Summary
I protocolli descrivono due sistemi di test in vitro di tossicità dello sviluppo (UKK e UKN1) a base di cellule staminali embrionali umane e studi trascrittoma. I sistemi di test prevedono pericolo tossicità per lo sviluppo umano, e possono contribuire a ridurre studi sugli animali, i costi e il tempo necessario per le prove della sicurezza chimica.
Abstract
Protocolli efficaci per differenziare le cellule staminali pluripotenti umane a vari tessuti in combinazione con le tecnologie omiche aprono nuovi orizzonti per la tossicità in vitro test in di potenziali farmaci. Per fornire una solida base scientifica per tali dosaggi, sarà importante per ottenere informazioni quantitative sul corso tempo di sviluppo e sui sottostanti meccanismi regolatori di approcci biologia dei sistemi. Due saggi sono stati quindi sintonizzati qui per queste esigenze. Nel sistema di test UKK, cellule staminali embrionali umane (hESC) (o altre cellule pluripotenti) sono lasciate per differenziare spontaneamente per 14 giorni in corpi embrionali, a consentire la generazione di cellule di tutte e tre strati germinali. Questo sistema ricapitola passaggi chiave del primo sviluppo embrionale umano, ed è in grado di prevedere in anticipo embrionale tossicità / teratogenicità specifici umano, se le cellule sono esposti a sostanze chimiche durante la differenziazione. Il sistema di test UKN1 si basa sulla differenziazione hESC a un populationi di neuroectodermica progenitore (NEP), le cellule per 6 giorni. Questo sistema ricapitola precoce sviluppo neurale e prevede presto neurotossicità per lo sviluppo e cambiamenti epigenetici innescati da sostanze chimiche. Entrambi i sistemi, in combinazione con studi transcriptome microarray, sono adatti per l'identificazione di marcatori di tossicità. Inoltre, essi possono essere usati in combinazione per generare dati di input per l'analisi dei sistemi biologia. Questi sistemi di prova hanno vantaggi rispetto ai tradizionali studi tossicologici che richiedono grandi quantità di animali. I sistemi di test, possono contribuire ad una riduzione dei costi per lo sviluppo di farmaci e la valutazione della sicurezza chimica. La loro combinazione mette in luce soprattutto sui composti che possono influenzare lo sviluppo neurologico specifico.
Introduction
La capacità delle cellule staminali embrionali umane (hESC) di differenziarsi in vari tipi di cellule ha aperto una nuova era di tossicità test in vitro 1, modelli di malattia e della medicina rigenerativa 2. Le cellule staminali sono dotati della capacità di auto-replicarsi, per mantenere il loro stato pluripotente, e di differenziarsi in cellule specializzate 3,4. Le proprietà di hESC (capacità di differenziarsi a tutti i principali tipi di cellule) si trovano anche in altre cellule staminali pluripotenti umane, come le cellule umane pluripotenti indotte staminali (hiPSC) o le cellule generate da trasferimento nucleare 5. Per esempio, molte linee di hESC diverse sono state differenziate in neuroni 6, cellule renali 7, cellule della cresta neurale 8, cardiomiociti 9-12 o epatociti come le cellule 13,14. Inoltre, hESC può differenziarsi spontaneamente in cellule di tutti e tre i foglietti embrionali 15-18 a corpi embrionali (EBS) 19,20. Esviluppo embrionale arly è regolato da espressione differenziale dei vari geni correlati ai diversi foglietti embrionali che è stato catturato a livello di mRNA da trascrittomica che usano la tecnologia microarray 15. Questi sforzi hanno portato alla definizione di modelli tossicologici specifici di organi sulla base di hESC / hiPSC e trascrittomica analisi (per la revisione cfr 21,22). Questi modelli hanno vantaggi rispetto al tradizionale uso di animali da laboratorio per gli studi tossicologici, come studi preclinici utilizzano animali da laboratorio non sono sempre predittivi della sicurezza umana. La tossicità indotti dagli stupefacenti riscontrati nei pazienti sono spesso legati a processi metabolici o di segnalazione che si differenziano tra esseri umani e animali da esperimento. La differenza di specie ha impedito l'affidabile la diagnosi precoce di tossicità sullo sviluppo umano, e per esempio farmaci come talidomide 23,24 e dietilstilbestrolo 25,26 sono stati ritirati dal mercato a causa di teratogenicità. ThaliDomide non ha mostrato alcuna tossicità sullo sviluppo nei ratti o topi. Sostanze chimiche ambientali come il mercurio metilico 27 provocato tossicità per lo sviluppo prenatale rispetto al sistema nervoso in varie specie, ma manifestazioni umane sono state difficili da modellare negli animali. Per affrontare il problema dei problemi specie specificità, gli scienziati che lavorano sotto diversi progetti basati sulle cellule staminali come ReProTect, ESNATS, DETECTIVE ecc sono impegnati nello sviluppo di modelli diversi per la tossicità embrionale, neurotossicità, cardiotossicità, epatotossicità e nefrotossicità con sostanze tossiche umani sospettati di interessare l'uomo. Nell'ambito del progetto europeo consorzio 'embrionali Novel strategie di sperimentazione alternative a base di cellule staminali (ESNATS)' sono stati stabiliti cinque sistemi di test. Un sistema di prova il cosiddetto UKK (niversitäts k linikum K OLN U) sistema di test acquisisce parzialmente primi stadi dello sviluppo dell'embrione umano. In questo sistema cellule H9 embrionali umane sono differenziati in tre foglietti embrionali (ectoderma, endoderma e mesoderma) 15 e foglietto embrionale firme specifici sono stati catturati da trascrittomica profilo utilizzando la piattaforma microarray Affymetrix. Varie sostanze tossiche sviluppo come talidomide 28, acido valproico, metilmercurio 16,17, o citosina arabinoside 15 sono stati testati in questo sistema, e la tossicità specifica firme genici sono stati ottenuti. In un secondo sistema di test, il cosiddetto la (U niversità di K onsta n z) UKN1 sistema di prova 1, cellule H9 sono differenziate alle cellule progenitrici neuroectodermal (NEP) per 6 giorni. Ciò è dimostrato da elevata espressione di marcatori genici neurale come PAX6 e OTX2. Durante la differenziazione per 6 giorni, le cellule NEP sono state esposte a sviluppo neuro-tossici come il VPA, il mercurio metilico. Tossico-specifici profili de-regolato trascrittomica sono stati ottenudefinita come pure utilizzando la piattaforma microarray Affymetrix 16,29.
