Summary
De protocollen beschrijven twee in vitro ontwikkelingstoxiciteit testsystemen (UKK en UKN1) op basis van menselijke embryonale stamcellen en transcriptoom studies. De testsystemen voorspellen mens ontwikkelingsstoornissen giftigheidsgevaar, en kunnen bijdragen aan dierproeven, de kosten en de tijd die nodig is voor de chemische veiligheid testen te verminderen.
Abstract
Efficiënte protocollen menselijke pluripotente stamcellen aan verschillende weefsels in combinatie onderscheiden met -omics technologieën opende nieuwe perspectieven voor in vitro testen van de toxiciteit van potentiële geneesmiddelen. Een solide wetenschappelijke basis voor dergelijke assays verschaffen, is het belangrijk om kwantitatieve informatie te verkrijgen over het tijdsverloop van de ontwikkeling en de onderliggende regulerende mechanismen systeembiologie benaderingen. Twee tests zijn daarom hier afgestemd op deze eisen. In het UKK testsysteem worden menselijke embryonale stamcellen (hESC) (of andere pluripotente cellen) links spontaan differentiëren 14 dagen in embryoid organen, opwekking van cellen van alle weefsels mogelijk. Dit systeem recapituleert belangrijkste stappen van vroege menselijke embryonale ontwikkeling, en kan voorspellen mensspecifieke vroege embryonale / teratogeniciteit, indien cellen worden blootgesteld aan chemicaliën tijdens differentiatie. Het UKN1 testsysteem is gebaseerd op hESC differentiëren naar een population van neuro-ectodermale progenitor (NEP) cellen gedurende 6 dagen. Dit systeem recapituleert vroege neurale ontwikkeling en voorspelt vroege ontwikkelingsneurotoxiciteit en epigenetische veranderingen veroorzaakt door chemicaliën. Beide systemen, in combinatie met transcriptoom microarray studies, zijn geschikt voor het identificeren van biomarkers toxiciteit. Bovendien kunnen zij worden gebruikt in combinatie om data systeembiologie analyse te genereren. Deze testsystemen hebben voordelen ten opzichte van de traditionele toxicologische studies waarbij grote hoeveelheden dieren. De test systemen kan bijdragen tot een vermindering van de kosten voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en chemische veiligheidsevaluatie. Hun combinatie belicht vooral op verbindingen die neurodevelopment specifiek kunnen beïnvloeden.
Introduction
Het vermogen van humane embryonale stamcellen (hESC) te differentiëren tot verschillende typen cellen opende een nieuw tijdperk van in vitro toxiciteitsproeven 1, ziektemodel en regeneratieve geneeskunde 2. De stamcellen zijn begiftigd met de capaciteit om te repliceren, om hun pluripotente toestand in stand te houden en te differentiëren tot gespecialiseerde cellen 3,4. De eigenschappen van hESC (capaciteit om te differentiëren tot alle belangrijke celtypes) zijn ook gevonden in andere menselijke pluripotente stamcellen, zoals de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) of cellen die door nucleaire transfer 5. Zo hebben vele verschillende cellijnen gedifferentieerd tot neuronen 6, 7 niercellen, neurale cellen 8, cardiomyocyten 12/09 of hepatocyten achtige cellen 13,14. Bovendien kan hESC spontaan differentiëren in cellen van alle drie de kiem lagen 15-18 in embryoid lichamen (EBS) 19,20. Early embryonale ontwikkeling wordt gereguleerd door differentiële expressie van verschillende genen betrokken bij de verschillende kiem lagen die op mRNA-niveau is vastgelegd door transcriptomics behulp van microarray technologie 15. Deze inspanningen resulteerden in de oprichting van het orgaan specifiek toxicologisch modellen gebaseerd op hESC / iPSC en transcriptomics analyse (zie voor een overzicht 21,22). Deze modellen hebben voordelen ten opzichte van het traditionele gebruik van proefdieren voor toxicologische studies, zoals preklinische studies met proefdieren zijn niet altijd voorspellend voor de menselijke veiligheid. De drug geïnduceerde toxiciteit aangetroffen bij patiënten zijn vaak gerelateerd aan metabole of signalering processen die verschillen tussen mensen en proefdieren. Het verschil soort is de betrouwbare vroege opsporing van ontwikkelingsstoornissen voorkomen bij de mens, en bijvoorbeeld drugs zoals thalidomide 23,24 en 25,26 diethylstilbestrol werden uit de markt genomen vanwege teratogeniciteit. ThaliDomide heeft niet aangetoond geen ontwikkelingsstoornissen bij ratten of muizen. Milieuchemicaliën zoals methylkwik 27 resulteerde in prenatale ontwikkelingstoxiciteit opzichte van het zenuwstelsel in verscheidene species, maar menselijke manifestaties zijn moeilijk te modelleren bij dieren zijn. Om het probleem van soortspecificiteit kwesties aan te pakken, wetenschappers werken onder verschillende projecten op basis van stamcellen zoals reprotect, ESNATS, detective etc. zijn bezig met de ontwikkeling van verschillende modellen voor embryonale toxiciteit, neurotoxiciteit, cardiotoxiciteit, hepatotoxiciteit en nefrotoxiciteit met menselijke toxische stoffen verdacht invloed op de mens. Onder het Europese consortium project 'embryonale stamcel-gebaseerde roman van alternatieve testmethoden (ESNATS) hebben vijf testsystemen vastgesteld. Een testsysteem de zogenaamde UKK (U niversitäts k linikum K OLN) testsysteem gedeeltelijk vangt vroege humane embryonale ontwikkeling. In dit system menselijke embryonale H9 cellen worden gedifferentieerd tot drie kiembladen (ectoderm, endoderm en mesoderm) 15 en kiemlaag specifieke handtekeningen zijn gevangen genomen door transcriptomics profiel met de Affymetrix microarray platform. Verschillende ontwikkelings toxische stoffen zoals thalidomide 28, valproïnezuur, methylkwik 16,17 of cytosinearabinoside 15 werden getest in dit systeem en de toxische specifiek gen handtekeningen zijn verkregen. In een tweede test-systeem, de zogenaamde de UKN1 (U niversiteit van K onsta n z) testsysteem 1, wordt H9 cellen gedifferentieerd om neuroectodermale voorlopercellen (NEP) voor 6 dagen. Dit blijkt uit een hoge expressie van neurale gen merkers zoals PAX6 en OTX2. Tijdens de differentiatie gedurende 6 dagen, NEP-cellen blootgesteld aan ontwikkelingsstoornissen neuro-toxische stoffen zoals VPA, methylkwik. Giftige stof-specifieke-de gereguleerde transcriptomics profielen obtai geweestevenals ned met behulp van de Affymetrix microarray platform 16,29.
De nieuwe visie voor toxicologie van de 21e eeuw wordt ervan uitgegaan dat testsystemen niet alleen fenotypische beschrijvingen opleveren zoals histopathologie in vivo, of transcriptoom veranderingen aan het eind van de lange termijn giftige stof incubaties. Het eerder suggereert dat assays bieden mechanistische informatie 3, en dat deze informatie kan worden toegewezen aan de zogenaamde negatieve uitkomst paden (AOP), dat een wetenschappelijke rationale voor gevaarlijke effecten 30. Om dergelijke informatie te verstrekken, de toegepaste testsystemen moeten worden zeer kwaliteit gecontroleerd 31, zoals bijvoorbeeld gedocumenteerd door robuuste standaard operatie procedures. Bovendien moeten tijdsafhankelijke veranderingen in kaart te brengen met een hoge resolutie. Dit vereist testsystemen met gesynchroniseerde veranderingen 32. De hier beschreven UKN1 en UKK testsystemen zijn geoptimaliseerd voor deze eisen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol werd uitgevoerd met behulp van menselijke embryonale stamcellen lijn (hESC) H9. Deze cellijn was routinematig gekweekt op mitotisch geïnactiveerde muis embryonale fibroblasten (MEF) in hESC cultuur media, aangevuld met bFGF en vervolgens gekweekt in stamcel media op 6 cm Petri platen bekleed met basaal membraan matrix zoals matrigel, om zich te ontdoen van MEF. De H9 cellen van> 80% confluente platen werden gebruikt voor verdere passage. H9 cellen gekweekt op basaal membraan matrix platen werden gebruikt voor de vorming van EBS. Alle in het volgende protocol genoemde procedures zijn uitgevoerd met behulp van standaard methoden voor aseptische en goede celcultuur praktijken.
Deel 1. UKK-test System
1. menselijke embryonale stamcellen kweken
- Splitsing en onderhoud van H9 op voedingscellen
- Pipetteer 2 ml 0,1% gelatine in elk 6 cm plaat en incubeer gedurende 30 minuten in celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2). Zuig gelatine-oplossing met een steriele Pasteur pipet.
- Voeg 2 ml MEF medium dat 0,1 x 10 6 MEF cellen / ml in beide gelatine beklede platen en incubeer ze in celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2) O / N.
- Op de volgende dag, verwijder de H9 cellen flesje uit de vloeibare stikstof opslagtank met behulp van een tang en ontdooien van de flacon in een 37 ° C waterbad met lange tang.
- Haal het flesje uit waterbad, bad met 70% ethanol, drogen in de bioveiligheid kast 15 tot 30 seconden en breng de cellen 15 ml Falcon buis.
- Voeg 9 ml H9 kweekmedium langzaam aan de binnenwand en centrifugeer de cellen bij 200 g gedurende 5 min.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 6 ml kweekmedium met ROCK-remmer (10 uM, Y27632) en voorzichtig pipet te mengen. Zuig MEF medium van de 6 cm plaat en voeg 3 ml celsuspensie in elke plaat. Verander het medium op day 3 en vervolgens om de andere dag. Subcultuur> 80% confluent plaat cellen met split verhouding 1: 3.
Opmerking: Meestal in 5 tot 7 dagen plaat wordt confluent. Feeders gebruikt worden verkregen uit CF1 muizen embryo en geïnactiveerd door blootstelling aan straling γ.
- H9 cel kweken op basaal membraan matrix gecoate platen
- Thaw stamcel medium (5x) supplement bij RT en voeg 100 ml in 400 ml basismedium in bioveiligheid kast.
- Thaw basaal membraan matrix op ijs. Voeg stelde volume van basaal membraan matrix (zie certificaat van de analyse voor elke partij) in 24 ml gekoelde DMEM / F-12 basaal medium voor twaalf 6 cm platen. Meng door en neer te pipetteren.
- Voeg 2 ml in elk 6 cm plaat. Laat de plaat bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Verwijder het medium en voeg 2 ml van stamcel medium.
- Neem vier confluent H9 platen op MEF. Verwijder de gedifferentieerde koloniën met 1 ml pipetpunt onder stereomicroscoop in bioveiligheid kast gehouden.
- Aspirerenhet medium en was de cellen met 4 ml PBS en voeg 2 ml stamcel medium in elke plaat. Snijd de ongedifferentieerde kolonies met 26 G naald in 6 tot 9 stuks elk.
- Voorzichtig het verzamelen van de cellen in 50 ml falcon buis. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten.
- Zuig het supernatant en resuspendeer in 12 ml stamcel medium. Tel de bosjes door de invoering van 20 ui op glas dia onder de microscoop en het volume voor 150 klonten per ml aan te passen. Voeg 2 ml suspensie in elke 6 cm plaat.
- Beweeg de platen heen en weer en side-to-side ontwerp gelijkmatige massa distributie en incubeer de platen in celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2).
- Verwijder de gedifferentieerde koloniën en geef medium veranderen elke andere dag.
2. embryoiden Bodies (EBS) Formation
Voer alle hieronder genoemde als per aseptische voorzorgsmaatregelen en in de bioveiligheid kast procedure.
- Day 0 & #8212; Plating van H9 cellen op V bodemplaten
- Bereid 5% blokcopolymeer zoals Pluronic F-127 in PBS en filteren door middel van vacuüm gedreven filtratie-systeem met behulp van 0,22 pm steriel filter.
- Coat V bodem 96 putjes met 40 pl 5% blokcopolymeer per putje en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 45 min.
- Verwijder de samenvloeiing basaal membraan matrix borden met H9 cellen van incubator en verwijder de gedifferentieerde koloniën met 1 ml pipetpunt onder stereomicroscoop in bioveiligheid kast.
- Zuig het medium en spoelen van de cellen met 4 ml PBS. Voeg 2 ml willekeurige differentiatie medium (H9 kweekmedium zonder bFGF, RD gemiddeld) in elke plaat. Gebruik passage gereedschap en snijd de H9 celkolonies in groepjes van gelijke grootte en vorm door het observeren onder stereomicroscoop in bioveiligheid kast en dan zachtjes te schrapen met de cel schraper.
- Verzamel de klonten in 50 ml Falcon buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer de cell in RD middellange tot 1.000 klonten per ml te krijgen.
- Zuig het blokcopolymeer van V bodemplaten. Giet de bosjes in steriele vierkante plaat en met behulp van meerkanaalspipet voeg 100 ul van schorsing aan elk putje van V bodemplaat.
- Voor de kracht aggregatie van klonten gecentrifugeerd met V bodem platen bij 4 ° C gedurende 4 min bij 400 x g. Incubeer de platen in celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2) gedurende vier dagen.
- Dag 4 - Het verzamelen van EBS
- Verzamel de EBS in de steriele vierkante plaat van V bodemplaten met meerkanaalspipet en wijde boring 200 pi tips.
- Verzamel de EBS uit steriele vierkante plaat in 15 ml falcon buis met 10 ml steriele serologische pipet. Laat EBS te regelen voor 2 min. Zuig het supernatant en was de EBS met 5 ml PBS.
- Laat EBS te regelen voor 2 min en zuig het supernatant. Re-schorten EBS in 5 ml RD medium.
- Pipet out 10 ml RD medium in 10 cmbacteriologische platen. Breng de EBS in 10 cm bacteriologische platen.
- Incubeer bacteriologische platen horizontaal schudapparaat (heen en weergaande beweging 50 / min) gehouden celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2) voor de vereiste tijdsperiode. Geef medium verandering (15 ml RD gemiddeld) om de andere dag.
Opmerking: Gentle hantering noodzakelijk is, terwijl het kweken hESCs. De grootte van EBS varieert op dag 4. Selecteer de uniforme grootte EBS (± 20%) door het observeren onder stereomicroscoop voor verdere experimenten. Ongeveer 50% EBS gevormd met deze werkwijze zijn van gelijke grootte. De overdracht van EBS op shaker resultaten in uniform vorm.
3. cytotoxiciteitstest voor IC 10 Bepaling
- Overdracht van EBS op optische bodemplaten
- Ontdooi 0,1% gelatine in een waterbad op 37 ° C gedurende 15 min en vacht optische bodemplaten met 50 pi 0,1% gelatine per putje gebruikt multichannel pipet. Incubeer de platen bij KT45 min. Na incubatie zuig het gelatine van optische bodemplaten.
- Neem de verzameld op dag 4 in 10 cm bacteriologische plaat met RD medium EBS.
- Houd optische bodemplaten in schuine positie in bioveiligheid kast. Transfer twee uniforme grootte van EBS in 100 ul RD medium per putje in optische bodem 96 wells plaat door het observeren onder stereomicroscoop. Houd 12 ste kolom leeg.
- Incubeer de platen in celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2) gedurende 24 uur.
- Blootstelling geneesmiddel van dag 5 tot dag 14
- Weeg de testverbinding en maak hoogste concentratie in bekende oplosmiddel.
- Voer half-logaritmische verdunning van de testverbinding tot 8 serie verdunningen in het oplosmiddel dat falcon buizen genummerd, waarbij A H, houden geen buis. I als vehikelcontrole, buis niet. J als negatieve controle (RD gemiddeld) en de buis niet. K als positief (70% ethanol) controle.
- Ontdooi de RD medium in een waterbad bij 37° C gedurende 15 min. Neem 5 ml RD medium elk in 11 steriele falcon buizen label van 1 tot 11.
- Overdracht 5 pi oplossing van buis tot buis A K op de buis 1-11 respectievelijk vortex de buizen. Neem de optische bodemplaat uit de incubator en de media verwijder voorzichtig met het gebruik van multichannel pipet.
- Voeg 200 ul van de media van de buis nummer 1-11 in de respectieve kolommen van de optische bodemplaat. Geef elke andere dag medium / drug verandering.
Opmerking: Voor half-logaritmische verdunningen nemen 6,48 ul oplosmiddel in 7 tubes label van 2 tot 8. Van hoogste concentratie buis no.1 overdracht 3 ul aan de buis no.2, vortex en serieel overdragen 3 pi tot volgende buis. Houd buis no.9 voor controle over het voertuig en de buis no.10 voor negatieve controle. Tube no.11 is 70% ethanol.
- Dag 14: resazurine belichting en fluorescentiemeting
- Dooi RD medium in een waterbad op 37 ° C gedurende 15 min. Voer alle procedure mention hieronder in afwezigheid van licht in de bioveiligheid kast.
- Neem 10 ml RD medium in 15 ml buis (A) en voeg de aanbevolen hoeveelheid resazurin reagens en meng door pipetteren. Neem de optische bodemplaat uit de incubator en verwijder alle medium met een multichannel pipet.
- Voeg 100 ul van medium van de buis A in elk putje. Incubeer de plaat in celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2) gedurende 90 min.
- Meet de fluorescentie met behulp van spectrofotometer (560 Ex / 590 Em).
- IC 10 waarde bepalen
- Importeer de waarden in de grafiek pad prisma na het aftrekken van de blanco waarden. Set x-as als dosis en y-as als fluorescentie-eenheden.
- Normaliseren van de waarden percentage op het y-as te verkrijgen en te transformeren de waarden (x-as als log schaal). Bereken IC 50 waarde met sigmoïdale dosis-respons parameter (variabele helling). Bereken log IC 10 waarden met behulp van volgendevergelijking:
F = 10 logEC 50 = logECF - (1 / hillslope) * log (F / (100-F))
Y = + Bottom (Boven-Onder) / (1 + 10 ^ ((LogEC 50 -X) * hillslope)) - Bepaal de IC 10 waarden die moeten worden genomen voor verder onderzoek.
4. Biomarker studie op basis van Microarrays
- Dag 0 tot dag 5:
- Embryoid lichaam vorming en de transfer naar 10 cm bacteriologische platen - volg de in punt 2 voor embryoid lichaam formatie genoemde stappen.
Opmerking: Gebruik drie biologische herhalingen voor elke studie. Verdeel elke biologische repliceren in twee delen - de behandeling op het IC 10 concentratie en controle over het voertuig Drug. Bereid drug concentratie van 10.000 voudige boven de IC 10-concentratie in het voertuig en van deze voeg 10 ul tot 100 ml RD medium met H9 cel klonten in 50 ml Eppendorf buisje goed mengen en zaad het op V bodemplaten. Volg dezelfde procedure voor het voertuig controle-groep.
<li> Voor de blootstelling aan het geneesmiddel op dag 5 tot 14, het verzamelen van de EB's en over te brengen in 10 cm bacteriologische platen op dag 4 volgens de in punt genoemde stappen 2. Breng de platen op horizontale shaker (heen en weer bewegende 50 / min) in celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2) gedurende 14 dagen. Geef elke andere dag medium verandering. - Embryoid lichaam vorming en de transfer naar 10 cm bacteriologische platen - volg de in punt 2 voor embryoid lichaam formatie genoemde stappen.
- Voor monstername, op dag 14, het verzamelen van de EBS van 10 cm platen in 15 ml falcon buis met een steriele serologische pipet. Laat EBS te regelen voor 2 min. Zuig het supernatant en was de EBS met 5 ml PBS. Laat EBS te regelen voor 2 min en zuig het supernatant. Resuspendeer EBS in 1 ml RNAlater oplossing of TRIzol reagens, vortex en bewaar het monster bij -80 ° C tot verdere verwerking.
Opmerking: Voer alle procedure in bioveiligheid kast als per goede laboratorium praktijken. Draai de platen cirkelvormige beweging rond het midden naar alle EBS midden in het medium rondom met behulp van steriele glazen paštu brengen zuigenre pipet, voeg 15 ml RD medium en voeg 15 ul van drug / voertuig voor het desbetreffende groep.
5. RNA isolatie en betrouwbaarheidstoetsing
- RNA isolatie:
Het merendeel van de onderstaande stappen zijn voor RNA-zuivering met gebruik van RNeasy Mini Kit volgens de handleiding wordt uitgevoerd. Gebruik altijd nuclease gratis buizen, pipetpunten en water. Tijdens het werken met TRIzol voeren alle procedure in de chemische veiligheid motorkap en draag beschermende bril evenals chemische beschermende handschoenen.- Ontdooi de monsters op ijs. Indien monsters worden opgeslagen in RNAlater oplossing gecentrifugeerd buizen bij 12.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml TRIzol reagens.
- Vermaal de monsters met behulp van 24 G naald en 1 ml spuit. Ongeveer 15 maal tritureren voldoende was voor het breken van EBS, celwanden en plasmamembranen.
- Voeg 200 ul chloroform in elk monster. Vortex de inhoud uniform te mengen. Centrifugebij 12.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder de RNeasy mini spin-kolommen, 1,5 ml buizen en label ze goed.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof in 1,5 ml buizen (terwijl het verzamelen van bovenstaande niet de middelste of onderste laag niet storen). Voeg gelijke volume van gekoelde 70% ethanol. Meng de inhoud door zacht schudden.
- Breng 700 pi van de respectievelijke buizen tot mini spinkolommen en centrifugeer ze bij 12.000 xg gedurende 20 seconden bij KT. Voer alle verdere stappen bij KT.
- Werp het filtraat en de overblijvende oplossing toegepast op de respectieve kolommen en centrifugeer ze bij 12.000 xg gedurende 20 sec. Gooi het filtraat.
- Breng 350 ui buffer RW1 aan de kolom en centrifugeer ze bij 12.000 xg gedurende 20 sec. Werp het filtraat en 10 ul DNAse en 70 gl buffer RDD toepassing op de kolom.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Breng 350 ui buffer RW1 aan de kolom en centrifugeer ze bij 12.000 xg gedurende 20 sec. Gooi het filtraat. Breng 500 piRPE wasbuffer aan de kolom en centrifugeer ze bij 12.000 xg gedurende 20 sec. Gooi het filtraat. Opnieuw Breng 500 pi van RPE wasbuffer aan de kolom en centrifugeer ze bij 12.000 xg gedurende 2 min. Gooi het filtraat.
- Verschuiving van de kolommen om nieuwe 2 ml collectie buizen en centrifuge ze op 12.000 xg gedurende 1 minuut. Breng de kolommen gelabelde 1,5 ml collectie buis en 22 ul van nuclease gratis water toe te passen. Centrifugeer de buisjes bij 12.000 xg gedurende 1 min.
- Verwijder de collectie buis en leg ze op ijs. Kwantificeren RNA met behulp van geautomatiseerde elektroforese systeem.
- RNA-concentratie, zuiverheid en integriteit testen.
Voor RNA zuiverheid en integriteit van het testen van het gebruik van geautomatiseerde elektroforese systeem en de bijbehorende kit 33.
6. Microarray Studies
- Voer transcriptie profiling met behulp van commerciële beschikbaar Human scala chips. Voor RNA-doelwit voorbereiding, fragmentatie, hybridisatie 34 en scalachip vlekken, wassen 35 gebruik in de handel verkrijgbare kits.
- Voer scala chip scannen en kwaliteitscontrole door het gebruik van standaard fluidics station, array scanners en standaard operationele software 36. Voor de analyse van genexpressie importeren gegenereerd uit scanners aan de standaard in de handel verkrijgbare software 37 bestanden, voeren achtergrond correctie, samenvatten en normalisatie met robuuste Multi-array analyse (RMA).
- Voor het verkrijgen van de lijst van differentieel tot expressie van genen (DEG's) voert u een ANOVA analyse. Uit deze lijst wegfilteren genen op basis van de veelvoudverandering (± 2) en FDR-gestuurde p-waarde (<0,05). Het verkrijgen van de Principal Component Analysis (PCA), Heat Map, etc. met behulp van deze software.
Deel 2. UKN 1 Test System
1. Onderhoud van hESC
- Zaaien van MEF
- Voor de differentiatie gebruik de NSCB # 8534 (H9) cellijn. Cultuur cells op muis embryonale fibroblasten (MEF) als voedingscellen. Coat T25 kolf met 4 ml 0,1% gelatine en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Dooi MEFs in 37 ° C waterbad en breng de cellen in voorverwarmde DMEM / 10% FBS.
- Spin 3,5 min bij 500 xg, verwijder supernatant en resuspendeer cellen tot 1 x 10 7 cellen / ml te verkrijgen. Plaat MEF 4 x 10 4 / cm 2 in T25 flessen op gelatine. Eventueel gebruikt de MEF de volgende twee dagen. Kwaliteit van MEF partijen zijn een zeer kritisch onderwerp voor hESC onderhoud. Daarom is het raadzaam om het beste bedrijf en bereidingswijze verhelderen van de H9 cellen. We gebruiken PMEF P3.
- Splitsen en onderhoud van H9
- Voeg 1 ml voorverwarmde dispase per T25 fles H9 en incubeer 9 min bij 37 ° C.
- Voeg 2 ml wasmedium te behandelen cellen en pipet 5 keer op en neer met een 5 ml pipet en transfercel oplossing voor een Falconbuis Dispase.
- Was de kolf met 9 ml wasmediumen cellen aan anderen. Spin 3,5 min bij 500 xg, verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 10 ml hESC medium.
- Spin 3,5 min bij 500 xg, verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 4 ml hESC medium. Voeg 0,5 ml celsuspensie en 4,5 ml hESC medium en plaat in een nieuwe (PBS gewassen) T25 fles met MEF. Verander elke dag volledige hESC medium (5 ml) van de kolf.
2. Differentiatie van hESC richting neuroectodermale Progenitor Cells (NEP)
- Bereid hESC medium en KCM medium. Coat een 10 cm schaal met gelatine (0,1% in PBS) per T25 fles en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Verwijder medium uit hESC toevoegen Accutase genoeg om de hele bodem van het vat (1 ml per T25 fles) te bedekken en incubeer 25-30 minuten bij 37 ° C.
- Bereid basaal membraan matrix gecoate platen tijdens Accutase incubatie. Voeg koude DMEM / F12 op bevroren basaal membraan matrix pellet en oplossen 01:20. Filter basaal membraan matrix solutie door een 40 um cel zeef. Toevoegen gefiltreerde oplossing aan de plaat, de gehele bodem bedekt moet worden (1 ml per 6 putjes vereist) en incubeer gedurende 2 uur bij KT.
- Na incubatietijd verwijder het basaal membraan matrix supernatant en zaad cellen op de beklede putjes. Na Accutase stap (2.1) stopt de reactie door toevoeging van 1,5 ml HES medium. Schraap cellen uit de kolf, voeg 8 ml hESC medium en produceren van een enkele cel oplossing door pipetteren met een 10 ml pipet grondig. Filter cellen door een 40 um cel zeef.
- Spin cellen 3 min met 500 xg, verwijder supernatant en resuspendeer cellen in 10 ml van hESC. Spin cellen weer 3 min met 500 xg, verwijder supernatant en resuspendeer cellen in hESC met ROCK-remmer Y-27632 bij een uiteindelijke concentratie van 10 uM.
- Verwijder supernatant gelatine gecoate schaal. Plate celsuspensie op gelatine gecoate schotel naar de MEF te verwijderen en laat in de incubator voor exact 1 uur.
LET OP: Tijdens deze stap van de MEF zal settle op de gelatine gecoate plaat, terwijl de hESC niet kan hechten aan gelatine. Daarom is dit cruciaal voor een feeder-vrije differentiatie te verkrijgen. Het is een cruciale stap als te lange incubatietijd resultaten in hESC klonten en te korte incubatie in inefficiënte verwijdering van MEF. Na 45 min incubatie de plaat moet worden onderzocht voor al geregeld MEF en hESC klonten. - Wanneer de MEF hebben gehecht, voorzichtig te wassen niet-hechtende cellen (hESC) na incubatie met het medium reeds in de plaat. Als meerdere T25 werden gebruikt om meer cellen te krijgen, enkele cellen kunnen nu worden gecombineerd. Was plaat eenmaal met hESC medium.
- Spin cellen 3 min bij 500 xg, verwijder supernatant en resuspendeer cellen in ongeveer 4 ml KCM met 10 pM ROCK remmer Y-27632 en 10 ng / ml FGF-2.
- Tellen cellen in een hemocytometer met trypaanblauw. Plate 18 x 10 3 cellen / cm2 op basaal membraan matrix gecoate platen in KCM met 10 pM ROCK-remmer Y-27632 en10 ng / ml FGF-2 (voor 6 zowel gebruik 1,5 ml per putje). Het is cruciaal om de cellen in de juiste dichtheid plaat om ze succesvol differentiëren in NEPs.
- Na 24 uur, veranderen medium om verse KCM met 10 uM ROCK-remmer Y-27632 en 10 ng / ml FGF-2. Na nog eens 24 uur, veranderen medium om verse KCM met 10 ng / ml FGF2.
- 72 uur na het zaaien van de cellen, differentiatie begint met het medium verandering naar KSR medium. Dit tijdstip is aangeduid als dag 0 van differentiatie (DoD0). Toevoeging van teststoffen is nu mogelijk.
- Op DoD1 en DoD2 het medium is veranderd precies zoals op DoD0. Volgende medium verandering is op DoD4 met 25% N2-S en 75% KSR. Bij DoD6 de differentiatie gestopt en de cellen geoogst voor analyse.
3. Chromatine Immunoprecipitatie (chip) van hESC en NEP
- Bereiding van kernen
- Voeg 500 ul Accutase aan elk 6 vormt dat moet worden geanalyseerd en incubeer gedurende 25 tot 30 min. Count cellen in een Neubauer kamer met behulp van trypan blauw.
- Resuspendeer cellen in 1% formaldehyde in DMEM / F12 voor verknopen. Voeg Tris pH 7,5 tot een eindconcentratie van 125 mM na 10 minuten de verknoping te stoppen.
- Spin cellen 3 min bij 500 xg bij 4 ° C, verwijderen van supernatant en resuspendeer cellen in koude PBS.
- Spin cellen 3 min bij 500 xg bij 4 ° C, verwijderen van supernatant en resuspendeer cellen in 1 ml buffer L1 / 1 x 10 6 cellen.
- Incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Spin 5 min bij 800 xg bij 4 ° C, verwijderen van supernatant en resuspendeer kernen in 1 ml L2- buffer / 2 x 10 6 cellen.
- Sonicatie en kwaliteitscontrole
- Ultrasone trillingen waardoor DNA fragmenten van 300-700 bp lengte gegenereerd. Spin 1 min bij 10.000 xg bij 4 ° C. Breng supernatant naar een nieuwe buis. De fragmenten moeten de juiste afmeting hebben, aangezien anders de immunoprecipitatie inefficiënte en de gevolgde qPCR zijn.
- Verwijder 50 ul eend mix met 50 ul L2 buffer om de efficiëntie van de sonificatie controleren door een agarosegel.
- Reverse verknopen door incubatie bij 65 ° C gedurende 4 uur en 500 rpm. Load monsters 1: 5 met Oranje G laadkleurstof op een 1,5% agarosegel en lopen 45 min bij 110 V in 1x TBE buffer. Controle fragmentgrootte (moet tussen 300-700 bp).
- Chromatine Immunoprecipitatie
- Verdunnen monsters 1: 5 in verdunningsbuffer en aliquot 1 ml per IP in gesiliconiseerde buizen.
- Verwijder 5% (volume) van verdunde chromatine monster (stap 3.3.1) en bewaar bij 4 ° C als "input".
- Incubeer monsters met antilichamen van uw keuze en met een niet-specifieke IgG O / N bij 4 ° C op een rotator.
- Voeg 50 ul Proteïne-A / G Sepharose beads aan elk monster na immunoprecipitatie. Incubeer de monsters 3 uur bij 4 ° C op een rotator. Spin 1 min met 1500 xg bij 4 ° C en verwijder supernatant.
- Wassen met 1 ml wassen kralen. Spin 1 min met 1500 xg bij4 ° C en verwijder supernatant. Herhaal stap g naar h. Wassen met 1 ml uiteindelijk wasbuffer. Tijdens de stappen die het wassen moet je niet verliest een van de parels, omdat deze verandert de hoeveelheid eluaat direct.
- Centrifuge 1 min met 1500 xg bij 4 ° C en verwijder supernatant. Voeg 125 ul elutiebuffer en incubeer 15 min bij 65 ° C bij 1000 rpm op een schudtafel.
- Spin 1 min bij 1.500 x g en breng supernatant naar een nieuwe buis Herhaal stap k en l. Voeg 200 pl elutiebuffer toe aan (3.3.2). Voeg Proteinase K en RNase aan elk monster en incubeer 30 min bij 37 ° C bij 500 rpm op een schudmachine en vervolgens 4 uur bij 65 ° C bij 500 rpm op een schudtafel.
LET OP: Voor DNA-extractie gebruik commercieel verkrijgbaar ChIP DNA Schoon en Concentrator Kit 38.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Methylkwik exposure in UKK testsysteem
De cytotoxiciteit bepaling werd uitgevoerd met H9 EBS een IC 10-waarde (vermindering van de levensvatbaarheid van 10%) voor de cytotoxiciteit van methylkwik (Fig 1) te verkrijgen. We voerden ook een microarray gebaseerde (Affymetrix platform) biomerker studie. De H9 EBS blootgesteld aan methylkwik (0,25 en 1 uM) gedurende 14 dagen. Op dag 14 zijn monsters gebruikt TRIzol verzameld en RNA werd geïsoleerd. Transcriptie profilering werd uitgevoerd met behulp van Human Genome U133 plus 2.0 serie chips. De gegevens zijn geanalyseerd met Partek Genomic Suite TM 6.6. Eerste data overzicht werd verkregen door Principle Component Analysis (Figuur 2A), generatie van Venn diagrammen (Figuur 2B) en de bouw van heat maps (figuur 2C). Het principe componenten analyse is de totale verdeling van genexpressie en duidelijk zichtbaar segregatie van MeHg 1 pM van de voertuigcontrole en MeHg 0,25 pM groepen (PC # 25.2) (Figuur 2A). Een lijst van differentieel tot expressie van genen (DEG) werd verkregen na statistische behandeling (one-way ANOVA) en filtering van de gegevens met behulp van een fold change cut-off van ± 2 en een veelheid gecorrigeerde (Benjamini-Hochberg methode) p-waarde <0,05 (Tabel 1). De 1 uM MeHg behandeling resulteerde in 276 DEGS en 0,25 pM in 31 DEGS (figuur 2B). De warmte kaart bleek dat MeHg 1 uM behandeling vooral verminderd genexpressie (figuur 2C). Informatie over oververtegenwoordigd gen ontologie termen werd verkregen met behulp van de DAVID bioinformatica tool. Tabel 2 geeft de aanzienlijk oververtegenwoordigd categorieën GO gen dat meer dan 5 genen bevatte. De-down gereguleerd transcriptiefactoren gerelateerd aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel werden geïdentificeerd. SEPP1, DDIT4, AK4, FRZB (ontwikkeling van de hersenen), PITX (neurale ontwikkeling nucleus) en ErbB3 UGT8, APOB, ApoA1 (ontwikkeling van het zenuwstelsel) werden down-gereguleerd op een dosisafhankelijke manier voor methylkwik behandeling (tabel 3).
UKN 1 testsysteem
Deze differentiatie protocol maakt gebruik van dual SMAD inhibitie 6 om een zuivere populatie van NEP binnen zes dagen van differentiatie te genereren. De resulterende cellen worden gekenmerkt door een opregulatie van de neurale precursor genen PAX6 en OTX2. De stamcel markers OCT4 en Nanog zijn vastgelegd gereguleerd tijdens de differentiatie in de richting van NEP (figuur 3A). Door het sterk synchrone en homogeen differentiatie, is het ook mogelijk om informatie over de histonmodificaties worden tijdens dit vroege stadium van ontwikkeling. We pasten het protocol voor chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met de cellen of bij het begin van differentiatie of na 6 dagendifferentiatie. Een switch van methylatie sites op de promotor regio van PAX6 en OTX2 was duidelijk uit deze studies (Figuur 3B). De onderzochte websites methylatie histon 3 lysine 4 trimethylation (H3K4me3) en histon 3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3) waren zeer dynamisch tijdens de differentiatie. Ook op eiwitniveau een neerwaartse regulatie van Oct4 worden waargenomen (figuur 4). De up-regulatie van Pax6 en de neurale stamcel marker Nestin waargenomen door immunofluorescentie microscopie op eiwitniveau (Figuur 4). De celpopulatie vertoonde een homogeen en zuiver differentiatie na zes dagen differentiatie. Daarom is de kweken kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor analyse van RNA en eiwit. Het systeem biedt ook de mogelijkheid om stoffen en het effect daarvan op de vroege neurale ontwikkeling 16,29 testen.
Figuur 1. cytotoxiciteitstest (H9 differentiatie) voor MeHg. De test is uitgevoerd volgens het protocol bij het IC 10 waarde voor methylkwik definiëren.
Figuur 2. Representatieve analyse van het differentieel tot expressie gebrachte genen geïnduceerd door 0,25 en 1 pM MeHg na toepassing van het UKK testsysteem. De hESCs werden behandeld met 0,25 en 1 pM MeHg volgens de UKK testsysteem. Analyse van de differentiële expressie transcripten in 14 dagen gedifferentieerd EBS werd uitgevoerd met de Partek Genomic Suite TM 6.6 software. (A) Belangrijkste component analyse (3-Dimenional) van de microarray data. (B) Venn diagram verkregen uit microarray analyse van genexpressie. Het diagram toont het aantalgenen gemoduleerd door de MeHg behandeling (voudige verandering> ± 2, p-waarde <0,05). (C) hiërarchische clustering van genexpressie data (fold change> ± 2, p waarde <0,05). De sterk uitgedrukt genen in het voertuig controlegroep worden onderdrukt door 1 uM MeHg behandeling. De 1 uM MeHg behandeling resulteerde in 233 transcripties met lagere expressie en 43 sondes met hogere expressie als te vergelijken met voertuigbeheersing groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. genexpressie en histon methylatie patroon tijdens de differentiatie van hESC richting NEP. Voor alle experimenten, hESC werden gedifferentieerd om neuroectodermale voorlopercellen (NEP). (A) Monsters werden op day 6 van differentiatie en transcript niveaus van merkergenen van neurale differentiatie werden bepaald door RT-qPCR. Data (genexpressie ten opzichte van hESC) zijn gemiddelden ± SEM van 5 experimenten. (B) Monsters voor chromatine immunoprecipitatie (ChIP) bereid op dag 6 van differentiatie. ChIP werd uitgevoerd met antilichamen specifiek voor H3K4me3 of H3K27me3 of controle IgG. Verrijking factoren promotorsequenties worden als input voor H3K4me3% (grijs) en H3K27me3 (zwart). De gegevens zijn gemiddelden ± SEM van 3 onafhankelijke celbereidingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Eiwitexpressie tijdens de differentiatie van hESC richting NEP. De cellen werden gefixeerd en gekleurd voor de stamcel markerOct4 (groen) op dag 0 van differentiatie (DoD0) en NEP markers PAX6 (rood) en Nestin (groen) op dag 6 van differentiatie (DoD6). Schaal balk geeft 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. Lijst van differentieel tot expressie van genen (> ± 2 maal, p-waarde <0,05) van MeHg behandeling versus controle over het voertuig in 14 dagen oude EBS. Klik hier om deze tabel te bekijken.
Tabel 2. Lijst van aanzienlijk verrijkt en geselecteerde GO categorieën (p-waarde <0,05,> 5 genen) met ontregelde transcripts voor MeHg versus controle over het voertuig in 14 dagen oude EBS.
| GO Term | Tellen | P waarde | Genen |
| Regulatie van apoptose | 18 | 0,0068 | ARHGEF3, TBX3, ErbB3, MITF, BNIP3, CDH1, IGF2, IFI16, HGF, GCH1, AMIGO2, SERPINB9, KRT18, MSX1, ETS1, VEGFA, PERP, IGFBP3 |
| Regulering van celproliferatie | 17 | 0,0123 | RBP4, LYN, TBX3, ErbB3, MITF, IGF2, KDR, RERG, MSX1, ADM, ETS1, VEGFA, BNC1, ADAMTS1, FABP1, IGFBP3, FIGF |
| Vaatstelsel Development | 12 | 0.0001 | PLAT, APOB, HAND1, TBX3, EPAS1, FOXF1, LepR, VEGFA, COL3A1, LOX, FIGF, KDR |
| Skeletal System Development ng> | 12 | 0,0008 | RBP4, MSX1, LGALS3, TBX3, HOXB6, COL3A1, STC1, IGF2, POSTN, FRZB, IGFBP3, AHSG |
| Hart Development | 11 | 0.0001 | RBP4, ACTC1, MSX1, HAND1, TBX3, ADM, PKP2, ErbB3, GATA6, COL3A1, ADAMTS1 |
| Glucose stofwisselingsproces | 9 | 0.0003 | PDK1, RBP4, LDHA, PGM5, PYGL, HK2, PFKP, IGF2, PGK1 |
| Lung Development | 7 | 0,0008 | RBP4, EPAS1, GATA6, FOXF1, VEGFA, LOX, KDR |
| Epitheel Development | 7 | 0,0386 | F11R, FREM2, GATA6, FOXF1, VEGFA, DSP, KDR |
| Mesoderm Development | 5 | 0,0088 | HAND1, TBX3, FOXF1, VEGFA, SNAI2 |
| Term | Gene Symbol | Vouw Change * | |
| 0,25 uM MeHg vs VC | 1 uM MeHg vs VC | ||
| Brain Development | SEPP1 | -2,17 | -4,13 |
| DDIT4 | -1,20 | -3,11 | |
| AK4 | -1,41 | -3,08 | |
| FRZB | -1,29 | -2,19 | |
| Neuronale kern ontwikkeling | PITX2 | -2,08 | -4,90 |
| Ontwikkeling van het zenuwstelsel | ErbB3 | -1,86 | -2,89 |
| UGT8 | -1,67 | -2,14 | |
| APOB | -3,59 | -5,72 | |
| ApoA1 | 2.63 | -2,90 | |
| VEGFA | -1,28 | -3,06 | |
* P-waarde <0,05
Tabel 4. Samenstelling van de cultuur media.
| Sr. No. | Medium / Buffer Naam | Samenstelling | |||
| Bedrag | | ||||
| 1 | MEF Medium | DMEM met hoge glucose | |||
| FCS | 10% | ||||
| Penicilline | 100 eenheden / ml | ||||
| Streptomycine | 100 ug / ml | ||||
| L-Glutamine | 2 mM | ||||
| 2 | H9 Culture Medium | DMEM F12 | |||
| KOSR | 20% | ||||
| NEAA | 1% | ||||
| Glutamax | 1x | ||||
| β-mercaptoethanol | 0,1 mM | ||||
| Penicilline | 100 eenheden / ml | ||||
| Streptomycine | 100 ug / ml | ||||
| bFGF | 4 ng / ml | 3 | RD Medium | H9 kweekmedium zonder bFGF | |
| 4 | Wasmedium | DMEM / F12 | |||
| Knockout Serum Replacment | 20% | ||||
| 1x GlutaMAX | 1x | ||||
| MEM niet-essentiële aminozuren | |||||
| HEPES | 15 mM | ||||
| β-mercaptoethanol | 90 uM | ||||
| 5 | KCM Medium | DMEM | |||
| FBS | 10% | ||||
| gedurende 24 uur op MEF | |||||
| 6 | Knockout Serum Vervanging (KSR) | ||||
| Knockout serum vervanging | 15% | ||||
| 1x GlutaMAX | |||||
| 1x MEM niet-essentiële aminozuren | |||||
| β-mercaptoethanol | 15 pm | ||||
| Bekertje | 35 ng / ml | ||||
| Dorsomorphin | 600 nM | ||||
| SB431542 | 10 uM | ||||
| 7 | N2-S | DMEM / F-12 | |||
| Apotransferin | 100 ug / ml | ||||
| Glucose | 1,55 mg / ml | ||||
| Putrescine | 10 mM | ||||
| Selenium | 500 pM | ||||
| Progesteron | 20 pM | ||||
| GlutaMAX | 200 pM | ||||
| 25 ug / ml | |||||
| 8 | L1 Buffer | Tris pH 8 | 50 mM | ||
| EDTA | 2 mM | ||||
| NP-40 | 0,10% | ||||
| Glycerol | 10% | ||||
| 9 | L2 Buffer | Tris pH 8 | 50 mM | ||
| EDTA | 10 mM | ||||
| SDS | 1% | ||||
| 10 | Elution Buffer | NaHCO 3 | 100 mM | ||
| SDS | 1% | ||||
| 11 | Wash Buffer | Tris | 20 mM | ||
| EDTA | 2 mM | SDS | 0,10% | ||
| NP-40 | 0,50% | ||||
| NaCl | 150 mM | ||||
| 12 | Final Wash Buffer | Tris | 20 mM | ||
| EDTA | 2 mM | ||||
| SDS | 0,10% | ||||
| NP-40 | 0,50% | ||||
| NaCl | 500 mM | ||||
| 13 | Stem Cell Medium | mTESAR TM basismedium | 400 ml | ||
| mTESAR TM supplement | 100 ml | ||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Traditionele benaderingen voor toxicologische tests op uitgebreide dierstudies waardoor testen kostbaar en tijdrovend. Bovendien kan door de interspecies verschillen preklinisch veiligheid bij dieren niet altijd geldig toxische effecten van potentiële geneesmiddelen relevant voor de mens voorspellen. Hoewel niet-menselijke primaten zijn meest voorspelbare, nog steeds sterk ethische en socioeconomical eisen snel verhogen door de moderne samenlevingen voor het ontwikkelen van gevoelige en robuuste in vitro-test systeem om de menselijke veiligheid relevant.
Het unieke vermogen van hESCs te differentiëren in alle somatische celtypes derhalve recapituleren in vivo menselijke ontwikkelingsprocessen in combinatie met gevoelige toxicogenomica benaderingen is voorgesteld als een alternatief voor de traditionele benaderingen voor drug veiligheidstesten 6,21. Onder het project 'ESNATS' de 'UKK' testsysteem is ontwikkeld om te voorspellende ontwikkeling van embryonale toxiciteit gebaseerd op transcriptomics profilering. In dit systeem hESC worden onderscheiden in de embryoid organen gedurende 14 dagen. De tijd kinetische transcriptomics profiel verkregen toont hoge expressie van differentiatie marker die specifiek zijn voor de drie kiem lagen ectoderm, endoderm en mesoderm op dag 14, die gedeeltelijk recapituleren vroege menselijke embryonale ontwikkeling. Gebaseerd op deze resultaten, gekend teratogeen drugs zijn blootgesteld tijdens de differentiatie van 14 dagen en differentieel tot expressie gebracht gen profiel zijn verkregen. Indrukwekkender gen handtekeningen gekoppeld aan de teratogene effecten van thalidomide waargenomen bij mensen, kan worden voorspeld door het testsysteem 28. De representatieve resultaten voor methylkwik in UKK systeem tonen concentratie afhankelijke omlaag regulatie van de transcriptie factoren met betrekking tot de ontwikkeling van het zenuwstelsel. De andere ontwikkelingsstoornissen neuro-toxische stoffen werden ook getest in dit systeem en de inspanningen gaande zijn om te identificerende gemeenschappelijke toxicologisch-markers over de verbindingen op mRNA-niveau en valideren ze op het eiwit niveau. De UKK testprotocol hier verstrekte geeft fundamentele leidraad voor het uitvoeren van het experiment met menselijke embryonale stamcellen H9 aan de transcriptomische handtekening identificeren ontwikkelingstoxiciteit vertoont.
De geoptimaliseerde standaard bewerkingsprocedure (SOP) voor differentiatie van pluripotente stamcellen overeenkomstig de UKN1 protocol maakt een robuust en gesynchroniseerde differentiatie van hESC naar NEP. Reeds na zes dagen differentiatie, een homogene celpopulatie met hoge PAX6 expressieniveaus wordt gegenereerd. De cellen groeien in adherente culturen, die analyse door immunokleuring mogelijk te maken. Immunocytochemische analyse met een hoge resolutie en door confocale microscopie vereist dat de cellen worden gekweekt op dunne glazen oppervlakken. Het is mogelijk dat deze culturen als het glas optimaal bekleed, maar het moet worden vermeld dat de cellen groeien zeer dichte, in meer dan een enkele laagna zes dagen. Daarom is routinematige analyse van de lijn-specifieke markers gemakkelijker uitgevoerd door RT-qPCR, chip of western blot. Een groot voordeel voor de biochemische analyse van het kweken is de hoge opbrengst aan cellen die kan worden bereikt door deze differentiatie protocol van een uitgangspopulatie van MES. Een nadeel van dit protocol is de hoge kosten van het medium supplementen (bijv noggin) nodig om de homogene neurale differentiatie dwingen. Een ander nadeel voor sommige toepassingen kan het zijn dat bepaalde kleine moleculen (kinase inhibitors) zijn aanwezig in het kweekmedium als deel van het protocol zijn. Aldus bepaalde signaalwegen niet toxicologisch onderzocht, als de verandering van de kweekomstandigheden verandert ook de differentiatie 29.
Het voordeel van het testsysteem combinatie beter begrip van DNT. Overwegende UKK bestrijkt een breder scala en nadelig effect hebben op de vroege vorming kiem laag kan worden onderzocht, UKN1 alleows meer neurale-specifieke mechanismen zoals de epigenetica te onderzoeken. Hoewel beide kweeksystemen gepresenteerde bleken ontwikkelingsneurotoxiciteit voorspellen enkele model gifstoffen 16, is er nog steeds behoefte aan hogere doorvoer versies van de protocollen die screening van een groot aantal potentiële ontwikkelings neurotoxische mogelijk. Bovendien is meer werk nodig is voor het identificeren en valideren gemeenschappelijke markers voor toxiciteit op mRNA of eiwit niveau en op te stellen als onderdeel van preklinische evaluatie geneesmiddelveiligheid.
Meer dan 20 miljard dollar per jaar worden geïnvesteerd door de farmaceutische industrie voor drug discovery 39. Als proof of concept, ontwikkelden we in vitro toxiciteitstest op basis van hESC en transcriptomics die geschikt zijn voor menselijke relevante toxische effecten van potentiële geneesmiddelen verbindingen in een kosteneffectieve en minder tijdrovende wijze voorspeld kunnen worden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
| mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
| V bottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
| Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Kits | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
| Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of equipment | |||
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Genechip Hybridisation Oven - 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of softwares | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |
|||
References
- Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
- Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceutical Biotechnology. Current Pharmaceutical Biotechnology. 12 (11), 1760-1773 (2011).
- Leist, M., Hartung, T., Nicotera, P. The dawning of a new age of toxicology. ALTEX. 25 (2), 103-114 (2008).
- Kuegler, P. B., et al. Markers of murine embryonic and neural stem cells, neurons and astrocytes: reference points for developmental neurotoxicity testing. ALTEX. 27 (1), 17-42 (2010).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. , (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of Developmental Toxicants and Signaling Pathways in a Functional Test Based on the Migration of Human Neural Crest Cells. Environmental Health Perspectives. 120 (8), 1116-1122 (2012).
- Bosman, A., et al. Molecular and Functional Evidence of HCN4 and Caveolin-3 Interaction During Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells and Development. 22 (11), 1717-1727 (2013).
- Sartiani, L., et al. Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach. Stem Cells. 25 (5), 1136-1144 (2007).
- Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation. 76 (9), 958-970 (2008).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (2), 200-206 (2013).
- Subramanian, K., et al. Spheroid Culture for Enhanced Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-Like Cells. Stem Cells and Development. 23 (2), 124-131 (2014).
- Sivertsson, L., Synnergren, J., Jensen, J., Bjorquist, P., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells Cultured in a Perfused Three-Dimensional Bioreactor. Stem Cells and Development. 22 (4), 581-594 (2013).
- Jagtap, S., et al. Cytosine arabinoside induces ectoderm and inhibits mesoderm expression in human embryonic stem cells during multilineage differentiation. British Journal of Pharmacology. 162 (8), 1743-1756 (2011).
- Krug, A. K., et al. Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach. Archives of Toxicology. 87 (1), 123-143 (2013).
- Leist, M., et al. Test systems of developmental toxicity: state-of-the art and future perspectives. Archives of Toxicology. 87 (12), 2037-2042 (2013).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Molecular medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Khoo, M. L. M., et al. Growth and differentiation of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells: Effect of glucose and basic fibroblast growth factor. Biology of Reproduction. 73 (6), 1147-1156 (2005).
- Son, M. Y., Kim, H. J., Kim, M. J., Cho, S. Physical Passaging of Embryoid Bodies Generated from Human Pluripotent Stem Cells. Plos One. 6 (5), (2011).
- Winkler, J., Sotiriadou, I., Chen, S., Hescheler, J., Sachinidis, A. The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology. Current medicinal chemistry. 16 (36), 4814-4827 (2009).
- Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17 (8), 759-766 (2010).
- Miller, M. T., Stromland, K. Teratogen update: Thalidomide: A review, with a focus on ocular findings and new potential uses. Teratology. 60 (5), 306-321 (1999).
- Newman, C. G. H. Teratogen Update - Clinical Aspects of Thalidomide Embryopathy - A Continuing Preoccupation. Teratology. 32 (1), 133-144 (1985).
- Stern, L. In vivo assessment of the teratogenic potential of drugs in humans. Obstetrics and gynecology. 58 (5 Suppl), 3S-8S (1981).
- Lynch, H. T., Reich, J. W. Diethylstilbestrol, Genetics, Teratogenesis, and Tumor Spectrum in Humans. Medical Hypotheses. 16 (3), 315-332 (1985).
- Satoh, H. Behavioral teratology of mercury and its compounds. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 1-9 (2003).
- Meganathan, K., et al. Identification of Thalidomide-Specific Transcriptomics and Proteomics Signatures during Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Plos One. 7 (8), (2012).
- Balmer, N. V., et al. Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome. Human Molecular Genetics. 21 (18), 4104-4114 (2012).
- Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M., Hartung, T. Developmental neurotoxicity - Challenges in the 21st Century and In Vitro Opportunities. ALTEX. 31 (2), 129-156 (2014).
- Leist, M., Efremova, L., Karreman, C. Food for thought ... considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX. 27 (4), 309-317 (2010).
- Zimmer, B., et al. Coordinated waves of gene expression during neuronal differentiation of embryonic stem cells as basis for novel approaches to developmental neurotoxicity testing. Cell Death and Differentiation. 18 (3), 383-395 (2011).
- Experion RNA StdSens Analysis Kit for RNA analysis by Electrophoresis. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000976B%20%20RNA%20STDSENS%20MANUAL.PDF (2014).
- Affymetix GeneChip 3 IVT Express Kit for Target RNA preparation, Fragmentation and hybridization. , Available from: http://microarray.csc.mrc.ac.uk/downloads/3'%20IVT%20Express%20Manual.pdf (2014).
- Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit. , Available from: http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1 (2014).
- Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1 (2014).
- Partek Genomics Suite. , Available from: http://www.partek.com/pgs (2014).
- ChIP DNA Clean and Concentrator. , Available from: http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/pcr-dna-clean-up-concentration/chip-dna-clean-concentrator (2014).
- Kraljevic, S., Stambrook, P. J., Pavelic, K. Accelerating drug discovery. EMBO Reports. 5 (9), 837-842 (2004).
