Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

תאי גזע אנושיים pluripotent בהתבסס התפתחותית רעילות מבחני לביולוגיה הקרנה ומערכות בטיחות כימית נתונים דור

doi: 10.3791/52333 Published: June 17, 2015
* These authors contributed equally

Summary

הפרוטוקולים מתארים שתי מערכות במבחנת רעילות התפתחותית מבחן (UKK וUKN1) המבוססים על תאי גזע עובריים אנושיים ומחקרי transcriptome. מערכות הבדיקה לחזות סיכון לרעילות התפתחותית אדם, ועשויות לתרום לצמצום ניסויים בבעלי חיים, עלויות והזמן הנדרשים לבדיקת בטיחות כימית.

Abstract

פרוטוקולים יעילים להבחין בתאי גזע pluripotent אנושיים לרקמות שונות בשילוב עם טכנולוגיות -omics פתחו אופקים חדשים במבחנה בדיקת רעילות של תרופות פוטנציאליות. כדי לספק בסיס מדעי מוצק למבחנים כאלה, זה יהיה חשוב כדי לקבל מידע כמותי על מהלך התפתחות הזמן ועל מנגנוני פיקוח הבסיסיים על ידי גישות ביולוגיה מערכות. שני מבחני ולכן היו מכוון כאן לדרישות אלה. במערכת בדיקת UKK, תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) (או תאי pluripotent אחרים) נותרים להבדיל באופן ספונטני במשך 14 ימים בגופי embryoid, כדי לאפשר יצירה של תאים של כל שלוש השכבות הנבט. מערכת זו משחזרת שלבים עיקריים של התפתחות עוברית אנושית המוקדמת, וזה יכול לחזות רעילות / teratogenicity העוברי מוקדם אדם ספציפי, אם תאים נחשפים לכימיקלים בבידול. מערכת בדיקת UKN1 מבוססת על הבחנה hESC לpopulatיון של אב neuroectodermal (NEP) תאים במשך 6 ימים. מערכת זו משחזרת את התפתחות עצבית מוקדמת וצופה ברעילויות התפתחותית מוקדמות ושינויים אפיגנטיים מופעלים על ידי כימיקלים. שני המערכות, בשילוב עם לימודי microarray transcriptome, מתאימות לזיהוי סמנים ביולוגיים רעילים. יתר על כן, הם יכולים לשמש בשילוב כדי ליצור נתוני קלט לניתוח מערכות ביולוגיים. יש מערכות בדיקה אלה יתרונות על פני לימודי טוקסיקולוגי המסורתיים הדורשים כמויות גדולות של בעלי חיים. מערכות הבדיקה עשויות לתרום להפחתת העלויות לפיתוח תרופות והערכת בטיחות הכימית. שילובם שופך אור בעיקר על תרכובות שיכולות להשפיע על התפתחות נוירולוגית ספציפית.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

היכולת של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) להתמיין לסוגים שונים של תאים נפתחה עידן חדש של בדיקות במבחנה רעילות 1, דוגמנות מחלה ורפואה רגנרטיבית 2. תאי הגזע הם ניחן ביכולת לשכפל את עצמו, כדי לשמור על מדינת pluripotent, ולהתמיין לתאים מתמחים 3,4. המאפיינים של hESC (יכולת להבחין לכל סוגי התאים) נמצאים גם בתאים אחרים אדם pluripotent גזע, כגון תאים אנושיים הנגרם pluripotent גזע (hiPSC) או תאים שנוצרו על ידי העברת גרעין 5. לדוגמא, קווי hESC שונים רבים כבר הבדיל לתוך הנוירונים 6, תאי כליה 7, 8 תאי רכס עצביים, cardiomyocytes 9-12, או hepatocytes כמו תאים 13,14. יתר על כן, באופן ספונטני hESC יכול להתמיין לתאים של כל שלוש השכבות הנבט 15-18 בגופי embryoid (EBS) 19,20. Eהתפתחות עוברית קארלי מוסדרת על ידי ביטוי ההפרש של גנים שונים הקשורים לשכבות הנבט השונות שכבר נתפסו ברמת ה- mRNA על ידי transcriptomics באמצעות טכנולוגית microarray 15. מאמצים אלה הביאו להקמתה של מודלים טוקסיקולוגי ספציפיים איבר מבוססים על hESC / hiPSC וניתוח transcriptomics (לסקירה ראה 21,22). יש מודלים אלה יתרונות על פני השימוש המסורתי של חיות מעבדה ללימודי טוקסיקולוגי, כמחקרים פרה-קליניים בבעלי החיים במעבדה לא תמיד חזוי של בטיחות אנושית. רעילויות התרופה מושרה נתקלו בחולים לעתים קרובות הקשורים לתהליכים מטבוליים או איתות ששונה בין בני האדם ובעלי חיים. הבדל המין מנע הגילוי המוקדם אמין של רעילות התפתחותית בבני אדם, ועבור תרופות למשל כמו תלידומיד 23,24 וdiethylstilbestrol 25,26 הוצא מהשוק בשל teratogenicity. טאליdomide לא הראה כל רעילות התפתחותית בחולדות או עכברים. כימיקלים סביבתיים כגון מתיל-כספית 27 גרמו לרעילות התפתחותית טרום לידתי ביחס למערכת העצבים במינים שונים, אבל גילויים אנושיים היו קשים לדגמן בבעלי חיים. כדי לטפל בבעיה של נושאים ספציפיים מינים, מדענים עובדים תחת פרויקטים שונים המבוססים על תאי גזע כמו ReProTect, ESNATS, בלש וכו 'עוסקים בפיתוח מודלים שונים לרעילות עוברית, רעילויות, קרדיאלית, רעילות וNephrotoxicity באמצעות רעלי אדם חשודים להשפיע על בני אדם. במסגרת פרויקט קונסורציום האירופי 'אלטרנטיבי בדיקת האסטרטגיות חדשניות המבוססות על תאי גזע עובריים (ESNATS) חמש מערכות בדיקה הוקמו. UKK שנקרא (niversitäts k K OLN U linikum) מערכת מערכת מבחן אחד מבחן באופן חלקי לוכדת התפתחות עוברית אנושית מוקדמת. בזה זההתאים העובריים האנושיים ystem H9 נבדלים בשלוש שכבות נבט (האאקטודרם, האנדודרם והמזודרם) 15 ושכבת נבט חתימות ספציפיות כבר נתפסו על ידי transcriptomics פרופיל באמצעות פלטפורמת microarray Affymetrix. רעלים התפתחותיים שונים כמו תלידומיד 28, חומצה ולפרואית, מתיל-כספית 16,17, או arabinoside ציטוזין 15 נבדקו במערכת זו, וחתימות גן toxicant ספציפי התקבלו. במערכת בדיקה שנייה, שנקרא (niversity U של K onsta n z) UKN1 מערכת בדיקה 1, תאי H9 נבדלים לתאי neuroectodermal (NEP) במשך 6 ימים. עדות לכך הוא ביטוי גבוה של סמנים גנטיים עצביים כגון Pax6 וOTX2. במהלך התמיינות במשך 6 ימים, תאי NEP נחשפו לנוירו-התפתחותית רעלים כגון VPA, מתיל-כספית. פרופילי transcriptomics מוסדר דה toxicant ספציפי היו obtaiנד, כמו גם על ידי שימוש בפלטפורמת microarray Affymetrix 16,29.

