Summary
Протоколы описывают два в пробирке тест-систем развития токсичности (УКК и UKN1) на основе эмбриональных стволовых клеток человека и транскриптом исследований. Тестовые системы прогнозирования с развитием токсичности человека, и может способствовать сокращению исследования на животных, затрат и времени, необходимого для тестирования химической безопасности.
Abstract
Эффективные протоколы дифференцировать человека плюрипотентных стволовых клеток в различных тканях в сочетании с -omics технологии открыли новые горизонты для экстракорпорального токсичности тестирования в потенциальных лекарственных препаратов. Чтобы обеспечить прочную научную основу для таких анализов, это будет иметь важное значение для получения количественной информации о времени ходе развития и на основных регуляторных механизмов по системной биологии подходов. Два теста были поэтому настроены здесь этих требований. В тестовой системе УКК, человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭСК) (или другие плюрипотентные клетки) оставляют самопроизвольно дифференцировать в течение 14 дней в эмбриональных телец, чтобы поколение клеток всех трех зародышевых листков. Эта система повторяет основные этапы раннего эмбрионального развития человека, и он может предсказать человеческое конкретных раннего эмбрионального токсичность / тератогенность, если клетки подвергаются воздействию химических веществ во время дифференцировки. Тест-система UKN1 основана на дифференциации ЭСК в populatион нейроэктодермального предшественников (НЭП) клетки в течение 6 дней. Эта система повторяет раннюю развития нервной и прогнозирует раннего развития нейротоксичности и эпигенетические изменения, запускаемые химическими веществами. Обе системы, в сочетании с транскриптом микрочипов исследований, подходят для идентификации биомаркеров токсичности. Кроме того, они могут быть использованы в комбинации для генерации входных данных для анализа системной биологии. Эти тест-системы имеют преимущества перед традиционными токсикологических исследований, требующих больших объемов животных. Тестовые системы могут способствовать снижению затрат на разработку лекарств и оценки химической безопасности. Их сочетание проливает свет на особенности соединений, которые могут повлиять на развитие нервной системы в частности.
Introduction
Способность человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК), чтобы дифференцироваться в различные типы клеток открыл новую эру тестирования в пробирке токсичность 1, моделирования болезни и регенеративной медицины 2. Стволовые клетки наделены способностью к самовоспроизведению, чтобы сохранить их плюрипотентных состояние и дифференцироваться в специализированные клетки 3,4. Свойства чЭСК (способностью дифференцироваться во все основные типы клеток) находятся также в других человеческих плюрипотентных стволовых клеток, таких как человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) или клеток, полученных с помощью ядерного переноса 5. Например, много различных линий чЭСК были дифференцированы в нейроны 6, 7 клеток почек, клеток нервного гребня 8, 9-12 кардиомиоцитов, или гепатоцитов, как клетки 13,14. Кроме того, чЭСК могут спонтанно дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков 15-18 в эмбриональных телец (EBS) 19,20. ЕАрли эмбриональное развитие регулируется с помощью дифференциальной экспрессии различных генов, связанных с различными зародышевых листков, которые были захвачены на уровне мРНК в транскриптомики использованием микрочипов технологии 15. Эти усилия привели к созданию органов конкретных токсикологических моделей, основанных на чЭСК / hiPSC и анализа транскриптомика (для обзора см 21,22). Эти модели имеют преимущества по сравнению с традиционным использованием лабораторных животных для токсикологических исследований, как доклинических исследований с использованием лабораторных животных не всегда прогнозирования человеческой безопасности. Препарат индуцированной токсичности, возникающие у пациентов часто связаны с метаболическими или сигнальных процессов, отличающихся между людьми и экспериментальных животных. Разница виды помешала надежное раннее обнаружение развития токсичности в организме человека, и, например, препаратов, таких как талидомид 23,24 и 25,26 диэтилстильбэстрола были изъяты с рынка из-за тератогенного. ТалиDomide не проявил никакого токсического воздействия на развитие крыс или мышей. Окружающей среды химических веществ, таких как метил ртути привело к 27 пренатального развития токсичности по отношению к нервной системы у различных видов, но человека проявления было трудно смоделировать на животных. Для решения этой проблемы вопросов видовой, ученые, работающие в различных проектах на основе стволовых клеток, как ReProTect, ESNATS, детектив и т.д. занимаются развитием различных моделей для эмбрионального токсичности, нейротоксичности, кардиотоксичности, гепатотоксичность и нефротоксичность, используя человеческие токсикантов, подозреваемых в влиять на людей. В соответствии с Европейской консорциум проекта «Эмбриональные стволовые клетки на основе романа альтернативной тестирования стратегий (ESNATS)" пять тест-системы были созданы. Одно испытание системы так называемый УКК (U niversitäts к linikum К OLN) Тест-система частично захватывает раннего эмбрионального развития человека. В этом System человеческие эмбриональные клетки H9 дифференцированы в трех зародышевых листков (эктодермы, энтодермы и мезодермы) 15 и зародыш слой конкретные подписи были захваченных транскриптомики профиль с помощью микрочипов платформу Affymetrix. Различные токсиканты развития как талидомид 28, вальпроевой кислотой, метилртути 16,17, или цитозинарабинозидом 15 были протестированы в этой системе, и ядовитых конкретных генов подписи были получены. Во втором тестовой системе, так называемый UKN1 (U niversity из К onsta п г) тест-системы 1, клетки H9 дифференцированы в клетки-предшественники нейроэктодермальная (NEP) в течение 6 дней. Это свидетельствует высокий уровень экспрессии нейронных маркеров генов, таких как Pax6 и Otx2. Во дифференциации в течение 6 дней, НЭП клетки были подвержены развития нервно-токсикантов, таких как VPA, метилртути. Токсикант конкретных де-регулируется профили транскриптомика были obtaiопределяется как хорошо с помощью микрочипов платформу Affymetrix 16,29.
Новое видение токсикологии 21-го века предусматривает, что тест-системы не только дать фенотипические описания как гистопатологии в естественных условиях, или изменения транскриптом в конце долгосрочных ядовитых инкубации. Это предполагает, что, скорее анализы обеспечивают механистической информации 3, и что эта информация может быть отображена в так называемые неблагоприятные исходы пути (АОП), которые обеспечивают научное обоснование для опасных последствий 30. Для обеспечения такой информации, тест-системы, применяемые должны быть высоко контроль качества 31, как, например, документально надежных стандартных операционных процедур. Кроме того, время-зависимые изменения должны быть отображены с высоким разрешением. Это требует тестирования систем с синхронизированными изменений 32. Тестовые системы UKN1 и УКК, описанные здесь, были оптимизированы для этих требований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол был выполнен с помощью линии эмбриональных стволовых клеток человеческого (чЭСК) H9. Эта клеточная линия была постоянно культивируют на митотически инактивированной мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) в чЭСК культуры среде с оФРФ, а затем культивируемых в среде стволовых клеток на 6 см чашки Петри с покрытием базальной мембраны матрице, такой как матригеле, чтобы избавиться от MEFs. В H9 клетки> 80% сливающихся пластин были использованы для дальнейшего прохождения. H9 клетки, культивируемые на матричных пластин базальной мембраны были использованы для формирования ЭТ. Все процедуры, указанные в следующей протокола были выполнены с использованием стандартных методов асептики и передовой практики культивирования клеток.
Часть 1. Проверка системы УКК
1. человеческих эмбриональных стволовых клеток Культивирование
- Расщепление и обслуживание H9 на фидерных клеток
- Пипетка 2 мл 0,1% желатина в каждую 6 см планшета и инкубируют в течение 30 мин в клеточной культуре incubATOR (37 ° С и 5% СО 2). Аспирируйте раствор желатина стерильной пипетки Пастера.
- Добавить 2 мл MEF среды, содержащей 0,1 × 10 6 клеток / MEF мл в двух покрытые желатином пластин и инкубируют их в инкубаторе для клеточных культур (37 ° С и 5% CO 2) O / N.
- На следующий день, удалите клетки H9 флакон из бака хранения жидкости азота с помощью щипцов и оттаивать флакон в водяную баню при 37 °, используя длинные щипцы.
- Удалить флакон из водяной бане, бане с 70% этанола, сухой воздух в шкафу биобезопасности в течение 15 до 30 сек, и передавать ячейки 15 мл трубки сокола.
- Добавить 9 мл культуральной среды H9 медленно на внутренней стенке и центрифугировать клетки при 200 х г в течение 5 мин.
- Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливать клеток в 6 мл культуральной среде, содержащей ингибитор ROCK (10 мкм, Y27632) и осторожно пипеткой перемешать. Аспирируйте MEF среды от 6 см пластины и добавить суспензию 3 мл клеток в каждой чашке. Изменение среды на Dай 3, а затем каждый день. Субкультура> 80% сливной пластины клетки с раздельным соотношении 1: 3.
Примечание: Обычно от 5 до 7 дней пластина становится вырожденная. Кормушки используются получаются из CF1 мышей эмбриона и инактивируется под воздействием γ-излучения.
- H9 культивирование клеток на пластинах базальной мембраны матрица с покрытием
- Оттепель среднего стволовых клеток (5x) добавка при комнатной температуре и добавить 100 мл в 400 мл базальной среды в области биобезопасности кабинета.
- Оттепель базальной мембраны матрица на льду. Добавить предложенный объем базальной мембраны матрицы (см сертификате анализа для каждой партии) в 24 мл охлажденного DMEM / F-12 базальной среде в течение двенадцати 6 см пластинах. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз.
- Добавить 2 мл в каждом 6 см пластины. Хранить пластину при КТ в течение 1 ч. Удалить среду и добавьте 2 мл стволовых клеток среды.
- Возьмите четыре сливной Н9 пластины на MEFs. Удалить дифференцированные колонии с 1 мл пипетки под стереомикроскопа хранится в шкафу биобезопасности.
- Придыхательныйсредних и мыть клетки с 4 мл PBS и добавьте 2 клеток среду в каждой чашке мл стволовых клеток. Вырезать недифференцированных колоний с 26 G иглой в от 6 до 9 штук в каждой.
- Осторожно собрать клетки в 50 мл трубки сокола. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин.
- Аспирата супернатант и повторно приостанавливать в 12 мл клеточной среде стволовые. Граф сгустки, поставив 20 мкл на стекле под микроскопом и регулировки громкости на 150 сгустки на мл. Добавить 2 мл суспензии в каждом 6 см пластины.
- Перемещение пластин назад и вперед и из стороны в сторону движения для равномерного распределения комок и инкубировать пластин в культуре клеток инкубатора (37 ° С и 5% СО 2).
- Удалить дифференцированных колонии и дать сменой среды каждый дополнительный день.
2. эмбриональных телец (ЭТ) Формирование
Выполните все процедуры, упомянутые ниже, в асептических меры предосторожности и биобезопасности кабинета.
- День 0 & #8212; Покрытие из клеток Н9 на нижних пластин V
- Подготовьте блок-сополимера 5%, такой как Pluronic F 127 в PBS и фильтруют через вакуум-приводом системы фильтрации с использованием 0,22 мкм стерильный фильтр.
- Шерсть В нижней 96-луночные планшеты с 40 мкл 5% блок-сополимера на лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 45 мин.
- Снимите сливной базальной мембраны матричные пластины с H9 клеток из инкубатора и удалить дифференцированные колонии с 1 мл пипетки в стереомикроскопом в области биобезопасности кабинета.
- Аспирируйте среду и промыть клетки с 4 мл PBS. Добавить 2 мл случайным дифференциация среднего (Н9 культуральной среде без оФРФ, РД среда) в каждой пластине. Использование проход инструмента и сократить H9 клеточных колоний в сгустки однородного размера и формы, наблюдая при стереомикроскопа в биозащитой а затем аккуратно очистить с клеточным скребком.
- Сбор сгустки в 50 мл трубки сокола и центрифуге при 200 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и вновь приостановить CELл в РД среды, чтобы получить 1000 глыбы на мл.
- Аспирируйте блок-сополимер с V нижней пластин. Налейте сгустки в стерильной квадратной пластины и с помощью многоканальной пипетки добавить 100 мкл суспензии в каждую лунку V нижней пластине.
- Для силового агрегации комков, центрифуги В нижние пластины при 4 ° С в течение 4 мин при 400 х г. Планшеты инкубируют в культуре клеток инкубатора (37 ° С и 5% CO 2) в течение четырех дней.
- День 4 - Коллекция ЭТ
- Сбор ЭТ в стерильной квадратной пластины из донных плит V с использованием многоканальной пипетки и широкие отверстия 200 мкл советы.
- Сбор ЭТ из стерильных квадратной пластины в 15 мл трубки сокола с 10 мл стерильной серологических пипетки. Разрешить ЭТ поселиться в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант и мыть ЭТ с 5 мл PBS.
- Разрешить ЭТ поселиться в течение 2 мин и аспирации супернатант. Повторное приостановить ЭТ в 5 мл среды РД.
- Внесите из 10 мл РД среднего 10 смбактериологические пластины. Передача ЭТ в 10 см бактериологических пластин.
- Инкубируйте бактериологических пластины на горизонтальном шейкере (50 возвратно-поступательное движение / мин) хранятся в инкубаторе для клеточных культур (37 ° С и 5% CO 2) в течение требуемого периода времени. Дайте среднего изменения (15 мл РД средний) каждый дополнительный день.
Примечание: Бережное обращение требуется, а культивирование ЭСК. Размер ЭТ меняется на день 4. Выберите единые ЭТ размер (± 20%), наблюдая при стереомикроскопом для дальнейшего эксперимента. Примерно 50% ЭТ, образованные с помощью этого метода имеют однородными по размеру. Перевод ЭТ на результатах шейкер в едином форме.
3. цитотоксичности для IC 10 Определение
- Передача ЭТ на нижних пластин оптических
- Разморозить 0,1% желатин на водяной бане при 37 ° С в течение 15 мин и нижней пластин покрытия оптических с 50 мкл 0,1% желатина на лунку помощью многоканальной пипетки. Инкубируйте пластин при комнатной температуре в течение45 мин. После инкубации аспирации желатин из нижних пластин оптических.
- Выньте ЭТ, собранных на 4 дня в 10 см бактериологического пластины, содержащие среду RD.
- Держите нижнюю пластины оптические в наклонном положении в области биобезопасности кабинета. Передача двух одинакового размера ЭТ в 100 мкл среды РД на лунку в оптическом нижней 96-луночного планшета, наблюдая под стереомикроскопа. Держите 12-е колонки пуст.
- Планшеты инкубируют в инкубаторе для клеточных культур (37 ° С и 5% CO 2) в течение 24 ч.
- Воздействием наркотиков из 5 день 14 день
- Взвесьте испытуемое соединение и сделать высокую концентрацию в известном растворителе.
- Провести полулогарифмических разбавлени тестируемого соединения последовательно до 8 разведений в растворителе, содержащем пронумерованные пробирки Фалкон с Н, держать трубку не. Я, как контроль транспортного средства, Tube Нет. J в качестве отрицательного контроля (РД) и среднего трубы не. К положительным (этанол 70%) контроль.
- Разморозить RD среды в водяной бане при 37° C в течение 15 мин. Выньте 5 мл RD среду каждый в 11 стерильных сокола труб помеченных от 1 до 11.
- Передача 5 мкл раствора из трубки от А до трубки K в к трубе 1 до 11 соответственно и вихрь трубы. Выньте оптический нижнюю пластину из инкубатора и осторожно снимите СМИ с использованием многоканальной пипетки.
- Добавить 200 мкл среды из трубки числа от 1 до 11 в соответствующих колонках оптического нижней пластине. Дайте смены среды / препарата через день.
Примечание: Для половиной логарифмические разведения принять 6,48 мкл растворителя в 7 труб помеченных от 2 до 8. С самой концентрации труба № 1 передачи 3 мкл в пробирку №2, вихря и последовательной передачи 3 мкл к следующему трубки. Держите трубку № 9 для контроля транспортного средства и трубки №10 по отрицательного контроля. Труба No.11 70% этанола.
- День 14: ресазурин экспозиции и флуоресценции Измерение
- Оттепели РД среднего водяной бане при 37 ° С в течение 15 мин. Выполните все процедуры mentioп ниже в отсутствие света в шкафу биобезопасности.
- Возьмите 10 мл RD среду в 15 мл трубки (A) и добавить Рекомендуемый объем резазурин реагента и перемешать с помощью пипетки. Выньте оптический нижнюю пластину из инкубатора и тщательно удалить все средние с многоканальной пипетки.
- Добавить 100 мкл среды из трубы А в каждую лунку. Инкубируйте планшет в культуре клеток инкубатора (37 ° C и 5% CO 2) в течение 90 мин.
- Измерьте с помощью спектрофотометра флуоресценции (560 Экс / 590 Эм).
- СК определение 10 стоимость
- Импорт значений в графе площадки призму после вычитания пустые значения. Набор оси Х в дозе и оси у как флюоресцентный единиц.
- Нормализовать значения, чтобы получить процент на оси у и преобразования значения (ось х, как логарифмической шкале). Рассчитать IC 50 значение с помощью реакции сигмоидальное дозы параметр (переменная наклона). Рассчитать войти IC 10 значений, используя следующиеУравнение:
F = 10 LogEc 50 = logECF - (1 / HillSlope) * журнала (F / (100-F))
Y = Низ + (верх-низ) / (1 + 10 ^ ((LogEc 50 -X) * HillSlope)) - Определить ИК 10 значений должны быть приняты для дальнейших исследований.
4. биомаркеров исследование, основанное на микрочипов
- День 0 до 5-й день:
- Эмбриоидов тело и трансфер в 10 см бактериологические плиты - выполните следующие действия, указанные в пункте 2 для формирования эмбриоидном тела.
Примечание: Используйте три биологические повторяет для каждого исследования. Разделите каждый биологический репликации на две части - Медикаментозное лечение в ИК 10 концентрации и контроля над автомобилем. Подготовка концентрация лекарственного 10000 раз выше концентрации IC 10 в транспортном средстве и от этого добавить 10 мкл до 100 мл РД среде с клеточными сгустки Н9 в 50 мл пробирку Эппендорф хорошо перемешать и семян его на V нижней пластин. Выполните ту же процедуру для контрольной группой.
<LI> Для воздействия наркотиков на 5-й день до 14, собрать EB's и передавать их в 10 см бактериологического пластин на 4-й день, как за шагов, указанных в пункте 2. Передача пластины на горизонтальном шейкере (возвратно-поступательное движение 50 / мин) в клеточной культуры инкубатор (37 ° С и 5% СО 2) в течение 14 дней. Дайте среды меняются каждый дополнительный день. - Эмбриоидов тело и трансфер в 10 см бактериологические плиты - выполните следующие действия, указанные в пункте 2 для формирования эмбриоидном тела.
- Для сбора проб, на 14 день, собирать ЭТ от 10 см пластин в 15 мл трубки сокола стерильной пипеткой серологического. Разрешить ЭТ поселиться в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант и мыть ЭТ с 5 мл PBS. Разрешить ЭТ поселиться в течение 2 мин и аспирации супернатант. Повторное приостановить ЭТ в 1 мл раствора RNAlater или реагентом TRIzol, вихря и хранить пробу при -80 ° С до дальнейшей обработки.
Примечание: Выполните все процедуры в области биобезопасности шкаф как надлежащей лабораторной практики. Поворот пластины в круговом движении вокруг центра, чтобы привести все в ЭТ центра, аспирация среды от окружающих с помощью стерильного стеклянного paštuRe пипетки, добавьте 15 мл RD среду, а затем добавить 15 мкл препарата / транспортного средства для соответствующей группы.
5. Выделение РНК и целостность тестирование
- Выделение РНК:
Большинство шагов, указанных ниже, должны быть выполнены для очистки РНК с использованием RNeasy Mini Kit согласно инструкции по эксплуатации. Всегда используйте нуклеазам бесплатно трубки, наконечники и воду. При работе с TRIzol провести всю процедуру в химической безопасности капотом и носить защитные очки, а также химические защитные перчатки.- Оттепель образцы на льду. Если образцы хранятся в растворе RNAlater, центрифугировать пробирки при 12000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалите супернатант и добавьте 1 мл TRIzol реагента.
- Растирают образцы с использованием 24 г иглу и шприц емкостью 1 мл. Примерно в 15 раз растирание достаточно для разрушения ЭТ, клеточной стенки и мембран плазмы.
- Добавить 200 мкл хлороформа в каждом образце. Вихревой смешивать содержимое равномерно. Центрифугапри 12000 х г в течение 15 мин при 4 ° С. Удалить спиновые колонки RNeasy мини, 1,5 мл трубки и маркировать их должным образом.
- Соберите супернатант в 1,5 мл пробирки (время сбора супернатанта не беспокоить середину или нижний слой). Добавить равный объем охлажденного 70% этанола. Смешайте содержимое, осторожно встряхивая.
- Применить 700 мкл из пробирок с соответствующими мини спиновых столбцов и центрифуги их при 12000 х г в течение 20 сек при комнатной температуре. Выполните все дальнейшие шаги при комнатной температуре.
- Отменить фильтрата и применять оставшийся раствор в соответствующих столбцов и центрифуги их при 12000 х г в течение 20 сек. Откажитесь от фильтрата.
- Применить 350 мкл буфера RW1 на колонку и центрифугировать их при 12000 х г в течение 20 сек. Отменить фильтрата и применить 10 мкл ДНКазы и 70 мкл RDD буфера в колонку.
- Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Применить 350 мкл буфера RW1 на колонку и центрифугировать их при 12000 х г в течение 20 сек. Откажитесь от фильтрата. Применить 500 мклНПП промывочный буфер на колонку и центрифугировать их при 12000 мкг в течение 20 сек. Откажитесь от фильтрата. Опять Применить 500 мкл промывочного буфера RPE к колонке и центрифуги их при 12000 х г в течение 2 мин. Откажитесь от фильтрата.
- Сдвиг колонки на новые 2 мл пробирки для сбора и центрифуге их при 12000 мкг в течение 1 мин. Перевести столбцы с надписью 1,5 мл пробирку и применять 22 мкл нуклеазы свободной воды. Центрифуга трубки при 12000 мкг в течение 1 мин.
- Снимите трубку сбора и положить их на льду. Количественно РНК с помощью автоматизированной системы электрофореза.
- Концентрация РНК, чистота и проверки целостности.
Для чистоты и целостности РНК тестирования использование автоматизированной системы электрофореза и соответствующей комплект 33.
6. микрочипов Исследования
- Выполните транскрипции профилирование с использованием коммерческих доступные чипы человека массива. Для приготовления РНК-мишени, фрагментации, гибридизации 34 и массиваЧип окрашивание, стиральная использовать коммерческие 35 доступные наборы.
- Выполните сканирование массива чип и проверку контроля качества, используя стандартные струйной станции, сканеры и массива стандартных операционных программного обеспечения 36. Для анализа экспрессии генов импортировать файлы, созданные из сканеров в стандартной коммерческой доступно программное обеспечение 37, фоновую коррекцию, обобщение и нормализации с Прочная нескольких массива анализа (RMA).
- Для получения списка дифференциально выраженных генов (DEG в) выполнить одну сторону ANOVA анализ. Из этого списка отфильтровать гены, основанные на изменении раза (± 2) и ФРГ, контролируемой р-значение (<0,05). Получить главных компонент (PCA), тепловая карта, и т.д., используя это программное обеспечение.
Часть 2. UKN 1 Тестовая система
1. Техническое обслуживание ЭСК
- Посев MEFs
- Для дифференциации используют НСКС # 8534 (H9) клеточной линии. Культура CEзаполняет на мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ), как фидерных клеток. Шерсть T25 колбу с 4 мл 0,1% желатина и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С.
- Оттепель МЭФ в С водяной бане 37 ° и передать клеток в предварительно нагретой DMEM / 10% FBS.
- Спин 3,5 мин с 500 мкг, удалить супернатант и повторно приостанавливать клеток, чтобы получить 1 × 10 7 клеток / мл. Пластинчатые МЭФ 4 х 10 4 / см 2 в колбы Т25 на желатин. При желании, использовать MEFs в течение следующих двух дней. Качество MEF партий являются очень важным вопросом для обеспечения чЭСК. Поэтому желательно, чтобы выяснить лучшую компанию и способ получения для клеток H9. Мы используем ПМЭФ P3.
- Расщепление и обслуживание H9
- Добавить 1 мл подогретого диспазу за T25 колбу H9 и инкубировать 9 мин при 37 ° С.
- Добавить 2 мл мыть среды в диспазу обработанные клетки и пипетки в 5 раз вверх и вниз с 5 мл пипетки и решения передачи клеток к сокола трубки.
- Вымойте колбу с 9 мл среды мытьи добавить клеток к другим. Спин 3,5 мин с 500 мкг, удалить супернатант и вновь приостановить клеток в 10 мл среды чЭСК.
- Спин 3,5 мин с 500 мкг, удалить супернатант и вновь приостановить клеток в 4 мл чЭСК среде. Добавить 0,5 мл суспензии клеток и 4,5 мл чЭСК среды и пластины в новом (PBS) промывают T25 колбу с MEFs. Изменение всю чЭСК среды (5 мл) в колбу каждый день.
2. Дифференциация ЭСК к нейроэктодермальных клеток-предшественников (НЭП)
- Подготовка чЭСК среды и КСМ среду. Шерсть один 10-см чашку с желатином (0,1% в ПБС) на T25 колбу и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С. Удалить среду из чЭСК и добавить достаточно Accutase, чтобы покрыть всю нижнюю часть колбы (1 мл на колбу Т25) и инкубируют 25 до 30 мин при 37 ° С.
- Подготовка пластин, покрытых базальной мембраны матричные во Accutase инкубации. Добавить холодную DMEM / F12, чтобы замороженные базальной мембраны матрицы гранул и решить ее 1:20. Фильтровать базальной мембраны матричные Солуние через сито 40 мкм клетки. Добавить отфильтрованного раствора с пластиной, вся нижняя должна быть покрыта (1 мл на 6-луночных требуется) и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре.
- После инкубационного периода удалите базальной мембраны матрицу супернатант и семян клетки на лунки, покрытые. После Accutase стадии (2.1) остановить реакцию добавлением 1,5 мл HES среды. Собрать клетки из колбы, добавляют 8 мл чЭСК среды и производить одно решение клеток с помощью пипетки с 10 мл пипеткой тщательно. Фильтровать клетки через сито 40 мкм клетки.
- Спин клетки 3 мин с 500 мкг, удалить супернатант и повторно приостанавливать клеток в 10 мл чЭСК. Спин клетки снова 3 мин с 500 мкг, удалить супернатант и повторно приостанавливать клеток в чЭСК, содержащие ингибитор ROCK Y-27632 до конечной концентрации 10 мкМ.
- Удалить супернатант желатина покрытием блюдо. Подвеска плиты клеток на покрытые желатином блюдо, чтобы удалить MEFs и оставить в инкубаторе в течение 1 часа ровно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого этапа МЭФ будет SЭттле на желатиновой покрытием пластины, в то время как чЭСК не можете прикреплять желатина. Поэтому это очень важно для получения подачи свободной дифференциации. Это важный шаг, как слишком длинные Результаты инкубации в чЭСК сгустки и слишком короткий инкубационный в неэффективной удаления MEFs. Через 45 мин инкубации пластина должна быть исследована уже поселились MEFs и чЭСК сгустки. - Когда МЭФ приложил, аккуратно мыть неадгезированных клетки (чЭСК) с после инкубации со средой уже в тарелке. Если несколько Т25 были использованы, чтобы получить больше клеток, отдельные клетки теперь могут быть объединены. Вымойте пластину один раз чЭСК среде.
- Спин клетки 3 мин с 500 мкг, удалить супернатант и повторно приостанавливать клетки в примерно 4 мл КСМ, содержащих ингибитор ROCK 10 мкМ Y-27632 и 10 нг / мл FGF-2.
- Граф клеток в гемоцитометра, используя трипанового синий. Пластина 18 х 10 3 клеток / см 2 на базальной мембране матрицы с покрытием пластин в КСМ, содержащие ингибитор ROCK 10 мкМ Y-27632 и10 нг / мл FGF-2 (для 6 также использовать 1,5 мл на лунку). Это имеет решающее значение для пластины клеток в правильном плотности дифференцировать их успешно в ПОШ.
- Через 24 часа, изменить среду на свежую КСМ, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632 и 10 нг / мл FGF-2. После дальнейшего 24 часов, изменить среду на свежую КСМ, содержащей 10 нг / мл FGF2.
- 72 ч после посева клеток, дифференциация начинается с изменения средней к КСР среды. Этот момент времени, называется день дифференциации (0 DoD0). Добавление тестируемых веществ в настоящее время это возможно.
- На DoD1 и DoD2 среда изменилась так, как на DoD0. Следующее изменение среда в DoD4, содержащий 25% N 2-S и 75% KSR. В DoD6 дифференциация прекращается и клетки собирают для анализа.
3. хроматина Иммунопреципитация (чип) из ЭСК и нэпа
- Подготовка ядер
- Добавить 500 мкл Accutase каждой скважине, которая 6 должны быть проанализированы и инкубировать в течение 25 до 30 мин. CouNT клетки в камере Neubauer использованием трипанового синий.
- Ресуспендируют клеток в 1% формальдегида в DMEM / F12 для сшивания. Добавить Трис, рН 7,5 до конечной концентрации 125 мМ через 10 мин, чтобы остановить сшивания.
- Спин клетки 3 мин с 500 мкг при 4 ° С, удалить супернатант и повторно приостанавливать клеток в холодном PBS.
- Спин клетки 3 мин с 500 мкг при 4 ° С, удалить супернатант и вновь приостановить клеток в 1 мл буфера / L1- 1 × 10 6 клеток.
- Инкубировать в течение 5 минут на льду. Спин 5 мин с 800 мкг при 4 ° С, удалить супернатант и повторно приостанавливать ядра в 1 мл буфера / L2- 2 × 10 6 клеток.
- Озвучивание и контроль качества
- Ультразвук так, что фрагменты ДНК длиной 300-700 п.н. генерируются. Спин 1 мин 10,000 мкг при 4 ° С. Передача супернатант в новую пробирку. Фрагменты должны иметь правильный размер, в противном случае иммунопреципитации будет неэффективной, а также с последующим КПЦР.
- Удалить 50 мклд смешать с 50 мкл буфера L2, чтобы проверить эффективность обработки ультразвуком, запустив в агарозном геле.
- Обратный сшивки путем инкубации при 65 ° С в течение 4 ч и 500 оборотов в минуту. Загружают образцы 1: 5 с оранжевый G красителем на 1,5% агарозном геле и запустить 45 мин при 110 В в буфере 1x КЭ. Размер фрагмента управления (должно быть между 300-700 б.п.).
- Хроматина Иммунопреципитация
- Развести образцы 1: 5 в буфере для разведения и аликвоты 1 мл на IP в силиконизированных пробирках.
- Удалить 5% (по объему) от разбавленного образца хроматина (шаг 3.3.1) и хранят при температуре 4 ° С, как "вход".
- Выдержите образцы с антителами на ваш выбор и с неспецифической IgG O / N при 4 ° С на ротатора.
- Добавить 50 мкл белка бисером / G сефарозы к каждому образцу, после иммунопреципитации. Инкубируйте образцы 3 ч при 4 ° С на ротатора. Спин 1 мин с 1500 мкг при 4 ° С и удаления надосадочной жидкости.
- Промыть 1 мл мытья шариков. Спин 1 мин с 1500 мкг в4 ° С и удаления надосадочной жидкости. Повторите шаг г до ч. Промыть 1 мл конечного буфера для промывки. Во время промывки не должна проиграть любой из бусин, так как это приводит к изменению количества элюата непосредственно.
- Центрифуга 1 мин с 1500 мкг при 4 ° С и удаления надосадочной жидкости. Добавить 125 мкл буфера для элюции и инкубируют 15 мин при 65 ° С при 1000 оборотах в минуту в шейкере.
- Спин 1 мин с 1500 мкг и передачи супернатант в новую трубку Повторите шаг к и л. Добавить 200 мкл буфера элюции для ввода (3.3.2). Добавить протеиназы К и РНКазы к каждому образцу и инкубировать 30 мин при 37 ° С при 500 оборотах в минуту в шейкере, а затем 4 ч при 65 ° С при 500 оборотах в минуту в шейкере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для извлечения ДНК использование коммерческой доступно ДНК-чип Clean и концентратор Kit 38.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метил воздействие ртути в тестовой системе УКК
Цитотоксичности проводили с H9 ЭТ, чтобы получить значение IC 10 (снижение жизнеспособности на 10%) на цитотоксичность метилртути (фиг.1). Мы также провели микрочипов на основе (Affymetrix платформы) биомаркеров исследование. H9 ЭТ были подвержены метилртути (0,25 и 1 мкМ) в течение 14 дней. На 14-й день, образцы были собраны с использованием TRIzol и РНК выделяли. Транскрипции профилирование осуществляли с использованием генома человека U133 Plus 2.0 фишки массива. Эти данные были проанализированы с Partek геномной Люкс ТМ 6.6. Обзор первых данные были получены с помощью анализа основного компонента (фиг.2А), генерации диаграммах Венна (фиг.2В) и построения карт тепла (фиг.2с). Анализ основным компонентом является общее распределение экспрессии генов и четко визуализируется segregвания из MeHg 1 мкм от управления транспортным средством и MeHg 0,25 мкм групп (ПК # 25.2) (рис 2А). Список дифференциально выраженных генов (DEG) была получена после статистической обработки (односторонний ANOVA) и фильтрация данных с использованием кратное изменение отсечение ± 2 и кратность исправлены (метод Benjamini-Höchberg) P-значение <0,05 (таблица 1). Лечение 1 мкМ MeHg привело 276 DegS и 0,25 мкМ в 31 DegS (рис 2b). Тепловая карта показала, что MeHg 1 мкМ лечение в основном сводится экспрессию гена (рис 2С). Информация о чрезмерно генных терминов онтологии были получены с помощью биоинформатики инструмент DAVID. Таблица 2 представляет значительно чаще категории генов ГО, содержащие более 5 генов. Были определены вниз регулируется факторами транскрипции, связанные с развитием нервной системы. SEPP1, DDIT4, АК4, FRZB (развитие мозга), П.И.Техас (развитие нервной ядра) и ErbB3, UGT8, APOB, APOA1 (развитие нервной системы) были вниз регулируется в зависимости от дозы при лечении метил ртути (Таблица 3).
UKN 1 тест-системы
Этот протокол использует двойную дифференциация SMAD inhibiton 6 генерировать чистую популяцию нэпа в течение шести дней дифференцировки. Полученные клетки характеризуются положительную регуляцию нервной генов-предшественников PAX6 и Otx2. В стволовых клеток маркеры OCT4 и Nanog снижаются регулируется во время дифференциации к НЭП (рис 3а). Из-за высокой степени синхронизированным и однородной дифференциации, можно также получить информацию о модификации гистонов при этом раннем этапе развития. Мы адаптировали протокол для хроматина иммуно-осадков (чип) с использованием клеток либо в начале, либо после дифференциации 6 днейдифференциация. Выключатель метилирования на промоторных участков PAX6 и Otx2 было видно из этих исследований (Фиг.3В). Исследуемые участки метилирования гистона 3 лизина 4 триметилирование (H3K4me3) и гистонов 3 лизин 27 триметилирование (H3K27me3) были весьма динамичным в дифференциации. Кроме того, на уровне белка вниз регулирование Oct4 можно было наблюдать (рисунок 4). До-регулирование Рах6 и нервных стволовых клеток маркера Нестин наблюдали иммунофлюоресценции микроскопии на уровне белка (рис 4). Клеточная популяция показали однородное и чистое дифференцирование после шести дней дифференциации. Поэтому культуры могут быть легко использованы для анализа РНК и белка. Система обеспечивает также возможность проверить вещества и их влияние на раннего развития нервной 16,29.
Рисунок 1. цитотоксичности (Н9) дифференциация по MeHg. Анализ был проведен в соответствии с протоколом, чтобы определить значение IC 10 для метилртути.
Рисунок 2. Представитель Анализ дифференциальных экспрессируемых генов, индуцируемых 0,25 и 1 мкМ MeHg после нанесения испытательной системы УКК. В ЭСК обрабатывали 0,25 и 1 мкМ MeHg в соответствии с тестовой системе УКК. Анализ дифференциальных выразил транскриптов в 14-дневных дифференцированных ЭТ была выполнена с использованием программного обеспечения 6.6 Partek геномной Люкс ТМ. (А) Анализ главных компонент (3-Dimenional) данных микрочипов. (Б) диаграмма Венна, полученный из микрочипов анализа экспрессии генов. Диаграмма показывает количествогены, модулированные лечения MeHg (кратным изменением> ± 2, р значение <0,05). (С) Иерархическая кластеризация данных генной экспрессии (диван изменение> ± 2, р значение <0,05). Высоко выраженные гены в контрольной группе транспортного средства подавляются 1 мкМ лечения MeHg. Лечение 1 мкМ MeHg привело в 233 транскриптов с низкой экспрессии и 43 зондов с высшим выражением, как по сравнению с контрольной группой,. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Выражение Джин и гистонов метилирование во время дифференцировки ЭСК из к нэпу. Для всех экспериментов, чЭСК были дифференцированы в клетки нейроэктодермальную предшественников (НЭП). (A) Пробы отбирали на DAY 6 дифференциации и уровни транскриптов генов маркеров дифференцировки нервной определяли с помощью RT-количественной ПЦР. Данные (ген выражение по отношению к ЭСК) являются средством ± SEM 5 экспериментов. (B) Образцы для иммунопреципитации хроматина (чип) были подготовлены на 6-й день дифференциации. Чип производится с антителами, специфичными для H3K4me3 или H3K27me3 или управления IgG. Факторы обогащения промоторных последовательностей приведены в% ввода для H3K4me3 (серый) и H3K27me3 (черный). Данные средства ± SEM из 3 независимых клеточных препаратов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Выражение протеина во время дифференцировки из ЭСК к НЭП. Клетки фиксировали и окрашивали для стволовых клеток маркераOct4 (зеленый) в день 0 дифференциации (DoD0) и НЭП маркеров Рах6 (красный) и нестин (зеленый) на 6-й день дифференциации (DoD6). Масштабная линейка показывает 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1. Список дифференциально выраженных генов (> ± 2 раза, значение р <0,05) лечения MeHg против управления автомобилем в 14-дневных ЭТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть эту таблицу.
Таблица 2. Список значительно обогатили и отдельных категорий GO (значение р <0,05,> 5 генов) с нарушением регуляции Транскрипты для MeHg против управления автомобилем в 14-дневных ЭТ.
| GO срок | Считать | Значение Р | Гены |
| Регуляции апоптоза | 18 | 0,0068 | ARHGEF3, Tbx3, ErbB3, MITF, BNIP3, CDH1, IGF2, IFI16, ФРГ, GCH1, AMIGO2, SERPINB9, KRT18, MSX1, ETS1, VEGFA, PERP, IGFBP3 |
| Регулирование пролиферации клеток | 17 | 0,0123 | RBP4, LYN, Tbx3, ErbB3, MITF, IGF2, КДР, RERG, MSX1, АДМ, ETS1, VEGFA, BNC1, ADAMTS1, FABP1, IGFBP3, FIGF |
| Разработка сосудистой | 12 | 0,0001 | ПЛАТ, APOB, Hand1, Tbx3, EPAS1, FOXF1, Lepr, VEGFA, COL3A1, кислородно, FIGF, КДР |
| Разработка скелетная система нг> | 12 | 0,0008 | RBP4, MSX1, LGALS3, Tbx3, HOXB6, COL3A1, STC1, IGF2, POSTN, FRZB, IGFBP3, AHSG |
| Разработка Сердце | 11 | 0,0001 | RBP4, ACTC1, MSX1, Hand1, Tbx3, АДМ, PKP2, ErbB3, GATA6, COL3A1, ADAMTS1 |
| Глюкоза метаболический процесс | 9 | 0,0003 | PDK1, RBP4, LDHA, PGM5, PYGL, НК2, PFKP, IGF2, PGK1 |
| Разработка легких | 7 | 0,0008 | RBP4, EPAS1, GATA6, FOXF1, VEGFA, кислородно, КДР |
| Разработка Эпителий | 7 | 0,0386 | F11R, FREM2, GATA6, FOXF1, VEGFA, ДСП, КДР |
| Разработка Мезодерма | 5 | 0,0088 | Hand1, Tbx3, FOXF1, VEGFA, SNAI2 |
| Термин | Джин Символ | Повязку меняют * | |
| 0,25 мкМ MeHg против ВК | 1 мкМ MeHg против ВК | ||
| Развитие мозга | SEPP1 | -2,17 | -4,13 |
| DDIT4 | -1.20 | -3,11 | |
| АК4 | -1,41 | -3,08 | |
| FRZB | -1.29 | -2,19 | |
| Развитие нейронов ядра | PITX2 | -2,08 | -4,90 |
| Развитие нервной системы | ErbB3 | -1,86 | -2,89 |
| UGT8 | -1,67 | -2,14 | |
| APOB | -3,59 | -5,72 | |
| APOA1 | 2.63 | -2.90 | |
| VEGFA | -1.28 | -3,06 | |
* Значение р <0,05
Таблица 4. Состав питательной среды.
| Старший номер | Средний / Имя буфера | Состав | |||
| Количество | | ||||
| 1 | MEF Средний | DMEM с высоким содержанием глюкозы | |||
| ФТС | 10% | ||||
| Пенициллин | 100 единиц / мл | ||||
| Стрептомицин | 100 мкг / мл | ||||
| L-Глютамин | 2 мм | ||||
| 2 | H9 культуральной среде | DMEM F12 | |||
| KOSR | 20% | ||||
| NEAA | 1% | ||||
| Glutamax | 1x | ||||
| β-меркаптоэтанола | 0,1 мм | ||||
| Пенициллин | 100 единиц / мл | ||||
| Стрептомицин | 100 мкг / мл | ||||
| оФРФ | 4 нг / мл | 3 | РД Средний | H9 питательная среда без оФРФ | |
| 4 | Вымойте среднего | DMEM / F12 | |||
| Нокаут Сыворотка Replacment | 20% | ||||
| 1x GlutaMAX | 1x | ||||
| MEM без незаменимых аминокислот | |||||
| HEPES | 15 мм | ||||
| β-меркаптоэтанола | 90 мкМ | ||||
| 5 | КСМ Средний | DMEM | |||
| ФБС | 10% | ||||
| инкубировали в течение 24 ч на MEFs | |||||
| 6 | Нокаут Сыворотка Замена (КСР) | ||||
| Замена сыворотки Нокаут | 15% | ||||
| 1x GlutaMAX | |||||
| 1x MEM без незаменимых аминокислот | |||||
| β-меркаптоэтанола | 15 мкм | ||||
| Башка | 35 нг / мл | ||||
| Dorsomorphin | 600 нМ | ||||
| SB431542 | 10 мкМ | ||||
| 7 | N2-S | DMEM / F-12 | |||
| Apotransferin | 100 мкг / мл | ||||
| Глюкоза | 1,55 мг / мл | ||||
| Путресцин | 10 мм | ||||
| Селен | 500 мкМ | ||||
| Прогестерон | 20 мкМ | ||||
| GlutaMAX | 200 мкМ | ||||
| 25 мкг / мл | |||||
| 8 | L1 буфера | Трис рН 8 | 50 мм | ||
| ЭДТА | 2 мм | ||||
| NP-40 | 0,10% | ||||
| Глицерин | 10% | ||||
| 9 | L2 буфер | Трис рН 8 | 50 мм | ||
| ЭДТА | 10 мм | ||||
| SDS | 1% | ||||
| 10 | Буфера для элюции | NaHCO 3 | 100 мм | ||
| SDS | 1% | ||||
| 11 | Промывочный буфер | Трис | 20 мм | ||
| ЭДТА | 2 мм | SDS | 0,10% | ||
| NP-40 | 0,50% | ||||
| NaCl | 150 мм | ||||
| 12 | Итоговый промывочного буфера | Трис | 20 мм | ||
| ЭДТА | 2 мм | ||||
| SDS | 0,10% | ||||
| NP-40 | 0,50% | ||||
| NaCl | 500 мм | ||||
| 13 | Стволовые клетки Medium | mTESAR ТМ базальная среда | 400 мл | ||
| mTESAR ТМ дополнение | 100 мл | ||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Традиционные подходы к токсикологической тестирования привлекать широкие исследования на животных, таким образом, делая тестирование дорого и отнимает много времени. Кроме того, из-за различий в межвидовых доклинические исследования безопасности животных не всегда справедливо для прогнозирования токсичности эффекты потенциальных лекарственных препаратов соответствующих для человека. Хотя нечеловеческие приматы являются наиболее предсказуемым, по-прежнему сильны этические и socioeconomical требования быстро поднимая современными обществами для разработки чувствительной и надежной в тесте пробирке Система отношение к безопасности человека.
Уникальная способность ЭСК к дифференцировке в всех типов соматических клеток, поэтому краткое повторение естественных процессов развития человека в сочетании с чувствительным ТОКСИКОГЕНОМИКА подходов был предложен в качестве альтернативы традиционным подходам для испытаний на безопасность лекарственного средства 6,21. В проекте "ESNATS" "УКК" тестовая система была разработана, чтобы предсказать,развития эмбриональных токсичности, основанный на транскриптомика профилирования. В этой системе чЭСК были дифференцированы и в эмбриональных телец в течение 14 дней. Время кинетическая профиль транскриптомика получены показывает высокий уровень экспрессии маркера дифференцировки характерных для трех зародышевых листков, эктодермы и мезодермы эндодермы на 14 день, которые частично воспроизводят раннего эмбрионального развития человека. На основании этих результатов, известные тератогенные препараты были подвержены во время дифференцировки в течение 14 дней и дифференциальный выражена профиль гена были получены. Впечатляюще, генные сигнатуры, связанные с тератогенных эффектов талидомида наблюдалось у людей, может быть предсказано этой тест-системы 28. Представительные результаты метилртути в УКК система шоу зависит от концентрации вниз регулирования транскрипционных факторов, связанных с развитием нервной системы. Другие развития нейро-токсикантов были также испытаны в этой системе и усилия идут, чтобы определитьобщие токсико-маркеры через соединений на уровне мРНК и проверить их на уровне белка. Протокол испытаний УКК, представленная здесь, дает основную директиву для проведения эксперимента с человеческой H9 эмбриональных стволовых клеток, чтобы определить транскриптомных подпись для токсиканта развития.
Оптимизированная стандартная процедура операции (СОП) для дифференциации плюрипотентных стволовых клеток в соответствии с протоколом UKN1 позволяет надежную и синхронизированный дифференциацию ЭСК для NEP. Уже после шести дней дифференциации, однородной клеточной популяции с уровнями экспрессии высокого PAX6 генерируется. Клетки растут в прикрепленных культур, которые позволяют анализ по иммунным. Иммуноцитохимическая анализ с высоким разрешением и с помощью конфокальной микроскопии требуется, что клетки выращиваются на тонких стеклянных поверхностей. Это возможно для этих культур, если стекло с покрытием оптимально, но необходимо отметить, что клетки растут очень плотным, более чем в один слойпосле шести дней. Таким образом, процедура анализа родословной конкретных маркеров легче осуществляется RT-КПЦР, чип или вестерн-блоттинга. Большим преимуществом для биохимического анализа культур с высоким выходом клеток, которые могут быть достигнуты с помощью этого протокола дифференцировки из небольшого начальной популяции чЭСК. Один из недостатков этого протокола является высокая стоимость среднего добавок (например, башка), необходимых, чтобы заставить однородной нейронной дифференциации. Еще одним недостатком для некоторых приложений может быть, что некоторые малые молекулы (ингибиторы киназы) должны присутствовать в культуральной среде, как часть протокола. Таким образом, определенные сигнальные пути не может быть рассмотрен токсикологически, а изменение условий культивирования также изменяет дифференцировку 29.
Преимущество комбинации тестовой системы является лучшее понимание ДНТ. В то время как УКК охватывает более широкий диапазон и негативное влияние на формирование раннего зародышей слоя могут быть исследованы, UKN1 всепотоки, чтобы исследовать больше нейронных конкретных механизмов, таких, как эпигенетике. Хотя два культуры системы, представленные здесь, были показаны предсказать нейротоксичность развития для нескольких токсикантов модель 16, все еще существует потребность в более поздних версиях пропускная способность протоколов, которые позволяют скрининг большого числа потенциальных нейротоксинов. Кроме того, необходима дальнейшая работа для выявления и подтверждения общих маркеров токсичности в мРНК или белка уровне, и установить их в качестве части доклинической оценки безопасности лекарственных средств.
Более 20 миллиардов долларов США в год инвестируются фармацевтической промышленности для обнаружения наркотиков 39. Как доказательство концепции, мы разработали в пробирке систем токсичности тест, основанный на ЭСК и транскриптомики, которые могут быть пригодны для прогнозирования соответствующие эффекты человека токсичности потенциальных лекарственных соединений в экономически эффективным и менее трудоемким способом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
| mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
| V bottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
| Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Kits | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
| Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of equipment | |||
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Genechip Hybridisation Oven - 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of softwares | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |
|||
References
- Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
- Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceutical Biotechnology. Current Pharmaceutical Biotechnology. 12 (11), 1760-1773 (2011).
- Leist, M., Hartung, T., Nicotera, P. The dawning of a new age of toxicology. ALTEX. 25 (2), 103-114 (2008).
- Kuegler, P. B., et al. Markers of murine embryonic and neural stem cells, neurons and astrocytes: reference points for developmental neurotoxicity testing. ALTEX. 27 (1), 17-42 (2010).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. , (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of Developmental Toxicants and Signaling Pathways in a Functional Test Based on the Migration of Human Neural Crest Cells. Environmental Health Perspectives. 120 (8), 1116-1122 (2012).
- Bosman, A., et al. Molecular and Functional Evidence of HCN4 and Caveolin-3 Interaction During Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells and Development. 22 (11), 1717-1727 (2013).
- Sartiani, L., et al. Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach. Stem Cells. 25 (5), 1136-1144 (2007).
- Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation. 76 (9), 958-970 (2008).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (2), 200-206 (2013).
- Subramanian, K., et al. Spheroid Culture for Enhanced Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-Like Cells. Stem Cells and Development. 23 (2), 124-131 (2014).
- Sivertsson, L., Synnergren, J., Jensen, J., Bjorquist, P., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells Cultured in a Perfused Three-Dimensional Bioreactor. Stem Cells and Development. 22 (4), 581-594 (2013).
- Jagtap, S., et al. Cytosine arabinoside induces ectoderm and inhibits mesoderm expression in human embryonic stem cells during multilineage differentiation. British Journal of Pharmacology. 162 (8), 1743-1756 (2011).
- Krug, A. K., et al. Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach. Archives of Toxicology. 87 (1), 123-143 (2013).
- Leist, M., et al. Test systems of developmental toxicity: state-of-the art and future perspectives. Archives of Toxicology. 87 (12), 2037-2042 (2013).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Molecular medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Khoo, M. L. M., et al. Growth and differentiation of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells: Effect of glucose and basic fibroblast growth factor. Biology of Reproduction. 73 (6), 1147-1156 (2005).
- Son, M. Y., Kim, H. J., Kim, M. J., Cho, S. Physical Passaging of Embryoid Bodies Generated from Human Pluripotent Stem Cells. Plos One. 6 (5), (2011).
- Winkler, J., Sotiriadou, I., Chen, S., Hescheler, J., Sachinidis, A. The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology. Current medicinal chemistry. 16 (36), 4814-4827 (2009).
- Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17 (8), 759-766 (2010).
- Miller, M. T., Stromland, K. Teratogen update: Thalidomide: A review, with a focus on ocular findings and new potential uses. Teratology. 60 (5), 306-321 (1999).
- Newman, C. G. H. Teratogen Update - Clinical Aspects of Thalidomide Embryopathy - A Continuing Preoccupation. Teratology. 32 (1), 133-144 (1985).
- Stern, L. In vivo assessment of the teratogenic potential of drugs in humans. Obstetrics and gynecology. 58 (5 Suppl), 3S-8S (1981).
- Lynch, H. T., Reich, J. W. Diethylstilbestrol, Genetics, Teratogenesis, and Tumor Spectrum in Humans. Medical Hypotheses. 16 (3), 315-332 (1985).
- Satoh, H. Behavioral teratology of mercury and its compounds. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 1-9 (2003).
- Meganathan, K., et al. Identification of Thalidomide-Specific Transcriptomics and Proteomics Signatures during Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Plos One. 7 (8), (2012).
- Balmer, N. V., et al. Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome. Human Molecular Genetics. 21 (18), 4104-4114 (2012).
- Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M., Hartung, T. Developmental neurotoxicity - Challenges in the 21st Century and In Vitro Opportunities. ALTEX. 31 (2), 129-156 (2014).
- Leist, M., Efremova, L., Karreman, C. Food for thought ... considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX. 27 (4), 309-317 (2010).
- Zimmer, B., et al. Coordinated waves of gene expression during neuronal differentiation of embryonic stem cells as basis for novel approaches to developmental neurotoxicity testing. Cell Death and Differentiation. 18 (3), 383-395 (2011).
- Experion RNA StdSens Analysis Kit for RNA analysis by Electrophoresis. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000976B%20%20RNA%20STDSENS%20MANUAL.PDF (2014).
- Affymetix GeneChip 3 IVT Express Kit for Target RNA preparation, Fragmentation and hybridization. , Available from: http://microarray.csc.mrc.ac.uk/downloads/3'%20IVT%20Express%20Manual.pdf (2014).
- Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit. , Available from: http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1 (2014).
- Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1 (2014).
- Partek Genomics Suite. , Available from: http://www.partek.com/pgs (2014).
- ChIP DNA Clean and Concentrator. , Available from: http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/pcr-dna-clean-up-concentration/chip-dna-clean-concentrator (2014).
- Kraljevic, S., Stambrook, P. J., Pavelic, K. Accelerating drug discovery. EMBO Reports. 5 (9), 837-842 (2004).
