Summary
Een hele cel bioreporter test met Burkholderia sartisoli RP037-mChe is ontwikkeld om fracties van een organische verontreiniging (dwz fluoreen-) beschikbaar voor bacteriële degradatie na actief transport door mycelium overbruggen met lucht gevulde poriën in een water onverzadigd modelsysteem detecteren.
Introduction
Grond wordt dichtbevolkt door een groot aantal micro-organismen zoals bacteriën 1,2. Echter, omstandigheden in deze habitat zijn uitdagend, vooral in termen van de beschikbaarheid van water 3. Bacteriën permanent te zoeken naar optimale omstandigheden in heterogene omgevingen 4, maar de afwezigheid van continue water films resulteert in beperkte mobiliteit 5 belemmeren hen om vrij te verspreiden. Ook diffusiesnelheden van opgeloste stoffen (bijv nutriënten) verlaagd onder onverzadigde omstandigheden 6. Aldus bacteriën en voedingsstoffen worden vaak fysiek gescheiden en toegankelijkheid nutriënt beperkt 3. Bijgevolg kan een transport vector chemische verbindingen die een continue waterfase niet vereist helpen om deze beperkingen te overwinnen. In feite hebben vele micro- organismen zoals schimmels en Oomycetes een filamenteuze groeivorm waarmee zij groeien door met lucht gevulde poriën waardoor het bereiken mobi ontwikkeldlizing ook fysiek gescheiden voedingsstoffen 7 en 8 koolstofhoudende stoffen over lange afstanden. Ze kunnen zelfs fungeren als biologische vervoer vectoren die suikers en andere energiebronnen om bacteriën 9 leveren. Opname en transport in mycelium organismen is ook aangetoond voor hydrofobe organische verontreinigingen zoals polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's) in Pythium ultimum 10 of arbusculaire mycorrhiza 11. Aangezien PAK zijn alomtegenwoordig en slecht in water oplosbare verontreinigingen 12 in de bodem, zou-mycelium gemedieerd transport helpen om verontreiniging biobeschikbaarheid voor potentiële bacteriële afbrekers verhogen. Dat de totale hoeveelheid verontreinigingen transport direct kunnen worden met chemische middelen 10, biobeschikbaarheid van verontreinigingen met mycelia vervoerd afbrekende bacteriën en andere organismen kunnen niet gemakkelijk worden beoordeeld.
Het volgende protocol toont een werkwijze om de invloed van myce evaluerenlia op verontreiniging biobeschikbaarheid om bacteriële afbrekers op een directe manier; staat het verzamelen van informatie over de spatiotemporele invloed van verontreinigingen op de microbiële ecosystemen. We beschrijven hoe het opzetten van een uitgebreid onverzadigd microkosmos systeem nabootsen van lucht-water-interfaces in de bodem door het koppelen van een fysiek gescheiden PAK puntbron met PAK-afbrekende bioreporter bacteriën via mycelial vervoer vectoren. Omdat de lucht vervoer is uitgesloten, kan het effect van mycelium vervoer op basis van PAK biobeschikbaarheid voor bacteriën worden bestudeerd in een geïsoleerde manier. Meer in detail werden drierings PAK fluoreen, het mycelium organisme Pythium ultimum en bioreporter bacterie Burkholderia sartisoli RP037-mChe 13 toegepast in de beschreven microkosmos setups. De bacterie B. sartisoli RP037-mChe werd oorspronkelijk gebouwd om fenantreen stromen naar de cel 14 bestuderen en tot expressie versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) als gevolg van de PAH fluxde cel, terwijl de rode fluorescerende mCherry constitutief wordt uitgedrukt. Gedetailleerde informatie over de verslaggever bouw wordt gegeven door Tecon et al. 13 In voorproeven, de bacterie bleek geen zwemmen en slechts zeer langzaam zwermen vermogen. Het kon langzaam migreren op hyfen van Pythium ultimum wanneer toegepast als een dichte suspensie bovenop de hyfen. Aangezien bacteriën werden ingebed in agarose in het volgende protocol leverde migratie hyfen optreden.
Met behulp van confocale laser scanning microscopie (CLSM), kan de bioreporter bacteriën direct gevisualiseerd in de microkosmossen en expressie van eGFP kan worden gekwantificeerd in verhouding tot het aantal cellen (evenredig met de mCherry signaal) met behulp van de software ImageJ. Dit maakt vergelijking biobeschikbaarheid kwalitatief verschillende scenario (dwz hoger of lager). FLU werd gevonden biologisch beschikbaar na het mycelium vervoer door P. te zijn ultimum (dat wil zeggen, hethoger dan in een negatieve controle). Bovendien is het protocol wordt beschreven hoe u het totale bedrag van-mycelium gemedieerd transport via chemische middelen te kwantificeren en verontreiniging biologische beschikbaarheid controleren met behulp van silicium gecoate glasvezels (SPME vezels) in identieke microkosmos. Resultaten van deze microcosm ingesteld zijn gepubliceerd en besproken voor de combinatie van P. ultimum, fluoreen en B. sartisoli RP037-mChe 15. Hier ligt de focus op een gedetailleerde beschrijving methode en de identificatie van mogelijke valkuilen van het protocol bij deze kennis bieden voor mogelijke verdere toepassingen. Verdere toepassingen kunnen diverse schimmels, bacteriële soorten (bijvoorbeeld van verontreinigde locaties) te betrekken, en andere verontreinigingen (bijvoorbeeld pesticiden) of verontreiniging-aanbod (bv leeftijd bodems).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de gerechten, dia's en Incubation Chambers
- Bereid het volgende materiaal voor elke microkosmos: één grote plastic petrischaal bodem (d = 10 cm), een gewijzigd (zie stap 1.2) kleine plastic petrischaal bodem (d = 5 cm) met deksels en een telkamer glijbaan met drie gaatjes.
- Neem het gewenste aantal petrischaal onderste delen (d = 5 cm). Verwijder een deel van de rand met een zaag precies past een dia (26 mm rand lengte). Om het systeem te steriliseren, geniet petrischaal bodems en deksels in 70% ethanol O / N en drogen gedurende minstens 2 uur in een flowkast onder UV-licht. Bewaar de petrischalen in een goed afgesloten plastic container, die tevens waren blootgesteld aan UV-licht gedurende 2 uur.
- Veeg het gewenste aantal dia's met 70% ethanol en air-droog ze. Wikkel dia's in aluminiumfolie en leg ze in een moffeloven gedurende 5 uur bij 450 ° C om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Bereid glas incubatie kamers met deksels. Reinigen met 70% ethanol en een open kamers blootstellen aan UV-licht gedurende minstens 2 uur in een stroom kast.
OPMERKING: Large exsiccatoren (diameter ongeveer 30 cm) met een deksel kan worden gebruikt voor dit doel; elke exsiccator kan huis tot tien microkosmos setups.
2. Voorbereiding van Media en Cultuur
- Aan 20 parallel microkosmossen werking verkrijgen 100 ml gemodificeerde trypton gist medium (MTY) 14 150 ml 21C minimaal medium 16 (MM), 5 ml minimaal medium agar (MMA, 0.5%, w / v), drie aardappel dextrose agar platen (PDA, 1,5% w / v) voor P. ultimum, vier lege platen, een PDA plaat met 2 mg L -1 cycloheximide, vier agarose platen (3% w / v) die 0,3 ml -1 g actieve kool en 40 mg FLU in 2 mg porties.
- Bereid MTY met 50 mg L -1 van kanamycine (kanamycine is required het eGFP reporterplasmide) en MM dat 10 mM acetaat voor bacteriële kweek behouden. Gebruik MM zonder acetaat voorbereiden 0,5% MMA voor de immobilisatie van bacteriën in de microkosmossen en giet platen (elk 20 ml) van 1,5% PDA teelt van Pythium ultimum en microkosmos opstellingen.
- Te enten sommige hyfen van P. ultimum drie verse PDA platen en incubeer in het donker bij 25 ° C gedurende ongeveer 72 uur. Zorgen dan dat de platen zijn overwoekerd volledig door verse en pluizige mycelium.
- Start twee culturen van B. sartisoli RP037-mChe in 50 ml Mty uit een glycerol voorraad. Incubeer bij 30 ° C met 230 rpm roterende kolf beweging O / N.
- Meet cultuur optische dichtheid (OD) bij 578 nm en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 10 min (voor B. sartisoli RP037-mChe, de verwachte OD 578 is ongeveer 1,0 en cellen in exponentiële fase). Gooi supernatant en resuspendeer de celleneen geschikte hoeveelheid MM om een OD 578 van 0,4 te bereiken. Inoculeer 20 ml MM dat 50 mg L -1 kanamycine met 400 ul van de geresuspendeerde cellen. Incubeer bij 30 ° C met 230 rpm roterende kolf beweging O / N.
- Meet OD 578 van de cultuur in MM (voor B. sartisoli RP037-mChe, de verwachte OD 578 is ongeveer 0,2 en cellen zijn in het begin van exponentiële fase). Centrifugeer kweken bij 2000 xg gedurende 10 min en resuspendeer de cellen in een geschikte hoeveelheid van MM om een OD van 0,4 te bereiken. Meng 50 pi van de celsuspensie met 500 pl warm, vloeibaar MMA in 2 ml buizen en opslag bij 50 ° C tot gebruik. Gebruik 150 ul cellen in MMA per microkosmos.
- Giet platen agarose gel met actieve kool. Smelt agarose (3%, w / v) met tweemaal gedestilleerd water. Meng grondig met actieve kool (0,3 g ml -1) en giet het mengsel in plastic petrischaaltjes(D = 10 cm).
3. microkosmos Montage
Opmerking. Het volledige microcosm setup is schematisch weergegeven in figuur 1, zie figuur 1 voor volgende stappen. De volgende stappen beschrijven de bereiding van een monster (SAM) met mycelium transport vectoren en drie verschillende control instellingen (CON AIR CON NEG, CON POS). Een overzicht van alle verschillende setups zijn te vinden in tabel 1.
- Neem gewenste aantal petrischalen en dia's en hen blootstellen aan UV-licht onder een stroom kast voor 30 min.
- Plaats de kleine petrischaal in de grote en past de dia door de opening van de kleine petrischaal. Neem een monster van de warme celsuspensie in MMA en voeg 150 ul in de middelste holte van een glijbaan. Herhaal deze stap totdat het midden holten van alle dia's zijngevuld met MMA. Wacht 5 minuten voor MMA stollen.
- Gebruik een 1 cm kurkboor om punch-out ronde patches van een lege PDA plaat. Plaats een pleister op een afstand van 2 mm naast het MMA in de kleine petrischaal. Voeg dit myceliumgroei in de setup (PDA 3 in figuur 1) te bevorderen.
- Snijd gebogen PDA patches mechanische barrières. Gebruik een schone en steriele kleine petrischaal onderste deel en druk het in een PDA plaat. Gebruik een spatel om een kleinere ring gesneden op een afstand van 0,5 cm in de agar waardoor een PDA-ring.
- Snijd een stuk, die precies past in de opening van de kleine petrischaal in de microkosmos setup en plaats deze in het gat boven op de slede. Controleer of de afstand tussen MMA en de ronde PDA barrière ongeveer 2 mm. Sluit het deksel van de kleine petrischaal voorzichtig drukken in de PDA barrière.
- Herhaal de stappen 3.4 en 3.4.1 met een PDA plaat met 2 gram L -1cycloheximide.
LET OP: Dit is de controle setup voor lucht transport (CON AIR) naar de bioreporter cellen, omdat mycelium worden geremd door cycloheximide en niet overwoekeren MMA.
- Gebruik een 1 cm kurkboor om punch-out ronde vlekken van een lege PDA plaat. Gebruik een andere 0,5 cm kurkboor te snijden uit het midden van de eerste patch. Plaats de resulterende kleine PDA-ring op een afstand van 1 mm naast de barrière PDA (PDA 1 in Figuur 1).
- Voeg 2 mg GRIEP in het gat van de PDA 1. Gebruik een 1 cm kurkboor uit te snijden ronde patches van PDA-platen begroeid met P. ultimum en plaats een patch (PDA 2 in figuur 1) onderkant naar beneden op de PDA ring zodat het mycelium mat wordt geconfronteerd met de FLU kristallen.
- Herhaal de vorige stap zonder FLU kristallen toe te voegen.
LET OP: Dit is de negatieve controle setup (CON NEG) naar de achtergrond te bepalenfluorescentie van bioreporter cellen.
- Herhaal de vorige stap zonder FLU kristallen toe te voegen.
- Gebruik een 1 cm kurkboor om punch-out ronde patches van de agar met actieve kool. Plaats vier plekken in elke microkosmos setup om de gasvormige FLU concentratie (Figuur 1) verder te verlagen.
- Bereid een positieve controle (CON POS). Voeg wat FLU kristallen tot 200 ul van MMA celsuspensie en zet het in een holte van een lege dia.
- Plaats een petrischaal (d = 10 cm) met een aantal poeder van actieve kool op de bodem van de incubatiekamer gasvormig FLU concentratie in de kamer te minimaliseren. Plaats bovendien 04:56 50 ml bekers met steriel water op de bodem te hoge luchtvochtigheid in de kamer te handhaven.
- Overdracht microcosm opstellingen in incubatie kamers en incubeer bij 25 ° C gedurende 96 uur. Leg monsters willekeurig in de verschillende groeikamers om locatie-effecten uit te sluiten.
LET OP: Deze incubatietijd aplagen de oomyceet P. ultimum. Het kan verschillend zijn voor andere organismen.
- Overdracht microcosm opstellingen in incubatie kamers en incubeer bij 25 ° C gedurende 96 uur. Leg monsters willekeurig in de verschillende groeikamers om locatie-effecten uit te sluiten.
4. confocale laser scanning microscopie
- Idealiter gebruik een CLSM setup met rechtopstaande microscoop.
NB: Het kan worden uitgerust met conventionele lasers aanbieden bv 488, 561 en 633 nm lijnen voor excitatie of met een regelbaar wit laserbron. - Gebruik de volgende instellingen voor het verzamelen van beelden: excitatie: 490 nm (eGFP) en 585 nm (mCherry) op de juiste laserintensiteit (gelijktijdige excitatie); emissie bereik: 500-550 nm (eGFP) en 605-650 nm (mCherry); objectief lens: 63x NA 0,9 water dompelpompen (wegens zijn lange werkafstand); stapgrootte voor z-stacks: 0,5 urn.
- Open microkosmos setup en gebruik een scalpel om PDA 1, 2, 3 en de PDA barrière te verwijderen. Zet een glazen deksel slip op de top van de MMA en druk deze voorzichtig om luchtbellen te verwijderen. Mount dia op microscoop podium. Voeg een druppel water op de top van the dekglas en gebruik mCherry instellingen bioreporter cellen in het monster te vinden.
- Hier krijg je een snel overzicht van het monster en de signaal-ruisverhouding te optimaliseren met behulp van een gloed-over-under opzoektabel voor rood (mCherry) en groen (eGFP) kanaal. Kies een willekeurige positie op de steekproef naar bioreporter fluorescentie analyseren.
OPMERKING: hyfen kunnen autofluorescentie vertonen in het traject van bioreporter emissie (bijvoorbeeld groen autofluorescentie) 17. Zorg ervoor dat u gebieden selecteren zonder schimmeldraden als dit het geval is. - Definiëren en op te nemen z-stacks voor elke positie in de groene (eGFP) en de rode (mCherry) kanaal. Vermijd bleken van het monster door langdurige blootstelling aan epifluorescentie licht of laserlicht.
- Herhaal de vorige stap voor tien willekeurig, gelijkmatig verdeeld posities.
- Herhaal alle stappen met dezelfde instellingen voor alle monsters van de testbaan (SAM), Con Air, CON NEG en CON POS. 5. Image Analysis
- Zorg ervoor dat u de logi_tool plugin (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/) te installeren.
- Open het bestand in ImageJ. Selecteer "split-kanalen" en dicht groene kanaal. Gebruik de macro 'mCherry gebied' verstrekt als aanvullende code bestand op gebied van rode fluorescentie te kwantificeren in z-stack. Pas de gewenste instellingen in de macro (vetgedrukt).
- Uitgang is een tafel met de gemeten pixels boven de drempel (en boven de gedefinieerde minimale grootte) in z-stack.
OPMERKING: De som van alle waarden is het totaal aantal rode pixels (gebied) in de stapel.
- Uitgang is een tafel met de gemeten pixels boven de drempel (en boven de gedefinieerde minimale grootte) in z-stack.
- Open het bestand in ImageJ. Selecteer "split-kanalen" en dicht rode kanaal. Gebruik de macro 216; eGFP int 'verstrekt als aanvullende code bestand naar intensiteit van de groene fluorescentie te kwantificeren in z-stack. Pas de gewenste instellingen in de macro (vetgedrukt).
- Uitgang is een tabel met de gemiddelde intensiteiten en de oppervlakte van alle groene objecten boven de drempel (en boven de gedefinieerde minimale grootte) in z-stack. Om de totale intensiteit van de groene pixels te berekenen in de stapel, vermenigvuldig elke gemiddelde intensiteit van het overeenkomstige gebied.
- Bereken de relatieve eGFP inductie (eGFP rel):
(1)
OPMERKING: Aangezien mCherry constitutief tot expressie wordt gebracht, de resulterende waarde van eGFP rel is een relatieve maat voor de hoeveelheid eGFP een bepaalde hoeveelheid cellen uitgedrukt. Zie ook tabel 3 voor meer informatie over de berekening van eGFP rel. - Wikkel 15 ml glazen flesjes, 1 ml GC / MS flesjes en inzetstukken in aluminiumfolie. Vul verdampen gerechten met Na 2 SO 4; eerst alle in moffeloven gedurende 5 uur bij 450 ° C om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Bewaar de Na 2 SO 4 binnenkant van een geactiveerde exsiccator.
- Snijd PDMS gecoate glasvezels in 0,5 cm lengte. Was vezels door schudden vier keer 2 uur in verse methanol. Herhaal het wassen van de stappen nog eens vier keer met ultrapuur water en winkel schoon vezels in ultrapuur water in een afgesloten glazen flesje.
- Bereid 1,5 liter tolueen / aceton (3: 1, v / v) bevattende 10 ug L -1 fenantreen-10 d.
- Voer stappen 1, 2 en 3 van het protocol. Bereid microkosmossen zonder bior(-) en Con Air (- SAM ()) eporter cellen om FLU transport te bestuderen en met bioreporter cellen (SAM) om FLU degradatie te controleren.
- Optioneel (zonder bioreporter cellen): Plaats drie PDMS gecoate glasvezels (meestal gebruikt voor SPME experimenten) als kunstmatige en kwantificeerbare verontreiniging gootsteen binnen MMA van SAM (-) met behulp van fijne pincet.
- Verwijder glasvezels met behulp van fijne pincet en breng een ieder in een GC / MS flacon met insert.
- Voeg 200 ul van tolueen en schud verticaal O / N en analyseren via GC / MS. Gebruik de instellingen in Tabel 2.
- Transfer MMA uit het midden holte in een 15 ml glazen flesje en voeg ongeveer drie spatels van Na 2 SO 4. Meng goed met een spatel en voeg 10 ml oplosmiddel. Vortex het mengsel en schud horizontaal O / N in het donker.
- Breng 1001; l van het monster in GC / MS flacon met insert. Voeg 10 ul van acenaftyleen-d 08 (10 mg L-1) en geanalyseerd via GC / MS met hetzelfde programma als beschreven in 6.4.3.
OPMERKING: Om rode (mCherry) en groen (eGFP) fluorescentie analyseren in de z-stacks opgenomen, onder andere opties de gratis software ImageJ 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) kan zijn gebruikt.
(1) OPMERKING: Microcosm opstellingen kunnen ook worden gebruikt om de chemische kwantificering van translocatie FLU bedragen met of zonder abiotische verontreiniging wastafel voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier gepresenteerde resultaten zijn reeds eerder 15 gepubliceerd. Verwijzen wij u naar het artikel voor gedetailleerde mechanistische en milieu-discussie.
Na beeldopname via CLSM kan een maximum intensiteitsprojectie worden uitgevoerd met respectieve microscoop software of ImageJ een eerste visuele indruk van het monster en de controles (figuur 2) te verkrijgen. Later kunnen de gegevens anders worden geprojecteerd om betekenisvolle eigenschappen specifieke visualiseringsoftware tonen. De positieve controle (CON POS) toont verschillende eGFP inductie (Figuur 2A), terwijl de lucht control (CON AIR) in eGFP achtergrond fluorescentie (figuur 2B) vertoont. eGFP fluorescentie in het testmonster (SAM) lijkt verhoogd vergeleken CON AIR, yet niet zo gemarkeerd als CON POS (figuur 2C). De mCherry fluorescentie is onafhankelijk van PAH degradatie en dus gelijk voor alle monsters. Echter licht verhoogde eGFP signalen niet worden gemeten door deze methode en daaropvolgende beeldanalyse essentieel.
Voor de geteste microkosmos, werd visuele inspectie aangevuld met beeldanalyse en de berekening van de relatieve eGFP inductie (zie stap 5 ev van het protocol; figuur 3). De groene achtergrond fluorescentie voor niet-geïnduceerde B. sartisoli RP037-mChe wordt berekend met CON NEG. Onder de gegeven omstandigheden, werd de relatieve eGFP inductie gevonden om eGFP rel te zijn = 0,53. Geen significant verschil kon worden gedetecteerd tussen CON NEG en Con Air (eGFP rel = 0,54; p> 0,95) dus elke dampfase GRIEP vervoer naar de bioreporter cellen exclusief. Voor CON POS, hoog verheven eGFP inductie (eGFP rel = 53.7) bleek bevestiging van de vitaliteit van de cellen in MMA na 96 uur en vertegenwoordigt de maximale eGFP inductie. In aanwezigheid van mycelia en FLU (SAM), werd eGFP aanzienlijk geïnduceerd in de cellen vergeleken met de negatieve controles (eGFP rel = 1.15; p <0,001). De eGFP inductie relatief laag in vergelijking met de positieve controle (zie tabel 3, punt 8).
Vervoer van FLU door mycelium van P. ultimum in de microkosmos setup werd chemisch gekwantificeerd (zie stap 6 ev van het protocol; Figuur 4). In aanwezigheid van FLU en P. ultimum (SAM (-)), mycelia transgelegen op ongeveer 25 ng van FLU binnen 96 uur waarin een transportsnelheid van 37.5pmold -1 cm -1 evenaart. Controles in de afwezigheid van mycelia (CON AIR (-)) onthulde gasvormige FLU vervoer naar de MMA in het bereik van slechts 2 ng binnen 96 uur, dat wil zeggen, kan inductie van de bioreporter door dampfase-concentraties worden uitgesloten. Wanneer B.sartisoli RP037-mChe aanwezig was (SAM), <1 ng van FLU werd gedetecteerd in de MMA patch. Dit geverifieerd effectieve bacteriële FLU degradatie na de-mycelium gemedieerde translocatie.
Het is mogelijk de invloed van bacteriële degradatie, dwz een FLU gootsteen op FLU translocatie onderzocht door toevoeging van een abiotische verontreiniging zinken naar het systeem (zie stap 6.4.1 en volgende van het protocol). Derhalve is men in staat om de hoeveelheid FLU geabsorbeerd door de vezels en de hoeveelheid achtergebleven in de MMA en bovenliggende hyfen kwantificeren. Voor SAM(-), De translocatie totale bedrag onafhankelijk is van de aanwezigheid van een verontreiniging sink (p> 0,9; figuur 5A). Echter een microkosmos met verhoogde FLU opname stippellijn ook getest zoals beschreven eerder 15. Er zou een aanzienlijke toename van de translocatie FLU bedrag worden gedetecteerd (Figuur 5B).
Figuur 1. Schematische tekening en foto's van de complete microkosmos setup. Uitzicht vanaf de bovenkant (A) en van de zijkant (B). Alle agar flarden werden op de top van een glijbaan met drie kleine holtes geplaatst. Twee mg FLU kristallen werden in een holte (d = 5 mm) in het midden van PDA 1. PDA 2 geplaatst was vers begroeid met hyfen van P. ultimum geconfronteerd PDA 1. Een gebogen PDA stuk werd geplaatst tussen PDA 2 en de MMA patch maak een mechanische FLU barrière tezamen met het deksel van een petrischaal (d = 5 cm). Vier agar pleisters met actieve kool werden in het setup geplaatst om de gasvormige GRIEP concentratie verder dalen. Foto's van de volledige microkosmos van boven (C) en diagonaal weergave (D) zonder micro-organismen en griep. Figuren 1A en 1B zijn gewijzigd met toestemming van Schamfuss et al. 15 Aangepast met toestemming van Schamfuss, S. et al. Impact van mycelium over de toegankelijkheid van fluoreen PAH-afbrekende bacteriën. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
pg "/>
Figuur 2. Maximale intensiteit projecties van confocale laser scanning micrografen. Micrografen zijn visualiseren van de mCherry en eGFP inductie van de bioreporter bacterie B. sartisoli RP037-mChe in MMA. Wanneer de bacteriën contactpersoon aan een kristallijn FLU bron in MMA had (CON POS; A), wordt de eGFP signaal wat hoger te vergelijking met controles (CON AIR; B). Monsters met griep en P. ultimum (SAM; C) een verhoogde eGFP signaal echter minder uitgesproken dan de positieve controle tonen ook. mCherry wordt constitutief tot expressie gebracht en dient derhalve als een visuele controle om de cellen te detecteren. (Vergroting 630X, bar 20 pm). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Relatieve eGFP inductie in B.sartisoli RP037-Che voor CON NEG, CON AIR en SAM met mycelium en griep. Vergelijking van de relatieve eGFP inductie (eGFP rel) door B.sartisoli RP037-Che na 96 uur in de afwezigheid van GRIEP (CON NEG), in aanwezigheid van FLU maar geen P.ultimum (CON AIR) en in de aanwezigheid van zowel FLU en P.ultimum (SAM). Statistisch significante verschillen te CON NEG zijn gemarkeerd met een asterisk. Experimenten werden uitgevoerd in onafhankelijke triplicaten voor CON AIR en
. (. Cf. Figuur 1) Figuur 4. Chemische FLU kwantificering Totale bedragen van griep in ng gewonnen uit de MMA pleister na 96 uur voor dampfase transport zonder cellen (CON AIR (-)), mycelial transport zonder cellen (SAM (-)) en mycelium vervoer met cellen (SAM). Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Schamfuss et al. 15 Aangepast met toestemming van Schamfuss, S. et al. Effect van mycelium op de toegankelijkheid van fluoreen aan PAK-afbrekende bacteriën. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.
Figuur 5. Chemische FLU kwantificering in de aanwezigheid van een abiotische verontreiniging gootsteen (A) Totale bedragen van griep in ng gewonnen uit de MMA pleister na 96 uur voor mycelium vervoer met of zonder kunstmatige verontreiniging gootsteen (SAM (. (Zie Figuur 1). - ) met of zonder PDMS coated vezels). (B) dezelfde resultaten voor een gevarieerde testbaan met een verhoogde mycelium FLU opname gebied. Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van Schamfuss et al. 15 Aangepast met toestemming van Schamfuss, S. et al. Effect van mycelium op de toegankelijkheid van fluoreen aan PAK-afbrekende bacteriën. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.
| Naam | FLU | Mycelia | Cellen | Toepassing | Reacties |
| SAM | + | + | + | CLSM | |
| GC / MS | |||||
| SAM (-) | + | - | GC / MS | ook mogelijk met PDMS vezels als kunstmatige verontreiniging sink | |
| CON AIR | + | (+) | + | CLSM | mycelium alleen opgroeien tot PDA barrière; MMA niet gedekt |
| Con Air (-) | + | (+) | - | GC / MS | mycelium alleen opgroeien tot PDA barrière; MMA niet gedekt |
| CON NEG | - | + | + | CLSM | |
| CON POS | + | - | + | CLSM | cellen worden rechtstreeks blootgesteld aan FLU kristallen |
Tabel 1. Overzicht van alle soorten monsters Samenvatting van alle controle en proefmonsters inclusief applicatie (bioreporter test - CLSM of chemische kwantificering - GC / MS). En compositiestie (FLU, mycelium en bioreporter cellen).
| Oven | |
| Begintemp | 50 ° C |
| Initiële tijd | 2 min |
| Tarief | 15 ° C min -1 |
| Final temp | 300 ° C |
| Laatste tijd | 6.33 min |
| Injector (PTV) | |
| Injectie Volume | 0,5 pl |
| Mode | splitless |
| Zuivering | 2.00 min |
| Purgeerstroom | 50.0 ml min -1 |
| Begintemp | 80 ° C |
| Initiële tijd | 0.02 min |
| Ramps: Rate | 600 ° C min -1 |
| Final temp | 300 ° C |
| Laatste tijd | 10 min |
| Kolom | |
| Model | J & W DB-5MS |
| Nominale lengte | 20 m |
| Nominale diameter | 180 micrometer |
| Nominale laagdikte | 0,18 micrometer |
| Draaggas | helium 0,8 ml min -1 |
| MSD overdrachtsleidingreactor | 280 ° C |
| MSD | |
| Sim-modus | |
| MS Bron | 230 ° C |
| MS Quad | 150 ° C |
Tabel 2. Instellingen voor de GC / MS. Samenvatting van alle instellingen voor GC en MS op quantify fluoreen in de microkosmos setups.
| VALKUILEN | COMMENT | |
| 1 | Voorlopige groei en vitaliteit testen | Bestudeer de groei van mycelium organisme keuze. Hoe lang duurt het om de MMA patch te bereiken? Wordt geremd door de cycloheximide barrière? Controleer ook of bioreporter cellen blijven van vitaal belang in MMA de hele tijd via vlechtwerk assays. Zo niet, men kan ook een koolstofbron aan het MMA die niet leidt tot bioreporter inductie voegen. Uitsluiten mogelijke wederzijdse remming van bacteriën en mycelium. |
| 2 | Myceliumgroei tarief | De groei van het mycelium organisme moet niet te langzaam zijn, omdat anders de gasfase transport van PAK toeneemt met langere incubatietijd. Het protocol kan worden aangepastaan PAK voegen op een later tijdstip, maar nogmaals, mycelium op de inoculatiepunt mag niet meer actief zijn. |
| 3 | Bacteriële mobiliteit | Als een punt scanning laser microscoop wordt gebruikt en de bacteriële stam beweeglijke de opname- en kwantificering van z-stacks kan onmogelijk zijn door beweging in MMA. Daarom moet bacteriële beweging worden voorkomen, bijvoorbeeld door verhoging van de stevigheid van MMA door gebruik CLSM met een snelle scanner of een draaiende schijf laser microscoop. |
| 4 | Dampfase transport | Dampfase van de chemische stof (bijvoorbeeld PAH) naar de bioreporter cellen moeten voldoende uitgesloten, omdat bioreporter cellen zijn zeer gevoelig voor chemische stoffen in de dampfase. Dit is het cruciale punt van de gehele protocol om vals-positieve resultaten als gevolg van gasvormige vervoer te voorkomen. De gasfase(-) concentratie door chemische analyse van CON AIR worden geschat en concentraties dampfase kan worden aangepast bijvoorbeeld door meer of minder agarose vlekken met actieve kool. |
| 5 | Toxiciteit | Houd in gedachten, dat hoge concentraties van de geteste chemische toxische effecten op het mycelium organisme en / of bacteriën zou kunnen hebben. |
| 6 | Autofluorescence | Controleer of de gekozen mycelium organisme toont enige autofluorescentie in het bereik van de verwachte bioreporter signaal. Zorg ervoor om te controleren op verschillende groeistadia sinds autofluorescence kunnen variëren 17. Als autofluorescence wordt gedetecteerd, moet u de z-stacks opnemen in-mycelium vrije gebieden. |
| 7 | Bleken | mCherry fluorescentie is gewoonlijk stabiel en niet gevoelig bleken de toegepaste bioreporter cellen. Daarentegen eGFP verbleken vrij snel. Daarom hebben de eGFP kanaal niet om de monster voor z-stack opname visualiseren. |
| 8 | eGFP inductie | Wij merkten een lage eGFP inductie in SAM vergeleken met CON POS. Dit wordt verklaard door de sterke ruimtelijke beperking en lage toegankelijkheid van de GRIEP bron tot zeer lage dampfase concentratie van FLU (zie laatste resultaten paragraaf) te behouden. Afhankelijk van de gekozen bioreporter stam chemische, kan het opname gebied op PDA 1 worden aangepast aan de transportsnelheid (figuur 5B) te verhogen. Er moet echter worden aangenomen dat deze dampfase transport verhoogt richting bioreporter cellen. |
| 9 | Berekening van eGFP rel | De gepresenteerde berekeningsmethode voor eGFP rel waarbij de intensiteit van de groene pixels wordt vergelekenhet gebied van de rode pixels is slechts één mogelijkheid. Verwijzen wij u naar de discussie voor meer informatie. |
| 10 | Pixelgrootte | Wees u ervan bewust dat de vergroting van de gekozen lens en een potentieel toegepast zoomfactor van invloed op de pixelgrootte van het beeld. Dit moet in aanmerking worden genomen voorafgaand aan beeldanalyse. |
| 11 | Biologisch beschikbare fracties | Houd in gedachten dat de biologische beschikbaarheid van de vervoerde stof kwalitatief via eGFP inductie wordt beoordeeld (niet kwantitatief). Nr correlatie van de berekende relatieve eGFP-inductie en de biobeschikbare fractie werd geprobeerd. Dit kan echter worden aangepakt in toekomstige toepassingen. |
| 12 | Detectielimieten | Chemische detectie. Voor chemische kwantificering van organische verbindingen, een breed scala van concentraties betrouwbaar kan worden gedetecteerd. We hebben geconstateerd bedragen in de range 0NG en 1000 ng. eGFP kwantificering. We vergeleken relatieve eGFP inductie bij monsters zonder transport van vuile stoffen (dat wil zeggen, 0NG vervoerd), met mycelium gemedieerd transport (dat wil zeggen, tussen 20 en 40 ng vervoerd; zie de figuren 4 en 5) en met rechtstreeks contact met de verontreiniging bron (dat wil zeggen, de maximale beschikbare bedrag). Deze drie gevallen bleken goed te onderscheiden met de beschreven werkwijze zijn. We kunnen echter niet een meer gedetailleerde verklaring af te leggen over de resolutie van de relatieve eGFP inductie. Dit probleem kan in de toekomst worden aangepakt door het koppelen van verschillende verontreinigende hoeveelheden met het correleren eGFP inductie in de microkosmos setups. |
| 13 | Petrischaal materiaal | Plastic petrischaaltjes kan leiden tot een onderschatting van mycelium PAK translocatie en / of biobeschikbaarheid. Dit moet nietproblematisch zijn, als kwalitatieve uitspraken worden nagestreefd. Bij nauwkeurige kwantitatieve metingen nodig zijn, de toepassing van glas petrischaaltjes moeten worden beschouwd, ondanks de voorbereiding en de behandeling zal lastig zijn. |
Tabel 3. Bespreking van mogelijke valkuilen. Valkuilen voor en tijdens het experiment en voorgestelde opmerkingen en opties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gepresenteerde microkosmos setup geschikt gebleken om de biologische beschikbaarheid van ruimtelijk gescheiden chemicaliën studeren aan een vernederende organismen na opname en transport door mycelium. Potentiële gasfase vervoer van gedeeltelijk vluchtige verbindingen wordt voorkomen en bacteriële bioreporter cellen kunnen worden gevisualiseerd zonder uitgebreide monstervoorbereiding en dus met een minimale verstoring van de gevoelige systeem. Tegelijkertijd, kan chemische analyse van het monster gemakkelijk worden uitgevoerd waardoor een goede beheersing van de behaalde resultaten en kwantificering van het vervoersysteem. Echter, sommige punten moeten zorgvuldig worden overwogen voorafgaand aan en tijdens het uitvoeren van het experiment. Een belangrijk punt is om de microkosmos vrij van bacteriële of chemische kruisbesmetting te houden. Dit kan lastig zijn, omdat veel microkosmossen zijn parallel en dus grote incubatie kamers (zoals droogmiddelen) nodig. Daarom is het van cruciaal belang om alle onderdelen te steriliseren zorgvuldig voorafgaand aan de setup constructie. Een ander kritisch punt kan de toepassing van plastic petrischaaltjes voor de microkosmos zijn. Hoewel PAH en bioreporter niet in direct contact komen, kan een bepaalde hoeveelheid PAK worden geabsorbeerd door het kunststof materiaal. Echter, beschouwen wij dit niet problematisch voor de beschreven protocol, omdat dit zou leiden, indien van toepassing, in een onderschatting van mycelium PAK-translocatie en / of de biologische beschikbaarheid. In ieder geval, als nauwkeurige kwantificering vereist is, moet worden beschouwd wisselen de plastic onderdelen met glazen delen, hoewel behandeling meer lastig zal zijn. Andere punten die moeten worden overwogen betrekken The Chosen bacteriën en schimmels stammen (mogelijke wederzijdse inhibitie, groei, mobiliteit en mogelijk autofluorescentie), de gekozen chemicaliën (toxische effecten op micro-organismen, volatiliteit, detectielimieten) en praktische aspecten (bleken, beperking van eGFP inductie en berekening van eGFP rel). Een overzicht van de mogelijke valkuilen en de respectieve opmerkingen zijn te vinden inTabel 3.
We gebruikten dit model microkosmos setup om mycelium FLU vervoer en de daarop volgende bacteriële afbraak in een onverzadigde systeem demonstreren direct op een cel-mycelium interactie niveau. Ons model set-up kan worden gevarieerd en aangepast aan verschillende behoeften van verschillende bacteriële en fungale stammen, chemische verbindingen, etc. Aldus kan het systeem worden gebruikt voor bijvoorbeeld (i) voldoen aan de invloed van mycelia van bacteriën in de aanwezigheid van evaluatie een anders beperkte chemische (bijvoorbeeld giftig) bron, (ii) de invloed van mycelia op de biologische beschikbaarheid van verbindingen voor bacteriële afbraak voorspellen, (iii) contaminant biobeschikbaarheidsstudie afhankelijk van de afstand van bacteriën voor het transport vector of (iv) het effect van verschillende chemische bronnen (bijvoorbeeld kristallijn, grond of opgelost) onderzoeken. De aanpassing van het systeem naar eenlternate voorwaarden zullen delicaat en moet stap voor stap worden uitgevoerd om duidelijke resultaten te bereiken. Tot dusver hebben we niet voor andere bacteriële of fungale stammen en andere verbindingen dan PAK getest. Aangezien mycelium netwerken bekend transport ook andere verontreinigingen dan PAH zoals pesticiden 19 of oplosbare stoffen zoals salicylaat 20, we denken dat het systeem kan worden uitgebreid naar andere chemische verbindingen gegeven verbindingsspecifieke bacteriële biosensor.
Houd er rekening mee dat, afhankelijk van de toegepaste bioreporter stam een andere berekening van eGFP rel zou beter zijn. In plaats van vergelijking (1) de volgende twee opties kunnen worden toegepast:
(2)
(3)
However, in de gepresenteerde protocol vergelijking (1) werd gekozen vanwege de volgende redenen: (i) eGFP intensiteit gemeld correleren met de PAK flux aan de cel 14 terwijl (ii) mCherry gemeld aanzienlijke verschillen voor verschillende cellen 13 tonen . Vergelijking (2) en (3), daarentegen, kan gekozen worden om valse informatie van potentiële licht artefacten in het monster voorkomen. In ieder geval, vergeleken we drie berekeningsmethodes elkaar, waarbij geen statistisch significante verschillen te vinden. Toch, als gevolg van de gerapporteerde variaties in de fluorescentie-intensiteit van mCherry, raden we u aan vergelijking (1) of (2).
Uiteindelijk moet enige beperkingen van de techniek worden beschouwd. Aangezien de batches werden ontworpen om gas-phase transport van de geteste verbinding voorkomen wordt mycelium opname van de verbinding verlaagd. Dit resulteert in lagere transporttarieven dan verwacht zou worden met ongehinderde opname. Vandaar dat de gevoeligheid van de Bioreportier stam moet hoog genoeg zijn om kleine veranderingen in biologisch beschikbare fracties op te sporen zijn. Verder zal de setup waarschijnlijk niet geschikt zijn voor schimmel stammen met een lage groei. In dit geval kan langdurige incubatie gasfase transport van de verontreiniging hetgeen leidt tot vals-positieve resultaten bevorderen. Het zou mogelijk zijn om de opstelling zodanig dat de verontreiniging op een later tijdstip kan worden toegepast wijzigen. Echter, kan hyphae dan al inactief of dood op het inoculatiepunt. Tenslotte, zoals hierboven vermeld, het aantal chemische verbindingen die worden vervoerd door mycelium netwerken is groot. Het is echter mogelijk de beschikbaarheid van een passende bioreporter stam een beperkende belangrijke factor zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest | |||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 (pH 6.0) | |||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2% | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8 | |||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | |||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| ImageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
References
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
- Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
- Griffin, D. M. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 141-151 (1981).
- Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 1-22 (1981).
- Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
- Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
- Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
- Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
- Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
- Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
- Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
- Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
- Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. Manual of methods for general bacteriology. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).
- Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).
- Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