החזון החדש לטוקסיקולוגיה של המאה ה -21 חוזה שמערכות בדיקה לא רק להניב תיאור פנוטיפי כמו histopathology in vivo, או שינויי transcriptome בסוף incubations toxicant לטווח ארוך. זה לא מצביע על כך שמבחנים לספק מידע מכניסטית 3, וכי מידע זה יכול להיות ממופה למה שנקרא מסלולי תוצאה שליליים (AOP) המספקים רציונל מדעי לתופעות מסוכנות 30. לספק מידע כזה, יש לי מערכות הבדיקה להחיל להיות מאוד איכות מבוקרת 31, כמו למשל תועד על ידי נהלי פעולה סטנדרטיים חזקים. יתר על כן, שינויים תלויי זמן צריכים להיות ממופים עם רזולוציה גבוהה. זה דורש מערכות בדיקה עם שינויים מסונכרנים 32. מערכות בדיקת UKN1 וUKK המתוארות כאן כבר מותאמות לדרישות אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפרוטוקול הבא בוצע באמצעות קו תאי גזע עובריים אנושי (hESC) H9. קו זה התא היה באופן שגרתי בתרבית על fibroblasts העכבר mitotically המומת העוברי (MEFs) בתקשורת ותרבות hESC תוספת bFGF ולאחר מכן בתרבית תאי גזע תקשורת על 6 סנטימטרים צלחות פטרי מצופים במטריצת קרום במרתף כגון matrigel, להיפטר מMEFs. תאי H9 מ> צלחות ומחוברות 80% שמשו למעבר נוסף. תאים בתרבית H9 על צלחות מטריצת קרום במרתף שמשו ליצירת EBS. כל הנהלים שהוזכרו בפרוטוקול הבא בוצעו תוך שימוש בשיטות סטנדרטית לשיטות תרבית תאי ספטית וטובות.

חלק מערכת בדיקת UKK 1.

1. Culturing תאי גזע העובריים האנושי

  1. פיצול ותחזוקה של H9 בתאים מזינים
    1. ג'לטין 2 מיליליטר 0.1% פיפטה לכל צלחת סנטימטר 6 ו דגירה של 30 דקות בincub תרבית תאיםator (37 ° C ו 5% CO 2). פתרון ג'לטין לשאוב עם פיפטה פסטר סטרילי.
    2. הוסף בינוני MEF 2 מיליליטר מכיל 0.1 x 10 6 תאים / מיליליטר MEF לשתי צלחות מצופים ג'לטין ודגירתם בתרבית תאי חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) O / N.
    3. ביום שלמחרת, להסיר את תאי H9 בקבוקון ממכל נוזל אחסון חנקן באמצעות מלקחיים ולהפשיר את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס באמצעות מלקחיים ארוכים.
    4. הסר את הבקבוקון מאמבט מים, אמבטיה זה עם 70% אתנול, אוויר יבש בארון הבטיחות הביולוגית במשך 15 עד 30 שניות ולהעביר את תאי צינור פלקון 15 מיליליטר.
    5. להוסיף 9 מיליליטר של מדיום תרבות H9 לאט על הקיר הפנימי וצנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות.
    6. לשאוב supernatant מחדש להשעות את התאים במדיום תרבות 6 מיליליטר מכיל מעכבי ROCK (10 מיקרומטר, Y27632) ובעדינות פיפטה לערבב. בינוני לשאוב MEF מצלחת 6 סנטימטר ולהוסיף השעיה תא 3 מיליליטר בכל צלחת. לשנות את המדיום בדאיי 3 ולאחר מכן בכל יום אחר. תאי צלחת ומחוברות תת> 80% עם יחס פיצול 1: 3.
      הערה: בדרך כלל ב5 עד 7 ימי צלחת הופכת ומחוברות. האכלה משמשת מתקבלת מעובר עכברי CF1 ומומתת על ידי חשיפה לקרינת γ.
  2. culturing תא H9 על צלחות מטריצת קרום במרתף מצופים
    1. בינוני הפשרת תאי גזע תוספת (5x) ב RT ולהוסיף 100 מיליליטר 400 מיליליטר למדיום בסיסי בארון בטיחות ביולוגית.
    2. מטריצת קרום במרתף הפשרה על קרח. להוסיף נפח הציע של מטריצת קרום במרתף (ראה תעודת הניתוח עבור כל אצווה) ב 24 מיליליטר המקורר DMEM / F-12 בינוניים בסיסית לעשר 6 צלחות סנטימטר. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    3. הוסף 2 מיליליטר בכל צלחת 6 סנטימטר. שמור את הצלחת ב RT עבור שעה 1. הסר את המדיום ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום בתאי גזע.
    4. קח את ארבע צלחות H9 ומחוברות בMEFs. הסר את מושבות הבדיל עם קצה פיפטה 1 מיליליטר תחת סטראו המשיך בקבינט בטיחות ביולוגית.
    5. לשאובהבינוני ולשטוף את התאים עם 4 מיליליטר PBS ולהוסיף 2 מ"ל נובע מדיום סלולארי בכל צלחת. חותך את המושבות מובחנת עם 26 מחט G ל6-9 חתיכות כל אחד.
    6. בעדינות לאסוף את התאים בצינור בז 50 מיליליטר. צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות.
    7. לשאוב supernatant מחדש להשעות 12 מ"ל בגזע מדיום סלולארי. לספור את הגושים על ידי הצבת 20 μl על שקופיות זכוכית מתחת למיקרוסקופ ולהתאים את עוצמת הקול עבור 150 גושים לכל מיליליטר. הוסף 2 מיליליטר של השעיה בכל צלחת 6 סנטימטר.
    8. הזז את הצלחות בחזרה-ושוב ותנועות מצד לצד לחלוקה גוש אחיד ודגירת הצלחות בתרבית תאי חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
    9. הסר את המושבות מובחנות ולתת שינוי בינוני כל יום חלופי.

2. גופים embryoid גיבוש (EBS)

לבצע את כל ההליך שהוזכר להלן לפי אמצעי זהירות אספטיים ובקבינט הבטיחות הביולוגית.

  1. יום & # 08212; ציפוי של תאי H9 על צלחות תחתונה V
    1. הכן 5% קופולימר בלוק כגון pluronic F 127 ב PBS ולסנן דרך מערכת סינון מונעת ואקום באמצעות 0.22 מיקרומטר סינון סטרילי.
    2. V המעיל תחתון 96 צלחות גם עם 40 μl של 5% קופולימר בלוק בכל טוב ולדגור על RT במשך 45 דקות.
    3. הסר את צלחות מטריצת קרום במרתף ומחוברות עם תאי H9 מהחממה ולהסיר את מושבות הבדיל עם קצה פיפטה 1 מיליליטר תחת סטראו בקבינט בטיחות ביולוגית.
    4. לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים עם 4 מיליליטר PBS. הוסף 2 מיליליטר בינוני בידול אקראי (מדיום תרבות H9 ללא bFGF, בינוני RD) בכל צלחת. השתמש בכלי מעבר ולחתוך את מושבות תאי H9 בגושים בגודל אחיד וצורה על ידי ההתבוננות בסטראו בארון בטיחות ביולוגית ולאחר מכן בעדינות לגרד עם מגרד התא.
    5. לאסוף את הגושים בצינור בז 50 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant מחדש להשעות cell במדיום RD כדי לקבל 1,000 גושים לכל מיליליטר.
    6. לשאוב קופולימר הבלוק מצלחות תחתונה V. יוצקים את הגושים בצלחת מרובעת סטרילי ועם עזרה של פיפטה רבה להוסיף השעיה 100 μl היטב בכל צלחת תחתונה V.
    7. לצבירת הכוח של גושים, צנטריפוגות הצלחות התחתונה V על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 400 x גרם. דגירה צלחות בתרבית תאי חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) במשך ארבעה ימים.
  2. יום 4 - אוסף של EBS
    1. לאסוף את EBS בצלחת מרובעת סטרילי מצלחות תחתונה V באמצעות פיפטה רבה וטיפים μl רחבים נשא 200.
    2. לאסוף את EBS מצלחת מרובעת סטרילי בעד 15 מיליליטר צינור בז עם פיפטה סרולוגיות סטרילי 10 מיליליטר. לאפשר EBS להתיישב למשך 2 דקות. לשאוב supernatant ולשטוף את EBS עם 5 מיליליטר PBS.
    3. לאפשר EBS להתיישב למשך 2 דקות ולשאוב supernatant. להשעות מחדש EBS במדיום 5 מיליליטר RD.
    4. פיפטה את מדיום RD 10 מיליליטר ב 10 סנטימטריםצלחות בקטריולוגית. העבר את EBS בצלחות בקטריולוגית 10 סנטימטר.
    5. דגירה צלחות בקטריולוגית בייקרה אופקי (תנועת הדדיות 50 / min) המשיכו בתרבית תאי חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) לתקופת זמן הנדרשת. תן שינוי בינוני (15 מיליליטר בינוני RD) בכל יום חלופי.
      הערה: טיפול עדין נדרש תוך culturing hESCs. הגודל של EBS משתנה ביום 4. בחר את EBS האחיד הגודל (± 20%) על ידי ההתבוננות בסטראו לניסוי נוסף. כ -50% EBS נוצר בשיטה זו הוא של אחיד בגודלם. העברת EBS על תוצאות שייקר בצורה אחידה.

3. Cytotoxicity Assay עבור IC 10 קביעה

  1. העברת EBS על צלחות תחתונה אופטיות
    1. להפשיר ג'לטין 0.1% באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 צלחות תחתונה אופטיות דקות ומעיל עם 50 μl של ג'לטין 0.1% לכל גם באמצעות פיפטה רבה. דגירה הצלחות ב RT ל45 דקות. לאחר הדגירה לשאוב ג'לטין מצלחות תחתונה אופטיות.
    2. קח את EBS שנאסף ביום 4 בצלחת 10 סנטימטרים בקטריולוגית המכילים בינוני RD.
    3. שמור צלחות תחתונה אופטיות בעמדה מלוכסנת בקבינט בטיחות ביולוגית. העברת שני גודל אחיד של EBS ב100 בינוני RD μl לכל גם בצלחת תחתונה אופטית 96 גם על ידי ההתבוננות בסטראו. שמור עמודה ה -12 ריקים.
    4. דגירה צלחות בתרבית תאי חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) במשך 24 שעות.
  2. חשיפה לסמים מיום 5 ליום 14
    1. לשקול את מתחם המבחן ולעשות ריכוז הגבוה ביותר בממס ידוע.
    2. לבצע דילול חצי לוגריתמים של מתחם מבחן סדרתי עד 8 דילולים בממס המכילים צינורות בז ממוספרים עם לH, שמור צינור לא. אני כמו שליטה ברכב, אין צינור. J כביקורת שלילית (בינוני RD) וצינור לא. K חיובי (70% אתנול) שליטה.
    3. להפשיר בינוני RD באמבט מים ב 37° C במשך 15 דקות. קח את 5 בינוני RD מיליליטר כל 11 צינורות בז סטרילי שכותרת 1-11.
    4. העברה 5 μl של פתרון מצינור לצינור K לצינור 1 עד 11 בהתאמה ומערבולת הצינורות. קח את הצלחת התחתונה האופטית מהחממה ולהסיר בזהירות את התקשורת עם שימוש בפיפטה רבה.
    5. הוסף 200 μl של תקשורת ממספר צינור 1 עד 11 לעמודות בהתאמה של הצלחת התחתונה האופטית. תן שינוי / סמים בינוניים בכל יום חלופי.
      הערה: דילולים חצי לוגריתמים לקחת 6.48 μl ממס ב7 צינורות שכותרתו 2 עד 8. מהגבוה ביותר העברת מס '1 צינור ריכוז 3 μl למס' 2 צינור, מערבולת וסדרתי להעביר 3 μl לצינור הבא. שמור No.9 צינור לשליטה ברכב ומס '10 צינור לביקורת שלילית. No.11 הצינור הוא 70% אתנול.
  3. מדידת חשיפת Resazurin וקרינה: יום 14
    1. בינוני הפשרת RD באמבט מים על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לבצע את כל ההליך mention להלן בהיעדר האור בקבינט הבטיחות הביולוגית.
    2. קח בינוני 10 מיליליטר RD בצינור 15 מיליליטר (א) ולהוסיף נפח מומלץ של מגיב resazurin ומערבבים על ידי pipetting. קח את הצלחת התחתונה האופטית מהחממה ולהסיר את כל המדיום עם פיפטה רבה בזהירות.
    3. להוסיף בינוני 100 μl מצינור בכל טוב. דגירה את הצלחת בתרבית תאי חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) במשך 90 דקות.
    4. מדוד את ספקטרופוטומטר הקרינה באמצעות (560 אקס / 590 Em).
  4. קביעת ערך IC 10
    1. לייבא את הערכים בפריזמה כרית גרף לאחר הפחתת הערכים הריקים. ציר x קבע כמנה וציר y כיחידות הקרינה.
    2. לנרמל את הערכים להשיג אחוז על ציר y ולהפוך את הערכים (ציר x כקנה מידת יומן). חישוב ערך IC 50 באמצעות תגובת sigmoidal מינון פרמטר (שיפוע משתנה). לחשב להיכנס IC 10 ערכים באמצעות הבאמשוואה:
      F = 10 = 50 logEC logECF - (1 / מדרון הר) * יומן (F / (100-F))
      Y = + תחתון (למעלה-למטה) / (1 ​​+ 10 מדרון הר ^ ((LogEC 50 -X) *))
    3. לקבוע את IC 10 הערכים שיש לנקוט למחקרים נוספים.

4. ביומרקר מחקר המבוסס על Microarrays

  1. יום 0 עד היום 5:
    1. היווצרות גוף embryoid והעברת 10 סנטימטרים צלחות בקטריולוגית - בצעו את השלבים שהוזכרו בנקודה 2 להיווצרות גוף embryoid.
      הערה: השתמש בשלושה משכפל ביולוגי לכל מחקר. מחלקים כל ביולוגי לשכפל לשני חלקים - טיפול התרופתי בIC 10 ריכוז ושליטה ברכב. הכן ריכוז תרופה 10,000 פי מעל IC 10 הריכוז ברכב ומזה להוסיף 10 μl 100 מיליליטר בינוני RD עם גושי תא H9 בשפופרת 50 מיליליטר אפנדורף מערבב היטב וזרעו על צלחות תחתונה V. בצע את אותו הליך לקבוצת שליטה ברכב.
  2. <li> לחשיפה לסמים ביום 5 עד 14, לאסוף EB's ולהעביר אותם בצלחות 10 סנטימטרים בקטריולוגית ביום 4 לפי השלבים שהוזכרו בנקודה 2. העברת הצלחות על שייקר אופקי (תנועת הדדיות 50 / min) ב חממת תרבות תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) במשך 14 ימים. תן שינוי בינוני כל יום חלופי.
  3. לאיסוף דגימה, ביום 14, לאסוף EBS מצלחות 10 סנטימטרים לצינור 15 מיליליטר בז עם פיפטה סרולוגיות סטרילי. לאפשר EBS להתיישב למשך 2 דקות. לשאוב supernatant ולשטוף את EBS עם 5 מיליליטר PBS. לאפשר EBS להתיישב למשך 2 דקות ולשאוב supernatant. להשעות מחדש EBS בפתרון מיליליטר 1 RNAlater או מגיב TRIzol, מערבולת ולאחסן את המדגם ב -80 ° C עד עיבוד נוסף.
    הערה: בצע את כל ההליך בארון בטיחות ביולוגית כמו לכל שיטות מעבדה טובות. סובב את הצלחות בתנועה מעגלית סביב המרכז להביא את כל EBS במרכז, לשאוב את המדיום מסובב בעזרת pastu זכוכית סטריליתמחדש פיפטה, להוסיף 15 מיליליטר בינוני RD ולאחר מכן להוסיף 15 μl של תרופה / רכב לקבוצה המתאימה.

5. בידוד RNA ויושרה בדיקה

  1. בידוד RNA:
    רוב הצעדים שהוזכרו להלן להתבצע לטיהור RNA באמצעות RNeasy מיני קיט לפי הוראות. השתמשו תמיד בצינורות nuclease חופשיים, טיפים פיפטה ומים. תוך כדי העבודה עם TRIzol לבצע את כל ההליך במכסת מנוע בטיחות כימית ולהרכיב משקפיים מגן, כמו גם כפפות מגן כימיות.
    1. להפשיר את הדגימות על קרח. אם דגימות נשמרות בפתרון RNAlater, צנטריפוגה הצינורות ב XG 12,000 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר מגיב TRIzol.
    2. Triturate הדגימות באמצעות מחט 24 G ומזרק 1 מיליליטר. כ 15 פעמים טחינה דקה מספיק לשיבוש EBS, דופן תא וקרום פלזמה.
    3. הוסף 200 μl של כלורופורם בכל דגימה. מערבולת לערבב את התוכן באופן אחיד. צנטריפוגהב XG 12,000 במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את עמודות ספין RNeasy מיני, 1.5 מיליליטר צינורות ולתייג אותם כראוי.
    4. לאסוף את supernatant בצינורות 1.5 מיליליטר (תוך איסוף supernatant לא להפריע באמצע או שכבה תחתונה). להוסיף נפח שווה של אתנול 70% צוננים. מערבבים את התוכן על ידי טלטול עדין.
    5. החל 700 μl מהצינורות לעמודות ספין מיני בהתאמה צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 20 שניות ב RT. לבצע את כל צעדים נוספים ב RT.
    6. מחק את התסנין וליישם פתרון שנותר לטורים של צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 20 שניות. מחק את התסנין.
    7. החל 350 μl של חיץ RW1 לעמודה ו צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 20 שניות. מחק את התסנין ולהחיל 10 μl של DNAse וחיץ RDD 70 μl לעמודה.
    8. לדגור על RT במשך 15 דקות. החל 350 μl של חיץ RW1 לעמודה ו צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 20 שניות. מחק את התסנין. החל 500 μl שלהרשתית הצפה לשטוף לעמודה ו צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 20 שניות. מחק את התסנין. שוב החל 500 μl של חיץ לשטוף הרשתית לעמודה ו צנטריפוגות ב XG 12,000 למשך 2 דקות. מחק את התסנין.
    9. Shift עמודות 2 מיליליטר צינורות אוסף החדשים וצנטריפוגות ב XG 12,000 דקות 1. העבר את העמודות לצינור 1.5 מיליליטר אוסף שכותרתו ולהחיל 22 μl מים nuclease חינם. בצנטריפוגה הצינורות ב XG 12,000 דקות 1.
    10. הסר את צינור האיסוף ולשים אותם על קרח. לכמת RNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית.
  2. ריכוז RNA, טוהר ויושר בדיקות.
    לטוהר RNA ויושרה בדיקת מערכת אלקטרופורזה שימוש אוטומטי וערכה בהתאמה 33.

6. Microarray לימודים

  1. לבצע פרופיל תעתיק באמצעות שבבי מערך מסחריים זמינים אדם. להכנת יעד RNA, פיצול, הכלאה 34 ומערךצביעת שבב, ערכות זמינות מסחריות כביסה 35 שימוש.
  2. בצע סריקת שבב מערך ובדיקת בקרת איכות באמצעות תחנת fluidics הסטנדרטי, סורקי מערך ותוכנות הפעלה סטנדרטית 36. לניתוח ביטוי גנים לייבא הקבצים שנוצרו מסורקים לתוכנות מסחריות זמינות סטנדרטי 37, לבצע תיקון רקע, סיכום ונורמליזציה עם Multi-מערך חזק ניתוח (RMA).
  3. לקבלת רשימה של גנים הביעו באופן דיפרנציאלי (של DEG) לבצע ניתוח ANOVA דרך אחת. מרשימה זו לסנן את הגנים המבוססים על שינוי הקיפול (± 2) ו- P-הערך שבשליטת רוזוולט (<0.05). השג את מנהל רכיב ניתוח (PCA), חום מפה, וכו 'באמצעות תוכנה זו.

מערכת מבחן 2. UKN חלק 1

1. תחזוקה של hESC

  1. זריעה של MEFs
    1. לבידול להשתמש # NSCB 8534 שורת תאים (H9). ce תרבותLLS על fibroblasts העכבר העוברי (MEFs) כמו תאים מזינים. בקבוק T25 מעיל עם 4 מיליליטר של ג'לטין 0.1% ו דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. MEFs הפשרה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהעביר את התאים לתוך FBS / 10% מראש חימם DMEM.
    3. ספין 3.5 דקות עם 500 XG, להסיר supernatant מחדש להשעות תאים להשיג 1 x 10 7 תאים / מיליליטר. MEFs צלחת 4 x 10 4/2 סנטימטר בצלוחיות T25 בג'לטין. לחלופין, להשתמש בMEFs לימים הבאים. איכות של קבוצות MEF היא נושא מאוד קריטי עבור תחזוקת hESC. לכן מומלץ להבהיר את החברה הטובה ביותר ושיטת הכנה לתאי H9. אנו משתמשים בPMEF P3.
  2. פיצול ותחזוקה של H9
    1. להוסיף dispase מראש חימם 1 מיליליטר לכל בקבוק T25 H9 דגירה 9 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. הוסף 2 מיליליטר לשטוף בינוני עד dispase תאים שטופלו וpipet 5 פעמים למעלה ולמטה עם pipet 5 מיליליטר ופתרון תא העברה לצינור בז.
    3. לשטוף את הבקבוק עם 9 מיליליטר לשטוף בינוניולהוסיף תאים לאחרים. ספין 3.5 דקות עם 500 XG, להסיר supernatant מחדש להשעות תאים בינוניים 10 מיליליטר hESC.
    4. ספין 3.5 דקות עם 500 XG, להסיר supernatant מחדש להשעות תאים בינוניים 4 מיליליטר hESC. הוסף 0.5 מיליליטר השעיה תא ו -4.5 מיליליטר בינוני hESC וצלחת בבקבוק חדש (PBS שטף) T25 עם MEFs. לשנות כל מדיום hESC (5 מיליליטר) של הבקבוק בכל יום.

2. התמיינות של תאי hESC כלפי neuroectodermal אב (NEP)

  1. להכין מדיום hESC ובינוני KCM. מעיל צלחת אחת 10 סנטימטר עם ג'לטין (0.1% ב PBS) לכל בקבוק T25 ודגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הסר בינוני מhESC ולהוסיף מספיק Accutase כדי לכסות את כל החלק התחתון של הבקבוק (1 מיליליטר לכל בקבוק T25) ודגירה 25 עד 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. הכן צלחות מצופים מטריצת קרום במרתף במהלך הדגירה Accutase. להוסיף DMEM / F12 הקר לגלולת מטריצת קרום במרתף קפוא ולפתור אותה 1:20. solu מטריצת קרום במרתף המסנןtion דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. להוסיף פתרון מסונן לצלחת, כל התחתית יש להיות מכוסה (1 מיליליטר ל6-גם נדרש) ודגירה של השעה 2 ב RT.
  3. לאחר תקופת הדגירה להסיר את supernatant הקרום במרתף המטריצה ​​ותאי זרע בבארות המצופים. לאחר שלב Accutase (2.1) לעצור תגובה על ידי תוספת של 1.5 מיליליטר בינוני הס. לגרד תאים מהבקבוק, להוסיף 8 מיליליטר בינוני hESC ולייצר פתרון תא בודד על ידי pipetting עם 10 מיליליטר pipet ביסודיות. תאי סינון דרך מסננת תא 40 מיקרומטר.
  4. תאי ספין 3 דקות עם 500 XG, להסיר supernatant מחדש להשעות תאים ב 10 מיליליטר של hESC. תאי ספין שוב 3 דקות עם 500 XG, להסיר supernatant מחדש להשעות תאים בhESC המכילים מעכבי ROCK Y-27632 בריכוז סופי של 10 מיקרומטר.
  5. הסר supernatant של צלחת מצופה ג'לטין. ההשעיה תא צלחת על צלחת ג'לטין המצופה להסיר את MEFs ולהשאיר בחממה במשך שעה 1 בדיוק.
    הערה: במהלך שלב זה MEFs יהיה שלettle לצלחת הטין מצופה, ואילו hESC לא יכול לצרף ג'לטין. לכן זה חיוני כדי להשיג בידול ללא מזין. זהו צעד קריטי כמו תוצאות דגירה ארוכות מדי בגושים hESC ודגירה קצרה מדי בהסרת יעילה של MEFs. לאחר 45 דקות של דגירה הצלחת יש לחקור לMEFs כבר התיישב וגושי hESC.
  6. כאשר MEFs צירפו, לשטוף בעדינות תאים שאינם חסיד (hESC) את לאחר דגירה עם המדיום כבר בצלחת. אם כמה T25 שימש כדי לקבל יותר תאים, תאים בודדים עכשיו יכולים להיות משולבים. לשטוף צלחת פעם אחת עם מדיום hESC.
  7. תאי ספין 3 דקות עם 500 XG, להסיר supernatant מחדש להשעות תאים בכ -4 KCM מיליליטר מכילים מעכבי ROCK 10 מיקרומטר Y-27632 ו- 10 ng / FGF-2 מיליליטר.
  8. ספירת תאים בhemocytometer באמצעות Trypan כחול. צלחת 18 x 10 3 תאים / 2 סנטימטר על מטריצת קרום במרתף מצופה צלחות בKCM המכיל מעכבי ROCK 10 מיקרומטר Y-27632 ו10 ng / FGF-2 מיליליטר (6 גם להשתמש 1.5 מיליליטר לכל היטב). זה חיוני כדי צלחת התאים בצפיפות הנכונה כדי להבדיל אותם בהצלחה לNEPs.
  9. לאחר 24 שעות, לשנות בינוני עד KCM הטרי המכיל Y-27632 ו- 10 ng מעכב ROCK 10 מיקרומטר / FGF-2 מיליליטר. לאחר שעות 24 נוספות, לשנות בינוני עד KCM הטרי המכיל 10 ng / ml FGF2.
  10. 72 שעות לאחר זריעת התאים, התמיינות מתחילה בשינוי בינוני לכיוון בינוני KSR. נקודת זמן זו נקראת יום של בידול 0 (DoD0). התוספת של חומרי בדיקה אפשרית עכשיו.
  11. על DoD1 וDoD2 הבינוני משתנה בדיוק כמו בDoD0. השינוי בינוני הבא הוא בDoD4 המכיל 25% N2-S ו -75% KSR. בDoD6 הבידול הוא עצר ותאים נקצרים לניתוח.

3. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) של hESC וNEP

  1. הכנת גרעינים
    1. הוסף 500 μl Accutase היטב כל אחד 6 שיש לנתח ודגירה של 25 עד 30 דקות. Couתאי NT בתא נויבאואר באמצעות Trypan כחול.
    2. תאים גלולים בפורמלדהיד 1% בDMEM / F12 לcrosslink. להוסיף טריס pH 7.5 לריכוז סופי של 125 מ"מ אחרי 10 דקות כדי לעצור את crosslink.
    3. תאי ספין 3 דקות עם XG 500 ב 4 ° C, להסיר supernatant מחדש להשעות תאים בקור PBS.
    4. תאי ספין 3 דקות עם XG 500 ב 4 ° C, להסיר supernatant מחדש להשעות תאים ב 1 מיליליטר L1- חיץ x / 1 10 6 תאים.
    5. דגירה של 5 דקות על קרח. ספין 5 דקות עם 800 XG ב 4 ° C, להסיר supernatant מחדש להשעות גרעינים ב 1 מיליליטר L2- חיץ x / 2 10 6 תאים.
  2. שליטת sonication ואיכות
    1. Sonicate כך שברי DNA באורך נ"ב 300-700 נוצרים. ספין דקות 1 עם 10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. העברת supernatant לצינור חדש. שברים צריכים את הגודל הנכון, אחרת immunoprecipitation יהיה לא יעיל, כמו גם qPCR אחריו.
    2. הסר 50 μlתמהיל ד עם חיץ L2 50 μl כדי לבדוק את יעילות של sonication על ידי הפעלת agarose ג'ל.
    3. הפוך crosslink על ידי דגירה על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות ו- 500 סל"ד. דגימות 1 טען: 5 עם צבע הכתום טעינת G על ג'ל agarose 1.5% ולהפעיל 45 דקות ב 110 V במאגר 1x TBE. גודל שבר שליטה (צריך להיות בין 300-700 נ"ב).
  3. Immunoprecipitation הכרומטין
    1. לדלל דגימות 1: 5 במאגר הדילול וaliquot 1 מיליליטר לIP בצינורות siliconized.
    2. הסר 5% (נפח) ממדגם המדולל הכרומטין (צעד 3.3.1) וחנות ב 4 ° C כמו "קלט".
    3. דגירה דגימות עם נוגדנים על פי בחירתך ועם נוקבים IgG O / N ב 4 ° C על הכתף.
    4. הוסף 50 חלבון-μl חרוזים / G Sepharose לכל דגימה לאחר immunoprecipitation. דגירה דגימות 3 שעות ב 4 ° C על הכתף. ספין 1 דקות עם 1,500 XG ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatant.
    5. לשטוף עם חרוזים כביסה 1 מיליליטר. ספין 1 דקות עם 1,500 XG ב4 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatant. ז חזור על השלב לשעות. לשטוף עם 1 מיליליטר כביסה חיץ סופי. במהלך שלבי הכביסה אתה לא צריך לאבד את כל חרוזים, כי זה משנה את כמות eluate ישירות.
    6. צנטריפוגה 1 דקות עם 1,500 XG ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatant. הוסף חוצץ elution 125 μl דגירה 15 דקות עם 65 מעלות צלזיוס ב 1000 סל"ד על שייקר.
    7. ספין 1 דקות עם 1,500 XG ולהעביר supernatant לk חדש חזור על צינור צעד ואני. הוסף 200 חיץ elution μl לקלט (3.3.2). הוסף proteinase K וRNase לכל דגימה ודגירה 30 דקות עם 37 מעלות צלזיוס ב 500 סל"ד על שייקר ולאחר מכן 4 שעות עם 65 מעלות צלזיוס ב 500 סל"ד על שייקר.
      הערה: לשימוש מסחרי מיצוי DNA שבב זמין DNA הנקי ומרוכז קיט 38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

חשיפה מתיל-כספית במערכת בדיקת UKK

Assay cytotoxicity בוצע עם H9 EBS להשיג IC 10 ערך (הפחתה של כדאיות של 10%) לרעיל של כספית מתיל (איור 1). אנחנו גם ביצענו מחקר סמן ביולוגי המבוסס microarray (פלטפורמת Affymetrix). H9 EBS נחשף מתיל-כספית (0.25 ו 1 מיקרומטר) במשך 14 ימים. ביום 14, דגימות נאספו באמצעות TRIzol ו- RNA היה מבודד. פרופיל תעתיק בוצע באמצעות הגנום האנושי U133 בתוספת 2.0 שבבי מערך. הנתונים כבר נותח עם Partek הגנום Suite TM 6.6. סקירת הנתונים הראשונה הייתה מתקבלת על ידי עיקרון רכיב ניתוח (איור 2 א), דור של דיאגרמות ון (איור 2) ובנייה של מפות חום (איור 2 ג). ניתוח מרכיבי העיקרון מייצג את החלוקה הכוללת של ביטוי גנים וזה ברור דמיין segregני של (איור 2 א) 1 MeHg מיקרומטר מהשליטה ברכב וMeHg 0.25 מיקרומטר קבוצות (PC # 25.2). רשימה של גנים באופן דיפרנציאלי-הביעו (DEG) הושגה לאחר טיפול סטטיסטי (בכיוון אחד ANOVA) וסינון של נתונים באמצעות שינוי חתך חיק ± 2 וp-ערך (Benjamini-הוכברג שיטה) מתוקן ריבוי <0.05 (טבלה 1). טיפול 1 מיקרומטר MeHg הביא 276 DEGs ו0.25 מיקרומטר ביום 31 בDEGs (איור 2). מפת החום הראתה כי טיפול מיקרומטר MeHg 1 בעיקר מופחת ביטוי גנים (איור 2 ג). מידע על תנאי אונטולוגיה גן ייצוג יתר הושג על ידי שימוש בכלי ביואינפורמטיקה DAVID. טבלה 2 מייצגת את קטגוריות גן GO ייצוג יתר משמעותי שהכילו יותר מ 5 גנים. גורמי השעתוק למטה מוסדר הקשורים להתפתחות מערכת העצבים זוהו. SEPP1, DDIT4, AK4, FRZB (התפתחות מוח), PITX (פיתוח גרעין עצבי) וERBB3, UGT8, apoB, APOA1 (פיתוח מערכת עצבים) היו למטה מוסדר באופן תלוי מינון לטיפול מתיל-כספית (לוח 3).

