Summary
De protokoll beskriver två in vitro utvecklingstoxicitets testsystem (UKK och UKN1) bygger på mänskliga embryonala stamceller och transkriptom studier. De testsystem förutse fosterskadande effekter fara människa, och kan bidra till att minska djurstudier, kostnader och den tid som krävs för kemisk säkerhetstester.
Abstract
Effektiva protokoll för att skilja mänskliga pluripotenta stamceller till olika vävnader i kombination med omik teknik öppnat nya horisonter för testning in vitro toxicitet potentiella läkemedel. Att ge en solid vetenskaplig grund för sådana analyser är det viktigt att få kvantitativ information om tidsförloppet för utveckling och om de underliggande regleringsmekanismer av systembiologiska metoder. Två analyser har därför ställts in här för dessa krav. I UKK testsystem, är mänskliga embryonala stamceller (hESC) (eller andra pluripotenta celler) kvar att spontant differentierar under 14 dagar i embryoidkroppar, för att möjliggöra generering av celler hos alla tre groddblad. Detta system rekapitulerar de viktigaste stegen i människans tidiga embryonal utveckling, och det kan förutsäga humanspecifik tidig embryonal toxicitet / teratogenicitet, om celler exponeras för kemikalier under differentieringen. Det UKN1 testsystem bygger på hESC differentiering till en population av neuroektodermal progenitorceller (NEP) celler under 6 dagar. Detta system rekapitulerar tidigt neurala utveckling och förutspår tidigt utvecklingsneurotoxiska och epigenetiska förändringar utlöses av kemikalier. Båda systemen, i kombination med transkriptom microarray studier, är lämpliga för att identifiera toxicitet biomarkörer. Dessutom kan de användas i kombination för att generera indata för systembiologi analys. Dessa testsystem har fördelar jämfört med de traditionella toxikologiska studier som kräver stora mängder av djur. De testsystem kan bidra till en minskning av kostnaderna för läkemedelsutveckling och utvärdering kemikaliesäkerhet. Deras kombination belyser speciellt på föreningar som kan påverka nervsystemets utveckling specifikt.
Introduction
Förmågan hos humana embryonala stamceller (hESC) att differentiera till olika typer av celler öppnat en ny era av testning in vitro toxicitet 1, sjukdom modellering och regenerativ medicin 2. Stamcellerna begåvats med förmågan att självreplikera, för att hålla sin pluripotent tillstånd, och att differentiera till specialiserade celler 3,4. Egenskaperna hos hESC (förmåga att differentiera till alla större celltyper) återfinns också i andra humana pluripotenta stamceller, såsom mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) eller celler som genereras av kärnöverföring 5. Till exempel har många olika hESC linjer differentierats till neuroner 6, njurceller 7, neurallist celler 8 cardiomyocytes 9-12, eller hepatocyter som celler 13,14. Dessutom hESC kan spontant differentiera till celler från alla tre germinallager 15-18 i embryoidkroppar (EBS) 19,20. EArly embryonal utveckling regleras genom differentiell expression av olika gener relaterade till de olika groddblad som har fångats på mRNA-nivå genom transkriptomik använder microarray-teknik 15. Dessa ansträngningar resulterade i upprättandet av organspecifika toxikologiska modeller baserade på hESC / hiPSC och transkriptomik analys (för en översikt se 21,22). Dessa modeller har fördelar jämfört med den traditionella användningen av försöksdjur för toxikologiska studier, som prekliniska studier med försöksdjur är inte alltid är prediktiva för människors säkerhet. Läkemedels inducerade toxicitet påträffas hos patienter är ofta relaterade till metabola eller signaleringsprocesser som skiljer sig mellan människor och försöksdjur. Skillnaden arter har hindrat tillförlitlig tidig upptäckt av fosterskadande effekter hos människor, och till exempel läkemedel såsom talidomid 23,24 och dietylstilbestrol 25,26 drogs tillbaka från marknaden på grund av fosterskada. Thalidomide har inte visat någon utvecklingstoxicitet hos råttor eller möss. Miljö kemikalier, såsom metylkvicksilver 27 resulterade i prenatal utvecklingstoxicitet med avseende på nervsystemet i olika arter, men mänskliga yttringar har varit svårt att modellera i djur. För att lösa problemet med artspecificiteten frågor, forskare som arbetar under olika projekt baserade på stamceller som ReProTect, ESNATS, DETECTIVE etc. är engagerade i utvecklingen av olika modeller för embryonal toxicitet, neuro kardiotoxicitet, levertoxicitet och nefrotoxicitet använder mänskliga gifter misstänks påverka människan. Enligt det europeiska konsortiet projektet "embryonala stamceller baserad roman alternativa testmetoder (ESNATS) fem testsystem har etablerats. Ett testsystem den så kallade UKK (U niversitäts k linikum K OLN) testsystem delvis fångar människans tidiga embryots utveckling. I detta sYSTEM mänskliga embryonala H9-celler differentieras i tre germinallager (ektoderm, endoderm och mesoderm) 15 och GRODDBLAD specifika signaturer har fångats av transkriptomik profil att använda Affymetrix microarray-plattform. Olika utvecklings toxikanter som talidomid 28, valproinsyra, metylkvicksilver 16,17, eller cytosinarabinosid 15 har testats i detta system, och det toxiska specifik gen signaturer har erhållits. I ett andra test-system, det så kallade UKN1 (U niversity K Önsta n ^) testsystem 1 är H9-celler differentierade för att neuroektodermala progenitorceller (NEP) och 6 dagar. Detta bevisas av högt uttryck av neurala genmarkörer såsom Pax6 och OTX2. Under differentiering för 6 dagar, har NEP-celler exponerats för utvecklingsstörningar neuro-toxiska ämnen, såsom VPA, metylkvicksilver. Gift-specifika avreglerade transkriptomik profiler har varit obtained samt genom att använda Affymetrix microarray plattformen 16,29.
Den nya visionen för toxikologi av 21-talet räknar man med att testsystem inte bara ge fenotypiska beskrivningar som histopatologi in vivo, eller transkriptom förändringar i slutet av långsiktiga gift inkubationer. Det tyder snarare att analyser ger mekanistiska uppgifter 3, och att denna information kan kopplas till så kallade negativa resultatvägar (AOP) som ger en vetenskaplig motivering för farliga effekter 30. Att lämna sådan information, de testsystem som används måste vara mycket kvalitetsgranskade 31, såsom exempelvis dokumenteras genom robusta standardrutiner. Dessutom, tidsberoende förändringar måste kartläggas med hög upplösning. Detta kräver testsystem med synkroniserade ändringar 32. De UKN1 och UKK testsystem som beskrivs här har optimerats för dessa krav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll utfördes med användning av mänskliga embryonala stamcellslinje (hESC) H9. Denna cellinje var rutinmässigt på mitotiskt inaktiverade mus embryonala fibroblaster (MEF) i hESC odlingsmedia kompletterat med bFGF och sedan odlade i stamcellsmedia på 6 cm Petri-plattor belagda med basalmembran matris såsom matrigel, för att bli av MEF. H9-celler från> 80% sammanflytande plattor användes för ytterligare passage. H9-celler odlade på basalmembranmatrisplattor användes för EBS-uppställning. Alla förfaranden som nämns i följande protokoll har genomförts med hjälp av standardmetoder för aseptiska och god cellodlingsmetoder.