La nuova visione per la tossicologia del 21 ° secolo, prevede che i sistemi di test non producono non solo descrizioni fenotipiche come istopatologia in vivo, o cambiamenti trascrittoma alla fine di incubazione la tossicità a lungo termine. Suggerisce piuttosto che le analisi forniscono informazioni relative alla meccanica 3, e che tali informazioni possono essere mappati ai cosiddetti percorsi di outcome avversi (AOP), che forniscono un razionale scientifico per gli effetti pericolosi 30. Per fornire tali informazioni, i sistemi di test applicati devono essere altamente qualità controllata 31, come ad esempio documentato da solide procedure operative standard. Inoltre, variazioni dipendenti dal tempo devono essere mappati con alta risoluzione. Ciò richiede sistemi di test con variazioni sincronizzate 32. I sistemi di test UKN1 e UKK qui descritti sono stati ottimizzati per queste esigenze.
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Protocol
Il seguente protocollo è stato eseguito utilizzando la linea di cellule staminali embrionali umane (hESC) H9. Questa linea cellulare è stata regolarmente coltivati su fibroblasti di topo mitoticamente inattivato embrionali (MEF) in coltura hESC multimediale integrato con bFGF e poi coltivate in mezzi di cellule staminali su 6 centimetri piastre Petri rivestite di matrice membrana basale come matrigel, per sbarazzarsi di MEF. Le cellule H9 di> 80% lastre confluenti sono stati utilizzati per un ulteriore passaggio. Cellule H9 coltivate su piastre di matrice membrana basale sono stati utilizzati per la formazione EBS. Tutte le procedure di cui al seguente protocollo sono state eseguite utilizzando metodi standard per le pratiche di coltura cellulare asettiche e buone.
Parte 1. Sistema di prova UKK
1. embrionali umane Culturing cellule staminali
- Splitting e manutenzione di H9 su cellule feeder
- Pipettare 2 ml di 0,1% di gelatina in ogni cm piastra 6 e incubare per 30 minuti in coltura cellulare incubator (37 ° C e 5% CO 2). Soluzione di gelatina Aspirare con pipetta Pasteur sterile.
- Aggiungere 2 ml di mezzo MEF contenente 0,1 x 10 6 cellule / ml MEF nelle due piastre rivestite di gelatina e incubare in coltura cellulare incubatore (37 ° C e 5% CO 2) O / N.
- Il giorno successivo, rimuovere le cellule H9 fiala dal serbatoio di azoto liquido con pinze e scongelare il flacone in un bagno di 37 ° C Acque con lunghe pinze.
- Rimuovere il flaconcino da bagno di acqua, bagno con il 70% di etanolo, aria secca nell'armadio biosicurezza per 15 a 30 secondi e trasferire le cellule a 15 ml tubo falco.
- Aggiungere 9 ml di mezzo di coltura H9 lentamente sulla parete interna e centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 6 ml di terreno di coltura contenente inibitori ROCCIA (10 micron, Y27632) e pipetta delicatamente per mescolare. Aspirare MEF mezzo dalla piastra 6 centimetri e aggiungere sospensione cellulare 3 ml in ogni piatto. Modificare il supporto su day 3 e poi ogni altro giorno. Subculture> 80% delle cellule piatto confluenti con rapporto di divisione 1: 3.
Nota: Di solito in 5 a 7 giorni piatto diventa confluenti. Alimentatori utilizzati sono ottenuti da CF1 topi embrione e inattivati dall'esposizione alle radiazioni γ.
- Colture di cellule H9 su piatti matrice membrana basale rivestite
- Mezzo di cellule staminali Thaw (5x) supplemento a temperatura ambiente ed aggiungere 100 ml in 400 ml di terreno di base in cabinet biosicurezza.
- Disgelo matrice membrana basale su ghiaccio. Aggiungere il volume consigliato di matrice membrana basale (fare riferimento al certificato di analisi per ciascun lotto) in 24 ml refrigerati DMEM / F-12 a medio basale per dodici 6 piatti cm. Mescolare pipettando su e giù.
- Aggiungere 2 ml in ogni piatto 6 centimetri. Mantenere la piastra a temperatura ambiente per 1 ora. Rimuovere il supporto e aggiungere 2 ml di terreno di cellule staminali.
- Estrarre quattro piatti H9 confluenti sul MEF. Rimuovere le colonie differenziati con 1 ml di punta della pipetta sotto stereomicroscopio conservati in armadio biosicurezza.
- Aspiraremedio e lavare le cellule con 4 ml di PBS e aggiungere 2 ml staminali medio di cellule in ogni piatto. Tagliare le colonie indifferenziate che possiedono 26 ago G per 6-9 pezzi ciascuno.
- Raccogliere delicatamente le cellule in tubo da 50 ml falco. Centrifugare a 200 xg per 5 min.
- Aspirare il supernatante e risospendere in 12 ml staminali medio cellule. Contare le macchie mettendo 20 ml su vetrino sotto il microscopio e regolare il volume per 150 ciuffi per ml. Aggiungere 2 ml di sospensione in ciascuna piastra 6 CM.
- Spostare le piastre avanti e indietro e da lato a lato proposte di distribuzione ciuffo uniforme ed incubare le piastre in coltura cellulare incubatore (37 ° C e 5% CO 2).
- Rimuovere le colonie differenziati e dare supporto cambio a giorni alterni.
2. corpi embrionali (EBS) Formazione
Eseguire tutte le procedure di seguito indicate secondo le precauzioni asettiche e nell'armadio biosicurezza.
- Day 0 & #8212; Placcatura di cellule H9 su piastre inferiori V
- Preparare copolimero a blocchi del 5% come Pluronic F 127 in PBS e filtrare attraverso il sistema di filtrazione a vuoto spinto con 0,22 micron filtro sterile.
- Cappotto V fondo 96 pozzetti con 40 ml di copolimero a blocchi del 5% per pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 45 min.
- Rimuovere le piastre di matrice membrana confluenti seminterrato con celle H9 da incubatore e rimuovere le colonie differenziati con 1 ml di punta della pipetta sotto stereomicroscopio in cabinet biosicurezza.
- Aspirare il mezzo e lavare le cellule con 4 ml di PBS. Aggiungere 2 ml di media differenziazione casuale (H9 medie cultura senza bFGF, RD media) in ogni piatto. Utilizzare lo strumento passaggio e tagliare le colonie di cellule H9 in ciuffi di forma e dimensione uniformi osservando sotto stereomicroscopio in cabinet biosicurezza e poi raschiare delicatamente con il raschietto cella.
- Raccogliere le macchie in tubo da 50 ml falco e centrifugare a 200 xg per 5 min. Aspirare il supernatante e risospendere il cell in media RD per ottenere 1,000 grumi per ml.
- Aspirare il copolimero a blocchi da lastre V di fondo. Versare i cespi in sterili piastra quadrata e con l'aiuto di pipetta multicanale aggiungere 100 ml di sospensione in ciascun pozzetto della V piastra inferiore.
- Per l'aggregazione forza di grumi, centrifugare le piastre V inferiore a 4 ° C per 4 min a 400 x g. Incubare le piastre a colture cellulari incubatore (37 ° C e 5% CO 2) per quattro giorni.
- Giorno 4 - Raccolta di EBs
- Raccogliere i EBs nella piastra quadrata sterile da piastre di fondo V utilizzando pipetta multicanale e in largo foro 200 microlitri suggerimenti.
- Raccogliere le EBs da sterili piastra quadrata in 15 ml di tubo falcon con 10 ml di sterile pipetta sierologica. Lasciare EBS riposare per 2 minuti. Aspirare il surnatante e lavare i corpi elementari con 5 ml di PBS.
- Lasciare EBS di stabilirsi per 2 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere EB in media 5 ml RD.
- Pipetta out 10 ml di mezzo RD a 10 centimetriPiastre batteriologiche. Trasferire i EBs a 10 centimetri piatti batteriologiche.
- Incubare le piastre batteriologici su agitatore orizzontale (movimento pendolamento 50 / min) mantenuti in coltura cellulare incubatore (37 ° C e 5% 2 CO) per il periodo di tempo richiesto. Dare cambiamento medio (15 ml medio RD) a giorni alterni.
Nota: è necessario manipolazione delicata durante la coltura hESC. La dimensione del EBs varia in giorno 4. Selezionare i EBs dimensioni uniformi (± 20%), osservando sotto stereomicroscopio per ulteriori esperimenti. Circa 50% EBs formate con questo metodo sono di dimensioni uniformi. Il trasferimento di EBS su risultati shaker in forma regolare.
3. citotossicità test per IC 10 Determinazione
- Trasferimento di EBS su piastre di fondo ottici
- Scongelare 0,1% di gelatina in bagno d'acqua a 37 ° C per 15 min e rivestire piastre inferiori ottici con 50 ml di 0,1% di gelatina per pozzetto usando pipetta multicanale. Incubare le piastre a temperatura ambiente per45 min. Dopo l'incubazione aspirare il gelatina da piastre inferiori ottici.
- Uccidete i EBs raccolti il giorno 4 in 10 cm Piatto batteriologico contenenti terreno RD.
- Tenere piastre di fondo ottici in posizione inclinata in cabinet biosicurezza. Trasferimento due dimensioni uniformi di EB in 100 microlitri medio RD per bene in fondo 96 pozzetti ottico osservando sotto stereomicroscopio. Mantenere 12 ° colonna vuota.
- Incubare le piastre a colture cellulari incubatore (37 ° C e 5% CO 2) per 24 ore.
- Esposizione al farmaco di giorno in giorno 5 14
- Pesare il composto in esame e rendere più alta concentrazione in solvente nota.
- Eseguire diluizione a metà logaritmica del composto in esame in serie fino a 8 diluizioni nel solvente contenenti tubi falco numerati con A alla H, tenere tubo no. Io come controllo del veicolo, tubo no. J come controllo negativo (media RD) e tubo no. K come positivo di controllo (70% etanolo).
- Scongelare il medium RD a bagnomaria a 37° C per 15 min. Estrarre 5 ml RD media ogni in 11 tubi falco sterili etichettate da 1 a 11.
- Trasferimento 5 ml di soluzione da tubo A al tubo K in a tubo da 1 a 11, rispettivamente, e vortex i tubi. Estrarre la piastra inferiore ottica dal termostato e rimuovere con attenzione il supporto con l'uso di una pipetta multicanale.
- Aggiungere 200 pl di supporto dal numero tubo 1 a 11 nelle rispettive colonne della piastra inferiore ottica. Dare cambiamento / farmaco medio a giorni alterni.
Nota: per diluizioni half-logaritmica prendono 6,48 ml di solvente in 7 tubi etichettati da 2 a 8. Da più alti tubo concentrazione di trasferimento n ° 1 di 3 ml di n ° 2 tubi, vortice e in serie trasferire 3 ml di tubo successivo. Mantenere tubo No.9 per il controllo del veicolo e tubo n.10 per il controllo negativo. Tubo n.11 è del 70% di etanolo.
- Misurazione dell'esposizione resazurina e fluorescenza: 14 giorni
- Media RD Scongelare in bagno d'acqua a 37 ° C per 15 minuti. Eseguire tutte le procedure mention seguito in assenza di luce nell'armadio biosicurezza.
- Prendere medio 10 ml RD in 15 ml di tubo (A) e aggiungere il volume consigliato di reagente resazurina e mescolare pipettando. Estrarre la piastra inferiore ottica dal termostato e rimuovere con attenzione tutte di medie con la pipetta multicanale.
- Aggiungere 100 ml di mezzo dalla metropolitana A in ciascun pozzetto. Incubare la piastra in coltura cellulare incubatore (37 ° C e 5% CO 2) per 90 min.
- Misurare la fluorescenza mediante spettrofotometro (560 Ex / 590 Em).
- IC 10 determinazione del valore
- Importare i valori sul grafico pad prisma dopo aver sottratto i valori del bianco. Set asse x come dose e y come una unità di fluorescenza.
- Normalizzare i valori per ottenere percentuale sull'asse y e trasformare i valori (asse X come scala logaritmica). Calcola IC50 valore utilizzando risposta sigmoidale dosi (pendenza variabile) parametro. Calculate log IC 10 valori utilizzando seguenteequazione:
F = 10 logEC 50 = logECF - (1 / versante) * log (F / (100-F))
Y = inferiore + (Alto-Basso) / (1 + 10 ^ ((LogEC 50 -X) * versante)) - Determinare i valori di IC 10 da prendere per ulteriori studi.
4. Biomarker studio basato su Microarrays
- Giorno 0 a giorno 5:
- Formazione corpo embrionali e il trasferimento a 10 cm di piatti batteriologici - seguire i passi di cui al punto 2 per la formazione del corpo embrioide.
Nota: Utilizzare tre repliche biologiche per ogni studio. Dividete ogni replica in due parti biologico - Il trattamento farmacologico a IC 10 concentrazione e il controllo del veicolo. Preparare concentrazione di farmaco 10.000 volte sopra la concentrazione IC 10 in veicoli e da questo componente aggiuntivo 10 ml e 100 ml di media RD con grumi di cellule H9 in tubo da 50 ml Eppendorf mescolare bene e sementi su piastre V fondo. Seguire la stessa procedura per il gruppo di controllo del veicolo.
<li> Per l'esposizione di droga al giorno 5 a 14, raccogliere i EB's e trasferirli in 10 centimetri piatti batteriologici il giorno 4 come per le operazioni di cui al punto 2. Trasferire le piastre sul agitatore orizzontale (pendolamento movimento 50 / min) a colture cellulari incubatore (37 ° C e 5% CO 2) per 14 giorni. Dare medio cambio a giorni alterni. - Formazione corpo embrionali e il trasferimento a 10 cm di piatti batteriologici - seguire i passi di cui al punto 2 per la formazione del corpo embrioide.
- Per la raccolta del campione, il giorno 14, raccogliere EBS da lastre 10 centimetri per 15 ml di tubo falcon con sterile pipetta sierologica. Lasciare EBS riposare per 2 minuti. Aspirare il surnatante e lavare i corpi elementari con 5 ml di PBS. Lasciare EBS di stabilirsi per 2 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere EB in soluzione RNAlater 1 ml o reagente TRIzol, vortex e conservare il campione a -80 ° C fino a ulteriori elaborazioni.
Nota: Eseguire tutte le procedure in cabinet biosicurezza secondo le buone pratiche di laboratorio. Ruotare le piastre in movimento circolare intorno al centro di portare tutti EB nel centro, aspirare il terreno dal circostante con l'aiuto di sterili pastu vetrore pipetta, aggiungere 15 ml di mezzo RD e poi aggiungere 15 ml di droga / veicolo per rispettivo gruppo.
5. RNA Isolamento e Verifica integrità
- RNA Isolation:
La maggior parte dei passaggi riportati di seguito devono essere eseguite per la purificazione di RNA utilizzando RNeasy Mini Kit secondo il manuale di istruzioni. Usare sempre tubi priva di nucleasi, puntali e acqua. Mentre si lavora con TRIzol effettuare tutte le procedure in cappuccio della sicurezza chimica ed indossare occhiali protettivi e guanti protettivi.- Scongelare i campioni sul ghiaccio. Se i campioni sono conservati in soluzione RNAlater, centrifugare le provette a 12.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante e aggiungere 1 ml di TRIzol reagente.
- Triturare i campioni utilizzando 24 ago G e 1 siringa ml. Circa 15 volte triturazione è sufficiente per la rottura di EB, parete cellulare e le membrane plasmatiche.
- Aggiungere 200 ml di cloroformio in ogni campione. Vortex per mescolare il contenuto in modo uniforme. Centrifugaa 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. Rimuovere le RNeasy mini colonne di rotazione, provette da 1,5 ml ed etichettare in modo corretto.
- Raccogliere il surnatante in provette da 1,5 ml (Mentre la raccolta di surnatante non disturbare la metà o livello di fondo). Aggiungere uguale volume di freddo il 70% di etanolo. Mescolare il contenuto da un leggero scuotimento.
- Applicare 700 microlitri dai tubi per rispettive colonne mini centrifuga e centrifugare a 12.000 xg per 20 secondi a temperatura ambiente. Eseguire tutti gli ulteriori passi a temperatura ambiente.
- Eliminare il filtrato e applicare la soluzione rimanente per rispettive colonne e centrifugare a 12.000 xg per 20 sec. Eliminare il filtrato.
- Applicare 350 microlitri di tampone RW1 alla colonna e centrifugare a 12.000 xg per 20 sec. Eliminare il filtrato e applicare 10 ml di DNAsi e 70 microlitri di buffer RDD alla colonna.
- Incubare a temperatura ambiente per 15 min. Applicare 350 microlitri di tampone RW1 alla colonna e centrifugare a 12.000 xg per 20 sec. Eliminare il filtrato. Applicare 500 ml diRPE Wash Buffer alla colonna e centrifugare a 12.000 g per 20 sec. Eliminare il filtrato. Ancora Applicare 500 microlitri di tampone di lavaggio RPE alla colonna e centrifugare a 12.000 xg per 2 min. Eliminare il filtrato.
- Spostare le colonne da 2 ml nuovi tubi di raccolta e centrifugare a 12.000 g per 1 min. Trasferire le colonne per etichettata tubo di raccolta da 1,5 ml e applicare 22 ml di acqua priva di nucleasi. Centrifugare le provette a 12.000 g per 1 min.
- Rimuovere il tubo di raccolta e metterli sul ghiaccio. Quantificare l'RNA utilizzando il sistema automatizzato di elettroforesi.
- Concentrazione di RNA, purezza e test di integrità.
Per RNA purezza e l'integrità sperimentazione dell'uso sistema automatico di elettroforesi e relativo kit di 33.
6. microarray Studi
- Eseguire profiling trascrizionale usando commerciali disponibili chip a matrice umani. Per la preparazione di RNA bersaglio, la frammentazione, l'ibridazione 34 e la matriceChip colorazione, lavaggio 35 utilizzare i kit commerciali disponibili.
- Eseguire la scansione di chip array e controllo di qualità, utilizzando stazione fluidica standard, scanner di matrice e software di funzionamento standard 36. Per l'analisi dell'espressione genica importare i file generati da scanner al commerciale disponibile software standard 37, eseguire la correzione di fondo, riepilogo e la normalizzazione con robusta multi-array Analysis (RMA).
- Per ottenere l'elenco dei geni differenzialmente espressi (di DEG) eseguire una maniera analisi ANOVA. Da questo elenco filtrare i geni basati sul cambiamento piega (± 2) e p-value FDR controllato (<0,05). Ottenere l'Analisi delle Componenti Principali (PCA), Mappa di calore, ecc utilizzando questo software.
Parte del sistema 2. UKN 1 test
1. Manutenzione di hESC
- Semina di MEF
- Per la differenziazione utilizzare la NSCB # 8534 (H9) linea cellulare. Cultura cells su fibroblasti embrionali di topo (MEF) come cellule di alimentazione. Coat beuta T25 con 4 ml di 0,1% di gelatina e incubare per 30 min a 37 ° C.
- MEF Scongelare a 37 ° C bagnomaria e trasferire le cellule in pre-riscaldato DMEM / 10% FBS.
- Spin 3,5 min con 500 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule per ottenere 1 x 10 7 cellule / ml. MEF piastra 4 x 10 4 / cm 2 in fusti T25 in gelatina. Facoltativamente, utilizzare i MEF per i prossimi due giorni. Qualità dei lotti MEF sono un problema molto critico per la manutenzione hESC. Pertanto è opportuno chiarire la migliore azienda e metodo di preparazione per le cellule H9. Usiamo PMEF P3.