מערכת בדיקה 1 UKN

פרוטוקול בידול זה משתמש inhibiton Smad הכפול 6 כדי ליצור אוכלוסייה טהורה של NEP בתוך שישה ימים של בידול. התאים כתוצאה מאופיינים בעד-רגולציה של Pax6 גני מבשר העצבי וOTX2. הסמנים של תאי גזע Oct4 וNanog מוסדרים נחלשו במהלך ההתמיינות לכיוון נס ר (איור 3 א). בשל בידול סינכרוני והומוגנית מאוד, אפשר גם לקבל מידע על שינויי היסטון בשלב מוקדם זה של התפתחות. מתאמנים את הפרוטוקול להכרומטין חיסוני ממטרים (שבב) באמצעות התאים או בתחילת בידול או לאחר 6 ימים שלבידול. מתג של אתרי מתילציה באזורי האמרגן של Pax6 וOTX2 ניכר ממחקרים אלה (איור 3). אתרי מתילציה נחקרו היסטון 3 trimethylation יזין 4 (H3K4me3) והיסטון 3 ליזין 27 trimethylation (H3K27me3) היו דינמי מאוד בבידול. גם ברמת חלבון במורד הסדרת Oct4 יכולה להיבחן (איור 4). עד-הרגולציה של Pax6 וסמן תא גזע העצבי Nestin נצפו על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence על רמת חלבון (איור 4). אוכלוסיית התאים הראתה בידול הומוגנית וטהור לאחר שישה ימים של בידול. לכן התרבויות יכולות לשמש בקלות לניתוח של RNA וחלבון. המערכת מספקת גם את האפשרות לבדוק את חומרים ואת ההשפעה שיש להם על התפתחות עצבית מוקדמת 16,29.

"איור איור 1. Cytotoxicity Assay (בידול H9) לMeHg. Assay שבוצע כאמור בפרוטוקול להגדיר IC 10 הערך עבור מתיל-כספית.

איור 2
איור 2. ניתוח נציג של גני ההפרש הביע הנגרמים על ידי 0.25 ו1 מיקרומטר MeHg לאחר היישום של מערכת בדיקת UKK. טופלו hESCs עם 0.25 ו 1 מיקרומטר MeHg לפי שיטת בדיקת UKK. ניתוח של את ההפרש הביע תמלילים בEBS הבדיל של 14 יום שבוצע באמצעות תוכנת Partek הגנום Suite TM 6.6. ניתוח עיקרי רכיב (3-Dimenional) של נתוני microarray (). תרשים (ב) ן המתקבל מניתוח microarray של ביטוי גנים. התרשים מציג את מספרגנים מווסת על ידי טיפול MeHg (שינוי קיפול> ± 2, ערך P <0.05). (ג) באשכולות היררכי של נתונים ביטוי גנים (לקפל שינוי> ± 2, ערך P <0.05). גנים הביעו מאוד בקבוצת שליטה ברכב מודחקים על ידי טיפול MeHg 1 מיקרומטר. טיפול 1 מיקרומטר MeHg הביא 233 תמלילים עם ביטוי נמוך ו -43 בדיקות עם ביטוי גבוה כמו להשוות לקבוצת שליטה ברכב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. ביטוי גנים ודפוס מתילציה היסטון במהלך בידול מhESC הכיוון נס ר. לכל הניסויים, hESC הובדלו לתאים מבשר neuroectodermal (NEP). דוגמאות (א) נלקחו בדאיי 6 של בידול, ותמליל רמות של גני סמן של בידול עצבי נקבעו על ידי RT-qPCR. נתונים (ביטוי גנים ביחס לhESC) הם אמצעי ± SEM של 5 ניסויים. דוגמאות (ב) לimmunoprecipitation הכרומטין (שבב) נערכו ביום 6 של בידול. השבב בוצע עם נוגדנים ספציפיים לH3K4me3 או H3K27me3 או IgG שליטה. גורמי ההעשרה של רצפי אמרגן ניתנים כקלט% עבור H3K4me3 (אפור) וH3K27me3 (שחור). הנתונים הם אמצעי ± SEM של 3 הכנות תא עצמאיות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. ביטוי חלבון בבידול מhESC כלפי NEP. תאים קובעו ונצבעו עבור הסמן בתאי גזעOct4 (ירוק) ביום 0 בידול (DoD0) ולPax6 NEP סמנים (אדום) וNestin (ירוק) ביום 6 של בידול (DoD6). בר סולם עולה 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלת 1
רשימת טבלה 1. של גנים הביעו באופן דיפרנציאלי (> ± 2 קיפול, ערך P <0.05) של טיפול MeHg לעומת שליטה ברכב בישן EBS 14 היום. אנא לחץ כאן לצפייה בטבלה זו.

רשימת טבלה 2. קטגוריות GO מועשרים באופן משמעותי ונבחרו (ערך P <0.05,> 5 גנים) עם טראן dysregulatedתסריטים לMeHg לעומת שליטה ברכב בישן EBS 14 היום.

GO טווח רוזן ערך P גנים
תקנה של אפופטוזיס 18 .0068 ARHGEF3, TBX3, ERBB3, MITF, BNIP3, CDH1, IGF2, IFI16, HGF, GCH1, AMIGO2, SERPINB9, KRT18, MSX1, ETS1, VEGFA, עבריין, IGFBP3
תקנה של התפשטות תאים 17 .0123 RBP4, לין, TBX3, ERBB3, MITF, IGF2, KDR, RERG, MSX1, ADM, ETS1, VEGFA, BNC1, ADAMTS1, FABP1, IGFBP3, FIGF
פיתוח כלי דם 12 0.0001 פלאט, apoB, HAND1, TBX3, EPAS1, FOXF1, LEPR, VEGFA, COL3A1, לקס, FIGF, KDR
פיתוח מערכת שלד ng> 12 0.0008 RBP4, MSX1, LGALS3, TBX3, HOXB6, COL3A1, STC1, IGF2, POSTN, FRZB, IGFBP3, AHSG
פיתוח לב 11 0.0001 RBP4, ACTC1, MSX1, HAND1, TBX3, ADM, PKP2, ERBB3, GATA6, COL3A1, ADAMTS1
תהליך חילוף חומרים של גלוקוז 9 0.0003 PDK1, RBP4, LDHA, PGM5, PYGL, HK2, PFKP, IGF2, PGK1
פיתוח ריאות 7 0.0008 RBP4, EPAS1, GATA6, FOXF1, VEGFA, לקס, KDR
פיתוח אפיתל 7 .0386 F11R, FREM2, GATA6, FOXF1, VEGFA, DSP, KDR
פיתוח המזודרם 5 .0088 HAND1, TBX3, FOXF1, VEGFA, SNAI2
lways "> טבלה 3. רשימה של באופן משמעותי את מוסדר תמלילים הקשורים למערכת עצבים התפתחותית עם טיפול MeHg בישן EBS 14 היום.

טווח גן סמל מקפלים שינוי *
0.25 מיקרומטר MeHg לעומת VC 1 מיקרומטר MeHg לעומת VC
התפתחות מוח SEPP1 -2.17 -4.13
DDIT4 -1.20 -3.11
AK4 -1.41 -3.08
FRZB -1.29 -2.19
פיתוח גרעין עצבי PITX2 -2.08 -4.90
פיתוח מערכת עצבים ERBB3 -1.86 -2.89
UGT8 -1.67 -2.14
ApoB -3.59 -5.72
APOA1 2.63 -2.90
VEGFA -1.28 -3.06

* ערך p <0.05

הרכב 4. שולחן של תקשורת בתרבות.

