Summary
protokoller, insan embriyonik kök hücreleri ve transcriptome çalışmalarına dayalı iki in vitro gelişimsel toksisite test sistemleri (UKK ve UKN1) açıklar. test sistemleri, insan gelişimsel toksisite tehlike tahmin ve hayvan çalışmaları, maliyet ve kimyasal güvenlik testi için gerekli süreyi azaltmak için katkıda bulunabilir.
Abstract
-omics Teknolojiler potansiyel ilaçların in vitro toksisite testleri için yeni ufuklar açtı verimli protokoller arada çeşitli dokularda insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek. Bu tür tahliller için sağlam bir bilimsel temel sağlamak için, gelişim zamanı seyrine ve sistemler biyolojisi yaklaşımları ile altta yatan düzenleyici mekanizmaları üzerine sayısal bilgiler elde etmek için önemli olacaktır. İki tahlilleri dolayısıyla bu gereksinimler için buraya ayarlandı. UKK test sistemi olarak, insan embriyonik kök hücreleri (HESC) (veya başka bir pluripotent hücreler) kendiliğinden üç germ hücrelerinin üretilmesini sağlamak için, embriyoid organları 14 gün ayırt etmek için bırakılır. Bu sistem, erken insan embriyonik gelişiminin önemli adımlar özetlediği ve hücreler farklılaşma sırasında kimyasallara maruz kalırsanız o, insana özgü erken embriyonik toksisite / teratojenite tahmin edebilirsiniz. UKN1 test sistemi bir populat için ayırt hESC dayanmaktadırnöroektodermal dede iyon (NEP) 6 gün boyunca hücreler. Bu sistem, erken nöral gelişimi özetlediği ve erken gelişim nörotoksisiteyi ve kimyasallar tarafından tetiklenen epigenetik değişiklikler öngörüyor. Her iki sistem de, transcriptome mikrodizi çalışmaları ile kombinasyon halinde, toksisite biyolojik göstergeleri için uygundur. Ayrıca, sistem biyolojisi analiz için veri üretmek için kombinasyon halinde kullanılabilmektedir. Bu test sistemleri, hayvanların büyük miktarlarda gerektiren geleneksel toksikolojik çalışmalar bir çok dezavantajı vardır. test sistemleri, ilaç geliştirme ve kimyasal güvenlik değerlendirmesi için maliyetlerin azalmasına katkıda bulunabilir. Onların kombinasyonu özellikle özel nöro-gelişimsel sürecini etkileyebilir bileşikler ışık tutuyor.
Introduction
hücrelerin çeşitli içine ayırt etmek, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) yeteneği in vitro toksisite testleri 1, hastalık modelleme ve rejeneratif tıp 2 yeni bir dönem açtı. kök hücreler kendini çoğaltmak için kapasite, onların pluripotent devleti korumak için, ve özelleşmiş hücrelere 3,4 içine ayırt etmek için sahiptirler. HESC özellikleri, aynı zamanda, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSC) ya da nükleer transfer 5 tarafından üretilen hücreler gibi diğer insan pluripotent kök hücreleri, bulunan (kapasitesi tüm ana hücre tiplerine ayırt etmek için). Örneğin, birçok farklı HESC hatları hücreler 13,14 gibi nöronlar 6, böbrek hücreleri 7, nöral krest hücrelerinden 8, kardiyomiyositler 9-12 veya hepatositlere ayırt edilmiştir. Dahası, HESC kendiliğinden embriyoid organları (EBS) 19,20 her üç germ 15-18 hücre içine ayırt edebilirsiniz. Early embriyonik gelişim mikro-dizi teknolojisi kullanılarak 15 transkriptomik mRNA düzeyinde yakalandı farklı germ ile ilgili çeşitli genlerin farklı sunum-düzenlenir. Bu çabalar HESC / hiPSC ve transkriptomik analizi (inceleme için 21,22 bakınız) dayalı organa özgü toksikolojik modellerin kurulması ile sonuçlandı. Bu modeller laboratuar hayvanları hep insan güvenliği tahmin değildir kullanarak preklinik çalışmalarda olarak toksikolojik çalışmalar için laboratuvar hayvanlarının geleneksel kullanımı üzerinde avantajları var. hastalarda karşılaşılan ilaca bağlı toksisiteleri genellikle insanlar ve deney hayvanlarında arasında farklılık metabolik veya sinyal süreçleriyle ilgilidir. türler farkı insanlarda gelişimsel toksisite güvenilir erken teşhis engelledi ve bu talidomid 23,24 ve 25,26 olarak dietilstilbestrol örnek ilaçlar nedeniyle teratojenite piyasadan çekildi. Thalidomide sıçan veya farelerde herhangi gelişimsel toksisite göstermemiştir. Örneğin metil civa 27 Çevresel kimyasal maddeler, çeşitli türlerde sinir sistemi ile ilgili prenatal gelişim toksisite sonuçlandı, ancak insan belirtiler hayvanlarda modellemek zor olmuştur. Türlerin özgüllüğü sorunları sorunu çözmek için, farklı projelerde altında çalışan bilim adamları vb şüphelenilen insan toksik atıkları kullanarak embriyonik toksisite, nörotoksisite, kardiyotoksisite, hepatotoksisite ve nefrotoksisite için farklı modellerin geliştirilmesinde başlattık reprotect, ESNATS, dedektif gibi kök hücreleri dayalı insanları etkiler. Avrupa konsorsiyumu projesinde 'Embriyonik Kök hücre tabanlı Roman Alternatif Test Stratejileri (ESNATS)' kapsamında beş test sistemleri kurulmuştur. Bir test sistemi olarak adlandırılan UKK (U niversitäts k linikum K OLN) test sistemi kısmen erken insan embriyonik gelişmeyi yakalar. Bu s olarakistem insan embriyonik H9 hücreleri üç germ (ektoderm, endoderm ve mezoderm) 15 ve germ tabakası belirli imzalar Affymetrix mikroarray platformu kullanarak profil transkriptomik tarafından esir edilmiş olarak ayrılır. Talidomid 28, valproik asit, metil cıva 16,17 veya sitosin arabinosid 15 gibi çeşitli gelişimsel toksik maddeler bu sistemde test edilmiştir ve zehirli spesifik gen imzalar elde edilmiştir. Ikinci bir test sisteminde, bu nedenle test sistemi 1 UKN1 (K onsta n = U niversity) olarak adlandırılan, H9 hücreleri 6 gün süreyle nöroektodermal projenitör hücreleri (NEP) ile ayrılır. Bu tür Pax6 ve OTX2 olarak nöral gen belirteçleri yüksek ifadesi ile belirlenir. Farklılaşma sırasında 6 gün, NEP hücreler gibi VPA, metil cıva gibi gelişimsel nöro-toksik maruz kalmıştır. Zehiri özgü de regüle transkriptomik profilleri obtai olmuşturAffymetrix mikroarray platformu 16,29 ile de tanımlanır.
21. yüzyılın toksikoloji için yeni bir vizyon test sistemleri uzun vadeli toxicant inkubasyon sonunda in vivo histopatolojik veya transcriptome değişiklikleri gibi fenotipik açıklamaları verim yapmak değil sadece öngörmektedir. Daha çok tahliller mekanistik bilgi 3. sağlamak ve bu bilgilerin sözde eşlenebilir düşündürmektedir olumsuz sonuç yolları (AOP) zararlı etkilerinden 30 için bilimsel gerekçe sağlamak. Bu tür bilgi vermek, uygulamalı test sistemleri yüksek kaliteli sağlam standart operasyon prosedürlerine göre belgelenmiş örneğin olarak, 31 kontrol edilmesi gerekiyor. Ayrıca, zaman-bağımlı değişiklikler yüksek çözünürlüklü eşlenmesi gerekir. Bu senkronize değişikliklerle 32 test sistemlerini gerektirir. Burada anlatılan UKN1 ve UKK test sistemleri bu gereksinimleri için optimize edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokol, insan embriyonik kök hücre hattı (HESC) H9 kullanılarak gerçekleştirildi. Bu hücre hattı rutin olarak HESC kültür ortamı mitotik inaktive fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) bFGF ile takviye edilmiş ve MEF'ler kurtulmak için, örneğin matrigel olarak bazal membran matris ile kaplanmış 6 cm Petri kapları kök hücre ortamda kültür üzerinde kültürlenmiştir. >% 80 konfluent plakalardan H9 hücreleri daha geçişi için kullanıldı. Bazal membran matrisi plakaları üzerinde kültürlendi H9 hücreleri EBS oluşumu için kullanılmıştır. Aşağıdaki protokolde belirtilen tüm işlemler aseptik ve iyi hücre kültür uygulamaları için, standart yöntemler kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
Bölüm 1. UKK testi Sistemi
1. İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürleme
- Yarma ve besleyici hücreler H9 bakımı
- Her bir 6 cm plaka pipetleyin 2 mi,% 0.1 jelatin ve hücre kültürü inkubasyondan 30 dakika boyunca inkübeator (37 ° C ve% 5 CO2). Steril Pasteur pipeti ile aspire jelatin çözüm.
- Iki jelatin kaplı plakalara 0.1 x 10 6 MEF hücre / ml ihtiva eden 2 mi MEF ortamı ilave edin ve hücre kültürü inkübatör (37 ° C ve% 5 CO2), O / N inkübe.
- Bir sonraki gün, forseps kullanılarak H9 hücreleri, sıvı azot depolama tankı arasında şişe çıkarın ve uzun forseps kullanılarak 37 ° C su banyosu içinde şişe çözülme.
- 15 ila 30 saniye için biyogüvenlik kabini su banyosu,% 70 etanol ile banyo onu, kuru hava gelen flakon çıkarın ve 15 ml şahin tüp hücreleri aktarın.
- 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri yavaş iç duvarında H9 kültür ortamının 9 ml ilave edilir ve santrifüj.
- Süpernatant aspire ve kaya inhibitörünü ihtiva eden 6 ml kültür ortamı içinde hücre (10 uM, Y27632) ile karıştırmak için hafifçe pipet yeniden askıya. Aspire MEF 6 cm plaka, orta ve her bir plaka içerisinde 3 mi hücre süspansiyonu ekleyin. D orta değiştirin3 ve daha sonra her gün ay. Bölünmüş oranı ile Altkültür>% 80 birleşen plaka hücreleri 1: 3.
Not: Genellikle 5-7 günlük plaka konfluent hale gelir. Kullanılan Besleme CF1 fare embriyo elde edilmiş ve radyasyon γ maruz bırakılarak etkisiz hale getirildi.
- Bazal membran matrisi kaplanmış plakalar üzerinde H9 hücre kültürü
- Çözülme kök hücre ortamı (5x) oda sıcaklığında ek ve biyogüvenlik kabini, 100 ml, 400 ml içine bazal orta ekleyin.
- Buz üzerinde çözülme bazal membran matrisi. Bazal membran matris önerilen hacim ekleyin oniki 6 cm plakalar için DMEM / F-12 bazal ortam soğutulmuş 24 ml (her parti için analiz sertifikası bakınız). Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
- Her bir 6 cm plaka 2 ml ilave edilir. 1 saat boyunca oda sıcaklığında plaka tutun. Orta çıkarın ve kök hücre orta 2 ml ekleyin.
- MEF'lerden dört konfluent H9 plakalarını çıkartın. Biyogüvenlik kabini tutulan stereomicroscope altında 1 ml pipet ile farklılaşmış koloniler çıkarın.
- Solukluorta ve 4 ml PBS ile hücrelerin yıkayın ve her bir plaka hücre ortamı kök ml 2 ekleyin. 6 ila 9 adet her 26 G iğne ile farklılaşmamış koloniler kesin.
- Yavaşça, 50 ml Falcon tüpü içine hücreleri toplamak. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı aspire ve hücre ortamı kök ml 12'de yeniden askıya. Mikroskop altında cam slayt 20 ul koyarak kümeleri sayın ve ml başına 150 kümeleri için ses seviyesini ayarlamak. Her bir 6 cm plaka içinde süspansiyon 2 ml ilave edilir.
- Tekdüze yığın dağıtımı için geri ve ileri-ve yan-yan hareketleri plakaları Taşı ve hücre kültürü inkübatör (37 ° C ve% 5 CO 2) plakaları kuluçkaya yatmaktadır.
- Farklılaşmış koloniler çıkarın ve orta değiştireceğim her alternatif gün verin.
2. Embriyoid Oluşumu (EBS) Oluşumu
Aseptik önlemler başına ve biyogüvenlik kabini aşağıda belirtilen tüm prosedürü uygulayın.
- Gün 0 & #8212; V tabanlı plakalar üzerinde H9 hücrelerinin Kaplama
- Böyle PBS Pluronik F 127 olarak% 5 blok kopolimeri hazırlayın ve 0.22 mikron steril filtre kullanılarak vakum tahrikli filtrasyon sistemi ile filtre.
- Oyuk başına% 5 blok kopolimerinin 40 ul 96 gözlü mikrotitre plaka kiti taban ve 45 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe kaplayın V.
- Inkübatör H9 hücreleri ile birleşen bazal membran matris plakaları çıkarın ve biyogüvenlik kabini stereomicroscope altında 1 ml pipet ile farklılaşmış koloniler çıkarın.
- Orta aspire ve 4 ml hücrelerin PBS ile yıkayın. Her plakada (bFGF, RD orta olmadan H9 kültür ortamı) 2 ml rasgele farklılaşma ortamı ekleyin. Geçit aracını kullanın ve biyogüvenlik kabini stereomicroscope altında gözlemleyerek üniforma boyut ve şekil yığınlarda H9 hücre kolonilerini kesmek ve daha sonra yavaşça hücre kazıyıcı ile kazıyın.
- 5 dakika boyunca 200 x g'de 50 ml Falcon tüpüne ve santrifüj kümeleri toplayın. Süpernatantı aspire ve cel yeniden askıyaRD ortamında l ml başına 1.000 kümeleri olsun.
- V alt plakalar blok kopolimer aspire. Steril köşeli plaka yığınları dökün ve çok kanallı bir pipet yardımı ile V tabanlı plakanın her oyuğuna süspansiyonu 100 ul ilave edin.
- Kümeleri kuvveti agregasyonu için, santrifüj, 400 x g, 4 dakika boyunca 4 ° C 'de V tabanlı plakalar. Dört gün hücre kültürü inkübatör (37 ° C ve% 5 CO2) 'de inkübe edin.
- 4. Gün - EBS Koleksiyonu
- Çok kanallı pipet ve geniş delik 200 ul ipuçlarını kullanarak V alt plakalar steril kare plakasındaki EBS toplayın.
- 10 ml steril serolojik pipet 15 ml şahin tüp steril kare plaka EBS toplayın. EBS 2 dakika yerleşmek için izin verin. Süpernatant aspire ve 5 ml PBS ile EBS yıkayın.
- EBS 2 dakika razı ve süpernatant aspire izin verin. 5 ml RD ortamında EBS yeniden askıya.
- 10 cm üzerinden Pipet 10 mi RD ortabakteriyolojik plakalar. 10 cm bakteriyolojik plakalarda EBS aktarın.
- (50 / dak ileri geri hareket) hücre kültürü inkübatör (37 ° C ve% 5 CO2) gerekli zaman süresi için muhafaza yatay çalkalayıcı üzerinde bakteriyolojik inkübe edin. Orta değişim (15 ml RD ortamı) her alternatif gün verin.
