Summary
Les protocoles décrivent deux vitro systèmes de test de toxicité sur le développement dans (UKK et UKN1) basée sur les cellules souches embryonnaires humaines et des études de transcriptome. Les systèmes de test prédisent risque de toxicité pour le développement humain, et peuvent contribuer à réduire les études sur les animaux, les coûts et le temps requis pour l'essai de la sécurité chimique.
Abstract
Protocoles efficaces pour différencier les cellules souches pluripotentes humaines à divers tissus en combinaison avec les technologies -omiques ouvert de nouveaux horizons pour les tests in vitro de toxicité de médicaments potentiels. Pour fournir une base scientifique solide pour ces essais, il sera important d'obtenir des informations quantitatives sur l'évolution dans le temps de développement et sur les mécanismes de régulation sous-jacents par des approches de biologie des systèmes. Deux essais ont donc été à l'écoute ici pour ces exigences. Dans le système d'essai UKK, les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) (ou d'autres cellules pluripotentes) sont laissés à différencier spontanément pendant 14 jours dans des corps embryoïdes, afin de permettre la génération de cellules des trois couches germinales. Ce système récapitule les principales étapes du développement embryonnaire humaine début, et il ne peut prédire la toxicité embryonnaire précoce / tératogénicité humain spécifique, si les cellules sont exposées à des produits chimiques lors de la différenciation. Le système de test est fondé sur UKN1 hESC différenciation à une population de neuroectodermale progénitrices (NEP) cellules pour 6 jours. Ce système récapitule le développement neural précoce et prédit la neurotoxicité développementale précoce et les changements épigénétiques provoqués par des produits chimiques. Les deux systèmes, en combinaison avec des études transcriptome de puces à ADN, sont appropriées pour l'identification de biomarqueurs de toxicité. En outre, elles peuvent être utilisées en combinaison pour générer des données d'entrée pour l'analyse de biologie des systèmes. Ces systèmes de test ont des avantages sur les études toxicologiques traditionnels nécessitant de grandes quantités d'animaux. Les systèmes de test peuvent contribuer à une réduction des coûts de développement des médicaments et l'évaluation de la sécurité chimique. Leur combinaison éclaire en particulier sur les composés qui peuvent influer sur le développement neurologique spécifiquement.
Introduction
La capacité des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à se différencier en divers types de cellules a ouvert une nouvelle ère de tests de toxicité in vitro 1, modélisation de la maladie et la médecine régénérative 2. Les cellules souches sont dotés de la capacité de se reproduire, de garder leur état pluripotent, et de se différencier en cellules spécialisées 3,4. Les propriétés de CSEh (capacité de se différencier à tous les principaux types de cellules) se trouvent également dans d'autres cellules souches pluripotentes humaines, telles que les cellules d'origine humaine souches pluripotentes (hiPSC) ou des cellules générées par transfert nucléaire 5. Par exemple, de nombreuses lignées de CSEh différents ont été différenciées en neurones 6, 7 cellules rénales, des cellules de la crête neurale 8, 9-12, cardiomyocytes ou des hépatocytes comme les cellules 13,14. En outre, les CSEh peut spontanément se différencier en cellules de tous les trois feuillets embryonnaires 15-18 en corps embryoïdes (EBS) 19,20. Ele développement embryonnaire Arly est réglementé par l'expression différentielle de divers gènes liés aux différentes couches de germe qui a été capturé au niveau ARNm par la transcriptomique utilisant la technologie des puces 15. Ces efforts ont abouti à l'établissement de modèles toxicologiques spécifiques orgue basés sur les CSEh / hiPSC et d'analyse transcriptomique (pour revue, voir 21,22). Ces modèles ont des avantages sur l'utilisation traditionnelle des animaux de laboratoire pour les études toxicologiques, les études précliniques utilisant des animaux de laboratoire ne sont pas toujours prédictives de la sécurité humaine. Les effets toxiques des médicaments induite rencontrés chez les patients sont souvent liés à des processus métaboliques ou signalisation qui diffèrent entre les humains et les animaux de laboratoire. La différence de l'espèce a empêché la détection précoce et fiable de toxicité pour le développement chez l'homme, et pour les médicaments d'instance comme la thalidomide 23,24 et 25,26 diéthylstilbestrol ont été retirés du marché en raison de tératogénicité. ThaliDomide n'a pas montré de toxicité pour le développement chez les rats ou les souris. Produits chimiques environnementaux tels que le mercure de méthyle 27 ont abouti à la toxicité pour le développement prénatal par rapport au système nerveux chez diverses espèces, mais les manifestations humaines ont été difficiles à modéliser des animaux. Pour résoudre le problème des questions de spécificité d'espèce, les scientifiques travaillant sous différents projets basés sur les cellules souches comme ReProTect, ESNATS, DETECTIVE etc. sont engagés dans le développement de différents modèles de toxicité embryonnaire, neurotoxicité, cardiotoxicité, l'hépatotoxicité et néphrotoxicité utilisant toxiques humains suspectés de affecter les humains. Dans le cadre du projet de consortium européen «embryonnaire Novel Stratégies alternatives de tests à base de cellules souches (ESNATS) 'cinq systèmes de test ont été établis. Un système de test que l'on appelle UKK (U niversitäts k linikum K OLN) système de test capture partiellement développement embryonnaire humaine tôt. Dans cette smeactuel cellules H9 embryonnaires humaines sont différenciés en trois feuillets embryonnaires (ectoderme, l'endoderme et le mésoderme) 15 et de la couche de germe signatures spécifiques ont été capturés par transcriptomique profil en utilisant la plateforme de biopuces Affymetrix. Divers toxiques pour le développement comme la thalidomide 28, l'acide valproïque, le mercure de méthyle 16,17 ou cytosine arabinoside 15 ont été testés dans ce système, et les signatures de gènes toxiques spécifiques ont été obtenus. Dans un second système de test, que l'on appelle la (U niversité de K onsta n z) UKN1 système de test 1, les cellules H9 sont différenciées aux cellules progénitrices neuroectodermique (NEP) pour 6 jours. Ceci est démontré par une expression élevée de gènes marqueurs neuronaux tels que PAX6 et OTX2. Pendant la différenciation pour 6 jours, les cellules NEP ont été exposés à des neuro-toxiques pour le développement tels que l'APV, le mercure de méthyle. Toxique profils spécifiques déréglementés transcriptomique ont été obtenie ainsi en utilisant la plate-forme de puces à ADN Affymetrix 16,29.