<td> אינסולין
מס 'האב בינוני / שם מאגר הרכב
הסכום
1 MEF בינוני גלוקוז הגבוה DMEM
FCS 10%
פניצילין 100 יחידות / מיליליטר
סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מיליליטר
L-גלוטמין 2 מ"מ
2 H9 תרבות בינוני DMEM F12
KOSR 20%
NEAA 1%
Glutamax 1x
β-mercaptoethanol 0.1 מ"מ
פניצילין 100 יחידות / מיליליטר
סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מיליליטר
bFGF 4 ng / ml 3 RD בינוני מדיום תרבות H9 ללא bFGF
4 לשטוף בינוני DMEM / F12
נוק סרום Replacment 20%
1x Glutamax 1x
חומצות אמינו לא חיונית ממ
HEPES 15 מ"מ
β-mercaptoethanol 90 מיקרומטר
5 KCM בינוני DMEM
FBS 10%
טופח במשך 24 שעות בMEFs
6 נוק סרום
החלפה (KSR)
החלפת סרום נוק 15%
1x Glutamax
חומצות אמינו לא חיונית 1x ממ
β-mercaptoethanol 15 מיקרומטר
גולגולת 35 ng / ml
Dorsomorphin 600 ננומטר
SB431542 10 מיקרומטר
7 N2-S DMEM / F-12
Apotransferin 100 מיקרוגרם / מיליליטר
גלוקוז 1.55 מ"ג / מיליליטר
פוטרסין 10 מ"מ
סלניום 500 מיקרומטר
Progesteron 20 מיקרומטר
Glutamax 200 מיקרומטר
25 מיקרוגרם / מיליליטר
8 L1 מאגר pH טריס 8 50 מ"מ
EDTA 2 מ"מ
NP-40 0.10%
גליצרול 10%
9 L2 מאגר pH טריס 8 50 מ"מ
EDTA 10 מ"מ
SDS 1%
10 הצפת elution NaHCO 3 100 מ"מ
SDS 1%
11 הצפת לשטוף טריס 20 מ"מ
EDTA 2 מ"מ SDS 0.10%
NP-40 0.50%
NaCl 150 מ"מ
12 סופי הצפת לשטוף טריס 20 מ"מ
EDTA 2 מ"מ
SDS 0.10%
NP-40 0.50%
NaCl 500 מ"מ
13 תאי גזע בינוני בינוני בסיסי mTESAR TM 400 מיליליטר
תוספת mTESAR TM 100 מיליליטר

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

גישות מסורתיות לבדיקה טוקסיקולוגית כרוכות מחקרים בבעלי חיים רבים ובכך בדיקה יקרה וגוזל זמן. יתר על כן, בשל הבדלי interspecies המחקרים פרה-קליניים בבעלי החיים בטיחות לא תמיד תקפים לחזות השפעות רעילות של תרופות פוטנציאליות רלוונטיות לבני אדם. למרות פרימטים לא אנושיים הם צפויים ביותר, עדיין חזקים אתיים, ודרישות socioeconomical במהירות העלאה על ידי חברות מודרניות לפיתוח רגיש וחזק במבחן מבחנה מערכת רלוונטית לבטיחות אדם.

היכולת הייחודית של hESCs להתמיין לכל סוגי התאים סומטיים, ולכן משחזרת in vivo תהליכים התפתחותיים אנושיים בשילוב עם גישות toxicogenomics רגישות הוצע כחלופה לגישות המסורתיות לבדיקת בטיחות תרופה 6,21. במסגרת הפרויקט 'ESNATS' מערכת הבדיקה 'UKK' פותחה כדי לחזותהרעילות העוברית התפתחותית המבוססת על פרופיל transcriptomics. במערכת זו hESC כבר הבדיל לגופי embryoid במשך 14 ימים. פרופיל transcriptomics הקינטית הזמן מתקבל תערוכות ביטוי גבוה של סמן הבידול ספציפי לשלושה האאקטודרם שכבות נבט, האנדודרם והמזודרם ביום 14 באופן חלקי לשחזר התפתחות עוברית אנושית מוקדמת. בהתבסס על תוצאות אלו, תרופות טרטוגניות ידועות נחשפו במהלך התמיינות במשך 14 ימים ופרופיל גנטי ההפרש הביע התקבלו. מרשים, חתימות גן הקשור להשפעות טרטוגניות של תלידומיד נצפה בבני אדם, יכולות להיות שחזו מערכת בדיקה זו 28. תוצאות הנציג מתיל-כספית ברגולציה ריכוז תלוי במורד הצג מערכת UKK של גורמי שעתוק הקשורים להתפתחות מערכת העצבים. נוירו-התפתחותית הרעלים האחרים גם נבדקו במערכת זו ומאמצים הולכים על לזהותtoxico-הסמנים הנפוצים על פני התרכובות ברמת ה- mRNA ולאמת אותם ברמת החלבון. פרוטוקול בדיקת UKK ניתן כאן נותן הנחיה בסיסית לביצוע הניסוי עם H9 בתאי גזע עובריים האנושי לזהות את חתימת transcriptomic לtoxicant התפתחותית.

ההליך מותאם הסטנדרטי הפעולה (SOP) להתמיינות של תאי גזע pluripotent על פי פרוטוקול UKN1 מאפשר בידול חזק ומסונכרן של hESC לנס ר. כבר לאחר שישה ימים של בידול, אוכלוסיית תאים הומוגנית עם רמות ביטוי הגבוה Pax6 נוצרה. התאים לגדול בתרבויות חסיד, המאפשרות ניתוח על ידי immunostaining. ניתוח Immunocytochemical עם רזולוציה גבוהה ועל ידי מיקרוסקופ confocal דורש שתאים גדלים על משטחי זכוכית דקים. זה אפשרי לתרבויות אלה אם הזכוכית מצופה בצורה אופטימלית, אבל זה צריך להיות מוזכר שהתאים לגדול מאוד צפופים, בשכבה אחת יותר מפעם אחתלאחר שישה ימים. לכן, ניתוח שיגרתי של סמני שושלת ספציפית מתבצע בקלות רבה יותר על ידי RT-qPCR, שבב או כתם מערבי. יתרון גדול לאנליזה ביוכימית של התרבויות הוא התשואה הגבוהה של תאים אשר יכול להיות מושגת על ידי פרוטוקול בידול זה מהתחלת אוכלוסייה קטנה של hESC. חסרון אחד של פרוטוקול זה הוא העלות הגבוהה של התוספים בינוניים (לדוגמא, שהגולגולת) נדרשים על מנת לאלץ את הבידול העצבי הומוגנית. חסרון נוסף עבור יישומים מסוימים יכול להיות שכמה מולקולות קטנות (מעכבי קינאז) צריכים להיות נוכח במדיום התרבות כחלק מהפרוטוקול. לפיכך, לא ניתן בדקו מסלולי אות מסוימים toxicologically, כשינוי של תנאי התרבות גם משנה את הבידול 29.

היתרון של שילוב מערכת בדיקה הוא ההבנה טובה יותר של DNT. בעוד UKK מכסה מגוון רחב יותר והשפעה שלילית על היווצרות שכבת נבט מוקדמת יכול להיחקר, UKN1 כלOWS לחקור יותר מנגנונים עצביים ספציפית כגון אפיגנטיקה. למרות ששתי מערכות התרבות שהוצגו כאן הוכחו לחזות ברעילויות התפתחותית לכמה מודל רעלי 16, עדיין יש צורך בגרסאות גבוהות יותר תפוקה של הפרוטוקולים המאפשרים הקרנה של מספר גדול של neurotoxicants התפתחותיות הפוטנציאלי. יתר על כן, נדרשת עבודה רבה יותר לזהות ולאמת סמנים משותפים של רעילות ברמת ה- mRNA או חלבון, ולהקים אותם כחלק מהערכת בטיחות תרופה פרה-קלינית.