Not: Nazik işleme gereklidir hESC kültüre ederken. EBS boyutu ileri bir deney için stereomicroscope altında gözlemleyerek üniforma boyut EBS (±% 20) seçin günde 4. değişir. Bu yöntemle oluşturulan yaklaşık% 50 EBS ölçülen büyüklük dağılımı düzgün vardır. üniforma şeklinde çalkalama sonuçlarına EBS transferi.
3. Sitotoksite Testi IC 10 Belirlenmesi
- Optik alt tabakalarına EBS Transferi
- De çok kanallı pipet kullanılarak 0.1% jelatin, 50 ul 15 dakika ve kılıf optik alt plakalar 37 ° C sıcaklıkta su banyosu içinde% 0.1 jelatin çözülme. Oda sıcaklığında inkübe edin45 dk. Inkübasyondan sonra optik alt plakalar jelatinin aspire.
- RD ortamı içeren 10 cm bakteriyolojik plaka gün 4 toplanan EBS dışarı atın.
- Biyogüvenlik kabini eğimli pozisyonda optik alt tabak tutun. Aktarım stereomikroskop altında gözlemleyerek optik tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 100 ul RD orta EBS iki homojen boyutu. Boş 12. sütunu tutun.
- 24 saat süre ile hücre kültürü inkübatör (37 ° C ve% 5 CO2) 'de inkübe edin.
- 14. günde gün 5 ilaca maruz kalma
- Test bileşiğinin tartılır ve bilinen bir çözücü içinde en yüksek konsantrasyonu yapın.
- Bir tüp tutun, seri H'ye kadar sayılı Falcon tüpleri içeren bir çözücü içinde 8 seyreltileri kadar test bileşiğinin yarı logaritmik seyreltme gerçekleştirin. Ben araç kontrolü, tüp No olarak. J bir negatif kontrol (RD ortamı) ve tüp gibi. (% 70 etanol), kontrol olarak pozitif K.
- 37 ° C'de su banyosu içinde RD orta çözülme15 dakika boyunca ° C. 1-11 etiketli 11 steril şahin tüpler 5 ml RD orta her dışarı atın.
- Transferi 5 sırasıyla 11 tüp 1 tüp K tüp A çözümün ul ve vorteks tüpleri. Inkübatör optik alt plaka çıkarın ve dikkatlice kanallı pipet kullanımı ile ortamı çıkarın.
- Optik alt plaka ilgili sütunlar halinde 11 tüp 1 numaralı ortamların 200 ul ekleyin. Orta / ilaç değiştireceğim her alternatif gün verin.
Not: Yarım logaritmik seyreltikleri seri tüp no.2, vorteks ve en yüksek konsantrasyon tüpü no.1 transferi 3 ul itibaren 8. 2'den etiketlenmiş 7 tüplerde çözücü 6.48 ul almak sonraki tüp 3 ul aktarmak için. Negatif kontrol için, araç kontrolü, boru No.10 tüp No.9 tutun. Tüp 11 sayılı% 70 etanoldur.
- Gün 14: Resazurin maruz kalma ve floresan ölçümü
- 15 dakika boyunca 37 ° C'de su banyosu içinde çözülme RD ortamı. Tüm prosedür mentio gerçekleştirinn, aşağıdaki biyo-güvenlik kabini ışık olmadan.
- 15 ml'lik bir tüpe (A) 10 mi RD orta alın ve resazurin reaktifi tavsiye edilen hacim kazandırmak ve pipetleme karıştırın. Inkübatör optik alt plaka çıkarın ve dikkatlice kanallı pipet ile tüm orta kaldırmak.
- Her bir göze boru A ortamı 100 ul ekle. 90 dakika boyunca hücre kültürü inkübatöründe plakası (37 ° C ve% 5 CO2) inkübe edin.
- Floresan kullanarak spektrofotometre (560 Ex / 590 Em) ölçün.
- IC 10 değer tespiti
- Boş değerleri çıkarıldıktan sonra grafik pad prizma değerleri ithal. Flöresanlı bir birim olarak bir dozda ve y-ekseni olarak ayarlayın x-ekseni.
- Y ekseninde yüzdesini elde ve değerleri (log ölçek olarak x-ekseni) dönüştürmek için değerleri normalleştirmek. Sigmoidal doz yanıt (değişken eğim) parametresini kullanarak IC 50 değerini hesaplayın. Aşağıdaki kullanarak Yatırım Ortamı 10 değerleri log hesaplayındenklem:
F = 10 logEC 50 = logECF - (1 / Yamaç) * log (F / (100 F))
Y = Taban + (Üst-Taban) / (1 + 10 ^ ((LogEC 50 = X) * Yamaç)) - Belirleyin IC 10 değerleri ileri çalışmalar için alınacak.
4. Biyomarker Çalışma Mikroarray'ler dayanarak
- Gün 5 Gün 0:
- Embriyoid vücut oluşumu ve transfer için 10 cm bakteriyolojik plakalar - embriyoid vücut oluşumu için 2. maddede belirtilen adımları izleyin.
Not: Her çalışma için üç biyolojik çoğaltır kullanın. IC 10 konsantrasyon ve araç kontrolünde İlaç tedavisi - Her biyolojik ikiye çoğaltmak bölün. Aracın ilaç konsantrasyonuna IC 10 konsantrasyonun üzerinde 10.000 kat hazırlayın ve bu 50 ml Eppendorf tüp H9 hücre kümeleri ile 100 ml'lik RD ortamına 10 ul ekleyin gelen iyice karıştırın ve V alt tabakalarına tohum. Araç kontrol grubu için aynı işlemi uygulayın.
<14'e Gün 5 uyuşturucu maruz İçin li> EB's toplamak ve nokta belirtilen adımlar göre günde 4 10 cm bakteriyolojik plakaları aktarabilirsiniz yatay çalkalayıcı (karşılıklılık hareketi 50 / dk) plakaları 2. Aktarım hücre kültürü yetiştirme cihazı kullanılmaktadır (37 ° C ve% 5 CO2) 14 gün boyunca uygulanır. Orta değiştireceğim her alternatif gün verin. - Embriyoid vücut oluşumu ve transfer için 10 cm bakteriyolojik plakalar - embriyoid vücut oluşumu için 2. maddede belirtilen adımları izleyin.
- Numune toplama için, 14. günde, steril bir serolojik pipet ile 15 ml Falcon tüpüne 10 cm plakalardan EBS toplar. EBS 2 dakika yerleşmek için izin verin. Süpernatant aspire ve 5 ml PBS ile EBS yıkayın. EBS 2 dakika razı ve süpernatant aspire izin verin. 1 mi RNAlater çözelti ya da Trizol reaktifi, girdap bölgesi EBS yeniden askıya ve daha ileri işleme kadar -80 ° C'de örnek saklayın.
Not: iyi laboratuvar uygulamaları başı olarak biyogüvenlik kabini tüm yordamı gerçekleştirin. Steril cam pastu yardımı ile çevredeki ortamı merkezindeki tüm EBS getirmek aspire merkezi çevresinde dairesel bir hareketle plakaları döndürünpipet yeniden, 15 ml RD orta ekleyin ve sonra ilgili grup için ilaç / araç 15 ul ekleyin.
5. RNA izolasyonu ve Bütünlük Testi
- RNA İzolasyonu:
Aşağıda belirtilen adımlardan en kullanım kılavuzuna göre RNeasy Mini Kit kullanılarak RNA saflaştırma için yapılması gereken vardır. Daima nükleaz ücretsiz tüpleri, pipet uçları ve su kullanın. TRIzol ile çalışırken kimyasal güvenlik kabini tüm prosedürü yürütmek ve koruyucu gözlük yanı sıra kimyasal koruyucu eldiven giyin.- Buz üzerinde örnekleri çözülme. Numuneler RNAlater çözelti içinde kayıtlı ise, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüj tüpleri. Süpernatantı atın ve 1 ml TRIzol reaktifi ekleyin.
