Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

전체 셀 Bioreporter 접근 물 불포화 시스템에서 유기 오염 물질의 운송과 생체 이용률을 평가하기 위해

doi: 10.3791/52334 Published: December 24, 2014

Summary

부르크 홀데 리아의 sartisoli RP037-mChe와 전 세포 bioreporter 분석은 물 불포화 모델 시스템에서 공기로 채워진 모공을 해소 균사체에 의한 능동 수송 후 세균 분해 가능한 유기 오염 물질 (즉, 플루 오렌)의 분수를 감지하기 위해 개발되었다.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

토양은 밀도가 박테리아 같은 미생물 1, 2의 넓은 범위에 의해 채워집니다. 그러나,이 서식지의 조건은 특히 물 이용 3의 관점에서, 도전이다. 박테리아는 영구적 이종 환경에서 최적의 조건 (4)를 검색 할 필요가 있지만, 물의 연속 필름 부재는 자유롭게 확산을 방해하도록 제한된 이동성 5 초래된다. 또한, 용질의 확산 속도 (예를 들어, 양분) 불포화 조건 하에서 6 낮아진다. 따라서, 박테리아와 영양분은 종종 물리적으로 분리하고 영양 접근성은 3 제한됩니다. 결과적으로, 물이 연속 상을 요구하지 않는 화학 물질에 대한 전송 벡터는 이러한 한계를 극복하는 데 도움이 있었다. 사실, 균류 및 oomycetes 많은 미생물하여 도달 모비 공기로 채워진 기공 공간을 통해 성장 할 수 있도록 사상 성장 양식을 개발했다LIZING는 실제 장거리 영양소 7, 8 탄소 물질을 분리. 심지어 박테리아 9 당 및 기타 에너지 원을 제공하는 생물학적 전송 벡터로서 작용할 수있다. 통풍 및 균사 생물의 전송은 또한 Pythium ultimum 10 또는 arbuscular mycorrhizal 곰팡이 (11)의 다환 방향족 탄화수소 (PAH)와 같은 소수성 유기 오염 물질에 대한 나타났다. PAH는 유비쿼터스 저조한 수용성 오염 물질이 토양에 12이기 때문에, 균사 매개 교통 잠재적 인 세균 degraders에 대한 오염 물질의 생체 이용률을 증가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 오염물 수송 총량 케미컬 직접 정량화 될 수있는 반면 분해 세균 및 다른 생물체에 의해 수송 균사 오염물 생체 이용률 쉽게 평가 될 수 없으며, 10을 의미한다.

다음 프로토콜 myce의 영향을 평가하기위한 방법을 제시직접 방식으로 세균 degraders에 오염 물질이 생체 이용률에 대한 LIA; 이 미생물 생태계에 오염 물질의 시공간에 미치는 영향에 대한 정보를 수집 할 수 있습니다. 우리는 어떻게 균사 전송 경로를 통해 PAH-굴욕 bioreporter 박테리아와 물리적으로 분리 된 PAH 포인트 소스를 연결하여 토양에 공기 - 물 인터페이스를 흉내 낸 정교한 불포화 소우주 시스템을 설정에 대해 설명합니다. 항공 운송은 제외되어 있기 때문에, 세균 PAH의 생체 이용률에 균사 기반 전송의 효과는 격리 방법으로 공부하실 수 있습니다. 보다 구체적으로, 세 개의 링 PAH 플루 오렌, 균사 유기체 Pythium ultimum과 bioreporter 박테리아 부르크 홀데 리아 sartisoli RP037-mChe (13)는 설명 소우주의 설정에 적용되었다. 세균 B. sartisoli RP037-mChe는 원래 셀 (14)에 페난 트렌 플럭스을 연구하기 위해 지어졌습니다에 PAH 플럭스의 결과로 녹색 형광 단백질 (eGFP는)을 강화 표현한다mCherry는 항시 적으로 발현되는 반면, 적색 형광 셀. 기자의 구성에 대한 자세한 정보는 TECON 등. 예비 시험에서 (13)에 의해 제공됩니다, 세균은 수영과 매우 느린 득시글 거리는 능력을 보이지 않았다. 그것은 균사의 상단에 조밀 한 서스펜션으로 적용 할 때 Pythium의 ultimum의 균사에 천천히 마이그레이션 할 수 있었다. 박테리아가 다음과 같은 프로토콜의 아가로 오스에 포함 되었기 때문에, 균사에 이주가 발생하지 않았다.

공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)을 이용하여, bioreporter 박테리아는 소우주 직접 시각화 될 수 있고 eGFP는 표현은 소프트웨어 ImageJ에의 도움으로 (mCherry 신호에 비례) 세포의 양과 관련하여 정량화 할 수있다. 이것은 다른 시나리오에서 질적으로 생체 이용률을 비교 할 수 있습니다 (즉, 높거나 낮은). 독감은 P.에 의해 균사 전송 후 생물학적 인 것으로 밝혀졌다 ultimum (즉, 그것을) 음성 대조군보다 높았다. 또한, 프로토콜은 화학적 수단을 통해 매개 된 수송 균사의 총량을 정량화하고 동일한 소우주 규소 코팅 된 유리 섬유 (SPME 섬유)를 사용하여 생체 이용률 오염물을 확인하는 방법을 설명합니다. 이 소우주 설정을 사용하여 결과 발표 및 P.의 조합에 대해 논의되었다 ultimum, 플루 오렌 및 B. sartisoli RP037-mChe 15. 여기서, 초점은 상기 애플리케이션에 대한 가능성이 기술을 제공하는 방법의 상세한 설명 및 프로토콜의 전위 함정 식별에 놓여있다. 또한 응용 프로그램 (오염 된 사이트의 예) 각종 곰팡이, 박테리아 종을 포함, 및 기타 오염 물질 (예를 들면, 농약) 또는 오염 물질 공급 (예를 들어, 세 토양) 할 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