La nouvelle vision de la toxicologie de la 21 ème siècle prévoit que les systèmes de test ne donnent pas seulement des descriptions phénotypiques comme histopathologie in vivo, ou des modifications du transcriptome à la fin de incubations de produits toxiques à long terme. Il suggère plutôt que les essais fournissent des informations mécaniste 3, et que ces informations peuvent être mappées à ce qu'on appelle les voies d'issue défavorable (AOP) qui fournissent une justification scientifique pour les effets dangereux 30. Pour fournir de telles informations, les systèmes de test appliquées doivent être hautement de qualité contrôlée 31, comme par exemple documenté par des procédures de fonctionnement standard robustes. En outre, les changements dépendant du temps doivent être mappé avec une grande résolution. Cela nécessite des systèmes de test avec des changements synchronisés 32. Les systèmes de test et UKN1 UKK décrits ici ont été optimisés pour ces exigences.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le protocole suivant a été réalisée en utilisant la ligne Embryonic Stem Cell humaine (CSEh) H9. Cette lignée cellulaire a été cultivées en routine sur des fibroblastes de souris mitotiquement inactivé embryonnaires (MEF) dans les milieux de culture de CSEh complété avec bFGF puis cultivées dans des milieux de cellules souches sur 6 cm boîtes de Pétri revêtues de la matrice de la membrane basale comme matrigel, de se débarrasser de MEF. Les cellules H9 de> 80% de plaques confluentes ont été utilisés pour plus de passage. Cellules H9 cultivées sur des plaques de matrice de membrane basale ont été utilisés pour la formation EBS. Toutes les procédures mentionnées dans le protocole suivant ont été effectuées en utilisant des méthodes standard pour les pratiques de culture de cellules et de bonnes aseptiques.
1. Système de test UKK Partie
1. Human Embryonic Stem Cell La culture
- Le fractionnement et l'entretien des H9 sur des cellules nourricières
- Introduire à la pipette 2 ml de 0,1% de gélatine dans chaque plaque de 6 cm et incuber pendant 30 minutes dans une culture cellulaire Incubteur (37 ° C et 5% CO 2). solution de gélatine Aspirer avec pipette Pasteur stérile.
- Ajouter 2 ml de milieu MEF contenant 0,1 x 10 6 cellules / ml MEF dans les deux plaques revêtues de gélatine et incuber dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C et 5% CO 2) O / N.
- Le lendemain, retirez les cellules H9 fiole de liquide réservoir de stockage d'azote en utilisant une pince et décongeler le flacon dans un bain d'eau à 37 C ° à l'aide de longues pinces.
- Retirer la cuvette de bain d'eau, salle de bain avec 70% d'éthanol, l'air sec dans le cabinet de biosécurité pour les 15 à 30 secondes et de transférer les cellules à 15 ml tube Falcon.
- Ajouter 9 ml de milieu de culture H9 lentement sur la paroi intérieure et centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu de culture de 6 ml contenant un inhibiteur de ROCK (10 um, Y27632) et délicatement la pipette pour mélanger. Aspirer le milieu MEF de la plaque de 6 cm et ajouter 3 ml de suspension cellulaire dans chaque plaque. Changer le support sur day 3 et ensuite tous les autres jours. Subculture> 80% des cellules de la plaque confluence avec un rapport de division 1: 3.
Remarque: Généralement disponible en 5 à 7 jours plaque devient confluent. Feeders utilisés sont obtenus à partir des souris CF1 embryon et inactivés par une exposition à un rayonnement γ.
- Culture de cellules sur des plaques revêtues H9 matrice de membrane basale
- Support de cellules souches Thaw (5x) de supplément à RT et ajouter 100 ml dans 400 ml de milieu de base dans l'armoire de biosécurité.
- Thaw matrice de membrane basale sur la glace. Ajouter le volume suggéré de la matrice de la membrane basale (voir certificat d'analyse pour chaque lot) dans 24 ml refroidi DMEM / F-12 milieu de base pour les douze 6 cm plaques. Mélanger par pipetage de haut en bas.
- Ajouter 2 ml dans chaque plaque de 6 cm. Conservez la plaque à température ambiante pendant 1 h. Retirez le moyen et ajouter 2 ml de milieu de cellules souches.
- Prenez quatre plaques H9 confluentes sur MEF. Retirez les colonies différenciées avec 1 ml pointe de la pipette sous stéréomicroscope gardé dans une armoire de biosécurité.
- Aspirerle milieu et laver les cellules avec 4 ml de PBS et ajouter 2 ml endiguer milieu cellulaire dans chaque assiette. Couper les colonies indifférenciées avec 26 aiguille G pour 6 à 9 pièces chacun.
- Recueillir délicatement les cellules dans 50 ml tube Falcon. Centrifuger à 200 g pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 12 ml endiguer milieu cellulaire. Comptez les bouquets en mettant 20 pi sur la lame sous le microscope et régler le volume de 150 ml par touffes. Ajouter 2 ml de suspension dans chaque plaque de 6 cm.
- Déplacer les plaques de va-et-vient et les mouvements d'un côté à-côté pour la distribution de bouquet uniforme et incuber les plaques dans l'incubateur de culture cellulaire (37 ° C et 5% de CO 2).
- Retirez les colonies différenciées et de donner changement de milieu tous les deux jours.
2. corps embryoïdes (EBS) Formation
Effectuez toute la procédure mentionnée ci-dessous selon les précautions d'asepsie et dans l'armoire de biosécurité.
- Jour 0 & #8212; Placage des cellules H9 sur des plaques de fond V
- Préparer copolymère bloc de 5% comme Pluronic F 127 dans du PBS et filtrer à travers un système de filtration sous vide poussé en utilisant filtre de 0,22 um stérile.
- Manteau de fond V plaques à 96 puits avec 40 pl de copolymère séquence de 5% par puits et incuber à température ambiante pendant 45 min.
- Retirez les confluents sous-sol matrice de la membrane des cellules H9 avec plaques de l'incubateur et retirer les colonies différenciées avec 1 ml pointe de la pipette sous stéréomicroscope enceinte de sécurité biologique.
- Aspirer le milieu et laver les cellules avec 4 ml de PBS. Ajouter 2 ml de milieu de différenciation aléatoire (milieu de culture H9 sans bFGF, moyen RD) dans chaque plaque. Utiliser l'outil de passage et couper les colonies de cellules H9 en touffes de taille uniforme et la forme en observant au microscope stéréoscopique dans l'armoire biosécurité puis grattez délicatement avec le grattoir cellulaire.
- Recueillir les touffes dans 50 ml tube falcon et centrifuger à 200 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le cell dans le milieu de RD pour obtenir 1.000 touffes par ml.
- Aspirer le copolymère à blocs à partir de plaques à fond en V. Verser les touffes en plaque carrée stérile et avec l'aide d'une pipette multicanaux ajouter 100 pi de suspension dans chaque puits de V plaque de fond.
- Pour l'agrégation des touffes de force, centrifuger les plaques à fond en V à 4 ° C pendant 4 min à 400 x g. Incuber les plaques dans l'incubateur de culture cellulaire (37 ° C et 5% de CO2) pendant quatre jours.
- Jour 4 - Collection de EB
- Recueillir les EB dans la plaque carrée stérile à partir de plaques de fond de V à l'aide d'une pipette multicanaux et larges alésage 200 conseils ul.
- Recueillir les EB de plaque carrée stérile dans le tube à 15 ml de faucon avec 10 ml pipette sérologique stérile. EB permettent de régler pendant 2 min. Aspirer le surnageant et laver les EB avec 5 ml de PBS.
- EB permettent de régler pendant 2 min et aspirer le surnageant. Re-suspendre EBS dans un milieu 5 ml de RD.
- Introduire à la pipette sur 10 ml de milieu de RD dans 10 cmplaques bactériologiques. Transférer les EBS plaques bactériologiques 10 cm.
- Incuber les boîtes bactériologiques sur un agitateur horizontal (mouvement d'un mouvement alternatif 50 / min) maintenus dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C et 5% de CO 2) pour la période de temps requise. Donnez changement de milieu (15 ml de milieu de RD) chaque jour alternatif.
Remarque: Une manutention délicate est nécessaire tout en cultivant CSEh. La taille de EB varie au jour 4. Sélectionnez les EB de taille uniforme (± 20%) en observant au microscope stéréoscopique pour plus d'expérience. Environ 50% EB formés avec cette méthode sont de taille uniforme. Le transfert d'EBS sur les résultats de shaker de forme uniforme.
3. Test de cytotoxicité pour IC 10 Détermination
- Transfert d'EBS sur des plaques de fond optique
- Décongeler 0,1% de gélatine dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 min et revêtir les plaques de fond optiques avec 50 ul de 0,1% de gélatine par puits en utilisant une pipette multicanaux. Incuber les plaques à température ambiante pendant45 min. Après incubation aspirer la gélatine à partir de plaques de fond optique.
- Sortez les EB recueillies le jour 4 dans 10 cm de plaques contenant du milieu bactériologique de RD.
- Conserver les plaques de fond optique en position inclinée en enceinte de sécurité biologique. Transfert de deux taille uniforme d'EBS dans 100 milieu de RD par puits dans le fond plaque de 96 puits optique en observant au microscope stéréoscopique. Gardez 12 ème colonne vide.
- Incuber les plaques dans l'incubateur de culture cellulaire (37 ° C et 5% de CO2) pendant 24 heures.
- L'exposition au médicament du jour 5 au jour 14
- Peser le composé d'essai et de faire plus forte concentration dans le solvant connu.
- Effectuer la dilution demi-logarithmique du composé de test en série jusqu'à 8 dilutions dans le solvant contenant des tubes Falcon numérotés avec A à H, Gardez le tube n. I comme le contrôle du véhicule, le tube n. J comme contrôle négatif (milieu de RD) et le tube non. K comme positif (70% d'éthanol) contrôle.
- Décongeler le milieu de RD dans un bain d'eau à 37° C pendant 15 min. Sortez 5 ml de milieu de RD chacun dans 11 tubes Falcon stériles étiquetés de 1 à 11.
- Transfert 5 pi de solution de tube A au tube K dans le tube 1 à 11 respectivement et Vortex les tubes. Sortez la plaque de fond optique de l'incubateur et retirez soigneusement les médias avec l'utilisation d'une pipette multicanaux.
- Ajouter 200 ul de milieu à partir du numéro du tube 1 à 11 dans les colonnes respectives de la plaque de fond optique. Donnez / changement de médicament moyenne tous les deux jours.
Remarque: Pour des dilutions demi-logarithmiques prennent 6,48 ul de solvant dans 7 tubes étiquetés de 2 à 8. De plus élevés de transfert de tube n ° 1 de concentration à 3 pi tuyau no.2, vortex et transfert en série de 3 ul de tube suivant. Gardez le tube n ° 9 pour le contrôle du véhicule et le tube n ° 10 pour le contrôle négatif. Tube n ° 11 est de 70% d'éthanol.
- Jour 14: exposition Résazurine et la fluorescence de mesure
- Thaw milieu de RD dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 min. Effectuez toute la procédure mention ci-dessous en l'absence de la lumière dans l'enceinte de sécurité biologique.
- Prenez moyenne 10 ml de RD dans le tube de 15 ml (A) et ajouter du volume recommandé de réactif de résazurine et mélanger par pipetage. Sortez la plaque de fond optique de l'incubateur et retirez soigneusement tout milieu avec une pipette multicanaux.
- Ajouter 100 ul de milieu de tube A dans chaque puits. Incuber la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire (37 ° C et 5% de CO2) pendant 90 minutes.
- Mesurer la fluorescence en utilisant un spectrophotomètre (560 Ex / Em 590).
- IC 10 détermination de la valeur
- Importez les valeurs dans le graphique pad prisme après avoir soustrait les valeurs à blanc. Axe des x-Set comme une dose et l'axe des y comme un unités de fluorescence.
- Normaliser les valeurs pour obtenir le pourcentage sur l'axe y et transformer les valeurs (axe des x que échelle logarithmique). Calculer IC 50 de la valeur en utilisant la réponse sigmoïde dose (pente variable) paramètre. Calculer connecter IC 10 valeurs en utilisant suivanteéquation:
F = 10 = 50 logEC logECF - (1 / versant) * log (F / (100-F))
Y = Bottom + (Haut-Bas) / (1 + 10 ^ ((LogEC 50 -X) * versant)) - Déterminer les valeurs IC 10 à prendre pour d'autres études.
4. Étude des biomarqueurs Basé sur Microarrays
- Jour 0 au jour 5:
- La formation de corps embryoïdes et transfert à 10 cm plaques bactériologiques - suivent les étapes mentionnées au point 2 pour la formation de corps embryoïdes.
Remarque: Utilisez trois répétitions biologiques pour chaque étude. Diviser chaque répliquer à deux parties biologique - Traitement de la toxicomanie chez IC 10 concentration et le contrôle du véhicule. Préparer la concentration du médicament 10.000 fois supérieure à la concentration IC 10 dans le véhicule et de cette ajouter 10 pi à 100 ml de milieu de RD avec des amas de cellules H9 dans 50 ml tube Eppendorf bien mélanger et ensemencer sur des plaques de fond en V. Suivre la même procédure pour le groupe de contrôle du véhicule.
<li> Pour l'exposition au médicament le jour de 5 à 14, de recueillir les EB's et de les transférer dans 10 cm plaques bactériologiques au jour 4 selon les étapes mentionnées au point 2. Transfert des plaques sur agitateur horizontal (mouvement alternatif de mouvement 50 / min) incubateur de culture cellulaire (37 ° C et 5% de CO2) pendant 14 jours. Donnez changement de milieu tous les deux jours. - La formation de corps embryoïdes et transfert à 10 cm plaques bactériologiques - suivent les étapes mentionnées au point 2 pour la formation de corps embryoïdes.
- Pour la collecte de l'échantillon, le jour 14, de recueillir les EB de plaques de 10 cm dans le tube à 15 ml de faucon avec pipette sérologique stérile. EB permettent de régler pendant 2 min. Aspirer le surnageant et laver les EB avec 5 ml de PBS. EB permettent de régler pendant 2 min et aspirer le surnageant. Re-suspendre EB dans une solution de 1 ml de RNAlater ou réactif TRIzol, vortex et stocker l'échantillon à -80 ° C jusqu'à traitement ultérieur.
Remarque: Effectuez toute la procédure dans l'armoire de biosécurité selon les bonnes pratiques de laboratoire. Faites tourner les plaques en mouvement circulaire autour du centre d'amener tous EB dans le centre, aspirer le milieu à partir environnante avec l'aide de pastu de verre stérilere pipette, ajouter 15 ml de milieu de RD, puis ajouter 15 ul de médicament / véhicule groupe respectif.
5. Isolement de l'ARN et le test d'intégrité
- Isolement de l'ARN:
La plupart des étapes mentionnées ci-dessous sont à exécuter pour la purification d'ARN en utilisant Mini Kit RNeasy selon le manuel d'instructions. Toujours utiliser des tubes sans nucléase, embouts de pipette et de l'eau. Tout en travaillant avec TRIzol effectuer toute la procédure dans le capot de la sécurité chimique et porter des lunettes de protection ainsi que des gants de protection chimique.- Décongeler les échantillons sur la glace. Si les échantillons sont conservés dans une solution RNAlater, centrifuger les tubes à 12.000 g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de réactif TRIzol.
- Triturer les échantillons en utilisant 24 aiguille G et seringue de 1 ml. Environ 15 fois trituration est suffisante pour la rupture de EB, la paroi cellulaire et les membranes du plasma.
- Ajouter 200 ul de chloroforme à chaque échantillon. Vortex pour mélanger le contenu de manière uniforme. Centrifugerà 12.000 g pendant 15 min à 4 ° C. Retirez les RNeasy colonnes de spin, tubes de 1,5 ml et les étiqueter correctement.
- Recueillir le surnageant en tubes de 1,5 ml (Lors de la collecte surnageant ne pas déranger le milieu ou la couche inférieure). Ajouter un volume égal d'éthanol à 70% refroidi. Mélanger le contenu en agitant doucement.
- Appliquer 700 pi des tubes à des mini colonnes de spin respectifs et les centrifuger à 12000 g pendant 20 sec à température ambiante. Effectuer toutes les autres étapes à TA.
- Jeter le filtrat et la solution restante pour appliquer les colonnes respectives et les centrifuger à 12 000 xg pendant 20 s. Jeter le filtrat.
- Appliquer 350 ul de tampon RW1 à la colonne et centrifuger à 12 000 xg eux pendant 20 s. Jeter le filtrat et appliquer 10 pi de DNAse et tampon RDD 70 pi à la colonne.
- Incuber à température ambiante pendant 15 min. Appliquer 350 ul de tampon RW1 à la colonne et centrifuger à 12 000 xg eux pendant 20 s. Jeter le filtrat. Appliquer 500 pi deRPE tampon de lavage à la colonne et centrifuger eux à 12.000 g pendant 20 sec. Jeter le filtrat. Appliquer à nouveau 500 pi de tampon de lavage de RPE à la colonne et centrifuger eux à 12.000 g pendant 2 min. Jeter le filtrat.
- Déplacer les colonnes 2 ml de nouveaux tubes de prélèvement et les centrifuger à 12 000 g pendant 1 min. Transférer les colonnes marqué tube de 1,5 ml collecte et applique 22 ul d'eau sans nucléase. Centrifuger les tubes à 12 000 x g pendant 1 min.
- Retirer le tube de collecte et de les mettre sur la glace. Quantifier l'ARN en utilisant le système d'électrophorèse automatisé.
- concentration d'ARN, la pureté et les tests d'intégrité.
Pour assurer la pureté et l'intégrité de l'ARN tester utilisation automatisée système d'électrophorèse et kit respective 33.
6. Etudes biopuces
- Effectuer profilage transcriptionnel utilisant des puces disponibles array droits commerciaux. Pour la préparation de la cible d'ARN, la fragmentation, l'hybridation 34 et tableaupuce coloration, lave-35 utilisation des kits commerciaux disponibles.
- Effectuer un balayage de la puce de réseau et le contrôle de contrôle de la qualité en utilisant la station fluidique standard, les scanners de réseau et de logiciels d'exploitation normalisées 36. Pour l'analyse de l'expression du gène importer les fichiers générés à partir de scanners au logiciel commercial disponible norme 37, effectuer une correction de fond, résumé et la normalisation avec Multi-array robuste Analyse (RMA).
- Pour obtenir la liste des gènes exprimés de manière différentielle (de DEG) effectuer une manière analyse ANOVA. De cette liste filtrer les gènes sur la base du facteur de variation (± 2) et p-valeur FDR-contrôlée (<0,05). Obtenir l'analyse en composantes principales (ACP), carte de chaleur, etc., en utilisant ce logiciel.
Partie 2. Système UKN 1 Test
1. Maintien de CSEh
- Ensemencement des MEF
- Pour la différenciation utiliser le NSCB # 8534 (H9) de la lignée cellulaire. Culture CElls sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) comme des cellules nourricières. Manteau flacon T25 avec 4 ml de gélatine à 0,1% et incuber pendant 30 min à 37 ° C.
- MEF dégel dans 37 ° C bain d'eau et de transférer les cellules dans DMEM / 10% de FBS préchauffé.
- Spin 3,5 min avec 500 xg, retirez surnageant et remettre en suspension les cellules pour obtenir 1 x 10 7 cellules / ml. MEF Plate 4 x 10 4 / cm 2 dans des flacons T25 sur la gélatine. Eventuellement, utiliser les MEF pour les deux prochains jours. Qualité de lots MEF sont une question très critique pour l'entretien des CSEh. Par conséquent, il est conseillé d'élucider la meilleure compagnie et procédé de préparation pour les cellules H9. Nous utilisons PMEF P3.
- Fractionnement et la maintenance de H9
- Ajouter 1 ml de dispase préchauffé par flacon T25 H9 et incuber 9 min à 37 ° C.
- Ajouter 2 ml lavent moyenne à Dispase cellules traitées et pipette 5 fois haut et bas avec 5 ml pipette et une solution de cellules de transfert à un tube Falcon.
- Laver le ballon avec 9 ml milieu de lavageet ajouter des cellules pour les autres. Spin 3,5 min avec 500 xg, retirez surnageant et les cellules dans un milieu de 10 ml de CSEh remettre en suspension.
- Spin 3,5 min avec 500 xg, retirez surnageant et les cellules dans un milieu 4 ml de CSEh remettre en suspension. Ajouter 0,5 ml de suspension de cellules et 4,5 ml de milieu de CSEh et la plaque dans une nouvelle (PBS lavé) flacon T25 avec MEF. Changer milieu de hESC entier (5 ml) dans le ballon de tous les jours.
2. La différenciation des CSEh vers cellules neuroectodermiques progénitrices (NEP)
- Préparer le milieu de CSEh et moyennes KCM. Recouvrez un plat de 10 cm avec de la gélatine (0,1% dans PBS) par flacon T25 et incuber pendant 30 min à 37 ° C. Éliminer le milieu de CSEh et ajouter suffisamment Accutase pour couvrir tout le fond du flacon (1 ml par flacon T25) et incuber 25 à 30 min à 37 ° C.
- Préparer des plaques enduites sous-sol de la matrice de membrane pendant Accutase incubation. Ajouter froid DMEM / F12 pour congelée matrice membrane basale culot et le résoudre 1:20. Filter matrice membrane basale solution à travers un tamis cellulaire de 40 pm. Ajoutez solution filtrée à l'assiette, tout le fond doit être couvert (1 ml par 6 puits est nécessaire) et incuber pendant 2 heures à température ambiante.
- Après la période d'incubation de retirer la matrice membrane basale surnageant et les cellules de semences sur les puits revêtus. Après l'étape de Accutase (2.1) arrêter la réaction par addition de 1,5 ml de milieu HES. Grattez les cellules de la fiole, ajouter 8 ml de milieu de CSEh et produire une solution de cellule unique par pipetage avec 10 ml pipette soigneusement. cellules de filtrer à travers un tamis cellulaire de 40 pm.
- cellules Spin 3 min avec 500 xg, supprimer surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de CSEh. cellules Spin nouveau 3 min avec 500 xg, supprimer surnageant et les cellules dans CSEh contenant un inhibiteur de ROCK Y-27632 à une concentration finale de 10 uM remettre en suspension.
- Retirer le surnageant de gélatine enduit plat. Plaque de suspension cellulaire sur la gélatine enduite plat pour enlever les MEF et laisser dans l'incubateur pendant exactement 1 h.
REMARQUE: Lors de cette étape volonté de les MEFettle sur la plaque enduite de gélatine, tandis que le CSEh ne peut pas joindre à la gélatine. Par conséquent ce qui est crucial pour obtenir une différenciation sans chargeur. Il est une étape critique que les résultats d'incubation trop longtemps dans des touffes de CSEh et trop courte incubation dans l'élimination inefficace des MEF. Après 45 min d'incubation de la plaque devrait être étudiée pour MEF déjà installés et de bouquets de CSEh. - Lorsque les FAE ont attaché, laver en douceur les cellules non-adhérentes (CSEh) off après incubation avec le milieu déjà dans la plaque. Si plusieurs T25 ont été utilisés pour obtenir plus de cellules, des cellules individuelles peuvent désormais être combinés. Laver la plaque une fois avec le milieu de CSEh.
- cellules Spin 3 min avec 500 xg, supprimer surnageant et les cellules à environ 4 ml contenant KCM inhibiteur de ROCK 10 uM Y-27632 et 10 ng / ml de FGF-2 remettre en suspension.
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre bleu Trypan. Plate 18 x 10 3 cellules / cm 2 sur sous-sol matrice de la membrane revêtus plaques dans KCM contenant un inhibiteur de ROCK 10 uM Y-27632 et10 ng / ml de FGF-2 (pour 6 bien utiliser 1,5 ml par puits). Il est crucial de plaque les cellules dans la bonne densité pour les différencier avec succès dans PES.
- Après 24 h, changer de moyen à KCM frais contenant 10 uM inhibiteur de ROCK Y-27632 et 10 ng / ml de FGF-2. Après plus de 24 heures, changer de moyen à KCM frais contenant 10 ng / ml FGF2.
- 72 heures après l'ensemencement des cellules, la différenciation commence par changement de milieu vers moyenne KSR. Ce point de temps est considéré comme jour de différenciation 0 (DoD0). L'ajout de substances d'essai est possible maintenant.
- Sur DOD1 et DOD2 le milieu est changé exactement comme sur DoD0. Suivant moyen de changement est à DoD4 contenant 25% de N2-S et 75% KSR. Au DoD6 la différenciation est arrêté et cellules sont récoltées pour analyse.
3. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des CSEh et NEP
- Préparation de noyaux
- Ajouter 500 pi Accutase à chaque 6 et qui doit être analysée et incuber pendant 25 à 30 min. Count cellules dans une chambre Neubauer utilisant bleu Trypan.
- Resuspendre les cellules dans 1% de formaldéhyde dans du DMEM / F12 pour réticulation. Ajouter Tris pH 7,5 à une concentration finale de 125 mM au bout de 10 min pour arrêter la reticulation.
- cellules Spin 3 min avec 500 g à 4 ° C, retirer surnageant et remettre en suspension les cellules dans du PBS froid.
- cellules Spin 3 min avec 500 g à 4 ° C, supprimer surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon L1 / 1 x 10 6 cellules.
- Incuber pendant 5 min sur la glace. Spin 5 min à 800 g à 4 ° C, retirer surnageant et remettre en suspension dans 1 ml noyaux L2- Buffer / 2 x 10 6 cellules.
- Sonication et contrôle de qualité
- Soniquer de sorte que les fragments d'ADN de 300-700 paires de bases de longueur sont générés. Spin 1 min avec 10 000 g à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Les fragments ont besoin d'avoir la bonne taille, sinon l'immunoprécipitation sera inefficace ainsi que la qPCR suivi.
- Retirer 50 ul und L2 mélange avec du tampon de 50 pi pour vérifier l'efficacité du traitement par ultrasons par l'exécution d'un gel d'agarose.
- Réticuler la route par une incubation à 65 ° C pendant 4 h et 500 tours par minute. Charger les échantillons 1: 5 avec Orange G colorant de charge sur un gel d'agarose à 1,5% et d'exécuter 45 min à 110 V dans un tampon 1 x TBE. La taille des fragments de contrôle (doit être comprise entre 300-700 pb).
- Immunoprécipitation de la chromatine
- Diluer les échantillons 1: 5 dans un tampon de dilution et aliquote de 1 ml par IP dans des tubes silicones.
- Retirez 5% (en volume) de l'échantillon dilué de la chromatine (étape 3.3.1) et conserver à 4 ° C comme "entrée".
- Incuber les échantillons avec des anticorps de votre choix et non spécifique avec IgG O / N à 4 ° C sur un rotateur.
- Ajouter 50 pi de protéine A / G Sepharose perles à chaque échantillon après immunoprécipitation. Incuber les échantillons 3 heures à 4 ° C sur un agitateur. Spin 1 min avec 1500 g à 4 ° C et retirer le surnageant.
- Laver avec 1 ml lavage des perles. Spin 1 min avec 1500 g à4 ° C et retirer le surnageant. Répétez l'étape g à h. Laver avec 1 ml de tampon de lavage final. Pendant les étapes de lavage, vous ne devriez pas perdre aucun des perles, parce que cela modifie la quantité d'éluat directement.
- Centrifugeuse 1 min avec 1500 g à 4 ° C et retirer le surnageant. Ajouter tampon d'élution de 125 pi et incuber 15 min avec 65 ° C à 1000 rpm sur un agitateur.
- Spin 1 min avec 1500 xg et transférer le surnageant dans un nouveau tube de l'étape Répétez k et l. Ajouter 200 pi de tampon d'élution à l'entrée (3.3.2). Ajouter à la protéinase K et la RNase à chaque échantillon et incuber 30 min à 37 ° C à 500 tpm sur un agitateur et ensuite 4 heures à 65 ° C à 500 tpm sur un agitateur.
NOTE: Pour l'extraction d'ADN usage commercial disponibles puce à ADN propre et Concentrateur Kit 38.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'exposition au méthylmercure dans le système de test UKK
L'essai de cytotoxicité a été effectué avec H9 EB pour obtenir une valeur de CI 10 (réduction de la viabilité de 10%) pour la cytotoxicité de mercure de méthyle (figure 1). Nous avons également effectué une puce à base (plate-forme Affymetrix) étude de biomarqueurs. L'EB H9 ont été exposées au mercure de méthyle (0,25 et 1 uM) pendant 14 jours. Au jour 14, des échantillons ont été recueillis à l'aide TRIzol et l'ARN a été isolé. Profilage transcriptionnel a été effectuée à l'aide du génome humain U133 Plus 2.0 puces de tableau. Les données ont été analysées avec Partek génomique Suite TM 6.6. Premier aperçu de données a été obtenu par l'analyse Principe composants (figure 2A), la génération de diagrammes de Venn (figure 2B) et la construction de cartes de chaleur (figure 2C). L'analyse en composantes principales représente la distribution globale de l'expression génique et il segreg clairement visualiséation de MeHg 1 uM du contrôle du véhicule et MeHg 0,25 uM groupes (PC # 25.2) (figure 2A). Une liste des gènes différemment exprimés (DEG) a été obtenue après traitement statistique (ANOVA à une voie) et le filtrage des données en utilisant un changement de coupure fois de ± 2 et une (méthode Benjamini-Hochberg) p-valeur de multiplicité corrigé <0,05 (tableau 1). Le traitement 1 uM MeHg a entraîné 276 DegS et 0,25 uM dans 31 DegS (figure 2B). La carte de chaleur a montré que le MeHg 1 traitement uM principalement réduit l'expression des gènes (figure 2C). Informations sur les conditions de l'ontologie de gènes surreprésentés a été obtenu en utilisant l'outil bioinformatique DAVID. Le tableau 2 présente les catégories de gènes de GO nettement surreprésentés qui contenaient plus de 5 gènes. Les facteurs de transcription régulés à la baisse liés au développement du système nerveux ont été identifiés. SEPP1, DDIT4, AK4, FRZB (développement du cerveau), PITX (développement de noyau de neurones) et ERBB3, UGT8, APOB, APOA1 (développement du système nerveux) ont été régulés à la baisse dans une manière dépendante de la dose pour le traitement de mercure de méthyle (tableau 3).
UKN système 1 d'essai
Ce protocole de différenciation utilise double inhibiton SMAD 6 pour générer une population pure de la NEP dans les six jours de différenciation. Les cellules résultantes sont caractérisées par une régulation à la hausse de la neuronal gènes précurseurs PAX6 et OTX2. Les marqueurs de cellules souches Oct4 et Nanog sont régulés à la baisse au cours de la différenciation vers NEP (figure 3A). En raison de la différenciation très synchrone et homogène, il est également possible d'obtenir des informations sur les modifications des histones pendant cette phase précoce de développement. Nous avons adapté le protocole d'immuno-précipitation de la chromatine (ChIP) en utilisant les cellules soit au début de la différenciation ou après 6 jours dedifférenciation. Un commutateur de sites de méthylation sur les régions promotrices de PAX6 et OTX2 était évident à partir de ces études (Figure 3B). Les sites de méthylation de l'histone étudiés 3 lysine 4 triméthylation (H3K4me3) et histone 3 lysine 27 triméthylation (H3K27me3) ont été très dynamique au cours de la différenciation. Également sur le niveau de la protéine une régulation négative de Oct4 a pu être observée (Figure 4). La régulation à la hausse de Pax6 et le marqueur neuronal sur les cellules souches de la nestine a été observée par microscopie en immunofluorescence au niveau de la protéine (figure 4). La population de cellules a montré une différenciation homogène et pur après six jours de différenciation. Par conséquent, les cultures peuvent être facilement utilisées pour l'analyse de l'ARN et des protéines. Le système fournit également la possibilité de tester des substances et l'effet qu'ils ont sur le développement neural précoce 16,29.
Figure 1. Essai de cytotoxicité (de différenciation H9) pour le MeHg. Le test a été effectué selon le protocole pour définir la valeur IC 10 pour le mercure de méthyle.
Figure 2. Analyse représentant des gènes exprimés différentielles induites par 0,25 et 1 uM MeHg après l'application du système de test UKK. Les CSEh ont été traités avec 0,25 et 1 uM MeHg selon le système de test UKK. Analyse de l'écart exprimé transcriptions dans 14 jours EB différenciées a été réalisée en utilisant le logiciel Partek génomique Suite TM 6.6. (A) Analyse en composantes principales (3-Dimenional) des données de puces à ADN. Diagramme (B) obtenu à partir de Venn analyse de microréseau de l'expression génique. Le diagramme montre le nombre degènes modulés par le traitement MeHg (changement pli> ± 2, la valeur de p <0,05). (C) de classification hiérarchique des données d'expression génique (fold change> ± 2, la valeur de p <0,05). Les gènes fortement exprimés dans le groupe de contrôle du véhicule sont réprimées par 1 uM traitement MeHg. Le traitement 1 uM MeHg a entraîné 233 transcrits avec une plus faible expression et 43 sondes avec une expression plus élevée que comparer à un groupe de contrôle du véhicule. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. expression génique et le modèle de méthylation de l'histone cours de la différenciation des CSEh à partir vers NEP. Pour toutes les expériences, CSEh ont été différenciées en cellules précurseurs neuroectodermique (NEP). (A) Les échantillons ont été prélevés à day 6 de la différenciation, et les niveaux de transcription des gènes marqueurs de différenciation de neurones ont été déterminées par RT-qPCR. (Données d'expression génique par rapport à hESC) sont des moyens ± SEM de 5 expériences. (B) Les échantillons pour immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) ont été préparés au jour 6 de la différenciation. ChIP a été réalisée avec des anticorps spécifiques pour H3K4me3 ou H3K27me3 ou IgG témoin. Les facteurs d'enrichissement de séquences promotrices sont données en% entrée pour H3K4me3 (gris) et H3K27me3 (noir). Les données sont des moyennes ± SEM de 3 préparations de cellules indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. expression des protéines lors de la différenciation des CSEh à partir vers NEP. Les cellules ont été fixées et colorées pour le marqueur de cellules souchesOct4 (vert) au jour 0 de la différenciation (DoD0) et des marqueurs NEP Pax6 (rouge) et Nestin (vert) au jour 6 de la différenciation (DoD6). La barre d'échelle indique 50 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1. Liste des gènes exprimés de manière différentielle (> ± 2 fois, la valeur de p <0,05) du traitement MeHg par rapport au contrôle de véhicule dans 14 jours anciens EBS. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir ce tableau.
Tableau 2. Liste des catégories GO considérablement enrichies et sélectionnés (valeur de p <0,05,> 5 gènes) avec tran déréguléescripts pour MeHg contre le contrôle du véhicule dans 14 jours anciens EBS.
| GO terme | Compter | P valeur | Genes |
| Régulation de l'apoptose | 18 | 0,0068 | ARHGEF3, TBX3, ERBB3, MITF, BNIP3, CDH1, IGF2, IFI16, HGF, GCH1, AMIGO2, SERPINB9, KRT18, MSX1, ETS1, VEGFA, PERP, IGFBP3 |
| Règlement de la prolifération cellulaire | 17 | 0,0123 | RBP4, LYN, TBX3, ERBB3, MITF, IGF2, KDR, RERG, MSX1, ADM, ETS1, VEGFA, BNC1, ADAMTS1, FABP1, IGFBP3, FIGF |
| Vasculature développement | 12 | 0,0001 | PLAT, APOB, HAND1, TBX3, EPAS1, FOXF1, LEPR, VEGFA, COL3A1, LOX, FIGF, KDR |
| Skeletal développement du système ng> | 12 | 0,0008 | RBP4, MSX1, LGALS3, TBX3, HOXB6, COL3A1, STC1, IGF2, Postn, FRZB, IGFBP3, AHSG |
| Coeur de développement | 11 | 0,0001 | RBP4, ACTC1, MSX1, HAND1, TBX3, ADM, pKP2, ERBB3, gata6, COL3A1, ADAMTS1 |
| Procédé de métabolisme du glucose | 9 | 0,0003 | PDK1, RBP4, LDHA, PGM5, PYGL, HK2, PFKP, IGF2, PGK1 |
| Développement du poumon | 7 | 0,0008 | RBP4, EPAS1, gata6, FOXF1, VEGFA, LOX, KDR |
| Épithélium développement | 7 | 0,0386 | F11R, FREM2, gata6, FOXF1, VEGFA, DSP, KDR |
| Mésoderme développement | 5 | 0,0088 | HAND1, TBX3, FOXF1, VEGFA, SNAI2 |
| Terme | Gene Symbole | Pliez Change * | |
| 0,25 uM MeHg vs VC | 1 uM MeHg vs VC | ||
| Développement du cerveau | SEPP1 | -2.17 | -4.13 |
| DDIT4 | -1.20 | -3.11 | |
| AK4 | -1.41 | -3,08 | |
| FRZB | -1.29 | -2.19 | |
| Le développement du noyau neuronale | PITX2 | -2.08 | -4,90 |
| Développement du système nerveux | ERBB3 | -1.86 | -2.89 |
| UGT8 | -1.67 | -2.14 | |
| APOB | -3.59 | -5,72 | |
| APOA1 | 2.63 | -2.90 | |
| VEGFA | -1.28 | -3.06 | |
* Valeur de p <0,05
Tableau 4. Composition du milieu de culture.
| Sr. No. | Medium / Nom Buffer | Composition | |||
| Quantité | | ||||
| 1 | MEF Moyen | DMEM hyperglycémie | |||
| FCS | 10% | ||||
| Pénicilline | 100 unités / ml | ||||
| Streptomycine | 100 pg / ml | ||||
| L-Glutamine | 2 mM | ||||
| 2 | H9 milieu de culture | DMEM F12 | |||
| KOSR | 20% | ||||
| NEAA | 1% | ||||
| Glutamax | 1x | ||||
| β-mercaptoéthanol | 0,1 mM | ||||
| Pénicilline | 100 unités / ml | ||||
| Streptomycine | 100 pg / ml | ||||
| bFGF | 4 ng / ml | 3 | RD moyen | Milieu de culture H9 sans bFGF | |
| 4 | Medium wash | DMEM / F12 | |||
| Knockout Sérum Replacment | 20% | ||||
| 1x GlutaMAX | 1x | ||||
| MEM acides aminés non essentiels | |||||
| HEPES | 15 mM | ||||
| β-mercaptoéthanol | 90 pM | ||||
| 5 | KCM moyen | DMEM | |||
| FBS | 10% | ||||
| incubé pendant 24 heures sur les MEF | |||||
| 6 | Knockout Sérum Remplacement (KSR) | ||||
| remplacement de sérum Knockout | 15% | ||||
| 1x GlutaMAX | |||||
| 1x MEM acides aminés non essentiels | |||||
| β-mercaptoéthanol | 15 pm | ||||
| Caboche | 35 ng / ml | ||||
| Dorsomorphin | 600 nM | ||||
| SB431542 | 10 pM | ||||
| 7 | N2-S | DMEM / F-12 | |||
| Apotransferin | 100 pg / ml | ||||
| Glucose | 1,55 mg / ml | ||||
| Putrescine | 10 mM | ||||
| Sélénium | 500 pM | ||||
| Progesteron | 20 pM | ||||
| GlutaMAX | 200 pM | ||||
| 25 pg / ml | |||||
| 8 | L1 Buffer | Tris pH 8 | 50 mM | ||
| EDTA | 2 mM | ||||
| NP-40 | 0,10% | ||||
| Glycérol | 10% | ||||
| 9 | L2 Buffer | Tris pH 8 | 50 mM | ||
| EDTA | 10 mM | ||||
| SDS | 1% | ||||
| 10 | Elution Buffer | NaHCO 3 | 100 mM | ||
| SDS | 1% | ||||
| 11 | Wash Buffer | Tris | 20 mM | ||
| EDTA | 2 mM | SDS | 0,10% | ||
| NP-40 | 0,50% | ||||
| NaCl | 150 mM | ||||
| 12 | Le tampon de lavage final | Tris | 20 mM | ||
| EDTA | 2 mM | ||||
| SDS | 0,10% | ||||
| NP-40 | 0,50% | ||||
| NaCl | 500 mM | ||||
| 13 | Stem Cell moyen | mTESAR TM milieu de base | 400 ml | ||
| supplément mTESAR TM | 100 ml | ||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les approches traditionnelles de tests toxicologiques impliquent de vastes études animales rendant ainsi tests coûteux et chronophage. En outre, en raison des différences entre les espèces les études de sécurité précliniques animale ne sont pas toujours valable pour prédire les effets de la toxicité des médicaments potentiels pertinents pour les humains. Bien que les primates non-humains sont le plus prévisible, encore forte éthique, et les demandes socioeconomical élèvent rapidement par les sociétés modernes pour le développement sensible et robuste de test in vitro système approprié pour la sécurité humaine.
La capacité unique de CSEh à se différencier en tous les types de cellules somatiques, donc récapitulant les processus de développement in vivo de l'homme dans la combinaison avec des approches de la toxicogénomique sensibles a été proposé comme une alternative aux approches traditionnelles pour les essais d'innocuité des médicaments 6,21. Sous le projet '' ESNATS le système de test 'UKK' a été développé pour prédirela toxicité embryonnaire de développement basée sur la transcriptomique profilage. Dans ce système hESC ont été différenciées dans des corps embryoïdes pendant 14 jours. La cinétique profil de temps de transcriptomique obtenu montre une expression élevée de différenciation marqueur spécifique aux trois feuillets embryonnaires ectoderme, l'endoderme et le mésoderme le jour 14 qui récapitulent partiellement développement embryonnaire humaine tôt. Sur la base de ces résultats, les médicaments tératogènes connus ont été exposés pendant la différenciation, pendant 14 jours et le profil différentiel exprimée du gène ont été obtenus. Impressionnant, signatures de gènes associés aux effets tératogènes de la thalidomide observés chez les humains, pourraient être prédits par ce système de test 28. Les résultats représentatifs pour le méthylmercure dans le show du système de règlement de concentration-dépendante bas UKK des facteurs de transcription liés au développement du système nerveux. Les autres neuro-toxiques pour le développement ont également été testés dans ce système et des efforts sont en cours pour identifierles toxico-marqueurs communs aux composés au niveau de l'ARNm et de les valider au niveau de la protéine. Le protocole de test UKK fournie ici donne directrice de base pour mener l'expérience avec H9 de cellules souches embryonnaires humaines pour identifier la signature transcriptomique pour toxique pour le développement.
La procédure optimisé norme de fonctionnement (SOP) pour la différenciation des cellules souches pluripotentes, selon le protocole de UKN1 permet une différenciation robuste et synchronisée de CSEh à NEP. Déjà après six jours de différenciation, une population de cellules homogène avec les taux d'expression élevé Pax6 est généré. Les cellules se développent dans les cultures adhérentes, qui permettent une analyse par immunocoloration. Analyse immunocytochimique à haute résolution et par microscopie confocale nécessite que les cellules sont cultivées sur des surfaces de verre minces. Ceci est possible pour ces cultures si le verre est revêtu de façon optimale, mais il doit être mentionné que les cellules se développent très dense, en plus d'une seule coucheaprès six jours. Par conséquent, l'analyse de routine des marqueurs spécifiques de la lignée est plus facilement réalisée par RT-qPCR, la puce ou western blot. Un gros avantage pour l'analyse biochimique des cultures est le rendement élevé de cellules qui peuvent être obtenus par ce protocole de différenciation à partir d'une petite population de départ des CSEh. Un inconvénient de ce protocole est le coût élevé des suppléments moyennes (par exemple, caboche) nécessaires pour forcer la différenciation neurale homogène. Un autre inconvénient pour certaines applications peut être que certaines petites molécules (inhibiteurs de kinase) doivent être présents dans le milieu de culture dans le cadre du protocole. Ainsi, certaines voies de signal ne peuvent pas être examinées sur le plan toxicologique, comme le changement des conditions de culture modifie également la différenciation 29.
L'avantage de la combinaison du système de test est la meilleure compréhension de DNT. Considérant que UKK couvre un éventail plus large et l'effet néfaste sur la petite formation de la couche de germe peut être étudiée, tout UKN1ux pour enquêter sur plusieurs mécanismes spécifiques de neurones tels que l'épigénétique. Bien qu'on ait démontré les deux systèmes de culture présentées ici de prédire la neurotoxicité développementale pour quelques substances toxiques modèle 16, il ya toujours un besoin pour les versions des débits plus élevés des protocoles qui permettent le dépistage d'un grand nombre de substances neurotoxiques potentiels de développement. En outre, plus de travail est nécessaire pour identifier et valider des marqueurs de toxicité communs au niveau de l'ARNm ou de protéines, et de les mettre en place dans le cadre de l'évaluation préclinique de l'innocuité des médicaments.
Plus de 20 milliards de dollars par année sont investis par les industries pharmaceutiques pour la découverte de médicaments 39. Comme une preuve de concept, nous avons développé des systèmes in vitro du test de toxicité sur la base de CSEh et transcriptomique qui peuvent être appropriés pour prédire les effets de toxicité pertinents relatifs aux droits de composés de médicaments potentiels d'une manière rentable et moins de temps.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
| mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
| V bottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
| Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Kits | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
| Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of equipment | |||
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Genechip Hybridisation Oven - 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of softwares | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |
|||
References
- Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
- Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceutical Biotechnology. Current Pharmaceutical Biotechnology. 12 (11), 1760-1773 (2011).
- Leist, M., Hartung, T., Nicotera, P. The dawning of a new age of toxicology. ALTEX. 25 (2), 103-114 (2008).
- Kuegler, P. B., et al. Markers of murine embryonic and neural stem cells, neurons and astrocytes: reference points for developmental neurotoxicity testing. ALTEX. 27 (1), 17-42 (2010).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. , (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of Developmental Toxicants and Signaling Pathways in a Functional Test Based on the Migration of Human Neural Crest Cells. Environmental Health Perspectives. 120 (8), 1116-1122 (2012).
- Bosman, A., et al. Molecular and Functional Evidence of HCN4 and Caveolin-3 Interaction During Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells and Development. 22 (11), 1717-1727 (2013).
- Sartiani, L., et al. Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach. Stem Cells. 25 (5), 1136-1144 (2007).
- Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation. 76 (9), 958-970 (2008).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (2), 200-206 (2013).
- Subramanian, K., et al. Spheroid Culture for Enhanced Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-Like Cells. Stem Cells and Development. 23 (2), 124-131 (2014).
- Sivertsson, L., Synnergren, J., Jensen, J., Bjorquist, P., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells Cultured in a Perfused Three-Dimensional Bioreactor. Stem Cells and Development. 22 (4), 581-594 (2013).
- Jagtap, S., et al. Cytosine arabinoside induces ectoderm and inhibits mesoderm expression in human embryonic stem cells during multilineage differentiation. British Journal of Pharmacology. 162 (8), 1743-1756 (2011).
- Krug, A. K., et al. Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach. Archives of Toxicology. 87 (1), 123-143 (2013).
- Leist, M., et al. Test systems of developmental toxicity: state-of-the art and future perspectives. Archives of Toxicology. 87 (12), 2037-2042 (2013).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Molecular medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Khoo, M. L. M., et al. Growth and differentiation of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells: Effect of glucose and basic fibroblast growth factor. Biology of Reproduction. 73 (6), 1147-1156 (2005).
- Son, M. Y., Kim, H. J., Kim, M. J., Cho, S. Physical Passaging of Embryoid Bodies Generated from Human Pluripotent Stem Cells. Plos One. 6 (5), (2011).
- Winkler, J., Sotiriadou, I., Chen, S., Hescheler, J., Sachinidis, A. The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology. Current medicinal chemistry. 16 (36), 4814-4827 (2009).
- Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17 (8), 759-766 (2010).
- Miller, M. T., Stromland, K. Teratogen update: Thalidomide: A review, with a focus on ocular findings and new potential uses. Teratology. 60 (5), 306-321 (1999).
- Newman, C. G. H. Teratogen Update - Clinical Aspects of Thalidomide Embryopathy - A Continuing Preoccupation. Teratology. 32 (1), 133-144 (1985).
- Stern, L. In vivo assessment of the teratogenic potential of drugs in humans. Obstetrics and gynecology. 58 (5 Suppl), 3S-8S (1981).
- Lynch, H. T., Reich, J. W. Diethylstilbestrol, Genetics, Teratogenesis, and Tumor Spectrum in Humans. Medical Hypotheses. 16 (3), 315-332 (1985).
- Satoh, H. Behavioral teratology of mercury and its compounds. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 1-9 (2003).
- Meganathan, K., et al. Identification of Thalidomide-Specific Transcriptomics and Proteomics Signatures during Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Plos One. 7 (8), (2012).
- Balmer, N. V., et al. Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome. Human Molecular Genetics. 21 (18), 4104-4114 (2012).
- Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M., Hartung, T. Developmental neurotoxicity - Challenges in the 21st Century and In Vitro Opportunities. ALTEX. 31 (2), 129-156 (2014).
- Leist, M., Efremova, L., Karreman, C. Food for thought ... considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX. 27 (4), 309-317 (2010).
- Zimmer, B., et al. Coordinated waves of gene expression during neuronal differentiation of embryonic stem cells as basis for novel approaches to developmental neurotoxicity testing. Cell Death and Differentiation. 18 (3), 383-395 (2011).
- Experion RNA StdSens Analysis Kit for RNA analysis by Electrophoresis. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000976B%20%20RNA%20STDSENS%20MANUAL.PDF (2014).
- Affymetix GeneChip 3 IVT Express Kit for Target RNA preparation, Fragmentation and hybridization. , Available from: http://microarray.csc.mrc.ac.uk/downloads/3'%20IVT%20Express%20Manual.pdf (2014).
- Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit. , Available from: http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1 (2014).
- Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1 (2014).
- Partek Genomics Suite. , Available from: http://www.partek.com/pgs (2014).
- ChIP DNA Clean and Concentrator. , Available from: http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/pcr-dna-clean-up-concentration/chip-dna-clean-concentrator (2014).
- Kraljevic, S., Stambrook, P. J., Pavelic, K. Accelerating drug discovery. EMBO Reports. 5 (9), 837-842 (2004).