- 24 G iğne ve 1 ml şırınga kullanarak örnekleri Karışım. Yaklaşık 15 katı toz haline getirme EBS, hücre duvarı ve plazma membran bozulması için yeterlidir.
- Her bir numune içinde kloroform 200 ul ekle. Vortex eşit içerikleri karıştırmak için. Santrifüj4 ° C'de 15 dakika boyunca 12,000 x g'de. RNeasy Mini Spin sütunlar, 1.5 ml tüpleri çıkarın ve bunları düzgün etiketleyin.
- (Süpernatant toplama orta veya alt tabaka rahatsız etmeyin iken) 1.5 ml tüpler içinde süpernatant toplayın. Soğutulmuş% 70 etanol eşit hacmi ekleyin. Nazik sallayarak içeriğini karıştırın.
- İlgili Mini sıkma kolonlara tüpler 700 ul uygulayın ve oda sıcaklığında 20 saniye boyunca 12.000 xg'de onları santrifüj. Oda sıcaklığında tüm diğer adımları uygulayın.
- Filtratı atın ve ilgili sütunlara kalan çözümü uygulamak ve 20 saniye boyunca 12.000 xg'de onları santrifüj. Filtratı atın.
- Sütuna RW1 tampon 350 ul uygulayın ve 20 saniye boyunca 12.000 xg'de onları santrifüj. Filtratı atın ve kolona 10 DNAz ul ve 70 ul RDD tampon uygulayın.
- 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Sütuna RW1 tampon 350 ul uygulayın ve 20 saniye boyunca 12.000 xg'de onları santrifüj. Filtratı atın. 500 ul uygulayınRPE sütun tampon ve 20 saniye boyunca 12.000 xg'de onları santrifüj yıkama. Filtratı atın. Yine kolona RPE yıkama tamponu içinde 500 ul uygulayın ve 2 dakika için 12,000 x g'de santrifüj. Filtratı atın.
- Yeni 2 ml toplama tüpleri sütunları Shift ve 1 dakika boyunca 12.000 xg'de onları santrifüj. Etiketli 1.5 ml toplama tüpüne sütun aktarın ve nükleaz serbest su 22 ul uygulayın. 1 dakika için 12,000 x g'de santrifüjleyin tüpler.
- Toplama tüpünü çıkarın ve buz üzerine koydu. RNA, otomatik elektroforez sistemi ile ölçmek.
- RNA konsantrasyonu, saflık ve dürüstlük testi.
RNA saflık ve bütünlük için kullanımı otomatik elektroforez sistemi ve ilgili kiti 33 test.
6. Mikroarray Çalışmaları
- Ticari kullanılabilir İnsan dizi yongaları kullanan transkripsiyon profil gerçekleştirin. RNA hedef hazırlama, parçalanma, melezleme 34 ve dizi içinchip boyama, yıkama 35 kullanımı, ticari mevcut kitler.
- Standart fluidik istasyonu, dizi tarayıcılar ve standart çalışma yazılımları 36 kullanılarak dizi çip tarama ve kalite kontrol kontrolü yapın. Gen ekspresyon analizi için standart mevcut ticari yazılımlar 37 tarayıcılardan elde edilen dosyaları içe, Sağlam Çoklu dizi analizi (RMA) ile arka plan düzeltme, özetleme ve normalleşme gerçekleştirin.
- Farklı ifade genlerin listesini elde etmek için (°) 'ın tek yönlü ANOVA analizi gerçekleştirmek. Bu listeden, katlama değişim (± 2) ve FDR kontrollü p-değeri (<0.05) göre genleri filtre. Bu yazılımı kullanarak, vb Principal Component Analysis (PCA), Isı Haritası, edinin.
Bölüm 2. UKN 1 Test Sistemi
HESC 1. Bakım
- MEF'lerin Tohum
- Farklılaşma için NSCB # 8534 (H9) hücre hattı kullanın. Kültür cebesleyici hücreler olarak fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) üzerine lls. % 0.1 jelatin, 4 ml ile kaplayın T25 şişesi 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
- 37 ° C su banyosu içinde çözülme MEF'ler ve önceden ısıtılmış DMEM /% 10 FBS içinde hücreleri aktarın.
- 500 xg ile 3,5 dakika Spin süpernatant kaldırmak ve 1 x 10 7 hücre / ml elde etmek için hücrelerin askıya yeniden. Jelatin üzerinde T25 şişeler 4 x 10 4 / cm 2 Levha MEF'ler. İsteğe bağlı olarak, sonraki iki gün MEFS kullanın. MEF toplu Kalite HESC bakım için çok kritik bir konudur. Bu nedenle, H9 hücreleri için en iyi şirket ve hazırlama yöntemi açıklamak için tavsiye edilir. Biz PMEF P3 kullanımı.
- Yarma ve H9 bakımı
- T25 şişesi H9 1 ml önceden ısıtılmış dispaz ekleyin ve 37 ° C'de 9 dakika inkübe edilir.
- 2 ml işlenmiş hücreleri ve pipet 5 kez yukarı ve bir şahin tüp 5 ml pipet ve transfer hücre çözümü ile aşağı dispase orta yıkama ekleyin.
- 9 mi yıkama ortamının sertliğine şişeye yıkayınve diğerleri hücreleri ekleyin. 500 xg ile 3,5 dakika Spin süpernatant kaldırmak ve 10 ml HESC ortamda hücrelerin yeniden askıya.
- 500 xg ile 3,5 dakika Spin süpernatant kaldırmak ve 4 ml HESC ortamda hücrelerin yeniden askıya. MEF'ler ile yeni bir (PBS yıkanmış) T25 şişesi içinde 0.5 ml hücre süspansiyonu ve 4.5 ml HESC orta ve plaka ekleyin. Her gün, şişenin tüm HESC ortamı (5 mi) değiştirin.
Nöroektodermal Progenitör Hücre doğru hESC 2. Farklılaşma (NEP)
- HESC orta ve KCM orta hazırlayın. Kat, bir 10 cm T25 şişesi başına jelatin (PBS içinde% 0.1) ile çanak ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir. HESC orta çıkarın ve şişenin bütün alt (T25 şişesi başına 1 mi) kapak ve 37 ° C'de 25 ila 30 dakika inkübe kadar Accutase ekleyin.
- Accutase inkübasyon sırasında taban membran matrisi kaplanmış plakalar hazırlayın. Dondurulmuş bazal membran matris pelet soğuk DMEM / F12 ekleyin ve 01:20 çözmek. Filtre bazal membran matris solu40 mikron hücre süzgecinden yon. Plaka, süzüldü çözeltisi ekleyin, tüm alt kapalı (6-oyuk başına 1 mi gerekmektedir) ve oda sıcaklığında 2 saat süre ile inkübe edilmesi gerekir.
- Kuluçka döneminden sonra kaplanmış kuyular üzerinde bazal membran matris süpernatant ve tohum hücreleri çıkarmak. Accutase aşama (2.1) sonra 1.5 mi HES ortamı ilave ederek reaksiyonu durdurun. Şişeden hücreler Pençe 8 mi HESC ortamı ilave edin ve iyice 10 mi pipetle pipetleme ile tek bir hücre çözeltisi üretir. 40 mikron hücre süzgecinden Filtre hücreleri.
- Spin hücreleri 500 xg ile 3 dakika, süpernatant kaldırmak ve hESC 10 ml hücrelerin yeniden askıya. Spin hücreleri tekrar 3 dk xg 500, süpernatant kaldırmak ve ROCK inhibitörü Y-27.632 10 uM nihai konsantrasyonda içeren hESC hücreleri askıya yeniden.
- Jelatin kaplı çanak süpernatantı. Jelatin kaplı çanak Plaka hücre süspansiyonu MEFS kaldırmak ve tam 1 saat inkübatör bırakmak.
NOT: Bu adım sırasında MEF'ler olacak settle HESC jelatin eklemek edemez ise jelatin kaplı plaka üzerine. Bu nedenle, bu besleyici içermeyen farklılaşma elde etmek önemlidir. Bu MEF'lerin verimsiz çıkarılması bir kritik adım HESC yığınlarda çok uzun kuluçka sonuçları ve çok kısa inkübasyon olduğunu. Inkübasyon 45 dakika sonra plaka zaten yerleşmiş MEF'ler ve HESC kümeleri için araştırılmalıdır. - MEF'ler eklenmiş sonra, yavaşça plaka daha önce ortam maddesi ile inkübe edildikten sonra rahatsız yıkanarak yapışmayan hücreler (HESC) yıkayın. Birkaç T25 daha fazla hücre elde etmek için kullanılmış olsaydı, tek hücreler artık kombine edilebilir. HESC ortamı ile bir kez yıkayın.
- Spin hücreleri 500 xg ile 3 dakika, süpernatant kaldırmak ve / ml FGF-2 10 uM ROCK inhibitörü Y-27632 ve 10 ng içeren yaklaşık 4 ml KCM hücreleri yeniden askıya.
- Tripan mavi kullanarak bir hemositometrede hücreleri saymak. Içeren KCM plakalar kaplı bazal membran matrisi üzerinde Plaka 18 x 10 3 hücre / cm 2 10 uM ROCK inhibitörü Y-27632 ve10 ng / ml FGF-2 (6 sıra oyuk başına 1.5 ml kullanım için). Bu NEP'lerin içine bunları başarıyla ayırt etmek doğru yoğunluk hücreleri plaka için çok önemlidir.
- 24 saat sonra, 10 uM ROCK önleyicisi Y-27632 ve 10 ng / ml FGF-2 ihtiva eden taze KCM orta değiştirin. 24 saat daha sonra, 10 ng / ml FGF2 ihtiva eden taze KCM orta değiştirin.
- Hücrelerin ekim sonra 72 saat, farklılaşma KSR orta yönelik orta değişim başlar. Bu zaman noktası, farklılaşma 0 (DoD0) gün olarak ifade edilir. Test maddelerinin eklenmesi mümkündür.
- DOD1 ve DOD2 On orta tam DoD0 olduğu gibi değiştirilir. Sonraki orta değişiklik DoD4% 25 N2-S ve% 75 KSR içeren yer almaktadır. DoD6 de farklılaşma durdurulur ve hücreler analizi için hasat edilir.
HESC ve NEP'in 3. Kromatin immünopresipitasyonu (ChIP)
- Çekirdeklerin hazırlanması
- Analiz ve 25 ila 30 dakika süreyle inkübe edilmelidir her 6 kuyuya Accutase 500 ul ekleyin. CouTripan mavisi kullanılarak, bir Neubauer bölmesi nt hücreleri.
- Çapraz bağlantısı için DMEM / F12% 1 formaldehit içinde süspanse hücreleri. Çapraz bağ durdurmak için 10 dakika sonra, 125 mM'lik bir son konsantrasyonda Tris pH 7.5 ekleyin.
- Spin hücreleri 4 ° C'de 500 xg ile 3 dakika, süpernatant kaldırmak ve soğuk PBS hücrelerin yeniden askıya.
- Spin hücreleri 4 ° C'de 500 xg ile 3 dak / 1 x 10 6 hücre tampon L1 1 ml hücreleri, süpernatant kaldırmak ve yeniden askıya.
- Buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin. Spin 4 ° C'de 800 x g'de 5 dak, süpernatant kaldırmak ve / 2 x 10 6 hücre tampon L2 1 ml çekirdekleri askıya tekrar.
- Sonikasyon ve kalite kontrol
- 300-700 bp uzunlukta DNA fragmanları oluşturulur, böylece sonikasyon. 4 ° C'de 10,000 x g'de 1 dakika dönerler. Yeni bir tüpe süpernatant aktarın. fragmanlar, aksi takdirde immunoprecipitation verimsiz yanı sıra izlenen qPCR olacak, doğru boyutu olması gerekir.
- 50 ul bir kaldır50 ul L2 tamponu d karışımı bir agaroz jel çalıştırarak sonication etkinliğini kontrol etmek için.
- 4 saat ve 500 rpm'de 65 ° C'de inkübasyon yoluyla çapraz Ters. Numuneleri 1:% 1.5 agaroz jeli üzerinde Orange G yükleme boyası 5 ve 1 x TBE tampon maddesi içinde 110 V de 45 dakika çalıştırılır. Kontrol fragmanı boyutu (300-700 bp arasında olmalıdır).
- Kromatin immüno-çökeltmesi
- Örnekleri 1 seyreltin: 5 seyreltme tamponu ve kısım içinde IP başına 1 ml silikonlu tüpler içinde.
- "Girdi" olarak 4 ° C'de seyreltilmiş kromatin numune (adım 3.3.1) ve deposundan% 5 (hacim) sökün.
- Bir döndürücüde 4 ° C 'de spesifik IgG O / N seçim ve antikorlar ile inkübe edin.
- Immüno sonra her bir örneğe 50 ul protein A / G sefaroz boncuklar ekleyin. Bir döndürücüde 4 ° C 'de Numuneler 3 saat inkübe edin. 4 ° C'de 1,500 xg ile 1 dakika Spin ve süpernatant kaldırmak.
- 1 ml yıkama boncuklar ile yıkayın. Spin 1 dk 1.500 xg'de ile4 ° C ve süpernatant kaldırmak. H adımı tekrarlayın g. 1 ml nihai yıkama tamponu ile yıkayın. Bu doğrudan elüatın miktarını değiştirir çünkü yıkama adımları sırasında, boncuk herhangi kaybetmek olmamalıdır.
- Santrifüj 1, 4 ° C'de 1500 x g'de dak ve supernatant çıkarın. 125 ul yıkama tamponu ilave edin ve bir çalkalayıcı üzerinde 1000 rpm'de 65 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
- 1,500 xg ile 1 dk Spin ve yeni bir tüp adımı tekrarlayın k ve l süpernatantı aktarın. Girdi (3.3.2) 200 ul elüsyon tamponu ekleyin. Her bir örnek için proteinaz K ve RNaz ekleyin ve bir karıştırıcı üzerinde 500 rpm'de 37 ° C'de 30 dakika inkübe edildi ve ardından 4 saat bir karıştırıcıda 500 rpm'de 65 ° C.
NOT: DNA ekstraksiyon kullanımı, ticari mevcut ChIP DNA Temiz ve Konsantratörü Kit 38 için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
UKK test sistemi Metil civa poz
Sitotoksisite tahlili IC 10 bir değer metil cıva sitotoksisite için (% 10 canlılığı azalma) (Şekil 1) elde etmek üzere H9 EBS ile gerçekleştirildi. Biz de bir mikrodizi tabanlı (affymetrix platformu) biyomarker çalışması gerçekleştirdi. H9 EBS 14 gün boyunca metil civa (0.25 1 uM) maruz kalmıştır. 14. günde numuneler Trizol ile toplanmış ve RNA izole edildi. Transkripsiyonal profilleme İnsan Genom U133 artı 2,0 dizi yongaları kullanılarak gerçekleştirildi. veri Partek Genomik Suite TM 6.6 ile analiz edilmiştir. İlk veri bakış Temel Bileşenler Analizi (Şekil 2A), Venn diyagramları nesil (Şekil 2B) ve ısı haritaları yapımı (Şekil 2C) ile elde edilmiştir. temel bileşen analizi gen ifadesinin genel dağılımını temsil eden ve açıkça segreg görüntülendiAraç kontrolü MeHg 1 uM ve MeHg (# 25.2 PC), 0.25 uM grup (Şekil 2A) asyon. Farklı şekilde ifade edilen genlerin listesi (DEG) sonra elde edildi istatistik tedavi (tek yönlü ANOVA) ve ± 2 katlık bir değişiklik kesme ve çokluğu düzeltilmiş (Benjamini-Hochberg yöntemi) p-değeri kullanarak veri filtreleme <0.05 (Tablo 1). 1 uM MeHg tedavisi 276 degs ve 31 degs (Şekil 2B), 0.25 uM ile sonuçlanmıştır. ısı haritası MeHg 1 uM tedavisi esas olarak gen ifadesinin (Şekil 2C) azalttığını göstermiştir. Yoğunlaştığından gen ontoloji şartlarda bilgiler DAVID biyoinformatik aracını kullanarak elde edildi. Tablo 2 en fazla 5 gen içerdiği önemli ölçüde fazla temsil GO gen kategorilerini temsil etmektedir. sinir sistemi gelişimine ilişkin aşağı regüle transkripsiyon faktörleri belirlendi. SEPP1, DDIT4, AK4, FRZB (beyin gelişimi), PITX (nöral gelişim çekirdeği) ve ErbB3 UGT8, apo B, APOA1 (sinir sistemi gelişme) metil cıva tedavisi (Tablo 3) için bir doz bağımlı bir şekilde aşağı-regüle edildi.
UKN 1 test sistemi
Bu farklılaşma protokol farklılaşma altı gün içinde NEP saf nüfus oluşturmak için çift SMAD inhibisyonunu 6 kullanır. Elde edilen hücreler nöral prekürsör genleri Pax6 ve OTX2 bir up-regülasyonu ile karakterize edilir. kök hücre belirteçleri Oct4 ve Nanog aşağı NEP (Şekil 3A) doğru farklılaşma sırasında düzenlenir. Nedeniyle son derece senkron ve homojen farklılaşma, bu gelişmenin bu erken aşamasında histon modifikasyonları hakkında bilgi almak da mümkündür. Biz farklılaşma başında ya da 6 gün sonra ya hücreleri kullanılarak bağışıklık yağış (ChIP) kromatin için protokol adaptefarklılaşma. Pax6 ve OTX2 yükseltici bölgelerinde metilleme bölgelerinin bir anahtar, bu çalışmada (Şekil 3B) açıktı. incelenen metilasyon siteleri 3 lizin 4 trimethylation (H3K4me3) ve histon 3 lizin 27 trimethylation (H3K27me3) farklılaşma sırasında son derece dinamik olduğunu sübstrat olarak histon. Ayrıca, protein düzeyinde Oct4 olmayan bir düzenlemesi (Şekil 4) gözlenebilir. Pax6 up-regülasyon ve nöral kök hücre belirteci Nestin protein düzeyi üzerindeki immunofloresan mikroskobu (Şekil 4) tarafından izlendi. hücre popülasyonu farklılaşma altı gün sonra homojen ve saf farklılaşma göstermiştir. Bu nedenle, kültürler, kolayca RNA ve protein analizi için kullanılabilir. Sistem aynı zamanda madde ve erken nöral gelişim 16,29 üzerinde sahip oldukları etkiyi test etmek imkanı sağlar.
Şekil MeHg 1. Sitotoksite Testi (H9 farklılaşma). Tahlil metil civa IC 10 değeri tanımlamak için protokole göre yapılmıştır.
UKK test sisteminin uygulanmasından sonra 0.25 1 uM MeHg neden diferansiyel olarak ifade edilen genlerin Şekil 2. Örnek analizi. HESC UKK Test sistemine göre 0.25 ve 1 uM MeHg ile muamele edildi. Diferansiyel analizi 14 günlük farklılaşmış EBS transkriptler Partek Genomik Suite TM 6.6 yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir ifade edilmiştir. (A) mikroarray verilerinin Temel bileşen analizi (3-Dimenional). (B) Venn şeması gen ifadesinin mikroarray analizinden elde edilen. diyagramı göstermektedirMeHg tedavisi (kat değişim> ± 2, p <0.05) ile modüle genler. (C) gen ifadesi verileri Hiyerarşik kümeleme (katlı değişim> ± 2, p <0.05). Araç kontrol grubunda yüksek ölçüde sentezlenen genlerin 1 uM MeHg işlenerek bastırıldı. . Araç kontrol grubu karşılaştırmak gibi 1 uM MeHg tedavi alt ifade ile 233 transkript ve daha yüksek ifadesi ile 43 prob sonuçlandı bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
NEP doğru hESC gelen farklılaşma sırasında Şekil 3. Gen ifadesi ve histon metilasyon desen. Bütün deneyler için, hESC nöroektodermal öncü hücrelerin (NEP) ile ayırt edildi. (A) Örnekler d alındıNöral farklılaşma marker genlerinin ay farklılaşma 6 ve transkript seviyeleri RT-qPCR ile belirlenmiştir. Veriler (hESC göre gen ekspresyonu) 5 deneylerin ± SEM araçlardır. Kromatin immunoprecipitation (chip) (B) Örnekler farklılaşma 6. günde hazırlandı. ChIP H3K4me3 ya H3K27me3 ya da kontrol IgG için özel antikorlar ile gerçekleştirildi. promotör sekanslarının zenginleşme faktörü H3K4me3 (gri) ve H3K27me3 (siyah)% girdi olarak verilir. Veriler 3 bağımsız hücre hazırlıkları ± SEM araçlarıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Doğru NEP. HESC gelen farklılaşma sırasında Şekil 4. Protein ifade Hücreleri sabit ve kök hücre belirteci için boyandıFarklılaşma (DoD0) gün 0 ve farklılaşma 6. günde (DoD6) de NEP belirteçleri Pax6 (kırmızı) ve Nestin (yeşil) için Oct4 (yeşil). Ölçek çubuğu 50 mikron gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Farklı ifade genlerin Tablo 1. listesi (> ± 2 kat, p <0.05) 14 gün eski EBS araç kontrole karşı MeHg tedavi. Bu tabloyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Düzensiz tran anlamlı zenginleştirilmiş ve seçilen GO kategoriler Tablo 2. listesi (p değeri <0.05,> 5 genler)14 gün eski EBS araç kontrole karşı MeHg için komut.
| GO Dönem | Saymak | P değeri | Genler |
| Apoptoz Yönetmeliği | 18 | 0.0068 | ARHGEF3, TBX3, erbB3, MITF, BNIP3, CDH1, IGF2, IFI16, HGF, GCH1, AMIGO2, SERPINB9, KRT18, MSX1, ETS1, VEGFA, PERP, IGFBP3 |
| Hücre Çoğalması düzenlenmesi | 17 | 0.0123 | RBP4 Lyn, TBX3, erbB3, MITF, IGF2, KDR, RERG, MSX1, ADM ETS1, VEGFA, BNC1, ADAMTS1, FABP1, IGFBP3, FIGF |
| Vaskulatür gelişme | 12 | 0.0001 | PLAT, APOB, HAND1, TBX3, EPAS1, FOXF1, leptin reseptör, VEGFA, COL3A1, LOX, FIGF, KDR |
| İskelet Sistemi Geliştirme ng> | 12 | 0.0008 | RBP4, MSX1, LGALS3, TBX3, HOXB6, COL3A1, STC1, IGF2, POSTN, FRZB, IGFBP3, AHSG |
| Kalp Geliştirme | 11 | 0.0001 | RBP4, ACTC1, MSX1, HAND1, TBX3, ADM PKP2, erbB3, GATA6, COL3A1, ADAMTS1 |
| Glikoz Metabolik Süreci | 9 | 0.0003 | PDK1, RBP4, LDHA, PGM5, PYGL, Hk2, PFKP, IGF2, PGK1 |
| Akciğer Geliştirme | 7 | 0.0008 | RBP4, EPAS1, GATA6, FOXF1, VEGFA, LOX, KDR |
| Epitel Geliştirme | 7 | 0,0386 | F11R, FREM2, GATA6, FOXF1, VEGFA, DSP, KDR |
| Mezoderm Geliştirme | 5 | 0.0088 | HAND1, TBX3, FOXF1, VEGFA, SNAI2 |
| Dönem | Gene Sembolü | * Değiştir Fold | |
| VC vs 0.25 uM MeHg | VC vs 1 uM MeHg | ||
| Beyin Gelişimi | SEPP1 | -2,17 | -4,13 |
| DDIT4 | -1,20 | -3,11 | |
| AK4 | -1,41 | -3,08 | |
| FRZB | -1,29 | -2,19 | |
| Nöronal çekirdek geliştirme | PITX2 | -2,08 | -4,90 |
| Sinir sistemi gelişimi | ERBB3 | -1,86 | -2,89 |
| UGT8 | -1,67 | -2,14 | |
| APOB | -3,59 | -5,72 | |
| APOA1 | 2.63 | -2,90 | |
| VEGFA | -1,28 | -3,06 | |
* P <0,05
Kültür ortamı Tablo 4. Kompozisyon.
| Sr No | Orta / Tampon Adı | Kompozisyon | |||
| Miktar | | ||||
| 1 | MEF Orta | DMEM yüksek glukoz | |||
| FCS | % 10 | ||||
| Penisilin | 100 birim / ml | ||||
| Streptomisin | 100 ug / ml | ||||
| L-Glutamin | 2 mM | ||||
| 2 | H9 Kültür Orta | DMEM F12 | |||
| KOSR | % 20 | ||||
| MEM'dir | % 1 | ||||
| Glutamax | 1x | ||||
| β-mersaptoetanol | 0.1 mM | ||||
| Penisilin | 100 birim / ml | ||||
| Streptomisin | 100 ug / ml | ||||
| bFGF | 4 ng / ml | 3 | RD orta | BFGF olmadan H9 kültür ortamı | |
| 4 | Yıkama Orta | DMEM / F12 | |||
| Nakavt Serum Replacment | % 20 | ||||
| 1x GlutaMAX | 1x | ||||
| MEM esansiyel olmayan amino asitler, | |||||
| HEPES | 15 mM | ||||
| β-mersaptoetanol | 90 uM | ||||
| 5 | KCM Orta | DMEM | |||
| FBS | % 10 | ||||
| MEF'ler 24 saat için kuluçkalanmıştır | |||||
| 6 | Nakavt Serum Yedek (KSR) | ||||
| Nakavt Serum değiştirme | % 15 | ||||
| 1x GlutaMAX | |||||
| 1x MEM esansiyel olmayan amino asitler, | |||||
| β-mersaptoetanol | 15 um | ||||
| Kafa | 35 ng / ml | ||||
| Dorsomorphin | 600 nM | ||||
| SB431542 | 10 uM | ||||
| 7 | N2-S | DMEM / F-12 | |||
| Apotransferin | 100 ug / ml | ||||
| Glikoz | 1.55 mg / ml | ||||
| Putrescine | 10 mM | ||||
| Selenyum | 500 uM | ||||
| Progesteron | 20 uM | ||||
| GlutaMAX | 200 uM | ||||
| 25 ug / ml | |||||
| 8 | L1 Tampon | Tris pH 8 | 50 mM | ||
| EDTA | 2 mM | ||||
| NP-40 | % 0.10 | ||||
| Gliserin | % 10 | ||||
| 9 | L2 tampon | Tris pH 8 | 50 mM | ||
| EDTA | 10 mM | ||||
| SDS | % 1 | ||||
| 10 | Elüsyon Tamponu | NaHCO 3 | 100 mM | ||
| SDS | % 1 | ||||
| 11 | Yıkama Tamponu | Tris | 20 mM | ||
| EDTA | 2 mM | SDS | % 0.10 | ||
| NP-40 | 0.50% | ||||
| NaCl | 150 mM | ||||
| 12 | Final Yıkama Tamponu | Tris | 20 mM | ||
| EDTA | 2 mM | ||||
| SDS | % 0.10 | ||||
| NP-40 | 0.50% | ||||
| NaCl | 500 mM | ||||
| 13 | Hücre Orta Kök | mTESAR TM bazal ortam | 400 mi | ||
| mTESAR TM takviyesi | 100 mi | ||||
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toksikolojik testler Geleneksel yaklaşımlar dolayısıyla test masraflı ve zaman alıcı hale kapsamlı hayvan çalışmaları içerir. Ayrıca, türler arası farklılıklar nedeniyle klinik öncesi hayvan güvenlik çalışmaları insanlar için uygun potansiyel ilaçların toksisitesi etkilerini tahmin etmek her zaman geçerli değildir. Insan olmayan primatlar, en öngörülebilir, halen etik güçlü ve sosyoekonomik talepleri hızla in vitro testinde hassas ve sağlam gelişen modern toplumlar tarafından yükselterek rağmen insan güvenliği ile ilgili sistem.
hESC sağlıyor, bu nedenle ilaç güvenliği testi 6,21 için geleneksel yaklaşımlara alternatif olarak öne sürülmüştür duyarlı toksikogenomik yaklaşımları ile birlikte in vivo insan gelişim süreçlerini yansıtan, tüm somatik hücre tiplerine ayırt etmek. 'ESNATS' projesi kapsamında 'UKK' test sistemi tahmin geliştirilmiştirtranskriptomik profil dayalı gelişimsel embriyonik toksisite. Bu sistemde HESC 14 gün embriyoid organlara yer ayırt edilmiştir. Elde edilen zaman kinetik transkriptomik profili, kısmen erken insan embriyo gelişimini özetlemek 14. günde üç germ ektoderm, endoderm ve mezoderm özgü farklılaşma işaretleyici yüksek ifadesini gösterir. Bu sonuçlara göre, bilinen teratojenik ilaçlar 14 gün farklılaşma sırasında maruz kaldıkları ve ayırıcı eksprese edilmiş gen profili elde edilmiştir. Etkileyici, insanlarda görülen talidomidin teratojenik etkileri ile ilişkili gen imzalar, bu test sisteminde 28 tarafından tahmin edilebilir. sinir sistemi gelişimi ile ilgili transkripsiyon faktörlerinin UKK sistem gösterisi konsantrasyona bağımlı aşağı yönetmelikte metil civa temsilcisi sonuçlar. diğer gelişimsel nöro-toksik maddeler de bu sistemde test edildi ve çabaları tanımlamak için gidiyoruzmRNA düzeyinde bileşikler arasında ortak toxico-işaretleri ve protein seviyesinde doğrular. Burada sağlanan UKK test protokolü gelişimsel zehiri için transkriptomik imza tanımlamak için insan embriyonik kök hücre H9 ile deneme yapılması için temel kılavuz verir.
UKN1 protokolüne göre pluripotent kök hücrelerin farklılaşması için optimize standart operasyon prosedürü (SOP) NEP hESC sağlam ve senkronize ayrımı izin verir. Zaten farklılaşma altı gün sonra, yüksek Pax6 sentezleme seviyelerine sahip homojen bir hücre popülasyonu oluşturulur. Hücreler immün analizler izin yapışık kültürler, büyür. Yüksek çözünürlükte ve konfokal mikroskopla İmmünositokimyasal analiz hücreleri ince cam yüzeyler üzerinde yetiştirilen gerektirir. Cam en uygun şekilde kaplanmış, bu bu kültürlerde mümkün olmakla birlikte, bu hücreler, birden fazla tek kat olarak, çok yoğun büyümesi bahsedilen gerekenAltı gün sonra değerlendirilmiştir. Bu nedenle, soyuna özel işaretleyicilerden rutin analizleri daha kolay RT-qPCR, talaş veya Western blot ile gerçekleştirilir. Kültürlerin biyokimyasal analiz için büyük bir avantaj hESC küçük bir başlangıç nüfus bu farklılaşma protokolü ile elde edilebilir hücrelerinin yüksek verim. Bu protokolün bir dezavantajı homojen nöral farklılaşma zorlamak için gerekli ortam takviyeleri (örneğin, noggin) yüksek maliyetidir. Bazı uygulamalar için başka bir dezavantajı, bazı küçük moleküller (kinaz inhibitörleri) protokolünün bir parçası olarak, kültür ortamı içinde mevcut olması söz konusu olabilir. Kültür koşullarının değişikliği de farklılaşmasını 29 değiştirir Böylece, belirli bir sinyal yolları, toksikolojik muayene edilemez.
test sistemi kombinasyonu avantajı DNT daha iyi anlaşılmasıdır. UKK erken germ tabakası oluşumu üzerine daha geniş bir aralığı ve olumsuz etkisi kapsarken, tüm UKN1 araştırılabilirakımlarının gibi epigenetik gibi daha nöral özgü mekanizmaları araştırmak için. Birkaç model, 16 Toksik burada sunulan, iki kültür sistemleri gelişim nörotoksisite tahmin gösterilmiş olmasına rağmen, potansiyel gelişim neurotoxicants bir sayıda tarama izin protokolleri, yüksek çıkış versiyonları için hala bir ihtiyaç vardır. Ayrıca, daha fazla iş tanımlamak ve mRNA veya protein düzeyinde toksisite ortak belirteçleri doğrulamak ve klinik öncesi ilaç güvenliği değerlendirmenin bir parçası olarak kurmak için gereklidir.
Yılda fazla $ 20000000000 ilaç keşfi için 39 ilaç endüstrisi tarafından değerlendirilmektedir. Kavramının bir kanıtı olarak, uygun maliyetli ve daha az zaman alıcı bir şekilde, potansiyel ilaç bileşimlerinin, insan ilgili toksisite etkilerini tahmin etmek için uygun olabilir hESC ve transkriptomik göre in vitro toksisite test sistemleri gelişmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
| mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
| V bottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
| Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Kits | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
| Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of equipment | |||
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Genechip Hybridisation Oven - 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of softwares | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |
|||
References
- Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
- Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceutical Biotechnology. Current Pharmaceutical Biotechnology. 12 (11), 1760-1773 (2011).
- Leist, M., Hartung, T., Nicotera, P. The dawning of a new age of toxicology. ALTEX. 25 (2), 103-114 (2008).
- Kuegler, P. B., et al. Markers of murine embryonic and neural stem cells, neurons and astrocytes: reference points for developmental neurotoxicity testing. ALTEX. 27 (1), 17-42 (2010).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. , (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of Developmental Toxicants and Signaling Pathways in a Functional Test Based on the Migration of Human Neural Crest Cells. Environmental Health Perspectives. 120 (8), 1116-1122 (2012).
- Bosman, A., et al. Molecular and Functional Evidence of HCN4 and Caveolin-3 Interaction During Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells and Development. 22 (11), 1717-1727 (2013).
- Sartiani, L., et al. Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach. Stem Cells. 25 (5), 1136-1144 (2007).
- Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation. 76 (9), 958-970 (2008).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (2), 200-206 (2013).
- Subramanian, K., et al. Spheroid Culture for Enhanced Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-Like Cells. Stem Cells and Development. 23 (2), 124-131 (2014).
- Sivertsson, L., Synnergren, J., Jensen, J., Bjorquist, P., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells Cultured in a Perfused Three-Dimensional Bioreactor. Stem Cells and Development. 22 (4), 581-594 (2013).
- Jagtap, S., et al. Cytosine arabinoside induces ectoderm and inhibits mesoderm expression in human embryonic stem cells during multilineage differentiation. British Journal of Pharmacology. 162 (8), 1743-1756 (2011).
- Krug, A. K., et al. Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach. Archives of Toxicology. 87 (1), 123-143 (2013).
- Leist, M., et al. Test systems of developmental toxicity: state-of-the art and future perspectives. Archives of Toxicology. 87 (12), 2037-2042 (2013).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Molecular medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Khoo, M. L. M., et al. Growth and differentiation of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells: Effect of glucose and basic fibroblast growth factor. Biology of Reproduction. 73 (6), 1147-1156 (2005).
- Son, M. Y., Kim, H. J., Kim, M. J., Cho, S. Physical Passaging of Embryoid Bodies Generated from Human Pluripotent Stem Cells. Plos One. 6 (5), (2011).
- Winkler, J., Sotiriadou, I., Chen, S., Hescheler, J., Sachinidis, A. The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology. Current medicinal chemistry. 16 (36), 4814-4827 (2009).
- Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17 (8), 759-766 (2010).
- Miller, M. T., Stromland, K. Teratogen update: Thalidomide: A review, with a focus on ocular findings and new potential uses. Teratology. 60 (5), 306-321 (1999).
- Newman, C. G. H. Teratogen Update - Clinical Aspects of Thalidomide Embryopathy - A Continuing Preoccupation. Teratology. 32 (1), 133-144 (1985).
- Stern, L. In vivo assessment of the teratogenic potential of drugs in humans. Obstetrics and gynecology. 58 (5 Suppl), 3S-8S (1981).
- Lynch, H. T., Reich, J. W. Diethylstilbestrol, Genetics, Teratogenesis, and Tumor Spectrum in Humans. Medical Hypotheses. 16 (3), 315-332 (1985).
- Satoh, H. Behavioral teratology of mercury and its compounds. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 1-9 (2003).
- Meganathan, K., et al. Identification of Thalidomide-Specific Transcriptomics and Proteomics Signatures during Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Plos One. 7 (8), (2012).
- Balmer, N. V., et al. Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome. Human Molecular Genetics. 21 (18), 4104-4114 (2012).
- Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M., Hartung, T. Developmental neurotoxicity - Challenges in the 21st Century and In Vitro Opportunities. ALTEX. 31 (2), 129-156 (2014).
- Leist, M., Efremova, L., Karreman, C. Food for thought ... considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX. 27 (4), 309-317 (2010).
- Zimmer, B., et al. Coordinated waves of gene expression during neuronal differentiation of embryonic stem cells as basis for novel approaches to developmental neurotoxicity testing. Cell Death and Differentiation. 18 (3), 383-395 (2011).
- Experion RNA StdSens Analysis Kit for RNA analysis by Electrophoresis. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000976B%20%20RNA%20STDSENS%20MANUAL.PDF (2014).
- Affymetix GeneChip 3 IVT Express Kit for Target RNA preparation, Fragmentation and hybridization. , Available from: http://microarray.csc.mrc.ac.uk/downloads/3'%20IVT%20Express%20Manual.pdf (2014).
- Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit. , Available from: http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1 (2014).
- Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1 (2014).
- Partek Genomics Suite. , Available from: http://www.partek.com/pgs (2014).
- ChIP DNA Clean and Concentrator. , Available from: http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/pcr-dna-clean-up-concentration/chip-dna-clean-concentrator (2014).
- Kraljevic, S., Stambrook, P. J., Pavelic, K. Accelerating drug discovery. EMBO Reports. 5 (9), 837-842 (2004).