יותר מ -20 מליארד דולרים לשנה הושקעו על ידי התעשיות פרמצבטיות לגילוי תרופות 39. כהוכחה של מושג, שפיתחנו במערכות מבחנה רעילות מבחן מבוססות על hESC וtranscriptomics שעשויה להיות מתאימים לחיזוי השפעות אנושיות רלוונטיות רעילות של תרכובות אפשריות לתרופה באופן חסכוני ופחות זמן רב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F-12 Life Technologies 11320082 Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12
KOSR Life Technologies 10828028 Knockout Serum Replacement
GlutaMAX Life Technologies 35050061 GlutaMAX supplement
NEAA Life Technologies 11140050 MEM Nonessential Amino Acids Solution
DPBS Life Technologies 14190-0144 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium
mTeSR medium Stemcell Technologies 5850
Pluronic F-127 Sigma P2443-250G
V bottom plate VWR 734-0483 Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST
V bottom plate lid VWR 634-0011 Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST
Pen/Strep Life Technologies 15140-122 Penicillin-Streptomycin, Liquid
Distilled Water Life Technologies 15230-089. Sterile Distilled Water
Human FGF-2 (bFGF) Millipore GF003AF-100UG Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free
Filter 0.22 μm Millipore SCGPU02RE Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized
StemPro EZPassageTM Disposablte Invitrogen 23181010
BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix Stemcell Technologies 354277 5 ml vial
DMSO Sigma D-2650
RNAlater Stabilization Solution Life Technologies AM7020 It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples.
70 μm Cell Strainer Becton Dickinson 352350 Cell strainer with 70 μm Nylon mesh
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube Becton Dickinson 352235 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm)
50 ml sterile Polypropylene tube Greiner Bio-One 227261 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile
T75 flask Greiner Bio-One 658175 CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks
TRIzol Life Technologies 10296010
96 well optical bottom plates Thermo Scientific 165305
CellTiter-Blue Promega G8081
Accutase PAA L11-007
Apotransferin Sigma-Aldrich T-2036
Dispase Worthington Biochemicals LS002104
Dorsomorphin Tocris Bioscience 3093
EDTA Roth 8043.2
FBS PAA A15-101
FGF-2 R&D Systems 233-FB
Gelatine Sigma-Aldrich G1890-100G
Glucose Sigma-Aldrich G7021-100G
GlutaMAX Gibco Invitrogen 35050-038
HEPES Gibco Invitrogen 15630-056
Insulin Sigma-Aldrich I-6634
Knockout DMEM Gibco Invitrogen 10829-018
Matrigel BD Biosciences 354234
Noggin R&D Systems 719-NG
PBS Biochrom AG L1825
Progesteron Sigma-Aldrich P7556
Putrescine Sigma-Aldrich P-5780
ROCK inhibitor Y-27632 Tocris Biosciences 1254
SB431542 Tocris Biosciences 1614
SDS Bio-Rad 161-0416
Selenium Sigma-Aldrich S-5261
β-Mercaptoethanol Gibco Invitrogen 31350-010
Name Company Catalog Number Comments
List of Kits
RNeasy Mini Kit (250) QIAGEN 74106
GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit Affymetrix 900721, 22, 23 This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays.
Rnase-Free DNase Set QIAGEN 79254
Name Company Catalog Number Comments
List of equipment
Inverted microscope Olympus IX71
Genechip Hybridisation Oven - 645 Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450 Affymetrix
Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G Affymetrix
Spectramax M5 Molecular Devices
 
 
 
Name Company Catalog Number Comments
List of softwares
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Online tools for Functional annotation
DAVID
Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27, (1), 17-27 (2013).
  2. Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceutical Biotechnology. Current Pharmaceutical Biotechnology. 12, (11), 1760-1773 (2011).
  3. Leist, M., Hartung, T., Nicotera, P. The dawning of a new age of toxicology. ALTEX. 25, (2), 103-114 (2008).
  4. Kuegler, P. B., et al. Markers of murine embryonic and neural stem cells, neurons and astrocytes: reference points for developmental neurotoxicity testing. ALTEX. 27, (1), 17-42 (2010).
  5. Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. (2014).
  6. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, (3), 275-280 (2009).
  7. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16, (1), 118-126 (2014).
  8. Zimmer, B., et al. Evaluation of Developmental Toxicants and Signaling Pathways in a Functional Test Based on the Migration of Human Neural Crest Cells. Environmental Health Perspectives. 120, (8), 1116-1122 (2012).
  9. Bosman, A., et al. Molecular and Functional Evidence of HCN4 and Caveolin-3 Interaction During Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells and Development. 22, (11), 1717-1727 (2013).
  10. Sartiani, L., et al. Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach. Stem Cells. 25, (5), 1136-1144 (2007).
  11. Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation. 76, (9), 958-970 (2008).
  12. Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115, (2), 200-206 (2013).
  13. Subramanian, K., et al. Spheroid Culture for Enhanced Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-Like Cells. Stem Cells and Development. 23, (2), 124-131 (2014).
  14. Sivertsson, L., Synnergren, J., Jensen, J., Bjorquist, P., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells Cultured in a Perfused Three-Dimensional Bioreactor. Stem Cells and Development. 22, (4), 581-594 (2013).
  15. Jagtap, S., et al. Cytosine arabinoside induces ectoderm and inhibits mesoderm expression in human embryonic stem cells during multilineage differentiation. British Journal of Pharmacology. 162, (8), 1743-1756 (2011).
  16. Krug, A. K., et al. Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach. Archives of Toxicology. 87, (1), 123-143 (2013).
  17. Leist, M., et al. Test systems of developmental toxicity: state-of-the art and future perspectives. Archives of Toxicology. 87, (12), 2037-2042 (2013).
  18. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Molecular medicine. 6, (2), 88-95 (2000).
  19. Khoo, M. L. M., et al. Growth and differentiation of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells: Effect of glucose and basic fibroblast growth factor. Biology of Reproduction. 73, (6), 1147-1156 (2005).
  20. Son, M. Y., Kim, H. J., Kim, M. J., Cho, S. Physical Passaging of Embryoid Bodies Generated from Human Pluripotent Stem Cells. Plos One. 6, (5), (2011).
  21. Winkler, J., Sotiriadou, I., Chen, S., Hescheler, J., Sachinidis, A. The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology. Current medicinal chemistry. 16, (36), 4814-4827 (2009).
  22. Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17, (8), 759-766 (2010).
  23. Miller, M. T., Stromland, K. Teratogen update: Thalidomide: A review, with a focus on ocular findings and new potential uses. Teratology. 60, (5), 306-321 (1999).
  24. Newman, C. G. H. Teratogen Update - Clinical Aspects of Thalidomide Embryopathy - A Continuing Preoccupation. Teratology. 32, (1), 133-144 (1985).
  25. Stern, L. In vivo assessment of the teratogenic potential of drugs in humans. Obstetrics and gynecology. 58, (5 Suppl), 3S-8S (1981).
  26. Lynch, H. T., Reich, J. W. Diethylstilbestrol, Genetics, Teratogenesis, and Tumor Spectrum in Humans. Medical Hypotheses. 16, (3), 315-332 (1985).
  27. Satoh, H. Behavioral teratology of mercury and its compounds. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 201, (1), 1-9 (2003).
  28. Meganathan, K., et al. Identification of Thalidomide-Specific Transcriptomics and Proteomics Signatures during Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Plos One. 7, (8), (2012).
  29. Balmer, N. V., et al. Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome. Human Molecular Genetics. 21, (18), 4104-4114 (2012).
  30. Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M., Hartung, T. Developmental neurotoxicity - Challenges in the 21st Century and In Vitro Opportunities. ALTEX. 31, (2), 129-156 (2014).
  31. Leist, M., Efremova, L., Karreman, C. Food for thought ... considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX. 27, (4), 309-317 (2010).
  32. Zimmer, B., et al. Coordinated waves of gene expression during neuronal differentiation of embryonic stem cells as basis for novel approaches to developmental neurotoxicity testing. Cell Death and Differentiation. 18, (3), 383-395 (2011).
  33. Experion RNA StdSens Analysis Kit for RNA analysis by Electrophoresis. Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000976B%20%20RNA%20STDSENS%20MANUAL.PDF (2014).
  34. Affymetix GeneChip 3 IVT Express Kit for Target RNA preparation, Fragmentation and hybridization. Available from: http://microarray.csc.mrc.ac.uk/downloads/3'%20IVT%20Express%20Manual.pdf (2014).
  35. Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit. Available from: http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1 (2014).
  36. Affymetrix GeneChip Operating Software. Available from: http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1 (2014).
  37. Partek Genomics Suite. Available from: http://www.partek.com/pgs (2014).
  38. ChIP DNA Clean and Concentrator. Available from: http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/pcr-dna-clean-up-concentration/chip-dna-clean-concentrator (2014).
  39. Kraljevic, S., Stambrook, P. J., Pavelic, K. Accelerating drug discovery. EMBO Reports. 5, (9), 837-842 (2004).
תאי גזע אנושיים pluripotent בהתבסס התפתחותית רעילות מבחני לביולוגיה הקרנה ומערכות בטיחות כימית נתונים דור
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shinde, V., Klima, S., Sureshkumar, P. S., Meganathan, K., Jagtap, S., Rempel, E., Rahnenführer, J., Hengstler, J. G., Waldmann, T., Hescheler, J., Leist, M., Sachinidis, A. Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation. J. Vis. Exp. (100), e52333, doi:10.3791/52333 (2015).More

Shinde, V., Klima, S., Sureshkumar, P. S., Meganathan, K., Jagtap, S., Rempel, E., Rahnenführer, J., Hengstler, J. G., Waldmann, T., Hescheler, J., Leist, M., Sachinidis, A. Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation. J. Vis. Exp. (100), e52333, doi:10.3791/52333 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter