했다.
UKN 1 테스트 시스템
이 분화 프로토콜은 차별화 여섯 일 이내에 NEP의 순수한 인구를 생성하는 이중 SMAD 억제 수준 (6)를 사용합니다. 생성 된 세포는 신경 전구 PAX6 유전자와의 Otx2의 상향 조절 (up-regulation)을 특징으로한다. 줄기 세포 마커 OCT4 및 Nanog를 아래로 NEP (그림 3A)으로 분화하는 동안 통제된다. 때문에 고도의 동기 및 균질 차별화, 그것은 개발의 초기 단계에서 히스톤 수정에 대한 정보를 얻을 수있다. 우리는 분화의 시작 또는 6 일 후에 어느 세포를 사용하여 면역 침전 (칩) 염색질의 프로토콜을 채택차별화. PAX6와의 Otx2의 프로모터 영역에 메틸화 사이트의 스위치는 이러한 연구 (그림 3B)에서 분명했다. 조사 메틸화 사이트는 3 라이신 4 trimethylation (H3K4me3) 및 히스톤 3 라이신 27 trimethylation (H3K27me3)가 분화하는 동안 매우 역동적이었다을 히스톤. 또한 단백질 수준 인 Oct4의 다운 규제는 (그림 4)을 관찰 할 수있다. PAX6의 상향 조절과 신경 줄기 세포 마커 네 스틴은 단백질 수준에서 면역 형광 현미경으로 관찰되었다 (도 4). 셀 인구는 차별화 육일 후 균일하고 순수한 차별화를 보여 주었다. 따라서, 배양 물은 쉽게 RNA와 단백질의 분석을 위해 사용될 수있다. 시스템은 또한 물질 및 신경 발달 초기에 16,29 그들이 가진 효과를 테스트 할 수있는 가능성을 제공한다.
그림 메틸 수은 1. 세포 독성 분석 (H9 차별화). 분석은 메틸 수은의 IC (10) 값을 정의하는 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
UKK 테스트 시스템의 적용 후, 0.25 μM 및 1- 메틸 수은에 의해 유도되는 유전자의 차등 발현도 2 주제 분석. 인간 배아 줄기 세포는 UKK 테스트 시스템에 따라 0.25 및 1 μM 메틸 수은으로 처리했다. 차동 분석 14 일 분화 EBS의 성적이 PARTEK 게놈 스위트 TM 6.6 소프트웨어를 사용하여 수행 된 표현. (A) 마이크로 어레이 데이터를 주성분 분석 (3- Dimenional). (B) 벤 다이어그램은 유전자 발현 마이크로 어레이 분석을 통해 얻어진. 그림은의 수를 표시메틸 수은 처리 (배 변경> ± 2, p 값 <0.05)에 의해 변조 유전자. (C) 유전자 발현 데이터의 계층 적 클러스터링 (변경 폴드> ± 2, p 값 <0.05). 용매 대조군에서 고도로 발현 된 유전자는 1 μM 메틸 수은 처리에 의해 억압된다. . 차량 제어 그룹에 비교으로 1 μm의 메틸 수은 처리는 낮은 식 (233) 성적 증명서 및 높은 식 43 프로브 결과 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
NEP으로 hESC의에서 분화하는 동안 그림 3. 유전자 발현 및 히스톤 메틸화 패턴은. 모든 실험을 위해, hESC의는 신경 외배엽 전구 세포 (NEP)으로 구분 하였다. () 샘플 D에서 찍은신경 분화 마커 유전자의 AY 분화 6, 전사 레벨은 RT-qPCR에 의해 결정 하였다. 데이터 (hESC의 상대 유전자 발현)는 5 실험의 평균 ± SEM이다. 크로 마틴 면역 (칩)에 대한 (나) 시료는 분화 하루 6에서 제조 하였다. 칩은 H3K4me3 또는 H3K27me3 또는 제어 IgG에 대한 특이 항체를 수행 하였다. 프로모터 시퀀스의 농축 계수는 H3K4me3 (회색)과 H3K27me3 (검은 색)에 대한 % 입력으로 주어진다. 데이터는 3 독립적 인 셀 준비의 SEM ± 수단이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
향해 NEP. hESC의 분화 동안로부터도 4 단백질 발현 세포는 고정되고 줄기 세포 마커 염색분화 (DoD0)의 날 0과 분화의 6 일 (DoD6)에서 NEP 마커 PAX6 (적색)과 네 스틴 (녹색)에 대한 인 Oct4 (녹색). 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
차등 발현 유전자의 표 1. 목록 (> ± 2 배, p 값 <0.05) 십사일 된 EBS의 차량 제어 대 메틸 수은 처리. 이 표를 보려면 여기를 클릭하십시오.
트란 조절 이상으로 크게 강화 및 선택 GO 카테고리의 표 2. 목록 (p 값 <0.05> 5 유전자)십사일 된 EBS의 차량 제어 대 메틸 수은에 대한 스크립트.
| GO 기간 | 계산 | P 값 | 유전자 |
| 세포 사멸의 규정 | (18) | 0.0068 | ARHGEF3, TBX3, ERBB3, MITF, BNIP3, CDH1, IGF2, IFI16, HGF, GCH1, AMIGO2, SERPINB9, KRT18, MSX1, ETS1, VEGFA, PERP, IGFBP3 |
| 세포 증식의 규제 | (17) | 0.0123 | RBP4, LYN, TBX3, ERBB3, MITF, IGF2, KDR, RERG, MSX1, ADM, ETS1, VEGFA, BNC1, ADAMTS1, FABP1, IGFBP3, FIGF |
| 혈관 개발 | (12) | 0.0001 | PLAT,으로 ApoB, HAND1, TBX3, EPAS1, FOXF1, LEPR, VEGFA, COL3A1, LOX, FIGF, KDR |
| 골격 시스템 개발 NG> | (12) | 0.0008 | RBP4, MSX1, LGALS3, TBX3, HOXB6, COL3A1, STC1, IGF2, POSTN, FRZB, IGFBP3, AHSG |
| 심장 개발 | (11) | 0.0001 | RBP4, ACTC1, MSX1, HAND1, TBX3, ADM, PKP2, ERBB3, GATA6, COL3A1, ADAMTS1 |
| 포도당 대사 과정 | 9 | 0.0003 | PDK1, RBP4,는 ldhA, PGM5, PYGL, HK2, PFKP, IGF2, PGK1 |
| 폐 개발 | 7 | 0.0008 | RBP4, EPAS1, GATA6, FOXF1, VEGFA, LOX, KDR |
| 상피 개발 | 7 | 0.0386 | F11R, FREM2, GATA6, FOXF1, VEGFA, DSP, KDR |
| 중배엽 개발 | (5) | 0.0088 | HAND1, TBX3, FOXF1, VEGFA, SNAI2 |
| 기간 | 유전자 기호 | * 변경을 접어 | |
| VC 대 0.25 μm의 메틸 수은 | VC 대 1 μm의 메틸 수은 | ||
| 두뇌 개발 | SEPP1 | -2.17 | -4.13 |
| DDIT4 | -1.20 | -3.11 | |
| AK4 | -1.41 | -3.08 | |
| FRZB | -1.29 | -2.19 | |
| 신경 세포의 핵 개발 | PITX2 | -2.08 | -4.90 |
| 신경 시스템 개발 | ERBB3 | -1.86 | -2.89 |
| UGT8 | -1.67 | -2.14 | |
| 으로 ApoB | -3.59 | -5.72 | |
| APOA1 | 2.63 | -2.90 | |
| VEGFA | -1.28 | -3.06 | |
* p 값 <0.05
문화 미디어의 표 4. 조성입니다.
| 미스터 번호 | 중간 / 버퍼 이름 | 구성 | |||
| 양 | | ||||
| 1 | MEF 중간 | DMEM 높은 포도당 | |||
| FCS | 10 % | ||||
| 페니실린 | 100 단위 / ㎖ | ||||
| 스트렙토 마이신 | 100 μg의 / ㎖ | ||||
| L 글루타민 | 2 mM의 | ||||
| (2) | H9 문화 매체 | DMEM F12 | |||
| KOSR | 20 % | ||||
| NEAA | 1 % | ||||
| 루타 | 1X | ||||
| β - 머 캅토 에탄올 | 0.1 mM의 | ||||
| 페니실린 | 100 단위 / ㎖ | ||||
| 스트렙토 마이신 | 100 μg의 / ㎖ | ||||
| bFGF를 | 4 NG / ㎖ | 3 | RD 중간 | bFGF를하지 않고 H9 배양 배지 | |
| 4 | 워시 중간 | DMEM / F12 | |||
| 넉 아웃 혈청 Replacment | 20 % | ||||
| 1X 루타 | 1X | ||||
| MEM 비 필수 아미노산 | |||||
| HEPES | 15 mM의 | ||||
| β - 머 캅토 에탄올 | 90 μm의 | ||||
| (5) | KCM 중간 | DMEM | |||
| FBS | 10 % | ||||
| MEFs에 24 시간 동안 배양 | |||||
| 6 | 녹아웃 세럼 교체 (KSR) | ||||
| 넉 아웃 혈청 교환 | 15 % | ||||
| 1X 루타 | |||||
| 1X MEM 비 필수 아미노산 | |||||
| β - 머 캅토 에탄올 | 15 μm의 | ||||
| 머리 | 35 ng를 / ㎖ | ||||
| Dorsomorphin | 600 nm의 | ||||
| SB431542 | 10 μm의 | ||||
| 7 | N2-S | DMEM / F-12 | |||
| Apotransferin | 100 μg의 / ㎖ | ||||
| 포도당 | 1.55 ㎎ / ㎖ | ||||
| 퓨 트레 신 (putrescine) | 10 mM의 | ||||
| 셀렌 | 500 μm의 | ||||
| Progesteron | 20 μm의 | ||||
| 루타 | 200 μm의 | ||||
| 25 μg의 / ㎖ | |||||
| 8 | (L1) 버퍼 | 트리스 산도 (8) | 50 mM의 | ||
| EDTA | 2 mM의 | ||||
| NP-40 | 0.10 % | ||||
| 글리세린 | 10 % | ||||
| 9 | L2 버퍼 | 트리스 산도 (8) | 50 mM의 | ||
| EDTA | 10 mM의 | ||||
| SDS | 1 % | ||||
| (10) | 용출 버퍼 | NaHCO3를 | 100 mM의 | ||
| SDS | 1 % | ||||
| (11) | 세척 버퍼 | 트리스 | 20 mM의 | ||
| EDTA | 2 mM의 | SDS | 0.10 % | ||
| NP-40 | 0.50 % | ||||
| 염화나트륨 | 150 mM의 | ||||
| (12) | 최종 세척 버퍼 | 트리스 | 20 mM의 | ||
| EDTA | 2 mM의 | ||||
| SDS | 0.10 % | ||||
| NP-40 | 0.50 % | ||||
| 염화나트륨 | 500 mM의 | ||||
| (13) | 셀 중간 줄기 | mTESAR TM 기초 배지 | 400 ml의 | ||
| mTESAR TM 보충 | 100 ㎖ | ||||
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Discussion
독성 시험에 대한 전통적인 접근법에 따라서 테스트 비용과 시간이 많이 소요하게 광범위한 동물 연구를 포함한다. 또한, 종간의 차이로 인해 전임상 동물 안전 연구는 인간을위한 관련 잠재적 인 약물의 독성 효과를 예측하는 항상 유효하지 않습니다. 인간이 아닌 영장류, 가장 예측, 여전히 윤리적 강하고 socioeconomical 요구는 빠르게 체외 시험에 민감하고 강력한 개발하는 현대 사회에 의해 제기되고 있지만 인간의 안전과 관련된 시스템.
인간 배아 줄기 세포의 독특한 능력은 그러므로 약물 안전성 시험 6,21위한 전통적인 접근법에 대한 대안으로서 제안되었다 민감한 toxicogenomics 접근법과 조합하여 생체 내 인간 발달 과정 recapitulating 모든 체세포 형태로 분화한다. 'ESNATS'프로젝트 아래 'UKK'테스트 시스템을 예측하기 위해 개발 된transcriptomics 프로파일을 기반으로 개발 배아 독성. 이 시스템에서 hESC의 14 일 동안 배아 체에 차별화되고있다. 얻어진 시간 운동 transcriptomics 프로파일은 부분적으로 초기 인간 배아 발달 요점을 되풀이 14 일에있는 세 개의 배엽의 외배엽, 내배엽과 중배엽에 특정 분화 마커의 높은 식을 보여줍니다. 이러한 결과를 바탕으로, 공지 최기형성 약물 14 일 동안 분화하는 동안 노출 된 차등 유전자 발현 프로파일이 얻어졌다. 인상적으로, 인간에서 관찰 탈리도마이드의 기형 유발과 관련된 유전자 서명은,이 테스트 시스템 (28)에 의해 예측 될 수있다. 신경 시스템 개발과 관련된 전사 인자의 UKK 시스템 쇼 농도 의존적 다운 규제에 메틸 수은에 대한 대표적인 결과. 다른 발달 신경 독성 물질은 또한이 시스템에서 테스트하고 노력을 식별하기 위해 진행된다mRNA의 수준에서 화합물 걸쳐 공통 toxico 마커 및 단백질 수준에서이를 확인. 여기에 제공된 UKK 시험 프로토콜 발달 독성 위해 transcriptomic 서명을 식별하기 위해 인간 배아 줄기 세포와 H9 실험을 수행하기위한 기본적인 지침을 준다.
UKN1 프로토콜에 따라 만능 줄기 세포의 분화를위한 최적화 된 표준 운영 절차 (SOP)는 NEP에 hESC의 강력한 동기화 차별화를 할 수 있습니다. 이미 분화 여섯 일 후에 PAX6 높은 발현 수준을 가진 동종 세포 집단이 생성된다. 세포는 면역 염색에 의한 분석을 허용 자기편 문화에서 성장. 높은 해상도와 공 초점 현미경에 의한 면역 세포 화학 분석은 세포가 얇은 유리 표면에 성장해야합니다. 유리 최적으로 코팅되어있는 경우이 이러한 배양 가능한이지만, 셀은 하나 이상의 단일 층에서 매우 고밀도 성장 언급해야육일 후. 따라서, 혈통 특정 마커의 일상적인 분석을보다 쉽게 RT-qPCR에, 칩 또는 웨스턴 블롯에 의해 수행된다. 문화의 생화학 적 분석을위한 큰 장점은 hESC의 작은 시작 인구에서이 분화 프로토콜에 의해 달성 될 수있다 세포의 높은 수율이다. 이 프로토콜의 한 단점은 균질 한 신경 분화를 강제해야 매체 보조제 (예를 들면, 머리)의 높은 가격이다. 일부 적용에 대한 또 다른 결점은 일부 작은 분자 (키나제 억제제) 프로토콜의 일부로서 배양 배지에 존재해야하는 것일 수도있다. 배양 조건의 변화는도 29의 분화를 변화함에 따라서, 어떤 신호 경로는, 독성 학적으로 검사 할 수 없다.
테스트 시스템의 조합의 이점은 DNT의 이해이다. UKK 초기 세균 층 형성에 더 넓은 범위와 부작용을 포함하는 반면 모든 UKN1을 조사 할 수있다OWS는 후성 유전학과 같은 더 신경 고유의 메커니즘을 알아보고자 하였다. 몇몇 모델이 16 유독물 여기 제시된 두 배양 시스템은 신경 발달을 예측 도시되었지만, 전위 발달 신경 독성 물질의 다수의 선별을 허용 높은 처리량 프로토콜 버전에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 또한, 더 많은 작업을 식별하고의 mRNA 또는 단백질 수준에서 독성의 일반적인 마커를 확인하고, 임상 약물 안전성 평가의 일부로 설정해야합니다.
연간 20 개 이상의 억 달러는 약물 발견 (39)에 대한 제약 산업 투자된다. 개념의 증거로서, 우리는 비용 효율적이고 덜 시간이 소요 방식으로 잠재적 인 약물 화합물의 인간 관련 독성 효과를 예측하기 적합 할 수있다 hESC의 및 transcriptomics을 기반으로 생체 독성 시험 시스템에서 개발했습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
| mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
| V bottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
| Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Kits | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
| Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of equipment | |||
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Genechip Hybridisation Oven - 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of softwares | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |
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References
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- Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1 (2014).
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