요리, 슬라이드 배양 챔버 1. 준비

  1. 각각의 소우주에 대해 다음 재료를 준비합니다 하나의 큰 플라스틱 페트리 접시 바닥 (D = 10cm), 수정 (단계 1.2 참조) 뚜껑 작은 플라스틱 페트리 접시 바닥 (D = 5cm)과 세 충치 하나의 계산 챔버 슬라이드.
  2. 페트리 접시 바닥 부분의 원하는 번호 (D = 5cm)를 가져 가라. 정확히 슬라이드 (26mm 에지 길이)에 맞게 톱으로 가장자리의 일부를 제거합니다. 시스템을 소독하기 위해 70 % 에탄올 O / N에서 배양 접시 바닥과 뚜껑을 담가 UV 빛 아래 흐름 캐비닛에 최소 2 시간 동안 건조한다. 또한 2 시간 동안 자외선에 노출되었던 단단히 밀봉 플라스틱 용기에서 배양 접시를 저장합니다.
  3. 70 % 에탄올과 슬라이드의 원하는 번호 닦아을 공기를 말린다. 알루미늄 호일에 슬라이드를 감싸고 가능한 오염을 제거하기 위해 450 ℃에서 5 시간 동안 머플에 넣어. 뚜껑 유리 배양 챔버를 준비합니다. 70 % 에탄올로 청소하고 흐름 캐비닛에 최소 2 시간 동안 자외선에 열려있는 챔버를 노출합니다.
    주 : 뚜껑 큰 데시 케이 터 (직경 약 30cm)가이 목적을 위해 이용 될 수있다; 각 데시 케이 터 10 소우주의 설정까지 수용 할 수 있습니다.

미디어 및 문화 2. 준비

  1. 수정 트립 효모 매체 (MTY) 14, 21 세기 최소한의 매체 (16) (MM)의 약 150 ml의, 최소 배지 한천 5 ㎖를 100 ㎖ 구 (20) 병렬 소우주를 실행하려면, 세 (MMA, 0.5 % / V w) 감자 덱 스트로스 한천 플레이트 (PDA; 1.5 %, w / v)를 용 P. ultimum, 4 빈 접시, 2 mg을 L -1 사이클로 헥, 네 아가 플레이트를 포함하는 하나 PDA 판 (3 %, w / v)의 0.3를 포함 g ml의 -1 활성탄 2 mg의 부분에서 독감의 40 mg을.
  2. MTY 카나마이신의 50 mg을 L -1을 포함 준비 (카나마이신은의 requir입니다ED는 세균 배양을위한 10 mM의 아세테이트를 포함하는 eGFP는 기자 플라스미드)과 MM을 유지합니다. 소우주에서 박테리아의 고정화 0.5 % MMA를 준비하는 아세테이트없이 MM를 사용 Pythium의 ultimum와 소우주 설정 배양에 1.5 %의 PDA의 판 (각 20 ml)에 붓는다.
  3. P.의 일부 균사를 접종 세 신선한 PDA 판에 ultimum과는 약 72 시간 동안 25 ° C에서 어둠 속에서 배양한다. 그런 다음 판 신선한 솜털 균사체에 의해 완전히 자란되어 있는지 확인하십시오.
  4. B의 두 문화를 시작합니다 글리세롤 주식에서 MTY 50 ㎖에 sartisoli RP037-mChe. 230 rpm으로 회전 플라스크 운동 O / N 30 ° C에서 품어.
  5. 측정 문화 광학 밀도 (OD) 578 nm에서 원심 분리기 10 분 동안 1,000 XG에 (B. sartisoli RP037-mChe를 들어, 예상 OD (578)은 약 1.0이고, 세포는 지수 상에있다). 뜨는을 취소하고 세포를 다시 일시 중지MM의 적당량 0.4 OD 578에 도달한다. 50 mg을 L -1 재현 탁 세포의 400 μL와 카나마이신을 포함하는 MM 20 ㎖를 접종한다. 230 rpm으로 회전 플라스크 운동 O / N 30 ° C에서 품어.
  6. MM의 문화의 OD 578을 측정 (B. sartisoli RP037-mChe를 들어, 예상 OD (578)은 약 0.2이고 세포는 초기 지수 단계에있다). 원심 배양은 10 분 2,000 XG 0.4의 OD에 도달하는 MM의 적절한 양으로 세포를 재 중단. 사용 때까지 50 ° C에서 셀 2 ml의 튜브에 따뜻한 액체 MMA의 500 μL와 서스펜션과 상점의 50 μl를 섞는다. 각각의 소우주에 대한 MMA에서 세포의 150 μl를 사용합니다.
  7. 활성 탄소를 포함하는 아가 로스 젤의 판을 따르십시오. 융해 (3 % W / V)을 두 번 증류수. (g ml의 -1 0.3)를 활성탄으로 잘 혼합 플라스틱 페트리 접시에 혼합물을 부어(D = 10cm).

설치 3. 소우주

참고 :. 완벽한 소우주 설정이 그림 1에 개략적으로 도시 모든 다음의 각 단계는 그림 1을 참조하십시오. 다음 단계는 균사 전송 벡터와 세 가지 제어 설정 (CON 공기, CON의 NEG, CON의 POS)과 샘플 (SAM)의 제조 방법을 설명한다. 모든 다른 설정의 요약은 표 1에서 찾을 수있다.

  1. 배양 접시와 슬라이드의 원하는 번호를 가지고 30 분 동안 흐름 캐비닛에서 자외선에 노출.
  2. 큰 하나 내부의 작은 페트리 접시를 놓고 작은 페트리 접시의 갭을 ​​통해 슬라이드를 맞습니다. MMA의 따뜻한 세포 현탁액의 하나의 샘플을 가지고 하나의 슬라이드의 중간 공동으로 150 μl를 추가합니다. 모든 슬라이드의 중간 충치가 될 때까지이 단계를 반복합니다MMA 가득합니다. MMA 응고 5 분을 기다립니다.
  3. 빈 PDA 판에서 원형의 패치를 펀치 1cm 코르크 구멍 뚫는을 사용합니다. 작은 페트리 접시 내부의 MMA 옆에 2mm의 거리에서 하나의 패치를 놓습니다. (그림 1의 PDA 3) 설정에서 균사 생장을 촉진하기 위해이 추가.
  4. 기계적 장벽 곡선 된 PDA 패치를 잘라. 깨끗하고 무균 작은 배양 접시 바닥 부분을 사용하여 PDA 판으로 누르십시오. PDA 링 결과 한천에 0.5 cm의 거리에서 또 다른 작은 반지를 잘라 주걱을 사용합니다.
    1. 정확히 소우주 설정에서 작은 페트리 접시의 격차에 맞는 조각을 잘라 슬라이드의 상단에 격차 내부에 배치합니다. MMA와 원형 PDA 장벽 사이의 거리가 약 2mm 있는지 확인하십시오. 부드럽게 PDA 장벽으로를 누르면 작은 페트리 접시의 뚜껑을 닫습니다.
    2. 반복 2g의 L를 포함하는 PDA 플레이트 3.4과 3.4.1 단계 -1의 사이클로 헥.
      참고 : 균사가 cycloheximide에 의해 억제되고 MMA를 자라다하지 않기 때문에 이것은 bioreporter 세포를 향해 공중 수송 (CON의 AIR)에 대한 제어 설정입니다.
  5. 빈 PDA 판의 원형 패치를 펀치 1cm 코르크 구멍 뚫는을 사용합니다. 첫 번째 패치의 중간을 잘라 다른 0.5 cm 코르크 구멍 뚫는을 사용합니다. PDA 장벽 (그림 1의 PDA 1) 옆에 1mm의 거리에서 결과 작은 PDA 링을 놓습니다.
  6. PDA 1.의 구멍 P.와 함께 자란 PDA 판에서 원형 패치를 잘라 1cm 코르크 구멍 뚫는에 독감의 2 mg을 추가 ultimum 및 균사 매트 독감 결정을 향하도록 PDA 링에 내려 바닥 (그림 1의 PDA 2) 하나의 패치를 배치합니다.
    1. 독감 결정을 추가하지 않고 이전 단계를 반복합니다.
      참고 :이 배경을 결정하는 음성 대조군 설정 (CON NEG)입니다bioreporter 세포의 형광.
  7. 활성 탄소를 포함하는 배지에서 원형 패치를 펀치 1cm 코르크 구멍 뚫는을 사용합니다. 또한 가스 독감 농도 (그림 1)을 감소하기 위해 각 축소판 설정에서 네 개의 패치를 놓습니다.
  8. 양성 대조군 (CON의 POS)를 준비합니다. MMA 세포 현탁액 200㎕의 일부 독감 결정을 추가하고 빈 슬라이드 중 하나 캐비티에 넣어.
  9. 챔버 내의 가스 독감 농도를 최소화하기 위해 배양 챔버의 바닥에 활성탄의 일부 가루와 함께 페트리 접시 (D = 10cm)를 놓습니다. 또한, 실내의 습도를 유지하기 위해 바닥에 멸균 물 4-5 50 ㎖ 비커를 놓습니다.
    1. 배양 챔버에 소우주의 설정을 전송하고 96 시간 동안 25 ℃에서 배양한다. 무작위로 다른 성장 챔버에 넣어 샘플 위치 효과를 제외한다.
      참고 :이 배양 시간 AP = 연합 뉴스난균 강 P.에 플라이 ultimum. 그것은 다른 생물 다를 수 있습니다.

4. 공 초점 레이저 주사 현미경

  1. 이상적으로 직립 현미경으로 CLSM 설정을 사용합니다.
    주 : 기존의 레이저 제공하는 예를 들어, 여기에 대한 또는 조정 가능한 흰색 레이저 소스와 488, 561 및 633 nm의 라인을 갖추고 할 수있다.
  2. 인가 전압 : 이미지의 수집을 위해 다음과 같은 설정을 사용하여 490 nm의 (eGFP는) 적절한 레이저 강도 (동시 여기)에서 585 나노 미터 (mCherry); 방출 범위 : 500 550 나노 미터 (eGFP는)과 605-650 nm의 (mCherry)에; 대물 렌즈 (인해 긴 작동 거리) 63X NA 0.9 물 침수; 0.5 μm의 : Z-스택에 대한 스텝 크기.
  3. 오픈 축소판 설정 및 PDA 1, 2, 3, PDA 장벽을 제거하기 위해 메스를 사용한다. MMA의 상단에 유리 커버 슬립을 넣고 기포를 제거하기 위해 부드럽게 누르십시오. 현미경 무대에 마운트 슬라이드. 제 위에 물방울을 추가전자 커버 슬립과 시료의 bioreporter 세포를 찾기 위해 mCherry 설정을 사용합니다.
  4. 샘플의 빠른 개요를하고 글로우 - 이상 - 아래 룩업 테이블 적색 (mCherry)과 녹색 (eGFP는) 채널을 사용하여 신호 대 잡음 비율을 최적화 할 수 있습니다. bioreporter 형광을 분석 할 수있는 샘플에 임의의 위치를​​ 선택합니다.
    참고 : 균사는 bioreporter 배출 (예를 들어, 녹색 형광도) 17의 범위에서 형광도를 표시 할 수 있습니다. 이 경우 경우 균사없이 영역을 선택해야합니다.
  5. 정의하고 녹색 (eGFP는)과 적색 (mCherry) 채널의 각 위치를 Z-스택을 기록한다. 표면 형광 빛 또는 레이저 빛에 오래 노출하여 샘플의 표백을하지 마십시오.
    1. 열 무작위로, 균일하게 분포 된 위치를 반복 이전 단계.
  6. 테스트 트랙 (SAM), CON 공기, CON의 NEG와 CON의 POS의 모든 샘플에 대해 동일한 설정을 사용하여 모든 단계를 반복합니다.
  7. 5. 이미지 분석

    참고 : 다른 옵션 사이에 자유 소프트웨어 ImageJ에 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html)이 될 수 있습니다, 기록 된 Z-스택에 적색 (mCherry)과 녹색 (eGFP는) 형광을 분석하려면 사용.

    1. logi_tool 플러그인 (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/)를 설치해야합니다.
    2. ImageJ에있는 파일을 엽니 다. "분할 채널"과 가까이의 녹색 채널을 선택합니다. Z-스택에 빨간색 형광의 영역을 정량화하는 보조 코드 파일로 제공 매크로 'mCherry 영역'을 사용합니다. 매크로에서 기본 설정을 조정합니다 (볼드체로 표시).
      1. 출력 Z- 스택에서 측정 된 픽셀 임계 값보다 (그리고 정의 된 최소 크기 이상)와 테이블입니다.
        주 : 모든 값의 합계는 스택에 빨간색 픽셀 (영역)의 총 수입니다.
    3. ImageJ에있는 파일을 엽니 다. "분할 채널 '과 가까운 빨강 채널을 선택합니다. 매크로를 사용하여 (216), 보조 코드 파일로 제공 eGFP는의 INT는 'Z- 스택에 녹색 형광의 강도를 정량화한다. 매크로에서 기본 설정을 조정합니다 (볼드체로 표시).
      1. 출력 Z-스택의 모든 녹색 객체 임계 값보다 (그리고 정의 된 최소 크기 이상)의 평균 농도와 면적 테이블입니다. 스택에서 녹색 화소의 강도를 계산하기 위해, 각각이 대응하는 영역에 의해 강도를 의미 곱한다.
    4. 상대 eGFP는 유도 (eGFP는 확인해)를 계산한다
      식 (1) (1)
      주 : mCherry는 항시 적으로 발현되므로, eGFP는 확인해의 결과 값이 셀들의 특정 량에 의해 표현 eGFP는 양의 상대 척도이다. 또한 eGFP는 확인해 계산에 대한 자세한 내용은 표 3을 참조하십시오.
    TLE "> 6. 화학 정량화

    주 : 소우주 셋업도 또는 비 생물학적 오염물 싱크없이 전좌 FLU 량의 화학 정량을 수행하는데 사용될 수있다.

    1. 알루미늄 호일에 15 ml의 유리 병, 1 ML의 GC / MS 튜브 및 삽입을 바꿈. 나 2 SO 4 요리를 증발 채우 가능한 오염을 제거하기 위해 450 ℃에서 5 시간 동안 머플의 모든 놓습니다. 활성화 된 데시 케이의 나 2 SO 4 내부를 저장합니다.
    2. 0.5 cm 길이로 PDMS 코팅 된 유리 섬유를 잘라. 신선한 메탄올 4 회 2 시간을 흔들어 섬유를 씻으십시오. 반복 세탁은 밀봉 된 유리 병에 초순수에서 초순수 및 저장 깨끗한 섬유와 또 다른 4 번 단계를 반복합니다.
    3. (: 1, v / V를 3)를 포함 10 μg의의 L -1 페난 트렌-D 10 톨루엔 / 아세톤 1.5 L를 준비합니다.
    4. 단계 1, 2, 프로토콜의 3을 수행합니다. bior없이 소우주를 준비독감 저하를 확인하고 bioreporter 세포 (SAM)와 () - (-)와AIR SAM () eporter 세포는 독감 전송을 연구한다.
      1. (bioreporter 세포없이) 옵션 : SAM의 MMA 내부 인공 및 정량화 할 수있는 오염 물질 싱크 (일반적으로 SPME 실험에 사용) 유리 섬유 코팅 장소 세 PDMS (-)를 미세 집게를 사용.
      2. 미세 집게를 사용하여 유리 섬유를 제거하고 삽입과 GC / MS 유리 병에 각각 전송합니다.
      3. 톨루엔의 200 μl를 추가하고 수직 O / N을 흔들 GC / MS를 통해 분석 할 수 있습니다. 표 2에서 제공되는 설정을 사용합니다.
    5. 15 mL 유리 병에 중간 공동에서 MMA를 전송하고 SO 42 세 주걱에 대해 추가합니다. 철저하게 주걱을 사용하여 혼합 용매 10 ㎖를 추가합니다. 소용돌이 혼합물과 어둠 속에서 수평으로 O / N를 흔들.
      1. 전송 (100)1, 삽입, GC / MS 유리 병에 시료의 리터. 아세 나프 틸렌 08-D (10 mg을 L-1) 10 μl를 첨가하고, 6.4.3에 기술 된 바와 같이 동일한 프로그램을 사용하여 GC / MS로 분석한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

여기에 제시된 결과는 이미 이전에 15 발표되었다. 자세한 기계적 및 환경 논의에 대한 문서를 참조하십시오.

CLSM 통한 화상 기록 후, 최대 강도 투영 시료의 제 시각적 인상 제어 (도 2)를 얻기 위해 각각의 현미경 ImageJ에 또는 소프트웨어를 사용하여 수행 할 수있다. 이후, 상기 데이터 세트는 특정 시각화 소프트웨어에 의해 의미있는 특징을 보여주기 위해 상이하게 돌출 될 수있다. 양성 대조군 (CON의 POS)은 공기 제어 (CON의 AIR) 반면 만 배경 eGFP는 형광 (그림 2B)를 전시하고, 별개의 eGFP는 유도 (그림 2A)를 보여줍니다. 테스트 샘플 (SAM)에 eGFP는 형광은 CON AIR, Y에 비해 높은 것으로 나타납니다등 CON POS (그림 2C)으로 표시되지있다. mCherry 형광은 PAH 저하 독립적 모든 샘플 따라서 유사하다. 그러나, 약간 높은 eGFP는 신호가이 방법과 이후의 이미지 분석에 의해 감지되지 않습니다 필수적이다.

테스트 소우주를 들어, 육안 검사는 이미지 분석 및 상대 eGFP는 유도의 계산에 의해 보완되었다 (참조, 단계 프로토콜의 5 FF; 그림 3). 비에 의한 B의 녹색 배경에 형광 sartisoli RP037-mChe은 CON의 NEG 계산된다. 주어진 조건에서 상대적 eGFP는 유도는 eGFP는 REL였다 = 0.53. 유의 한 차이는 (eGFP는 확인해 CON의 NEG와 CON 공기 사이에 감지 할 수 없었다 = 0.54; P> 0.95) 따라서 bioreporter 세포으로 어떤 기상 독감 전송을 제외하고. CON의 POS를 들어, 매우 높은 eGFP는 유도 (eGFP는 확인해 = 53.7)은 96hr 후 MMA에서 세포의 활력을 확인하고 최대 eGFP는 유도를 나타내는 발견되었다. 균사체와 FLU (SAM)의 존재는 eGFP는 (음성 대조군에 비해 세포에서 상당히 eGFP는 확인해을 유도 = 1.15; p <0.001). 그러나, eGFP는 유도 양성 대조군 (참조 표 3 점 8)에 비해 상대적으로 낮다.

P.의 균사체에 의한 독감의 전송 ultimum는 소우주 설정에서 (; 그림 4 참조, 단계를 프로토콜의 6 FF)를 화학적으로 정량 하였다. 독감과 P.의 존재 ultimum (SAM (-)), 균사 트랜스에게37.5pmold -1 cm -1의 전송 속도를 동일 96hr 내 독감의 25ng에 대한 위치. 균사체의 부재에서 컨트롤 (CON의 AIR는 (-))즉, 기상-농도에 의해 bioreporter의 유도가 제외 될 수 96hr 내 2ng의 범위에서 MMA에 가스 독감 전송 한 것으로 밝혀졌습니다. B.sartisoli RP037-mChe이 (SAM) 존재하는 경우, <독감의 1ng은 MMA 패치에서 검출되었다. 균사체 매개 전위 이후이 검증 된 효과적인 박테리아 독감 저하.

그것은 시스템 (참조 단계 프로토콜의 6.4.1 FF)에 비 생물 적 오염 물질 싱크를 추가하여 독감 전위에 독감 싱크의 세균 저하, 즉,의 영향을 조사하는 것이 가능하다. 따라서, 하나의 섬유에 의해 흡수 된 FLU 량과 MMA 및 상부 균사의 내부에 남아 양을 정량화 할 수있다. (-), 전좌 총 양은 싱크 오염물의 존재에 독립적 인 (p> 0.9;도 5a). 이전 15 상세히 설명하지만, 증가 된 FLU 흡수 면적 축소판 또한 시험 하였다. 가, 전위 된 독감 양의 유의 한 증가 (그림 5B)를 검출 할 수있다.

그림 1
그림 1. 회로도 도면과 완벽한 소우주 설정의 사진. 상단 (A)에서보기와 측면에서 (B). 모든 한천 패치는 세 개의 작은 충치와 슬라이드의 상단에 배치했다. 독감 결정의 두 MG는 PDA (1)의 중간 PDA 2 캐비티 (D = 5mm) 내부에 배치 된 것은 P.의 균사 갓 자란했다 PDA 1. 직면 ultimum은 곡선 PDA 조각은 PDA (2)와 MMA 패치에 사이에 배치되었다 페트리 접시 (D = 5cm)의 뚜껑과 함께 기계적 독감 장벽을 만들 수 있습니다. 활성 탄소를 포함하는 4 한천 패치 FLU 상기 기체 농도를 감소시키는 설정에 넣었다. 미생물 독감없이 최고 (C)과 대각선보기 (D)에서 전체 소우주의 사진. 그림 1A1B는 Schamfuss 등의 허가 수정되었습니다. (15)는 Schamfuss, S. 등의 허가를 적응. 균사의 영향 플루 오렌의 접근성하는 박테리아를 PAH-저하. 싸다합니다. 과학. 기술이. (47) 6908-6915. 저작권 (2013) 미국 화학 학회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

PG "/>
공 초점 레이저 주사 현미경 사진 그림 2. 최대 강도 예측입니다. 현미경 사진이다 bioreporter 박테리아 (B)의 mCherry 및 eGFP는 유도를 시각화 MMA에서 sartisoli RP037-mChe. 박테리아가 MMA에서 결정 독감 소스에 접촉했을 때 (CON의 POS를; A), eGFP는 신호는 컨트롤 (CON 공기를, B)에 비해 상승. 독감과 P.와 샘플 ultimum (SAM; C)도 그러나 적은 양의 제어보다 표시 상승 eGFP는 신호를 보여줍니다. mCherry는 항시 적으로 발현하고, 따라서 셀을 검출하는 시​​각 제어 역할을한다. (배율 630X, 바, 20 μm의). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

"fo를하는 것은 : 유지-together.within 페이지를 ="항상 "> 그림 3
독감의 부재에서 96hr 후 균사체와 독감 B.sartisoli RP037-체에 의해 상대적 eGFP는 유도 (eGFP는 확인해)의. 비교와 CON의 NEG, CON 공기와 SAM에 대한 B.sartisoli RP037-체 그림 3. 상대 eGFP는 유도 그러나 P.ultimum FLU (CON 공기)의 부재의 존재 하에서 (CON의 NEG) 및 FLU 및 P.ultimum (SAM) 둘의 존재하에. 통계적으로 CON의 NEG에 유의 한 차이는 별표로 표시됩니다. 실험이 CON의 AIR에 대한 독립적 인 3 회 반복 수행하고, CON의 NEG에 대한 중복. 하나의 샘플은 CON의 POS 대해 테스트 및 eGFP는 확인해은 53.7로 계산 하였다. 이 수치는 박테리아를 분해하는 PAH에 Schamfuss 등. (15) 플루 오렌의 접근에 Schamfuss, S. 등. 균사의 영향의 허가 적응의 허가 수정되었습니다. 싸다. 과학. 기술이. (47) 6908-6915. 저작권 (2013) 미국 화학 학회.

그림 4
. (. CF 그림 1) 그림 4. 화학 독감 정량 MMA 패치에서 추출한 NG에서 독감의 총 양의 세포없이 기상 수송 96hr 후 (CON의 AIR (-)), m세포와 균사 전송 (SAM) - 세포없이 ycelial 전송 () SAM (). 이 수치는 박테리아를 분해하는 PAH에 Schamfuss 등. (15) 플루 오렌의 접근에 Schamfuss, S. 등. 균사의 영향의 허가 적응의 허가 수정되었습니다. 싸다. 과학. 기술이. (47) 6908-6915. 저작권 (2013) 미국 화학 학회.

그림 5
그림 5. 비 생물 적 오염 물질 싱크의 존재 화학 독감 정량 (A) MMA 패치에서 추출한 NG에서 독감의 총 양의 인공 오염 물질 싱크없이 균사 전송 (SAM에 대한 96hr 후 (. (CF 그림 1.) - ) 또는 PDMS 공동없이ated 섬유). 증가 균사 독감 흡수 영역과 다양한 테스트 트랙 (B) 같은 결과. 이 수치는 박테리아를 분해하는 PAH에 Schamfuss 등. (15) 플루 오렌의 접근에 Schamfuss, S. 등. 균사의 영향의 허가 적응의 허가 수정되었습니다. 싸다. 과학. 기술이. (47) 6908-6915. 저작권 (2013) 미국 화학 학회.

이름 독감 균사체 세포 신청 댓글
SAM + + + CLSM
GC / MS
SAM (-) + - GC / MS 또한 가능한 인공 오염 물질 싱크으로 PDMS 섬유와
CON AIR + (+) + CLSM 균사체는 PDA 장벽 성장; MMA에 포함되지
CON AIR (-) + (+) - GC / MS 균사체는 PDA 장벽 성장; MMA에 포함되지
CON NEG - + + CLSM
CON의 POS + - + CLSM 세포를 직접 독감 결정에 노출

모든 종류의 시료 표 1. 개요 응용 프로그램 (bioreporter 분석 - CLSM 또는 화학 물질 정량화 - GC / MS)를 포함한 모든 제어 및 테스트 샘플의 요약.과 성분 조성기 (FLU, 균사체 및 bioreporter 세포).

오븐
초기 온도 50 ° C
초기 시간 2 분
15 ° C의 분 -1
최종 온도 300 ° C
최종 시간 6.33 분
인젝터 (PTV)
사출 볼륨 0.5 μL
모드 비분
숙청 2.00 분
퍼지 흐름 50.0 ml의 분 -1
초기 온도 80 ° C
초기 시간 0.02 분
경사로 : 평가 600 ° C의 분 -1
최종 온도 300 ° C
최종 시간 10 분
기둥
모델 J & W DB-5MS
공칭 길이 20m
공칭 직경 180 μm의
공칭 막 두께 0.18 μm의
캐리어 가스 0.8 ml의 분 헬륨 -1
MSD Transferline 280 ° C
MSD
시뮬레이션 모드
MS 소스 230 ° C
MS 쿼드 150 ° C

Q에 GC와 MS에 대한 모든 설정의 GC / MS. 요약 2. 설정소우주의 설정에 uantify 플루 오렌.

주의 할 점 COMMENT
(1) 예비 성장과 활력 테스트 선택의 균사 유기체의 성장을 연구. 얼마나 MMA 패치에 도달하기 위해 걸립니까? 또한 사이클로 헥 장벽에 의해 억제된다? 또한 bioreporter 세포가 MMA에 조물 분석을 통해 전체 시간을 생명 유지 여부를 확인합니다. 그렇지 않다면, 하나는 bioreporter 유도 초래하지 않는 MMA에 탄소원을 추가 할 수있다. 박테리아와 균사의 가능한 상호 억제를 제외합니다.
균사 생장 속도 그렇지 PAH의 기상 수송 장시간 배양 시간에 따라 증가하기 때문에 균사체 유기체의 성장 속도가 너무 느리다는 안된다. 프로토콜이 적응 될 수있다나중에 지점에서 PAH를 추가,하지만 다시 접종 점에서 균사체는 더 이상 활성화되지 않을 수 있습니다.
3 세균 이동 포인트 스캐닝 레이저 현미경을 사용하여 박테리아 균주, 운동성 인 경우 Z-스택의 기록 및 정량 인해 MMA의 내부 움직임에 불가능할 수있다. 따라서, 박테리아의 이동은 고속 스캐너 또는 회전 디스크 레이저 현미경과 CLSM을 사용하여, MMA의 견고 함을 증가시킴으로써, 예를 방지해야한다.
4 기상 수송 bioreporter 세포 기상 화학 물질에 매우 민감하기 때문에 bioreporter 셀 향해 화학 (예, PAH)의 기상 수송 충분히 배제되어야한다. 이것은 수송 기체에 의한 위양성 결과를 방지하기 위하여 전체 프로토콜 중요한 점이다. 기상(-) 농도 CON 공기의 화학 분석을 통해 추정 할 수 있고, 기상 농도는 활성탄 다소간 아가 패치를 추가함으로써, 예를 들어 조절 될 수있다.
(5) 독성 시험 화학 물질의 높은 농도가 균사체 생물 및 / 또는 박테리아에 독성 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의하십시오.
(6) 자기 형광 선택한 균사 유기체가 예상 bioreporter 신호의 범위에서 약간의 형광도를 보여줍니다 있는지 확인합니다. 자가 형광 17 다양하기 때문에 서로 다른 성장 단계에서 확인하시기 바랍니다. 자가 형광이 감지되면 균사가없는 지역에서 Z-스택을 기록해야합니다.
7 표백 mCherry 형광은 일반적으로 안정적이고 적용 BI 표백에 민감하지 않다oreporter 세포. 대조적으로, eGFP는 오히려 빨리 표백. 따라서, Z-스택 녹음하기 전에 샘플을 시각화하기 위해 eGFP는 채널을 사용하지 마십시오.
8 eGFP는 유도 우리는 SAM에서 낮은 eGFP는 유도가 POS를 CON에 비해났습니다. 이 독감의 매우 낮은 기상 농도 (참조, 마지막 결과 단락)을 유지하기 위해 강한 공간 제한 및 독감 소스의 낮은 접근성으로 회계. 선택된 bioreporter 균주 및 화학에 따라, PDA (1)의 흡수 영역은 전송 속도 (도 5B)를 증가하도록 변화 될 수있다. 그러나, 이것은 또한 셀 bioreporter 향해 기상 수송을 증가시키는 것으로 간주되어야한다.
9 eGFP는 확인해 계산 녹색 픽셀의 강도가 비교된다 eGFP는 확인해위한 계산 방법을 제시적색 화소 영역에 오직 하나의 가능성이다. 자세한 내용은 설명을 참조하십시오.
(10) 픽셀 크기 선택된 렌즈의 배율과 잠재적 적용 줌 배율 화상의 화소 크기에 영향을 알려드립니다. 이것은 이미지 분석 전에 고려되어야한다.
(11) 생물학적으로 분수 수송 화합물의 생체 이용률은 eGFP는 유도를 통해 (안 정량적) 질적으로 평가된다 명심하십시오. 계산 된 상대 eGFP는 유도 및 생체 부분의 어떤 상관 관계가 시도되지 않았다. 그러나, 이것은 미래의 애플리케이션에서 다루어 질 수있다.
(12) 검출 한계 화학 물질 측정. 유기 화합물의 화학 정량화 concen 광범위한trations 확실하게 검출 할 수있다. 우리는 범위 0ng 및 내지 1,000 ng의 양을 감지했습니다. eGFP는 정량. (; 참조, 4 및도 5 (20)와 이송 40ng 사이) 및 오염 물질 소스에 직접 접촉 (즉, 최대 우리는 균사체 매개 수송과 오염 물질 수송없이 샘플에서 상대 eGFP는 유도 (즉은, 수송 0ng), 비교 사용 가능한 양). 이 세 가지 경우가 한 방법으로 잘 구별 할 수있는 것으로 판명. 그러나, 우리는 상대적 eGFP는 유도의 해상도에 대한보다 상세한 진술을 할 수 없습니다. 이 문제는 축소판 셋업에 상관 유도 eGFP는 서로 다른 양의 오염물을 연결하여 미래에서 해결 될 수있다.
(13) 페트리 접시 재료 플라스틱 페트리 접시는 균사 PAH 전위 및 / 또는 생체 이용률의 과소 평가 될 수 있습니다. 이것은해야하지질적 문이 열망하는 경우, 문제가 될 수. 경우 정확한 정량적 측정, 필요한 유리 페트리 접시의 응용 프로그램이 더 불편할 것입니다 준비 및 취급에도 불구하고 고려되어야한다.