Del 1. UKK TESTSYSTEM
1. mänskliga embryonala stamceller Odling
- Uppdelning och underhåll av H9 på matarceller
- Pipettera 2 ml 0,1% gelatin i var 6 cm platta och inkubera under 30 min i cellodlings incubtören (37 ° C och 5% CO2). Aspirera gelatinlösning med steril pasteurpipett.
- Lägg 2 ml MEF medium innehållande 0,1 x 10 6 MEF celler / ml i de två gelatinbelagda plattor och inkubera dem i cellkultur inkubator (37 ° C och 5% CO2) O / N.
- På nästa dag, ta bort H9-celler flaska från flytande kväve ackumulatortank med hjälp av pincett och tina flaskan i ett 37 ° C vattenbad med långa pincett.
- Avlägsna flaskan från vattenbadet, bad den med 70% etanol, lufttorka i biosäkerhet skåpet för 15 till 30 sekunder och överföra cellerna till 15 ml Falcon-rör.
- Lägg 9 ml H9 odlingsmedium långsamt på innerväggen och centrifugera cellerna vid 200 xg under 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 6 ml odlingsmedium innehållande ROCK-hämmare (10 ^ M, Y27632) och försiktigt pipett för att blanda. Aspirera MEF mediet från 6 cm platta och tillsätt 3 ml cellsuspension i varje platta. Ändra medium på day 3 och därefter varannan dag. Subkultur> 80% sammanflytande platt celler med delningsfaktorn 1: 3.
Obs: Vanligtvis i 5 till 7 dagar plattan blir sammanflytande. Matare som används erhålls från CF1 möss embryo och inaktiveras genom exponering för γ strålning.
- H9 cellodling på basalmembranmatris belagda plattor
- Tina stamcellsmedium (5x) tillägg vid RT och tillsätt 100 ml till 400 ml basmedium i biosäkerhet skåp.
- Tina basalmembranet matris på is. Lägg föreslås volym basalmembranmatris (se intyg om analys av varje parti) i 24 ml kyld DMEM / F-12 basalt medium för tolv 6 cm plattor. Blanda genom att pipettera upp och ned.
- Tillsätt 2 ml i varje 6 cm platta. Förvara plattan vid RT under 1 timme. Avlägsna mediet och tillsätt 2 ml stamcellmedium.
- Ta ut fyra sammanflytande H9 plattor på MEF. Ta bort de differentierade kolonier med 1 ml pipettspets enligt stereo förvaras i biosäkerhet skåp.
- Aspireramediet och tvätta cellerna med 4 ml PBS och tillsätt 2 ml stamcells mediet i varje platta. Skär odifferentierade kolonier med 26 G nål in på 6 till 9 stycken vardera.
- Samla försiktigt cellerna i 50 ml Falcon rör. Centrifugera vid 200 xg under 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera i 12 ml stamcellsmedium. Räkna klumpar genom att sätta 20 ^ på objektglas i mikroskop och justera volymen för 150 stycken per ml. Tillsätt 2 ml suspension i varje 6 cm platta.
- Flytta plattorna tillbaka-och-tillbaka och sida till sida rörelser för jämn klump fördelning och inkubera plattorna i cellodlingsinkubator (37 ° C och 5% CO2).
- Ta bort de differentierade kolonier och ger medel förändring varannan dag.
2. Embryoid organ (EBS) Bildning
Utför alla förfarande som nämns nedan enligt aseptiska försiktighetsåtgärder och i biosäkerhet skåpet.
- Dag 0 & #8212; Plätering av H9-celler på V bottenplattor
- Bered 5% segmentsampolymer såsom Pluronic F 127 i PBS och filtrera genom vakuumdriven filtreringssystem med hjälp av 0,22 um sterilt filter.
- Coat V-bottnade plattor med 96 brunnar med 40 pl av 5% segmentsampolymer per brunn och inkubera vid RT i 45 min.
- Ta bort sammanflytande källaren membranmatrisplattor med H9-celler från inkubatorn och ta bort differentierade kolonier med 1 ml pipettspets enligt stereo i biosäkerhet skåp.
- Aspirera mediet och tvätta cellerna med 4 ml PBS. Lägg 2 ml slumpmässig differentieringsmedium (H9 kulturmedium utan bFGF, RD-medium) i varje platta. Använd passage verktyg och skär H9 cellkolonier i klumpar av enhetlig storlek och form genom att observera i stereomikroskop i biosäkerhet skåp och sedan försiktigt skrapa med cellskrapa.
- Samla klumpar i 50 ml Falcon-rör och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter. Aspirera supernatanten och återsuspendera celli RD medium för att få 1.000 stycken per ml.
- Sug segmentsampolymeren från V bottenplattor. Häll klumparna i steril kvadratisk platta och med hjälp av multikanalpipett till 100 | il av suspensionen till varje brunn i V bottenplatta.
- För kraft aggregering av klumpar, centrifugera V-bottnade plattor vid 4 ° C under 4 min vid 400 x g. Inkubera plattorna i cellodlingsinkubator (37 ° C och 5% CO2) under fyra dagar.
- Dag 4 - Samling EBS
- Samla EB i den sterila torget plattan från V bottenplåtarna med multikanalpipett och breda hålet 200 ul tips.
- Samla EB från steril fyrkantig platta i 15 ml Falcon rör med 10 ml steril serologisk pipett. Låt EB nöja sig med 2 min. Aspirera supernatanten och tvätta EBS med 5 ml PBS.
- Låt EB att nöja sig med 2 minuter och aspirera supernatanten. Återsuspendera EB i 5 ml RD-medium.
- Pipettera ut 10 ml RD-medium i 10 cmbakteriologiska plåtar. Överför EB i 10 cm bakteriologiska plåtar.
- Inkubera bakteriologiska plattor på horisontell skakapparat (fram- och återgående rörelse 50 / min) hålls i cellkultur inkubator (37 ° C och 5% CO2) under nödvändig tidsperiod. Ge medel förändring (15 ml RD-medium) varannan dag.
Obs: Gentle hantering krävs medan odling hESCs. Storleken på EBS varierar dag 4. Välj de enhetliga format EBS (± 20%) genom att observera i stereomikroskop för ytterligare experiment. Cirka 50% EBS bildade med denna metod är av enhetlig storlek. Överföringen av EBS på shaker resulterar i enhetlig form.
3. cytotoxicitetsanalysen för IC 10 Fastställande
- Överföring av EBS på optiska bottenplattor
- Tina 0,1% gelatin i vattenbad vid 37 ° C under 15 min och belägga optiska bottnade plattor med 50 | il 0,1% gelatin per brunn med användning flerkanalspipett. Inkubera plattorna vid rumstemperatur i45 min. Efter inkubation aspirera gelatinet från optiska bottnade plattor.
- Ta ut EBS samlats på dag 4 i 10 cm bakteriologiska platta innehåller RD medium.
- Håll optiska bottenplattor i lutande position i biosäkerhet skåp. Överför två enhetlig storlek EBS i 100 ^ RD-medium per brunn i optisk botten 96 brunnar genom att observera i stereomikroskop. Håll 12 te kolumnen tom.
- Inkubera plattorna i cellodlingsinkubator (37 ° C och 5% CO2) under 24 h.
- Läkemedels exponering från dag 5 till dag 14
- Väg testföreningen och göra högsta koncentrationen på känt lösningsmedel.
- Utför halv-logaritmiska spädning av testföreningen i serie tills åtta utspädningar i lösningsmedlet som innehåller Falcon-rör numrerade med A-H, Håll röret nr. Jag som fordonskontroll, rör inte. J som negativ kontroll (RD medium) och rör inte. K som positivt (70% etanol) kontroll.
- Tina RD mediet i vattenbad vid 37° C under 15 minuter. Ta ut 5 ml RD-medium vardera i 11 sterila falk rör märkta 1-11.
- Överför 5 pl lösning från röret A till röret K i till röret 1 till 11 respektive och skaka rören. Ta ut den optiska bottenplattan från inkubatorn och försiktigt bort media med användning av multikanalpipett.
- Lägg 200 | il media från rörets nummer 1 till 11 in i respektive kolumner av det optiska bottenplattan. Ge medel förändring / drog varannan dag.
Obs: För halv logaritmisk späd ta 6,48 il lösningsmedel i 7 rör märkta från 2 till 8. Från högsta koncentrationen rör no.1 överföra 3 il till röret nr.2, virvel och seriellt överföra 3 il till nästa rör. Håll röret no.9 för styrning fordon och rör no.10 för negativ kontroll. Tube nr.11 är 70% etanol.
- Dag 14: Resazurin exponering och fluorescensmätning
- Tö RD medium i vattenbad vid 37 ° C under 15 minuter. Utför alla förfarande nämndan nedan i frånvaro av ljus i biosäkerhet skåpet.
- Ta 10 ml RD-medium i 15 ml rör (A) och tillsätt rekommenderad volym av resazurin reagens och blanda genom pipettering. Ta ut den optiska bottenplattan från inkubatorn och försiktigt bort alla medium med multikanalpipett.
- Lägg 100 | il medium från rör A i varje brunn. Inkubera plattan i cellkultur inkubator (37 ° C och 5% CO2) under 90 min.
- Mät fluorescens med hjälp av spektrofotometer (560 Ex / 590 Em).
- IC 10 värde bestämning
- Importera värdena i grafen pad prisma efter avdrag de tomma värden. Uppsättning x-axeln som en dos och y-axeln som en fluorescensenheter.
- Normalisera värdena för att erhålla procentandelen på y-axeln och omvandla värdena (x-axel som log skala). Beräkna IC 50 värde genom att använda sigmoidal dos respons (variabel lutning) parameter. Beräkna log IC 10 värdena genom att använda följandeekvation:
F = 10 logEC 50 = logECF - (1 / HillSlope) * log (F / (100-F))
Y = Bottom + (Top-Bottom) / (1 + 10 ^ ((LogEC 50 X) * HillSlope)) - Bestäm IC 10 värdena tas för fortsatta studier.
4. Biomarker studie baserad på Microarrays
- Dag 0 till dag 5:
- Embryoidkroppar kroppsbildning och överföring till 10 cm bakteriologiska plåtar - följ stegen som anges i punkt 2 för embryoid kroppsbildning.
Obs: Använd tre biologiska replikat för varje studie. Dela varje biologisk replikera i två delar - Läkemedelsbehandling vid IC 10 koncentration och kontroll av fordon. Förbered läkemedelskoncentrationen 10.000 gånger högre än IC 10 koncentrationen i fordonet och från detta tillägg 10 pl till 100 ml RD medium med H9 cellklumpar i 50 ml Eppendorf-rör blanda väl och utsäde den på V bottenplattor. Följ samma procedur för fordonskontrollgruppen.
<li> För läkemedelsexponering på Dag 5 till 14, samla EB's och överföra dem i 10 cm bakteriologiska plåtar på dag 4 enligt de åtgärder som anges i punkt 2. Överför plattorna på horisontell skak (fram- och återgående rörelse 50 / min) i cellodlingsinkubator (37 ° C och 5% CO2) under 14 dagar. Ge mediumbyte varannan dag. - Embryoidkroppar kroppsbildning och överföring till 10 cm bakteriologiska plåtar - följ stegen som anges i punkt 2 för embryoid kroppsbildning.
- För provsamling, på dag 14, samla EBS från 10 cm plattor i till 15 ml Falcon-rör med steril serologisk pipett. Låt EB nöja sig med 2 min. Aspirera supernatanten och tvätta EBS med 5 ml PBS. Låt EB att nöja sig med 2 minuter och aspirera supernatanten. Återsuspendera EB i 1 ml RNAlater lösning eller TRIzol reagens, virvel och förvara provet vid -80 ° C tills vidare bearbetning.
Obs: Utför allt förfarandet i biosäkerhet skåp enligt god laboratoriepraxis. Rotera plattorna i cirkelrörelse runt centrum för att få alla EBS i centrum, aspirera mediet från omgivande med hjälp av steril glas pasture pipett, tillsätt 15 ml RD-medium och sedan lägga 15 ul av läkemedel / fordon för respektive grupp.
5. RNA-isolering och integritet testning
- RNA-isolering:
De flesta av de åtgärder som anges nedan ska utföras för RNA-rening med användning av RNeasy Mini Kit enligt bruksanvisningen. Använd alltid nukleasfritt rör, pipettspetsar och vatten. Under arbetet med TRIzol utföra allt förfarandet i kemikaliesäkerhets huva och skyddsglasögon samt kemiska skyddshandskar.- Tina proverna på is. Om proverna lagras i RNAlater lösning, centrifugera rören vid 12.000 xg under 5 min vid 4 ° C. Kasta supernatanten och tillsätt 1 ml TRIzol reagens.
- Finfördela de prover med 24 G nål och 1 ml spruta. Ungefär 15 gånger rivning är tillräcklig för störningar av EBS, cellvägg och plasmamembran.
- Lägg 200 ul av kloroform i varje prov. Vortex för att blanda innehållet likformigt. Centrifugeravid 12.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C. Ta bort RNeasy mini spinnkolonner, 1,5 ml rör och märka dem på rätt sätt.
- Samla supernatanten i 1,5 ml rör (samtidigt samla supernatanten inte stör mitten eller bottenskiktet). Lägg lika stor volym av kyld 70% etanol. Blanda innehållet genom försiktig skakning.
- Applicera 700 pl från rören till respektive minispinnkolonner och centrifugera dem vid 12.000 xg under 20 sekunder vid rumstemperatur. Utför alla ytterligare steg vid rumstemperatur.
- Kassera filtratet och applicera återstående lösningen till de respektive kolumnerna och centrifugera dem vid 12.000 xg under 20 sek. Kassera filtratet.
- Applicera 350 pl av RW1 buffert till kolonnen och centrifugera dem vid 12.000 xg under 20 sek. Kassera filtratet och applicera 10 | il DNAse och 70 | il RDD buffert till kolonnen.
- Inkubera vid rumstemperatur under 15 minuter. Applicera 350 pl av RW1 buffert till kolonnen och centrifugera dem vid 12.000 xg under 20 sek. Kassera filtratet. Applicera 500 pl avRPE tvättbuffert till kolonnen och centrifugera dem vid 12.000 xg under 20 sek. Kassera filtratet. Igen Applicera 500 ul av RPE tvättbuffert till kolonnen och centrifugera dem vid 12.000 xg under 2 minuter. Kassera filtratet.
- Skift kolumnerna till nya 2 ml uppsamlingsrör och centrifugera dem vid 12.000 xg i 1 min. Överför kolumnerna till märkt 1,5 ml provrör och tillämpa 22 pl nukleasfritt vatten. Centrifugera rören vid 12.000 xg i 1 min.
- Ta bort provröret och lägg dem på is. Kvantifiera RNA med användning av automatiserade elektroforessystem.
- RNA-koncentration, renhet och integritet testning.
För RNA-renhet och integritet testa användning automatiserade elektroforessystem och respektive kit 33.
6. Microarray Studier
- Utför transkriptions profilering med hjälp av kommersiellt tillgängliga mänskliga arraychippen. För framställning RNA-mål, fragmentering, hybridisering 34 och matrischip färgning, tvättning 35 använda kommersiellt tillgängliga kit.
- Utför array chip skanning och kvalitetskontrollen kontroll genom att använda standard Fluidics station, array skannrar och standard mjukvaror 36. För genuttrycksanalys importera filer som genereras från skannrar till standard kommersiellt tillgängliga program 37, utföra bakgrundskorrektion, sammanfattnings och normalisering med Robust Multi-array analys (RMA).
- För att erhålla en lista över differentiellt uttryckta gener (DEG s) utföra ett sätt ANOVA analys. Från denna lista filtrera bort de gener baserade på fold change (± 2) och FDR-kontrollerad p-värde (<0,05). Skaffa Principal Component Analysis (PCA), Heat Map, etc. med hjälp av denna programvara.
Del 2. UKN 1 testsystem
1. Underhåll av hESC
- Ympning av MEF
- För differentiering använda NSCB # 8534 (H9) cellinje. Kultur cells på mus embryonala fibroblaster (MEF) som matarceller. Kläd T25 kolv med 4 ml av 0,1% gelatin och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C.
- Tina MEF i 37 ° C vattenbad och överföra celler till förvärmda DMEM / 10% FBS.
- Spin 3,5 min med 500 x g, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna för erhållande av en x 10 7 celler / ml. Plate MEF 4 x 10 4 / cm2 i T25-kolvar på gelatin. Du kan också använda de MEF för de kommande två dagarna. Kvaliteten på MEF partier är en mycket viktig fråga för hESC underhåll. Därför är det lämpligt att klargöra det bästa företaget och framställningsmetod för H9-celler. Vi använder PMEF P3.
- Uppdelning och underhåll av H9
- Tillsätt 1 ml förvärmda dispas per T25-kolv H9 och inkubera 9 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 2 ml tvättmedium att dispas behandlade celler och pipett 5 gånger upp och ner med 5 ml pipett och överföra cellösning till en falk rör.
- Skölj kolven med 9 ml tvättmediumoch lägga till celler till de andra. Spin 3,5 min med 500 x g, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 ml hESC medium.
- Spin 3,5 min med 500 x g, avlägsna supernatanten och återsuspendera celler i 4 ml hESC medium. Tillsätt 0,5 ml cellsuspension och 4,5 ml hESC medium och platta i en ny (PBS tvättade) T25 kolv med MEF. Ändra hela hESC medium (5 ml) av kolven varje dag.
2. Differentiering av hESC mot neuroektodermalt stamceller (NEP)
- Förbered hESC medium och KCM-medium. Coat en 10 cm skål med gelatin (0,1% i PBS) per T25-kolv och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C. Avlägsna mediet från hESC och tillsätt tillräckligt Accutase att täcka hela botten av kolven (1 ml per T25-kolv) och inkubera 25 till 30 minuter vid 37 ° C.
- Förbered basalmembran matris belagda plattor under Accutase inkubation. Tillsätt kallt DMEM / F12 till fryst basalmembranet matris pellets och lösa det 1:20. Filtrera basalmembranmatrislösningarning genom en 40 ìm cell sil. Lägg filtrerade lösningen till plattan, måste hela botten som skall täckas (1 ml per 6-brunnars krävs) och inkubera i 2 h vid RT.
- Efter inkubationsperioden avlägsna basalmembranmatrisen supernatanten och fröceller på de belagda brunnarna. Efter Accutase steg (2,1) stoppa reaktionen genom tillsats av 1,5 ml HES medium. Skrapa celler från kolven, tillsätt 8 ml hESC medium och producera en enda cell lösning genom att pipettera med 10 ml pipett noggrant. Filter celler genom en 40 ìm cell sil.
- Spin celler 3 min med 500 xg, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 10 ml hESC. Spin-celler igen 3 min med 500 x g, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i hESC innehållande ROCK-inhibitor Y-27632 vid en slutlig koncentration av 10 | iM.
- Avlägsna supernatanten av gelatin belagda skålen. Plate cellsuspensionen på gelatin belagda skålen bort MEF och lämna i inkubatorn för exakt 1 timme.
OBS: Under detta steg MEF kommer settle på gelatin-belagda plattan, medan hESC inte kan fästa till gelatin. Därför är detta är avgörande för att erhålla en matare fritt differentiering. Det är ett kritiskt steg som alltför lång inkubationstid resulterar i hESC klumpar och för kort inkubation i ineffektivt avlägsnande av MEF. Efter 45 min inkubation plattan bör utredas för redan avgjorda MEF och hESC klumpar. - När MEF har fäst, försiktigt tvätta icke vidhäftande celler (hESC) av efter inkubation med mediet redan i plattan. Om flera T25 användes för att få fler celler, enskilda celler nu kan kombineras. Tvätta plattan en gång med hESC medium.
- Spin-celler 3 min med 500 x g, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i ungefär 4 ml KCM innehållande 10 pM ROCK-inhibitor-Y-27632 och 10 ng / ml FGF-2.
- Räkna celler i en hemocytometer med användning av trypanblått. Plate 18 x 10 3 celler / cm2 på basalmembranet matris belagda plattor i KCM innehållande 10 pM ROCK-hämmare Y-27.632 och10 ng / ml FGF-2 (för 6 väl använda 1,5 ml per brunn). Det är viktigt att plattan cellerna i rätt densitet för att skilja dem framgångsrikt i NEP.
- Efter 24 timmar, ändra på medellång till frisk KCM innehållande 10 pM ROCK-hämmare Y-27.632 och 10 ng / ml FGF-2. Efter ytterligare 24 timmar, ändra på medellång till frisk KCM innehållande 10 ng / ml FGF2.
- 72 timmar efter sådd cellerna börjar differentiering av medel förändring mot KSR medium. Denna tidpunkt betecknas som dag av differentiering 0 (DoD0). Tillsatsen av testsubstanser är möjligt nu.
- På DoD1 och DoD2 mediet ändras precis som på DoD0. Nästa medel förändring är på DoD4 innehållande 25% N2-S och 75% KSR. På DoD6 differentieringen stoppas och cellerna skördas för analys.
3. Kromatin Immunoprecipitation (chip) i hESC och NEP
- Framställning av kärnor
- Tillsätt 500 pl Accutase varje 6 brunn som bör analyseras och inkubera under 25 till 30 minuter. Count celler i en Neubauer kammare med hjälp av Trypan blå.
- Resuspendera cellerna i 1% formaldehyd i DMEM / F12 för tvärbindning. Lägg Tris pH 7,5 till en slutlig koncentration av 125 mM efter 10 minuter för att stoppa tvärbindnings.
- Spin celler 3 min med 500 xg vid 4 ° C, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i kall PBS.
- Spin-celler 3 min med 500 xg vid 4 ° C, avlägsna supernatanten och återsuspendera celler i en ml L1-buffert / 1 x 10 6 celler.
- Inkubera i 5 minuter på is. Spin 5 min med 800 xg vid 4 ° C, avlägsna supernatanten och återsuspendera kärnor i 1 ml L2-buffert / 2 x 10 6 celler.
- Sonication och kvalitetskontroll
- Sonikera så att DNA-fragment av 300-700 bp längd genereras. Spin 1 min med 10.000 xg vid 4 ° C. Överför supernatanten till ett nytt rör. Fragmenten måste ha rätt storlek, annars immunoprecipitation blir ineffektiv liksom följt qPCR.
- Ta bort 50 pl end blandning med 50 | j, l L2-buffert för att kontrollera effektiviteten av sonikering genom att köra en agarosgel.
- Omvänd tvärbinda genom inkubering vid 65 ° C under 4 h och 500 rpm. Last prover 1: 5 med Orange G laddningsfärg på en 1,5% agarosgel och kördes 45 minuter vid 110 V i 1 x TBE-buffert. Kontrollfragmentstorlek (ska vara mellan 300-700 bp).
- Kromatin Immunoprecipitation
- Späd prover 1: 5 i utspädningsbuffert och delprov 1 ml per IP i silikoniserade rör.
- Ta bort 5% (volym) från utspätt kromatin prov (steg 3.3.1) och förvara vid 4 ° C som "input".
- Inkubera prov med antikroppar i ditt val och med ospecifik IgG O / N vid 4 ° C på en rotator.
- Tillsätt 50 ul protein-A / G Sepharose-pärlor till varje prov efter immunutfällning. Inkubera proverna 3 h vid 4 ° C på en rotator. Spin 1 minut med 1500 xg vid 4 ° C och avlägsna supernatanten.
- Tvätta med 1 ml tvätt pärlor. Snurr 1 minut med 1500 xg vid4 ° C och avlägsna supernatanten. Upprepa steg g till h. Tvätta med 1 ml slutlig tvättbuffert. Under tvättningsstegen bör du inte förlora något av pärlorna, eftersom detta förändrar mängden eluat direkt.
- Centrifug 1 minut med 1500 xg vid 4 ° C och avlägsna supernatanten. Lägg 125 pl elueringsbuffert och inkubera 15 min med 65 ° C vid 1000 rpm på en skakare.
- Spin 1 minut med 1500 xg och överföra supernatanten till ett nytt rör Upprepa steg k och l. Lägg 200 pl elueringsbuffert till ingång (3.3.2). Lägg Proteinas K och RNas till varje prov och inkubera 30 min med 37 ° C vid 500 rpm på en skakare och efteråt 4 h med 65 ° C vid 500 rpm på en skakmaskin.
OBS: För DNA-extraktion använda kommersiellt tillgängligt chip DNA Clean och Concentrator Kit 38.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metylkvicksilver exponering i UKK testsystem
Cytotoxicitetsanalysen utfördes med H9 EB att erhålla en IC 10 värde (minskning av lönsamheten med 10%) för cytotoxiciteten av metylkvicksilver (Figur 1). Vi genomförde också en microarray baserad (Affymetrix plattform) biomarkör studie. Den H9 EB har utsatts för metylkvicksilver (0,25 och 1 ^ M) under 14 dagar. På dag 14, har prover samlats med hjälp av TRIzol och RNA isolerades. Transkriptionell profilering genomfördes med hjälp av Human Genome U133 plus 2,0 arraychip. Uppgifterna har analyserats med Partek Genomic Suite TM 6.6. Första dataöversikten erhölls genom princip Component Analysis (Figur 2A), generering av Venn diagram (Figur 2B) och konstruktion av värmekartor (Figur 2C). Principen komponentanalys representerar den totala fördelningen av genuttryck och tydligt visualiseras segregation av MeHg 1 iM från vehikelkontroll och MeHg 0,25 pM grupper (PC # 25,2) (Figur 2A). En lista över differentiellt uttryckta gener (DEG) erhölls efter statistisk behandling (envägs ANOVA) och filtrering av data med hjälp av en faldig förändring cut-off på ± 2 och ett flertal-korrigerad (Benja-Hochberg metoden) p-värde <0,05 (tabell 1). Den 1 pM MeHg behandling resulterade i 276 DEGS och 0,25 | iM i 31 DEGS (figur 2b). Värme karta visade att MeHg 1 iM behandling främst minskat genuttryck (Figur 2C). Information om överrepresenterad gense Ontology termer erhölls genom att använda DAVID bioinformatik verktyget. Tabell 2 representerar signifikant överrepresenterade GO gen kategorier som innehöll mer än 5 gener. De nedregleras transkriptionsfaktorer relaterade till nervsystemets utveckling identifierades. SEPP1, DDIT4, AK4, FRZB (hjärnans utveckling), PITX (neurala kärna utveckling) och ErbB3, UGT8, apoB, ApoA1 (nervsystemets utveckling) var nedregleras i ett dosberoende sätt för behandling metylkvicksilver (tabell 3).
UKN ett testsystem
Denna differentiering protokoll använder dubbla SMAD hämning 6 för att generera en ren population av NEP inom sex dagar av differentiering. De resulterande cellerna kännetecknas av en uppreglering av det neurala prekursor gener Pax6 och OTX2. De markörer stamceller Oct4 och nanog är nedregleras under differentieringen mot NEP (Figur 3A). På grund av den mycket synkron och homogen differentiering, är det också möjligt att få information om de histon ändringar under detta tidiga skede av utvecklingen. Vi anpassade protokollet för kromatin immunfällning (chip) med hjälp av celler antingen i början av differentiering eller efter 6 dagardifferentiering. En omkopplare av metylering ställen på promotorregionerna av Pax6 och OTX2 var uppenbart från dessa studier (fig 3B). De undersökta metylering platser histon 3 lysin 4 trimethylation (H3K4me3) och histon 3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3) var mycket dynamisk under differentieringen. Även på proteinnivå en nedreglering av Oct4 kunde observeras (Figur 4). Den uppreglering av Pax6 och neurala stamceller markören nestin observerades immunofluorescensmikroskopi på proteinnivå (Figur 4). Cellpopulationen visade en homogen och ren differentiering efter sex dagar av differentiering. Därför kulturerna lätt kan användas för analys av RNA och protein. Systemet ger också möjlighet att testa ämnen och de effekter de har på tidig neural utveckling 16,29.
Figur 1. cytotoxicitetsanalysen (H9 differentiering) för MeHg. Analysen har gjorts enligt protokollet för att definiera IC 10 värde för metylkvicksilver.
Figur 2. Representativa analys av differential uttryckt gener inducerade av 0,25 och en iM MeHg efter applicering av UKK testsystemet. De hESCs behandlades med 0,25 och en iM MeHg enligt UKK testsystemet. Analys av skillnaden uttryckt transkript i 14-dagars differentierade EBS har utförts med hjälp av Partek Genomic Suite TM 6.6 programvara. (A) Principalkomponentanalys (3-Dimenional) av mikromatrisdata. (B) Venndiagram erhållen från microarray analys av genuttryck. Diagrammet visar antaletgener moduleras genom MeHg behandling (faldig förändring> ± 2, p-värde <0,05). (C) Hierarkisk klustring av genexpressionsdata (faldig förändring> ± 2, p-värde <0,05). De höggradigt uttryckta gener i vehikelkontrollgruppen trycks av 1 iM MeHg behandling. Den 1 iM MeHg behandling resulterade i 233 utskrifter med lägre uttryck och 43 sönder med högre uttryck som jämför med vehikelkontrollgruppen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Genuttryck och histon metylering mönster under differentiering från hESC mot NEP. För alla experiment, hESC differentierades till neuroektodermal prekursorceller (NEP). (A) Prover togs vid day 6 av differentiering, och transkriptionsnivåer markörgener av neural differentiering bestämdes genom RT-qPCR. Data (genuttryck relativt hESC) är medel ± SEM av 5 experiment. (B) Prover för kromatin immunoprecipitation (chip) framställdes på dag 6 av differentiering. ChIP utfördes med antikroppar specifika för H3K4me3 eller H3K27me3 eller kontroll-IgG. Anrikningsfaktorer promotorsekvenser är angivna som% ingång för H3K4me3 (grå) och H3K27me3 (svart). Data är medel ± SEM av 3 oberoende cellpreparationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Protein uttryck under differentiering från hESC mot NEP. Cellerna fixeras och färgas för stamcellsmarkörOct4 (grön) vid dag 0 av differentiering (DoD0) och för NEP markörer Pax6 (röd) och nestin (grön) på dag 6 av differentiering (DoD6). Skala bar visar 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Förteckning över differentiellt uttryckta gener (> ± 2 gånger, p-värde <0,05) av MeHg behandling jämfört med vehikelkontroll i 14 dagar gamla EB. Klicka här för att se tabellen.
Tabell 2. Förteckning över betydligt berikade och utvalda GO kategorier (p-värde <0,05,> 5 gener) med oreglerad transkript för MeHg kontra fordonskontroll i 14 dagar gamla EB.
| GO Term | Räkna | P-värde | Gener |
| Reglering av apoptos | 18 | 0,0068 | ARHGEF3, TBX3, eröB3, MITF, BNIP3, CDH1, IGF2, IFI16, HGF, GCH1, AMIGO2, SERPINB9, KRT18, MSX1, ETS1, VEGFA, PERP, IGFBP3 |
| Reglering av cellproliferation | 17 | 0,0123 | RBP4, LYN, TBX3, eröB3, MITF, IGF2, KDR, RERG, MSX1, ADM, ETS1, VEGFA, BNC1, ADAMTS1, FABP1, IGFBP3, FIGF |
| Vaskulatur Utveckling | 12 | 0,0001 | Plat, ApoB, HAND1, TBX3, EPAS1, FOXF1, LEPR, VEGFA, COL3A1, LOX, FIGF, KDR |
| Skeletal Systemutveckling ng> | 12 | 0,0008 | RBP4, MSX1, LGALS3, TBX3, HOXB6, COL3A1, STC1, IGF2, POSTN, FRZB, IGFBP3, AHSG |
| Hjärta Utveckling | 11 | 0,0001 | RBP4, ACTC1, MSX1, HAND1, TBX3, ADM, PKP2, eröB3, GATA6, COL3A1, ADAMTS1 |
| Glukos metabolisk process | 9 | 0,0003 | PDK1, RBP4, LDHA, PGM5, PYGL, HK2, PFKP, IGF2, PGK1 |
| Lungutveckling | 7 | 0,0008 | RBP4, EPAS1, GATA6, FOXF1, VEGFA, LOX, KDR |
| Epitel Utveckling | 7 | 0,0386 | F11R, FREM2, GATA6, FOXF1, VEGFA, DSP, KDR |
| Mesoderm Utveckling | 5 | 0,0088 | HAND1, TBX3, FOXF1, VEGFA, SNAI2 |
| Term | Gene symbol | Vik Ändra * | |
| 0.25 iM MeHg vs VC | 1 iM MeHg vs VC | ||
| Hjärnans utveckling | SEPP1 | -2,17 | -4,13 |
| DDIT4 | -1,20 | -3,11 | |
| AK4 | -1,41 | -3,08 | |
| FRZB | -1,29 | -2,19 | |
| Neuronal kärna utveckling | PITX2 | -2,08 | -4,90 |
| Nervsystemets utveckling | ErbB3 | -1,86 | -2,89 |
| UGT8 | -1,67 | -2,14 | |
| ApoB | -3,59 | -5,72 | |
| ApoA1 | 2,63 | -2,90 | |
| VEGFA | -1,28 | -3,06 | |
* P-värde <0,05
Tabell 4. Sammansättning av kulturmedia.
| Sr No. | Medium / buffertnamn | Sammansättning | |||
| Mängd | | ||||
| 1 | MEF medium | DMEM hög glukos | |||
| FCS | 10% | ||||
| Penicillin | 100 enheter / ml | ||||
| Streptomycin | 100 ^ g / ml | ||||
| L-glutamin | 2 mM | ||||
| 2 | H9 Odlingsmedium | DMEM F12 | |||
| KOSR | 20% | ||||
| NEAA | 1% | ||||
| Glutamax | 1x | ||||
| β-merkaptoetanol | 0,1 mM | ||||
| Penicillin | 100 enheter / ml | ||||
| Streptomycin | 100 ^ g / ml | ||||
| bFGF | 4 ng / ml | 3 | RD medium | H9 kulturmedium utan bFGF | |
| 4 | Tvättmedium | DMEM / F12 | |||
| Knockout Serum Replacment | 20% | ||||
| 1x GlutaMAX | 1x | ||||
| MEM icke-essentiella aminosyror | |||||
| HEPES | 15 mM | ||||
| β-merkaptoetanol | 90 pM | ||||
| 5 | KCM Medium | DMEM | |||
| FBS | 10% | ||||
| inkuberades under 24 timmar på MEF | |||||
| 6 | Knockout Serum Utbyte (KSR) | ||||
| Knockout serum ersättning | 15% | ||||
| 1x GlutaMAX | |||||
| 1x MEM icke-essentiella aminosyror | |||||
| β-merkaptoetanol | 15 | im | ||||
| Noggin | 35 ng / ml | ||||
| Dorsomorphin | 600 nM | ||||
| SB431542 | 10 | iM | ||||
| 7 | N2-S | DMEM / F-12 | |||
| Apotransferin | 100 ^ g / ml | ||||
| Glukos | 1,55 mg / ml | ||||
| Putrescin | 10 mM | ||||
| Selen | 500 pM | ||||
| Progesteron | 20 ^ M | ||||
| GlutaMAX | 200 pM | ||||
| 25 | ig / ml | |||||
| 8 | L1-buffert | Tris pH 8 | 50 mM | ||
| EDTA | 2 mM | ||||
| NP-40 | 0,10% | ||||
| Glycerol | 10% | ||||
| 9 | L2-buffert | Tris pH 8 | 50 mM | ||
| EDTA | 10 mM | ||||
| SDS | 1% | ||||
| 10 | Elueringsbuffert | NaHCOs 3 | 100 mM | ||
| SDS | 1% | ||||
| 11 | Tvättbuffert | Tris | 20 mM | ||
| EDTA | 2 mM | SDS | 0,10% | ||
| NP-40 | 0,50% | ||||
| NaCI | 150 mM | ||||
| 12 | Slutlig Tvättbuffert | Tris | 20 mM | ||
| EDTA | 2 mM | ||||
| SDS | 0,10% | ||||
| NP-40 | 0,50% | ||||
| NaCI | 500 mM | ||||
| 13 | Stamcells Medium | mTESAR TM basalmedium | 400 ml | ||
| mTESAR TM tillägg | 100 ml | ||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Traditionella metoder för toxikologiska tester innebär omfattande djurstudier vilket gör att testa kostsamt och tidskrävande. Dessutom, på grund av skillnader mellan arterna de prekliniska djursäkerhetsstudier är inte alltid gäller att förutsäga toxiska effekter av potentiella läkemedel som är relevanta för människor. Även icke-mänskliga primater är mest förutsägbara, fortfarande stark etisk och socioekonomiska krav snabbt höja med det moderna samhället för att utveckla känsliga och robust in vitro-test Systemet som är relevanta för människors säkerhet.
Den unika förmåga hESCs att differentiera till alla somatiska celltyper, därför rekapitulera mänskliga utvecklingsprocesser i kombination med känsliga toxikogenomik metoder in vivo har föreslagits som ett alternativ till de traditionella metoder för läkemedelssäkerhet testning 6,21. Under "ESNATS" projektet "UKK" testsystem har utvecklats för att förutsägautvecklings embryonala toxicitet baserad på transkriptomik profilering. I detta system hESC har differentierats i de embryoidkroppar för 14 dagar. Tiden kinetiska transkriptomik profil som erhållits visar hög expression av differentieringsmarkör som är specifik för de tre germinallager ektoderm, endoderm och mesoderm på dag 14 som delvis sammanfatta människans tidiga embryots utveckling. Baserat på dessa resultat, har kända teratogena läkemedel utsatts under differentieringen i 14 dagar och differential uttryckt gen profil har erhållits. Imponerande, genprodukter signaturer associerade med de teratogena effekterna av talidomid observerades hos människor, skulle kunna förutsägas genom detta testsystem 28. De representativa resultat för metylkvicksilver i UKK-systemet visar koncentrationsberoende nedreglering av transkriptionsfaktorer relaterade till nervsystemets utveckling. De andra utvecklingsneurotoxiska testades också i detta system och insatser pågår för att identifierade gemensamma toxikologisk-markörer över föreningarna på mRNA-nivå och validera dem på proteinnivå. Den UKK testprotokoll ges här ger grundläggande riktlinjer för att genomföra experimentet med stamceller från mänskliga embryon H9 att identifiera transcriptomic signatur för fosterskadande effekter.
Den optimerade normal drift förfarande (SOP) för differentiering av pluripotenta stamceller enligt UKN1 protokollet tillåter en robust och synkroniserad differentiering av stamceller från mänskliga embryon till NEP. Redan efter sex dagar av differentiering, är en homogen cellpopulation med hög Pax6 uttrycksnivåer genereras. Cellerna växer i vidhäftande kulturer, som möjliggör analys av immunfärgning. Immunocytokemisk analys med hög upplösning och genom konfokalmikroskopi kräver att cellerna odlas på tunna glasytor. Detta är möjligt för dessa kulturer om glaset belägges optimalt, men det måste nämnas att cellerna växer mycket tät, i fler än ett enda skiktefter sex dagar. Därför är rutinanalys av härstamningsspecifika markörer lättare utförs av RT-qPCR, ChIP eller western blot. En stor fördel för biokemisk analys av odlingarna är det höga utbytet av celler som kan uppnås genom denna differentiering protokoll från ett litet start befolkning hESC. En nackdel med detta protokoll är de höga kostnaderna för de medel kosttillskott (t.ex. noggin) som krävs för att tvinga den homogena neural differentiering. En annan nackdel för vissa applikationer kan vara att vissa små molekyler (kinashämmare) behöver vara närvarande i odlingsmediet som en del av protokollet. Således kan vissa signalvägar inte prövas toxikologiskt, som förändringen av odlingsförhållandena ändras också differentieringen 29.
Fördelen med testsystem kombinationen är bättre förståelse för DNT. Av följande skäl: UKK täcker ett bredare sortiment och negativ effekt på tidig GRODDBLAD bildning kan undersökas, UKN1 allaöden att undersöka fler neurala specifika mekanismer, såsom epigenetik. Även om de två odlingssystem som presenteras här har visat sig förutsäga utvecklingsneurotoxicitet för några modell toxikanter 16, finns det fortfarande ett behov av högre genomströmnings versioner av de protokoll som möjliggör screening av ett stort antal potentiella utvecklingsneurotoxicitet. Dessutom är mer arbete behövs för att identifiera och validera gemensamma markörer för toxicitet vid mRNA eller proteinnivå, och att etablera dem som en del av preklinisk läkemedelsutveckling säkerhetsbedömning.
Mer än 20 miljarder dollar per år investeras av läkemedelsindustrin för läkemedelsutveckling 39. Som ett proof of concept, har vi utvecklat in vitro toxicitets testsystem baserade på hESC och transkriptomik som kan vara lämpliga att förutsäga mänskliga relevanta toxiska effekter av potentiella läkemedelsföreningar i ett kostnadseffektivt och mindre tidskrävande sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
| mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
| V bottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
| Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Kits | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
| Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of equipment | |||
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Genechip Hybridisation Oven - 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of softwares | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |
|||
References
- Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
- Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceutical Biotechnology. Current Pharmaceutical Biotechnology. 12 (11), 1760-1773 (2011).
- Leist, M., Hartung, T., Nicotera, P. The dawning of a new age of toxicology. ALTEX. 25 (2), 103-114 (2008).
- Kuegler, P. B., et al. Markers of murine embryonic and neural stem cells, neurons and astrocytes: reference points for developmental neurotoxicity testing. ALTEX. 27 (1), 17-42 (2010).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. , (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of Developmental Toxicants and Signaling Pathways in a Functional Test Based on the Migration of Human Neural Crest Cells. Environmental Health Perspectives. 120 (8), 1116-1122 (2012).
- Bosman, A., et al. Molecular and Functional Evidence of HCN4 and Caveolin-3 Interaction During Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells and Development. 22 (11), 1717-1727 (2013).
- Sartiani, L., et al. Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach. Stem Cells. 25 (5), 1136-1144 (2007).
- Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation. 76 (9), 958-970 (2008).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (2), 200-206 (2013).
- Subramanian, K., et al. Spheroid Culture for Enhanced Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-Like Cells. Stem Cells and Development. 23 (2), 124-131 (2014).
- Sivertsson, L., Synnergren, J., Jensen, J., Bjorquist, P., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells Cultured in a Perfused Three-Dimensional Bioreactor. Stem Cells and Development. 22 (4), 581-594 (2013).
- Jagtap, S., et al. Cytosine arabinoside induces ectoderm and inhibits mesoderm expression in human embryonic stem cells during multilineage differentiation. British Journal of Pharmacology. 162 (8), 1743-1756 (2011).
- Krug, A. K., et al. Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach. Archives of Toxicology. 87 (1), 123-143 (2013).
- Leist, M., et al. Test systems of developmental toxicity: state-of-the art and future perspectives. Archives of Toxicology. 87 (12), 2037-2042 (2013).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Molecular medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Khoo, M. L. M., et al. Growth and differentiation of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells: Effect of glucose and basic fibroblast growth factor. Biology of Reproduction. 73 (6), 1147-1156 (2005).
- Son, M. Y., Kim, H. J., Kim, M. J., Cho, S. Physical Passaging of Embryoid Bodies Generated from Human Pluripotent Stem Cells. Plos One. 6 (5), (2011).
- Winkler, J., Sotiriadou, I., Chen, S., Hescheler, J., Sachinidis, A. The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology. Current medicinal chemistry. 16 (36), 4814-4827 (2009).
- Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17 (8), 759-766 (2010).
- Miller, M. T., Stromland, K. Teratogen update: Thalidomide: A review, with a focus on ocular findings and new potential uses. Teratology. 60 (5), 306-321 (1999).
- Newman, C. G. H. Teratogen Update - Clinical Aspects of Thalidomide Embryopathy - A Continuing Preoccupation. Teratology. 32 (1), 133-144 (1985).
- Stern, L. In vivo assessment of the teratogenic potential of drugs in humans. Obstetrics and gynecology. 58 (5 Suppl), 3S-8S (1981).
- Lynch, H. T., Reich, J. W. Diethylstilbestrol, Genetics, Teratogenesis, and Tumor Spectrum in Humans. Medical Hypotheses. 16 (3), 315-332 (1985).
- Satoh, H. Behavioral teratology of mercury and its compounds. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 1-9 (2003).
- Meganathan, K., et al. Identification of Thalidomide-Specific Transcriptomics and Proteomics Signatures during Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Plos One. 7 (8), (2012).
- Balmer, N. V., et al. Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome. Human Molecular Genetics. 21 (18), 4104-4114 (2012).
- Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M., Hartung, T. Developmental neurotoxicity - Challenges in the 21st Century and In Vitro Opportunities. ALTEX. 31 (2), 129-156 (2014).
- Leist, M., Efremova, L., Karreman, C. Food for thought ... considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX. 27 (4), 309-317 (2010).
- Zimmer, B., et al. Coordinated waves of gene expression during neuronal differentiation of embryonic stem cells as basis for novel approaches to developmental neurotoxicity testing. Cell Death and Differentiation. 18 (3), 383-395 (2011).
- Experion RNA StdSens Analysis Kit for RNA analysis by Electrophoresis. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000976B%20%20RNA%20STDSENS%20MANUAL.PDF (2014).
- Affymetix GeneChip 3 IVT Express Kit for Target RNA preparation, Fragmentation and hybridization. , Available from: http://microarray.csc.mrc.ac.uk/downloads/3'%20IVT%20Express%20Manual.pdf (2014).
- Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit. , Available from: http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1 (2014).
- Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1 (2014).
- Partek Genomics Suite. , Available from: http://www.partek.com/pgs (2014).
- ChIP DNA Clean and Concentrator. , Available from: http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/pcr-dna-clean-up-concentration/chip-dna-clean-concentrator (2014).
- Kraljevic, S., Stambrook, P. J., Pavelic, K. Accelerating drug discovery. EMBO Reports. 5 (9), 837-842 (2004).