- Divisione e manutenzione di H9
- Aggiungere 1 ml dispasi pre-riscaldato per T25 pallone H9 e incubare 9 min a 37 ° C.
- Aggiungere 2 ml lavano medio dispasi cellule trattate e pipetta 5 volte su e giù con 5 ml di pipetta e soluzione di cellule trasferimento in un tubo falco.
- Sciacquare il pallone con 9 ml lavare medioe aggiungere celle agli altri. Spin 3,5 min con 500 xg, rimuovere il surnatante e risospendere cellule in terreno 10 ml hESC.
- Spin 3,5 min con 500 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in media 4 ml hESC. Aggiungere 0,5 ml di sospensione cellulare e 4,5 ml di mezzo hESC e la piastra in una nuova (PBS lavato) pallone T25 con MEF. Cambiare intera media hESC (5 ml) del pallone ogni giorno.
2. La differenziazione di hESC nei confronti delle cellule progenitrici neuroectodermico (NEP)
- Preparare media hESC e KCM medio. Coat un piatto 10 centimetri di gelatina (0,1% in PBS) per bombola T25 e incubare per 30 min a 37 ° C. Rimuovere media da hESC e aggiungere abbastanza accutase a coprire tutto il fondo del pallone (1 ml per beuta T25) e incubare 25 a 30 min a 37 ° C.
- Preparare piatti rivestiti matrice membrana basale durante accutase incubazione. Aggiungere freddo DMEM / F12 per congelato pellet matrice membrana basale e risolverlo 1:20. Filtrare solu matrice membrana basalezione attraverso un colino cella di 40 micron. Aggiungi soluzione filtrata al piatto, tutto il fondo deve essere coperta (1 ml per 6 pozzetti è richiesta) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
- Dopo il periodo di incubazione rimuovere il surnatante matrice membrana basale e le cellule di semi sui pozzetti rivestiti. Dopo il punto accutase (2.1) arrestare la reazione mediante aggiunta di 1,5 ml HES medie. Raschiare le cellule dal pallone, aggiungere 8 ml di mezzo hESC e produrre una soluzione di singole cellule pipettando 10 ml pipetta a fondo. Celle filtranti attraverso un colino cella di 40 micron.
- Celle Spin 3 min con 500 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di hESC. Celle Spin ancora 3 minuti con 500 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in hESC contenenti inibitori ROCCIA Y-27632 ad una concentrazione finale di 10 micron.
- Rimuovere il surnatante di piatto di gelatina rivestito. Sospensione cellulare piastra sul piatto di gelatina rivestito per rimuovere le MEF e lasciare in incubatrice per esattamente 1 ora.
NOTA: Durante questa fase i MEF volontàEttle sul piatto di gelatina rivestita, mentre il hESC non potrà allegare alla gelatina. Quindi questo è fondamentale per ottenere una differenziazione senza alimentatore. Si tratta di un passo fondamentale come troppo a lungo i risultati di incubazione a ciuffi hESC e troppo breve incubazione nella rimozione inefficiente del MEF. Dopo 45 minuti di incubazione la piastra deve essere indagato per MEF già insediati e ciuffi hESC. - Quando i MEF hanno attaccato, lavare delicatamente le cellule non aderenti (hESC) dopo incubazione con il mezzo già nel piatto. Se più T25 sono stati utilizzati per ottenere più cellule, singole cellule ora possono essere combinate. Lavare la piastra una volta con il mezzo hESC.
- Celle Spin 3 min con 500 xg, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in circa 4 ml KCM contenenti inibitori ROCCIA 10 micron Y-27632 e 10 ng / ml FGF-2.
- Contare le celle in un emocitometro utilizzando Trypan blu. Piastra 18 x 10 3 cellule / cm 2 di matrice membrana basale piastre rivestite in KCM contenenti inibitori ROCCIA 10 micron Y-27632 e10 ng / ml FGF-2 (per 6 ben utilizzare 1,5 ml per pozzetto). E 'fondamentale per placcare le cellule della giusta densità di differenziarsi con successo in NEP.
- Dopo 24 ore, cambiare mezzo di KCM fresco contenente 10 pM inibitore ROCK Y-27632 e 10 ng / ml FGF-2. Dopo ulteriori 24 ore, cambiare mezzo di KCM fresco contenente 10 ng / ml FGF2.
- 72 ore dopo la semina delle cellule, differenziazione inizia dal cambiamento medio verso KSR medio. Questo punto di tempo viene definito come giorno di differenziazione 0 (DoD0). L'aggiunta delle sostanze in esame è possibile ora.
- Su DOD1 e DOD2 il mezzo è cambiato esattamente come su DoD0. Successivo medio cambiamento è in DoD4 contenente il 25% N2-S e il 75% KSR. Al DoD6 la differenziazione viene arrestato e le cellule vengono raccolti per l'analisi.
3. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di hESC e NEP
- Preparazione di nuclei
- Aggiungere 500 microlitri accutase per ogni 6 bene che deve essere analizzato e incubare per 25 a 30 min. Coucellule NT in una camera di Neubauer utilizzando Trypan blu.
- Risospendere le cellule in 1% di formaldeide in DMEM / F12 per incrociato. Aggiungere Tris pH 7,5 ad una concentrazione finale di 125 mM dopo 10 minuti per fermare la reticolazione.
- Celle Spin 3 min con 500 xg a 4 ° C, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in PBS freddo.
- Cellule Spin 3 min con 500 xg a 4 ° C, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml L1- tampone / 1 x 10 6 cellule.
- Incubare per 5 min in ghiaccio. Spin 5 min a 800 xg a 4 ° C, rimuovere il surnatante e risospendere nuclei in 1 ml tampone L2 / 2 x 10 6 cellule.
- Sonicazione e controllo qualità
- Sonicare così vengono generati che frammenti di DNA di lunghezza 300-700 bp. Spin 1 min con 10.000 xg a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. I frammenti devono avere la dimensione corretta, altrimenti la immunoprecipitazione sarà inefficace come pure la qPCR seguito.
- Rimuovere 50 ml und mix con 50 microlitri di buffer L2 per verificare l'efficienza di sonicazione eseguendo un gel di agarosio.
- Reverse reticolare mediante incubazione a 65 ° C per 4 ore e 500 rpm. Caricare i campioni 1: 5 con Orange G loading dye su un gel di agarosio 1,5% e corrono 45 min a 110 V in 1x tampone TBE. Controllo dimensione del frammento (dovrebbe essere compreso tra 300-700 bp).
- Immunoprecipitazione della cromatina
- Diluire i campioni 1: 5 in tampone di diluizione e aliquota 1 ml per IP in provette siliconate.
- Togliere 5% (in volume) di campione diluito cromatina (passaggio 3.3.1) e conservare a 4 ° C come "input".
- Incubare i campioni con anticorpi di vostra scelta e con aspecifica IgG O / N a 4 ° C su un rotatore.
- Aggiungere 50 ml Protein-A / G Sepharose perline per ogni campione dopo immunoprecipitazione. Incubare campioni 3 ore a 4 ° C su un rotatore. Spin 1 min con 1500 xga 4 ° C e rimuovere il surnatante.
- Lavare con lavaggio perline 1 ml. Spin 1 min con 1500 xga4 ° C e rimuovere il surnatante. Ripetere il passaggio g di h. Lavare con 1 ml tampone di lavaggio finale. Durante le fasi di lavaggio non si dovrebbe perdere nessuna delle perline, perché questo altera la quantità di eluato direttamente.
- Centrifugare 1 min con 1500 xga 4 ° C e rimuovere il surnatante. Aggiungere 125 microlitri tampone di eluizione e incubare 15 min con 65 ° C a 1000 rpm su un agitatore.
- Spin 1 min con 1.500 xg e trasferire il surnatante in un nuovo passo k tubo Ripeti e l. Aggiungere 200 microlitri tampone di eluizione di ingresso (3.3.2). Aggiungere Proteinasi K e RNase a ciascun campione e incubare 30 min con 37 ° C a 500 rpm su un agitatore e dopo 4 ore con 65 ° C a 500 rpm su un agitatore.
NOTA: Per l'estrazione del DNA uso commerciale disponibile ChIP DNA Pulire e concentratore Kit 38.
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Representative Results
Esposizione al mercurio metile in sistema di prova UKK
Il saggio di citotossicità è stata eseguita con H9 EBs per ottenere un valore di IC 10 (riduzione della vitalità del 10%) per la citotossicità di metilmercurio (Figura 1). Abbiamo anche eseguito un microarray basato (piattaforma Affymetrix) studio biomarker. La H9 EBs sono stati esposti al mercurio metilico (0.25 e 1 micron) per 14 giorni. Il giorno 14, i campioni sono stati raccolti utilizzando TRIzol e RNA è stato isolato. Profilatura trascrizionale è stata effettuata utilizzando Human Genome U133 Plus 2.0 chip a matrice. I dati sono stati analizzati con Partek Genomica Suite TM 6.6. Prima panoramica dati sono stati ottenuti Principle Component Analysis (Figura 2A), generazione di diagrammi di Venn (Figura 2B) e la costruzione di mappe di calore (Figura 2C). L'analisi delle componenti principio rappresenta la distribuzione complessiva di espressione genica ed è chiaramente visualizzato segregzione di MeHg 1 mM dal controllo del veicolo e MeHg 0,25 mM gruppi (PC # 25.2) (Figura 2A). Un elenco di geni differenzialmente espressi-(DEG) è stato ottenuto dopo trattamento statistico (ANOVA) e filtraggio dei dati utilizzando un fold change cut-off di ± 2 e un (metodo Benjamini-Hochberg) p-value molteplicità corretta <0.05 (Tabella 1). Il trattamento di 1 micron MeHg provocato 276 degs e 0.25 micron in 31 degs (Figura 2b). La mappa di calore è emerso che MeHg 1 trattamento micron principalmente ridotta espressione genica (Figura 2C). Informazioni sulle condizioni ontologia del gene sovrarappresentati è stata ottenuta utilizzando lo strumento di bioinformatica DAVID. Tabella 2 rappresenta le categorie di geni GO significativamente sovrarappresentati che contenevano più di 5 geni. I fattori di trascrizione down-regolato relativi allo sviluppo del sistema nervoso sono stati identificati. SEPP1, DDIT4, AK4, FRZB (lo sviluppo del cervello), PITX (sviluppo nucleo neurale) e ERBB3, UGT8, APOB, APOA1 (sviluppo del sistema nervoso) sono stati down-regolati in modo dose-dipendente per il trattamento di mercurio metile (Tabella 3).
UKN sistema 1 test
Questo protocollo di differenziazione utilizza dual inibizione SMAD 6 per generare una popolazione pura della Nep entro sei giorni di differenziazione. Le cellule risultanti sono caratterizzate da un up-regulation della neurale geni precursori PAX6 e OTX2. I marcatori di cellule staminali Oct4 e Nanog sono giù regolati durante la differenziazione verso NEP (Figura 3A). Dovuto la differenziazione altamente sincrona e omogeneo, è anche possibile ottenere informazioni sulle modificazioni degli istoni durante questa fase iniziale di sviluppo. Abbiamo adattato il protocollo per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) usando cellule o all'inizio di differenziazione o dopo 6 giorni didifferenziazione. Un interruttore di siti di metilazione sulle regioni promotrici di PAX6 e OTX2 era evidente da questi studi (Figura 3B). I siti di metilazione dell'istone indagati 3 lisina 4 trimethylation (H3K4me3) e istone 3 lisina 27 trimethylation (H3K27me3) erano altamente dinamico durante la differenziazione. Anche a livello proteina potrebbe essere osservato un down regulation di Oct4 (Figura 4). L'up-regolazione di Pax6 e il marcatore di cellule staminali neurali Nestin stata osservata al microscopio immunofluorescenza su livelli di proteina (Figura 4). La popolazione di cellule ha mostrato una differenziazione omogeneo e puro dopo sei giorni di differenziazione. Pertanto le culture possono essere facilmente utilizzato per l'analisi di RNA e proteine. Il sistema prevede anche la possibilità di testare le sostanze e gli effetti che hanno sul primo sviluppo neuronale 16,29.
Figura 1. citotossicità Assay (differenziazione H9) per MeHg. Il saggio è stato eseguito come da protocollo per definire il valore di IC 10 di metilmercurio.
Figura 2. Analisi rappresentativa dei geni espressi differenziali indotti da 0,25 e 1 mM MeHg dopo l'applicazione del sistema di saggio UKK. I hESCs sono stati trattati con 0,25 e 1 mM MeHg secondo il sistema di test UKK. Analisi del differenziale espresso trascritti in 14 giorni EB differenziati è stata effettuata utilizzando il software Partek Genomica Suite TM 6.6. (A) Analisi delle Componenti Principali (3-Dimenional) dei dati microarray. Schema (B) Venn ottenuto dall'analisi microarray di espressione genica. Il diagramma mostra il numero digeni modulati dal trattamento MeHg (fold change> ± 2, valore p <0.05). (C) il clustering gerarchico dei dati di espressione genica (piega cambiamento> ± 2, valore di p <0.05). I geni altamente espressi nel gruppo di controllo del veicolo sono repressi da 1 micron trattamento MeHg. Il trattamento di 1 micron MeHg portato a 233 trascritti con l'espressione inferiore e 43 sonde con maggiore espressione come confrontare con gruppo di controllo del veicolo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. espressione genica e metilazione degli istoni modello durante la differenziazione di hESC verso NEP. Per tutti gli esperimenti, hESC sono stati differenziati per le cellule neuroectodermal precursori (NEP). (A) I campioni sono stati prelevati a day 6 di differenziazione, e trascrizione livelli di geni marcatori di differenziazione neurale sono state determinate mediante RT-qPCR. I dati (espressione genica rispetto al hESC) sono mezzi ± SEM di 5 esperimenti. (B) I campioni di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) sono stati preparati al giorno 6 di differenziazione. ChIP è stata effettuata con anticorpi specifici per H3K4me3 o H3K27me3 o IgG controllo. I fattori di arricchimento di sequenze promotrici sono dati come input% per H3K4me3 (grigio) e H3K27me3 (nero). I dati sono mezzi ± SEM di 3 preparazioni di cellule indipendenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. espressione della proteina durante la differenziazione di hESC verso NEP. Le cellule sono state fissate e colorate per il marcatore di cellule staminaliOct4 (verde) al giorno 0 di differenziazione (DoD0) e per i marcatori NEP Pax6 (rosso) e Nestin (verde) al giorno 6 di differenziazione (DoD6). Bar Scala indica 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Elenco dei geni espressi in modo differenziale (> ± 2 volte, valore di p <0.05), del trattamento MeHg verso il controllo del veicolo in 14 giorni vecchi EBS. Clicca qui per visualizzare questa tabella.
Tabella 2. Elenco delle categorie GO notevolmente arricchito e selezionati (valore p <0.05,> 5 geni) con tran disregolatoscript per MeHg contro il controllo del veicolo in 14 giorni vecchi EBS.
| GO Termine | Contare | Il valore P | Geni |
| Regolazione dell'apoptosi | 18 | 0,0068 | ARHGEF3, TBX3, ERBB3, MITF, BNIP3, CDH1, IGF2, IFI16, HGF, GCH1, AMIGO2, SERPINB9, KRT18, MSX1, ETS1, VEGFA, PERP, IGFBP3 |
| Regolazione della proliferazione cellulare | 17 | 0,0123 | RBP4, LYN, TBX3, ERBB3, MITF, IGF2, KDR, RERG, MSX1, ADM, ETS1, VEGFA, BNC1, ADAMTS1, FABP1, IGFBP3, FIGF |
| Sviluppo Vasculature | 12 | 0,0001 | PLAT, APOB, Hand1, TBX3, EPAS1, FOXF1, LEPR, VEGFA, COL3A1, LOX, FIGF, KDR |
| Sistemi di sviluppo scheletrico ng> | 12 | 0,0008 | RBP4, MSX1, LGALS3, TBX3, HOXB6, COL3A1, STC1, IGF2, POSTN, FRZB, IGFBP3, AHSG |
| Sviluppo Cuore | 11 | 0,0001 | RBP4, ACTC1, MSX1, Hand1, TBX3, ADM, PKP2, ERBB3, GATA6, COL3A1, ADAMTS1 |
| Glucosio processo metabolico | 9 | 0,0003 | PDK1, RBP4, LDHA, PGM5, PYGL, HK2, PFKP, IGF2, PGK1 |
| Sviluppo Lung | 7 | 0,0008 | RBP4, EPAS1, GATA6, FOXF1, VEGFA, LOX, KDR |
| Sviluppo Epithelium | 7 | 0,0386 | F11R, FREM2, GATA6, FOXF1, VEGFA, DSP, KDR |
| Sviluppo Mesoderma | 5 | 0,0088 | Hand1, TBX3, FOXF1, VEGFA, SNAI2 |
| Termine | Gene Simbolo | Fold Change * | |
| 0.25 micron MeHg vs VC | 1 micron MeHg vs VC | ||
| Lo sviluppo del cervello | SEPP1 | -2,17 | -4,13 |
| DDIT4 | -1.20 | -3,11 | |
| AK4 | -1,41 | -3,08 | |
| FRZB | -1.29 | -2.19 | |
| Sviluppo nucleo neuronale | PITX2 | -2,08 | -4,90 |
| Lo sviluppo del sistema nervoso | ERBB3 | -1,86 | -2,89 |
| UGT8 | -1,67 | -2,14 | |
| APOB | -3,59 | -5,72 | |
| APOA1 | 2.63 | -2,90 | |
| VEGFA | -1,28 | -3,06 | |
* Valore di p <0.05
Tabella 4. Composizione dei terreni di coltura.
| Sr. No. | Medio / Nome Buffer | Composizione | |||
| Importo | | ||||
| 1 | MEF medio | DMEM alta glucosio | |||
| FCS | 10% | ||||
| Penicillina | 100 unità / ml | ||||
| Streptomicina | 100 mg / ml | ||||
| L-glutammina | 2 mm | ||||
| 2 | H9 Cultura Media | DMEM F12 | |||
| KOSR | 20% | ||||
| NEAA | 1% | ||||
| Glutamax | 1x | ||||
| β-mercaptoetanolo | 0,1 mm | ||||
| Penicillina | 100 unità / ml | ||||
| Streptomicina | 100 mg / ml | ||||
| bFGF | 4 ng / ml | 3 | RD media | Terreno di coltura H9 senza bFGF | |
| 4 | Wash medio | DMEM / F12 | |||
| Knockout Serum Replacment | 20% | ||||
| 1x Glutamax | 1x | ||||
| Aminoacidi non essenziali MEM | |||||
| HEPES | 15 MM | ||||
| β-mercaptoetanolo | 90 micron | ||||
| 5 | KCM medio | DMEM | |||
| FBS | 10% | ||||
| incubati per 24 ore su MEF | |||||
| 6 | Knockout Serum Sostituzione (KSR) | ||||
| La sostituzione siero Knockout | 15% | ||||
| 1x Glutamax | |||||
| Aminoacidi non essenziali MEM 1x | |||||
| β-mercaptoetanolo | 15 micron | ||||
| Boccaletto | 35 ng / ml | ||||
| Dorsomorphin | 600 Nm | ||||
| SB431542 | 10 mM | ||||
| 7 | N2-S | DMEM / F-12 | |||
| Apotransferin | 100 mg / ml | ||||
| Glucosio | 1,55 mg / ml | ||||
| Putrescina | 10 mM | ||||
| Selenio | 500 micron | ||||
| Progesteron | 20 micron | ||||
| Glutamax | 200 pM | ||||
| 25 mg / ml | |||||
| 8 | L1 Buffer | Tris pH 8 | 50 MM | ||
| EDTA | 2 mm | ||||
| NP-40 | 0,10% | ||||
| Glicerina | 10% | ||||
| 9 | L2 Buffer | Tris pH 8 | 50 MM | ||
| EDTA | 10 mM | ||||
| SDS | 1% | ||||
| 10 | Elution Buffer | NaHCO 3 | 100 MM | ||
| SDS | 1% | ||||
| 11 | Wash Buffer | Tris | 20 mm | ||
| EDTA | 2 mm | SDS | 0,10% | ||
| NP-40 | 0,50% | ||||
| NaCl | 150 mm | ||||
| 12 | Finale Wash Buffer | Tris | 20 mm | ||
| EDTA | 2 mm | ||||
| SDS | 0,10% | ||||
| NP-40 | 0,50% | ||||
| NaCl | 500 mm | ||||
| 13 | Stem Cell Media | mTESAR TM terreno di base | 400 ml | ||
| mTESAR TM supplemento | 100 ml | ||||
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Discussion
Gli approcci tradizionali alla sperimentazione tossicologica coinvolgono ampi studi su animali rendendo così i test costoso e richiede tempo. Inoltre, a causa delle differenze interspecie gli studi sulla sicurezza animale preclinici non sono sempre validi per prevedere effetti di tossicità di potenziali farmaci rilevanti per gli esseri umani. Anche se i primati non umani sono più prevedibili, ancora forte etica, e le richieste socioeconomiche sono rapidamente alzando dalla società moderne per sviluppare sensibili e robusti test in vitro sistema rilevanti per la sicurezza umana.
La capacità unica di hESC di differenziarsi in tutti i tipi di cellule somatiche, quindi ricapitolando i processi di sviluppo umano in vivo a combinazione con approcci tossicogenomica sensibili è stato proposto come alternativa agli approcci tradizionali per i test sulla sicurezza dei farmaci 6,21. Nell'ambito del progetto i "ESNATS 'il sistema di test' UKK 'è stata sviluppata per predirela tossicità embrionale dello sviluppo sulla base di trascrittomica profiling. In questo sistema hESC sono stati variati agli organismi embryoid per 14 giorni. Il profilo trascrittomica cinetica tempo ottenuto mostra ad alta espressione del marcatore differenziazione specifica per i tre foglietti embrionali ectoderma, endoderma e mesoderma il giorno 14, che in parte ricapitolare primi stadi dello sviluppo dell'embrione umano. Sulla base di questi risultati, noti farmaci teratogeni sono stati esposti durante la differenziazione per 14 giorni e differenziale espresso profilo genico sono stati ottenuti. Impressionante, firme genetiche associate con gli effetti teratogeni della talidomide osservati negli esseri umani, potrebbero essere previste da questo sistema di test 28. I risultati rappresentativi per il mercurio metilico a UKK sistema spettacolo regolazione concentrazione-dipendente giù dei fattori di trascrizione relativi allo sviluppo del sistema nervoso. Gli altri neuro-tossici di sviluppo sono stati testati in questo sistema e gli sforzi sono in corso per identificareovvero tossico-marcatori comuni tra i composti a livello di mRNA e li convalidano a livello proteico. Il protocollo di prova UKK fornite qui dà orientamento di base per condurre l'esperimento con H9 di cellule staminali embrionali umane per identificare la firma trascrittomica per tossica per lo sviluppo.
La procedura ottimizzata normale funzionamento (SOP) per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in base al protocollo UKN1 permette una differenziazione robusto e sincronizzata di hESC a NEP. Già dopo sei giorni di differenziazione, viene generata una popolazione cellulare omogenea con livelli di espressione alta PAX6. Le cellule crescono in colture aderenti, che consentono l'analisi mediante immunocolorazione. Analisi immunocitochimica con alta risoluzione e mediante microscopia confocale richiede che le cellule sono coltivate su superfici di vetro sottili. Ciò è possibile per queste culture se il vetro è rivestita in modo ottimale, ma deve essere menzionato che le cellule crescono molto denso, in più di un singolo stratodopo sei giorni. Pertanto, l'analisi di routine di marcatori specifici del lignaggio è più facilmente effettuata mediante RT-qPCR, chip o Western Blot. Un grande vantaggio per l'analisi biochimica delle culture è l'alta resa di cellule che possono essere ottenuti da questo protocollo differenziazione da una piccola popolazione di partenza di hESC. Uno svantaggio di questo protocollo è il costo elevato dei supplementi medi (es noggin) necessari per forzare la differenziazione neuronale omogenea. Un altro inconveniente per alcune applicazioni può essere che alcune piccole molecole (inibitori chinasi) devono essere presenti nel mezzo di coltura come parte del protocollo. Così, alcuni percorsi di segnale non possono essere esaminati tossicologico, come la variazione delle condizioni di coltura cambia anche la differenziazione 29.
Il vantaggio della combinazione di sistema di prova è la migliore comprensione DNT. Mentre UKK copre una gamma più ampia e effetti negativi sulla prima formazione foglietto embrionale può essere indagato, UKN1 tuttoOWS per indagare più meccanismi specifici neurale come epigenetica. Sebbene i due sistemi di coltura qui presentati hanno dimostrato di predire neurotossicità per alcuni modelli tossici 16, vi è ancora una necessità per le versioni di throughput superiori dei protocolli che permettono lo screening di un gran numero di potenziali neurotossici sviluppo. Inoltre, più lavoro è necessario per identificare e convalidare marcatori comuni di tossicità a livello di mRNA e di proteine, e di stabilire come una parte della valutazione preclinica sicurezza dei farmaci.
Più di 20 miliardi dollari l'anno vengono investiti dalle industrie farmaceutiche per la scoperta di farmaci 39. Come prova di concetto, che abbiamo sviluppato nei sistemi di test di tossicità in vitro basate su hESC e la trascrittomica che può essere adatto per prevedere gli effetti di tossicità rilevanti umani di potenziali composti farmacologici in modo economicamente efficace e meno in termini di tempo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
| mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
| V bottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
| Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Kits | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
| Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of equipment | |||
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Genechip Hybridisation Oven - 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of softwares | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |
|||
References
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