가능한 함정 표 3. 토론. 이전 및 실험과 제안 된 의견과 옵션 중 가능한 함정.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

제시된 소우주 설정은 균사체에 의한 흡수와 수송 후 생물 분해에 공간적으로 분리 된 화학 물질의 생체 이용률을 연구하기에 적합 증명했다. 부분적 휘발성 화합물의 잠재적 기상 수송이 방지된다 bioreporter 박테리아 세포 성 시스템으로의 방해를 최소화하므로 정교한 시료 전처리없이 가시화 될 수있다. 동시에, 시료의 화학적 분석을 용이 얻은 결과 양호한 제어 및 전송의 총 수 정량을 실시 할 수있다. 그러나, 일부 포인트에 앞서 및 실험을 수행 할 때 고려되어야한다. 중요한 점은 어떤 세균이나 화학 교차 오염의 무료 소우주를 유지하는 것입니다. 많은 소우주가 병렬로 실행되며, 따라서, (예를 데시 케이 터 등의) 큰 배양 챔버가 요구되기 때문에 이것은 문제가 될 수있다. 그러므로, 설치 CO​​NSTRUC하기에 앞서 모든 부분을 소독하는 것이 중요하다기. 또 다른 중요한 점은 소우주 플라스틱 페트리 접시를 적용 할 수있다. PAH bioreporter과 직접 접촉하지 않지만, 어느 정도의 PAH는 플라스틱 재료에 의해 흡수 될 수있다. 이 초래하기 때문에, 우리는 균사 PAH-전위 및 / 또는 생체 이용률의 과소 평가 (있는 경우), 설명 프로토콜이 문제가되지 고려하십시오. 정확한 정량화가 요구되는 경우보다 취급이 불편지라도 어떤 경우, 또, 유리와 플라스틱 부품의 부품 교환을 고려하여야한다. 고려되어야 다른 점은 선택된 세균과 곰팡이 균주 (가능한 상호 억제, 성장 속도, 이동 가능한자가 형광), 선택된 화학 물질과 실용적인 측면 (표백, eGFP는의 제한 (미생물, 휘발성, 검출 한계에 독성을) 포함 유도 및 eGFP는 확인해 계산). 잠재적 인 함정과 각각의 코멘트 요약에서 찾을 수 있습니다표 3.

우리는 직접 세포 균사체 상호 작용 수준에 불포화 시스템의 균사 독감 수송 및 후속 세균 저하를 설명하기 위해이 모델의 축소판 설정을 사용했다. 이 모델 셋업 변화와의 존재 하에서 박테리아에 균사의 영향을 평가하기 때문에, 시스템은 예를 들어 (I)에 대해 사용될 수있는 다양한 세균성 균주, 화학적 화합물, 서로 다른 요구를 충족하기 위해 조절 될 수있다 그렇지 않으면 제한된 화학적 (예, 독성) 소스, (Ⅱ) 세균 분해 화합물의 생체 이용률에 균사의 영향을 예측하기는, (ⅲ) 운반 벡터 또는 박테리아의 거리에 따라 오염물 생체 이용률을 연구하는 (ⅳ) 다른 화학 소스 (예를 들어, 결정, 또는 토양에 용해)의 효과를 조사한다. 그러나, 시스템에 조정lternate 조건 섬세되며 명확한 결과를 달성하기 위해 단계적으로 수행되어야한다. 지금까지, 우리는 다른 박테리아 또는 곰팡이 균주 및 PAH 이외의 화합물에 대한 시스템을 테스트하지 않았습니다. 균사 네트워크는 살충제 또는 살리 실 레이트 19 20 등 수용성 물질과 같은보다 PAH 다른 오염 물질을 수송하는 공지되어 있기 때문에, 우리는 시스템이 복합 - 특정 세균 바이오 센서의 주어진 다른 화학적 화합물에 확장 될 수 있다고 생각한다.

적용 bioreporter에 따라하는 eGFP는 확인해 다른 계산이 바람직 할 수도 변형주의하시기 바랍니다. 대신 식 (1)의 다음과 같은 두 가지 옵션을 적용 할 수 있습니다 :

식 (2) (2)

식 (3) (3)

HoweveR, 제시된 프로토콜 식 (1) 다음과 같은 이유로 선택 하였다 : (II) mCherry가 서로 다른 셀 (13)에 대한 상당한 변화를 표시하는 것으로보고되었다 반면 (I) eGFP는 강도가 셀 (14)에 PAH 플럭스 상관 알려졌다 . 식 (2) 및 (3) 이와 달리, 샘플에 잠재적 광 인공물로 인한 오동작을 방지하기 위해 정보를 선택 될 수있다. 임의의 경우에, 우리는 통계 학적으로 유의 한 차이가 발견되지 않았다함으로써, 서로 세 계산 방법을 비교 하​​였다. 그럼에도 mCherry의 형광 강도의 변화에​​ 의한보고, 우리는 방정식을 사용하여 추천 (1) 또는 (2).

결국, 기술의 몇 가지 제한 사항이 고려되어야한다. 소우주가 시험 화합물의 기상 수송을 방지하도록 설계 되었기 때문에, 상기 화합물의 균사체 흡수가 감소된다. 이것은 흡수 방해받지 예상되는 것보다 더 낮은 전송 속도 초래한다. 비오레의 따라서, 감도포터 균주는 생물학적으로 분수에 작은 변화를 감지하기에 충분히 높아야한다. 또한, 설정은 아마 낮은 성장률 곰팡이 균주에 적합하지 않습니다. 이 경우, 장기 배양 따라서 위양성 선도 오염물 기상 수송을 선호 할 수 있습니다. 이것은 오염물이 나중 시점에서 적용될 수있는 방식으로 설정을 수정하는 것이 가능할 것이다. 그러나, 균사는 접종 시점에서 이미 비활성 또는 사망 할 수있다. 상기 한 바와 같이 마지막으로, 네트워크에 의해 균사체 반송되는 화학적 화합물의 범위는 크다. 그러나, 적절한 bioreporter 균주의 가용성은 제한 핵심 요소가 될 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal Microscope Leica TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM
GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD Agilent an equivalent GC/MS may be used
GC capillary column J&W 121-5522              Agilent
Cork borer Fisher Scientific 12863952 or any other
Cover slips Marienfeld 107222 High performance, No.1.5H
GC/MS insterts WICOM WIC 47080
GC/MS vials 2 ml WICOM WIC 41150
Lids / septa for screw cap vials DIONEX 49463 / 049464 
Lids for GC/MS vials WICOM WIC 43948/B
Objective Slides Menzel ordinary
PDMS coated glass fibers Polymicro Technologies, Inc. V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1
Petri Dishes small / big Greiner 633-102 / 628-102
Screw cap vials 40 ml DIONEX 48783 other glass vials may be used
Screw cap vials 60 ml DIONEX 48784 other glass vials may be used
Acenaphthylene d08 Dr. Ehrenstorfer C 20510100
Acetone Carl Roth 9372.2
Activated carbon Sigma-Aldrich 242276-1kg
Agarose Carl Roth 2267.4
Fluorene Fluka 46880
Kanamycin sulfate Carl Roth T832.2 50 mg L-1
Methanol Carl Roth P7171
Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest
Solution 1
Ammonium sulfate Carl Roth 3746.1 5 g L-1 
Magnesium chloride x 6 H2O Carl Roth 2189.1 1 g L-1
Calcium nitrate x 4 H2O Carl Roth P740.1 0.5 g L-1
Solution 2
Disodium phosphate Carl Roth P030.1 55.83 g L-1
Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1 20 g L-1
Solution 3 (pH 6.0)
Disodium EDTA MERCK 1084180250 0.8 g L-1
Iron(II) chloride x 4 H2O MERCK 1038610250 0.3 g L-1
Cobalt(II) chloride x 6 H2O Carl Roth T889.3 4 mg L-1
Manganese(II) chloride x 1 H2O Carl Roth 4320.2 10 mg L-1
Copper(II) sulfate Carl Roth P023.1 1 mg L-1
Sodium molybdate x 2 H2O Carl Roth 0274.1 3 mg L-1
Zinc chloride MERCK 1088160250 2 mg L-1
Lithium chloride Carl Roth P007.1 0.5 mg L-1
Tin(II) chloride x 2 H2O Carl Roth 4473.1 0.5 mg L-1
Boric acid Riedel-de-Haen              11606 1 mg L-1
Potassium bromide Carl Roth A137.1 2 mg L-1
Potassium iodide Carl Roth 6750.1 2 mg L-1
Barium chloride Carl Roth 4453.1 0.5 mg L-1
MMA Minimal medium + agarose 0.2%
Phenanthrene d10 Dr. Ehrenstorfer C 20920100
Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8
Potato Dextrose broth Difco/ Beckton Dickinson 254920
Bacto-agar Difco/ Beckton Dickinson 214040
Sodium acetate x 3 hydr. Carl Roth 6779.1
Sodium sulfate MERCK 1066495000
Toluene MERCK 1083252500
mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl
Yeast extract Merck 1037530500
Tryptone Serva 4864702
Sodium chloride Carl Roth 3957.1
ImageJ with logi tool plugin http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum strain 67-1 Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland
Burkholderia sartisoli RP037-mChe Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
  2. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
  3. Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
  4. Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
  5. Griffin, D. M. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. Soil Science Society of America. 141-151 (1981).
  6. Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. Soil Science Society of America. 1-22 (1981).
  7. Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
  8. Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
  9. Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
  10. Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
  11. Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
  12. Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
  13. Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
  14. Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
  15. Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
  16. Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. Manual of methods for general bacteriology. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).
  17. Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  19. Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).
  20. Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
전체 셀 Bioreporter 접근 물 불포화 시스템에서 유기 오염 물질의 운송과 생체 이용률을 평가하기 위해
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).More

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter