Summary
与鼻疽sartisoli RP037-MCHE全细胞bioreporter法的开发是为了检测有机污染物（ 即芴）供细菌降解菌丝桥空气填充孔隙中水不饱和模型系统主动转运后的分数。
Introduction
人口稠密由多种微生物1,2的土壤如细菌。然而，在此栖息条件具有挑战性，特别是在水的供应3项。菌永久需要寻找在异构环境4的最佳条件，但没有连续水膜是导致受限可移动性5妨碍他们自由传播。此外，溶质的扩散率（ 例如，营养素）的不饱和的条件6下降低。因此，细菌和营养物往往物理上分离和营养辅助限于3。其结果是，传输载体的化学化合物，它不需要连续水相可有助于克服这些限制。事实上，很多微生物如真菌和卵菌已经开发出一种丝状增长方式，使他们通过空气填充孔隙成长从而达到和MOBIlizing也物理长距离分离营养素7和8含碳物质。他们甚至可以作为其提供糖和其他能源，以细菌9生物的运输载体。摄取和运输中菌丝生物体也已显示对疏水性有机污染物如多环芳烃（PAH）在终极腐霉 10或在丛枝菌根真菌11。由于PAH是无处不在，难溶于水的污染物在土壤中12，菌丝体介导的运输可能有助于提高生物利用度污染的潜在细菌降解。装置10而污染物输送的总量，可以通过化学直接定量，污染物通过菌丝体降解细菌和其它生物体输送的生物利用度不能容易地进行评估。
以下协议呈现给评估myce的影响的方法LIA对污染物的生物利用度要以直接的方式细菌降解;它允许收集有关污染物的微生物生态系统的时空影响的信息。我们描述了如何建立一个复杂的不饱和缩影系统通过将一个物理上分开PAH点源通过菌丝体的运输载体的PAH降解菌bioreporter模仿气水界面土壤。因为空中交通被排除，菌丝基于交通工具上的PAH的生物利用度对于细菌的效果，可以研究在一个孤立的方式。更详细地说，三环多环芳烃芴，菌丝生物体终极腐霉和细菌bioreporter 伯克霍尔德sartisoli RP037-MCHE 13中所描述的缩影设置施加。细菌B.最初构建sartisoli RP037-MCHE研究菲通量到电池14，并表示增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的PAH通量的结果细胞中，而红色荧光mCherry表示组成。详细信息，记者建造由TECON 等 13在初步测试中给出，细菌没有透露游泳，只有非常缓慢蜂拥能力。它能够在作为致密悬浮在菌丝顶端施加缓慢迁移对终极腐霉的菌丝。因为细菌嵌入琼脂糖在以下方案，上菌丝迁移并没有出现。
使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）中，bioreporter细菌，可以直接在微观可视和EGFP的表达可以相对于被量化到细胞的量（正比于mCherry信号）与该软件ImageJ的的帮助。这允许定性在不同的情景进行比较生物利用度（ 即，更高或更低）。 FLU被发现是后由P.菌丝运输生物利用霉 （ 即，它较阴性对照更高）。此外，该协议描述了如何量化通过化学手段菌丝体介导的转运的总量，并使用硅被覆的玻璃纤维（固相微萃取纤维）中相同的缩影验证污染物的生物利用度。使用此设置一个缩影成果已发表 和体育相结合的探讨霉 ，芴和B. sartisoli RP037-MCHE 15。在这里，重点在于一个详细的方法说明和协议的潜在缺陷的鉴定潜在的进一步应用提供了这方面的知识。进一步的应用可涉及各种真菌，细菌种类（ 例如，从污染的场所），以及其它污染物（ 例如，农药）或杂质的供应（ 例如，年龄土壤）。
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Protocol
1.准备菜肴，幻灯片和孵化商会
- 准备以下材料每缩影：一个大的塑料培养皿底部（D = 10厘米），一个被修改的（见步骤1.2）的小塑料培养皿底部（D = 5厘米）与盖和三腔一个计数室幻灯片。
- 取的培养皿底部零件所需的数字（D = 5厘米）。用锯恰好适合幻灯片（26毫米边长）拆下边缘的一部分。消毒系统，浸泡培养皿底部和盖在70％乙醇的O / N和干燥它们至少2小时在流动柜在UV光下。存储培养皿在一个密封的塑料容器，这也被暴露在UV光2小时。
- 擦滑动用70％乙醇和所需数量的空气干燥。包裹滑动铝箔，并把它们在马弗炉中进行5小时，在450℃以除去可能的污染物。 准备玻璃孵化室带盖。清洗，用70％的乙醇和暴露室开放于UV光至少2小时在流动柜。
注：大干燥器（直径约30厘米），用盖子可以用于这一目的;每个干燥器可容纳多达10缩影设置。
2.准备媒体与文化
- 运行20平行缩影，得到百毫升改性胰蛋白胨-酵母培养基（MTY）14，约150毫升的21℃的基本培养基16（MM），将5ml基本培养基琼脂甲酯（MMA; 0.5％，重量/体积），三马铃薯葡萄糖琼脂平板上（PDA; 1.5％，重量/体积）为P.霉 ，4空白板，其中之一PDA平板含有2mg L -1酮，四琼脂糖平板（3％，重量/体积）含0.3克·毫升-1活性炭和40mg感在2毫克的部分。
- 制备含50毫克卡那霉素的L -1 MTY（卡那霉素是requirED保持EGFP报告质粒）和MM含10毫米醋酸细菌培养。使用MM的无乙酸以制备0.5％的MMA为细菌在微观上固定和倾1.5％的PDA平板（各20毫升）中进行栽培的终极腐霉和缩影设置。
- 接种P.一些菌丝霉三个新鲜PDA平板孵育在黑暗中在25℃下进行约72小时。然后确保这些板块都长满完全新鲜和柔软的菌丝体。
- B.启动两种文化sartisoli RP037-MCHE在50ml MTY的从甘油贮存。孵育在30℃，230转旋转烧瓶运动O / N。
- 测量培养的光密度（OD）在578纳米和离心机在1000×g离心10分钟（为B. sartisoli RP037-MCHE，预期的OD 578为约1.0和细胞处于指数期）。弃上清液并重新悬浮细胞在MM中的一个适当的量来达到的OD 0.4 578。接种20毫升的MM含有50mg L-1用400微升重新悬浮的细胞的卡那霉素。孵育在30℃，230转旋转烧瓶运动O / N。
- 衡量MM文化的OD 578（为B. sartisoli RP037-MCHE，预计OD 578大约是0.2和细胞在早期指数期）。离心培养在2000×g离心10分钟，并重新悬浮细胞中的MM适量以达到0.4的OD。混合50微升用500μl温暖，液体的MMA的细胞悬浮在2ml管中并储存在50℃，直到使用。用150微升的细胞中的MMA的每个缩影。
- 倾含有活性碳的琼脂糖凝胶片。融化琼脂糖（3％;重量/体积）在双蒸水。用活性炭调匀（0.3克毫升-1），将混合物倒入塑料培养皿（D = 10厘米）。
3.缩影安装
注意：完整的缩影设置在图1中示意性地描绘的，请参阅图1为所有以下各个步骤。下面的步骤被描述一个样品（SAM）与菌丝传输载体和三种不同的控制设置（CON AIR中 ，CON NEG，CON POS）的制备。所有不同的设置的摘要可以在表1中可以找到。
- 取的培养皿和幻灯片期望数量和它们下一个流柜暴露于UV光30分钟。
- 放置小培养皿内的大的，并通过小培养皿的间隙配合的幻灯片。取暖细胞悬浮液中的MMA的一个样本，并添加150微升到中间的一个滑动的空腔。直到所有幻灯片的中间空腔重复此步骤，充满了MMA。等待5分钟的MMA凝固。
- 使用1厘米的打孔器冲出来的圆形贴片从空白PDA板。放置一个贴剂以2mm旁边的MMA的小皮氏培养皿内的距离。添加该促进在设置菌丝生长（PDA 3中图1）。
- 切弯PDA补丁的机械屏障。使用干净和无菌小培养皿底部，并将其按入一个PDA板。用刮刀切另一个较小环以0.5厘米的距离成其导致一个PDA的环琼脂。
- 切出一块，这恰好装配到小培养皿中的缩影设置的间隙，并将其放置在滑动的顶部的间隙内。确保MMA和圆形的PDA屏障之间的距离为约2毫米。关闭小培养皿轻轻按压入在PDA屏障的盖子。
- 重复步骤3.4和3.4.1与含有2g L的PDA板-1对放线菌酮。
注意：这是控制设置为空中运输（CON AIR）对bioreporter细胞，由于菌丝体是由放线菌酮抑制，不长满MMA。
- 使用1厘米的打孔器冲出来的是空白PDA板的圆形贴片。使用另一个0.5厘米打孔器切出第一补丁的中间。放置所产生的小的PDA型环以1mm旁边的PDA屏障（PDA 1中图1）的距离。
- 添加2毫克流感进入PDA 1.用孔1厘米的打孔器切出从PDA板长满P.圆形补丁霉和放置一个补丁（PDA 2在图1中）底部向下到PDA的环，使得菌丝垫朝向FLU晶体。
- 无需重复添加FLU晶体上一步。
注意：这是阴性对照设置（CON NEG）来确定背景荧光bioreporter细胞。
- 无需重复添加FLU晶体上一步。
- 使用1厘米的打孔器冲出来的圆形贴片含有活性炭琼脂。将4个贴片在每一个缩影设置，以进一步降低气体浓度FLU（ 图1）。
- 准备阳性对照（CON POS）。一些FLU晶体添加到200微升的MMA细胞悬液，并把它放在一个空的幻灯片的一个腔。
- 放置一个培养皿（D = 10厘米），用活性炭对孵育室的底部的一些粉末，以尽量减少在腔室中的气态FLU浓度。此外，放置在底部四到五50毫升烧杯用无菌水以保持高湿度的室中。
- 转移缩影设置成孵化室和孵化在25℃96小时。将样品随机在不同的生长室，以排除位置的影响。
注：此孵化时间AP层数为卵菌P.霉 。它可能是用于其它生物体不同。
- 转移缩影设置成孵化室和孵化在25℃96小时。将样品随机在不同的生长室，以排除位置的影响。
4.激光共聚焦显微镜
- 理想的情况是使用激光共聚焦显微镜的设置与正置显微镜。
注意：它可以配备有常规的激光器提供例如用于激励或具有可调白光激光源488，561和633纳米的线条。 - 使用以下设置收集的图像：激发：490纳米（EGFP）和585纳米（mCherry）在适当的激光强度（同时激励）;发射范围：500〜550纳米（EGFP）和605至650纳米（mCherry）;物镜：63X 0.9 NA水浸入（由于其工作距离长）;步长大小对于z轴堆栈：0.5微米。
- 开放缩影设置和使用手术刀去除PDA 1，2，3和PDA的屏障。放置在MMA的顶部玻璃盖玻片并按下它轻轻地除去气泡。在显微镜阶段安装幻灯片。加的水的液滴在th之上Ë盖玻片并用mCherry设置找bioreporter细胞样品中。
- 获取样品的快速浏览和使用电热环比下查找表的红色（mCherry）和绿色（EGFP）信道优化信噪比。选择在样本的随机位置来分析bioreporter荧光。
注：菌丝可能显示自发荧光在bioreporter发射（ 例如，绿色自发荧光）17的范围内。一定要选择无菌丝地区，如果是这样的话。 - 定义和在绿色（EGFP）和红色（mCherry）信道的各位置记录的z栈。通过长时间曝光，以萤光光或激光避免样品漂白。
- 对10个随机，均匀的分布位置，重复前面的步骤。
- 重复使用相同的设置进行测试轨道（SAM），CON AIR，CON NEG和CON POS的所有样品的所有步骤。 5.图像分析
- 请确保安装logi_tool插件（http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/）。
- 在ImageJ的打开文件。选择“拆分通道”并关闭绿色通道。用宏“mCherry区”作为补充代码文件到Z堆栈量化红色荧光区。在宏观调整首选设置（以粗体显示）。
- 输出与所测量的像素在阈值以上（以上所定义的最小尺寸）的Z-堆栈的表。
注：所有值的总和是一个红色像素（区域）中的叠层的总数。
- 输出与所测量的像素在阈值以上（以上所定义的最小尺寸）的Z-堆栈的表。
- 在ImageJ的打开文件。选择“拆分通道”，并接近红色通道。使用宏 216;绿色荧光蛋白INT“作为补充代码文件，以量化的绿色荧光强度Z-堆栈。在宏观调整首选设置（以粗体显示）。
- 输出与平均强度在Z堆栈的所有绿色物体高于阈值（及以上定义的最小尺寸）和区域的表格。为了计算在堆栈绿色像素的总强度，乘以各意味着由相应的区域的强度。
- 计算相对的eGFP感应（eGFP的REL）：
（1）
注意：由于mCherry表达组成型，eGFP的相对的结果值是的eGFP的一定量的细胞的表达量的相对量度。也请参考表3的绿色荧光蛋白相对计算的进一步信息。 - 包装15毫升玻璃小瓶，1毫升GC / MS小瓶和插入铝箔。填充用Na 2 SO 4蒸发器皿;将所有在马弗炉中进行5小时，在450℃以除去可能的污染物。存储活化干燥器的用Na 2 SO 4内。
- 切割PDMS涂覆的玻璃纤维成0.5厘米长。通过摇动四倍2小时的新鲜甲醇洗纤维。重复洗涤步骤再四次用超纯水和存储清洁纤维在超纯水中，在密封的玻璃小瓶中。
- 制备1.5升的甲苯/丙酮（3:1，V / V）含有10μgL -1的菲-D 10。
- 执行步骤1，2和3的协议。准备微观无bioreporter细胞来研究FLU运输（SAM（ - ）和CON AIR（ - ））中，用bioreporter细胞（SAM）来验证FLU降解。
- 可选（无bioreporter细胞）：将镀膜玻璃纤维3 PDMS（通常用于SPME实验）作为内SAM的MMA人工和可量化的污染物接收器（ - ）用细镊子。
- 删除使用细镊子玻璃纤维和每一个与插入转移到GC / MS小瓶。
- 加入200μl甲苯和垂直摇O / N，并通过GC / MS分析。使用表2中提供的设置。
- 从中间空腔转移的MMA入15ml玻璃小瓶中，并加入约用Na 2 SO 4 3铲。调匀用抹刀和加入10毫升溶剂。旋涡的混合物，并在黑暗中晃动水平O / N。
- 转移1001，L样品放入GC / MS小瓶插入。添加10微升苊-D 08（10毫克L-1），并使用如在6.4.3中描述的相同的程序，通过GC / MS法进行分析。
注意：要分析红色（mCherry）和绿色（EGFP）的荧光在记录的z栈，其中包括选择的自由软件ImageJ的18（http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html）可以是使用。
（1） 注：微观设置也可被用于执行的易位FLU量有或没有非生物污染物水槽化学定量。
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Representative Results
这里介绍的结果已经较早公布的15。请参考文章进行详细的机械和环境的讨论。
通过CLSM图像记录后，最大强度投影可使用相应的显微镜软件或ImageJ的获得样品的一个第一视觉印象和对照（ 图2）进行。以后，该数据集可以以显示由特定的可视化软件有意义特征被投影不同。阳性对照（CON POS）显示明显的绿色荧光蛋白的诱导（ 图2A），而空中控制（CON AIR）仅表现出绿色荧光蛋白的背景荧光（ 图2B）。要升高相比CON AIR，Y绿色荧光蛋白的荧光测试样品（SAM）的出现等不作为标记为CON 的POS（图2C）。的mCherry荧光是独立的PAH降解，因此对所有的样品相似。然而，略微升高的eGFP信号不会被通过该方法和随后的图像分析进行检测是必不可少的。
对于所测试的缩影，目视辅之以图像分析和相对的eGFP感应的计算（ 参照步骤5 FF协议的; 图3）。绿色背景荧光非诱导B. sartisoli RP037-MCHE计算与CON NEG。根据给定的条件下，相对的eGFP感应被发现是eGFP的相对 = 0.53。可以CON NEG和CON AIR之间进行检测（EGFP 相对没有显著差异 = 0.54; P> 0.95），从而排除对bioreporter细胞的任何气相FLU运输。对于CON POS，高度升高绿色荧光蛋白的诱导（EGFP 相对 = 53.7）发现证实了细胞在MMA的96小时后，活力和表示最大绿色荧光蛋白的诱导。在菌丝体和流感（SAM）的存在下，绿色荧光蛋白是在相对 于阴性对照的细胞显著诱导（eGFP的相对 = 1.15; P <0.001）。然而，相对于阳性对照（ 参见 表3中 ，点8）的eGFP感应相对较低。
流感由P.菌丝体运输霉的缩影设置定量化学（ 参见步骤6 FF协议的; 图4）。在流感和P.存在霉 （SAM（ - ）），菌丝体反位于大约在96小时这等于37.5pmold -1厘米-1的传输速率25ng感。在不存在的菌丝体的对照（CON AIR（ - ））揭示了气态FLU转运入MMA中仅在96小时2纳克， 即，诱导bioreporter的通过气相-浓度可排除的范围。当B.sartisoli RP037-MCHE存在（SAM），<感为1ng是在MMA的补丁检测。以菌丝体介导的转随后这验证有效的细菌降解FLU。
有可能通过添加非生物污染物沉到系统（ 参见步骤6.4.1 FF协议的）调查细菌降解流感水槽， 即 ，在FLU易位的影响。因此，一个是能够量化FLU由纤维吸收的量和离开MMA和覆菌丝内的量。对于SAM（ - ），总易位量是独立于污染物水槽的存在下（P> 0.9; 图5A）。然而，具有增加的FLU摄取区域的缩影还测试如前面15进行详细描述。那里，易位FLU量的显著增加可检测（ 图5B）。
图1.示意图和照片的完整缩影设置的 。鉴于从顶部（A）和从侧面（B）中 。所有琼脂贴剂置于一个带有三个细孔滑动的顶部。两毫克FLU晶体置于一个空腔（D = 5毫米）的PDA 1的中间的PDA 2的内部是新鲜长满P的菌丝霉面临PDA 1.弯曲PDA片放在PDA 2和MMA补丁之间用培养皿（D = 5厘米）的盖子共创机械FLU屏障。含活性炭的四个琼脂补丁被安置在设置进一步降低气体浓度FLU。照片从顶部（C）和立体图（D）中的完整缩影无微生物和流感。 图1A和1B已被修改以允许从Schamfuss 等人 15适于与从Schamfuss，S。 等的权限。菌丝体的影响芴的无障碍PAH-降解菌。ENVIRON。科幻。 TECHNOL。47，6908-6915。版权所有（2013）美国化学学会。 请点击此处查看该图的放大版本。
皮克“/>
对激光扫描共聚焦显微图2.最大强度的预测。显微照片。 可视化mCherry和绿色荧光蛋白诱导bioreporter细菌的B. sartisoli RP037-MCHE在MMA。当细菌已经接触到在MMA的结晶FLU源（CON POS; A），所述的eGFP信号被升高相比对照（CON 空气 ; B）。样品FLU和P.霉 （SAM℃）也显示升高的eGFP的信号，但较不显着高于阳性对照。 mCherry表达组成性，因此用作可见控制来检测细胞。 （放大倍数630X，酒吧20微米）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.相对绿色荧光蛋白诱导B.sartisoli RP037-车为CON NEG，CON AIR和SAM与菌丝体和FLU相对绿色荧光蛋白的诱导（EGFP REL）由B.sartisoli RP037-澈，比较96小时在没有流感后， （CON NEG），在FLU但缺乏P.ultimum（CON AIR）的存在，并在这两个感和P.ultimum（SAM）中的存在。统计学显著差异CON NEG都标有星号。实验是在独立式三份的CON AIR进行，
（ 比照 图1）图4.化学FLU量化从MMA的补丁NG提取总量的FLU的96小时为气相运输后没有细胞（CON AIR（ - ）），米无细胞ycelial运输（SAM（ - ））和菌丝运输与细胞（SAM）。这个数字已被修改与许可Schamfuss 等 15改编许可，从Schamfuss，S. 等菌丝体的影响对芴的无障碍PAH降解菌。ENVIRON。科幻。 TECHNOL。47，6908-6915。版权所有（2013）美国化学学会。
图5.化学FLU量化在非生物污染物片的存在（A）96小时用或不用人为污染物片菌丝运输（SAM后的总金额FLU从MMA补丁NG提取（。（参见图1）。 - ）有或没有PDMS共ated纤维）。 （B）相同结果的不同的测试轨道上增加菌丝FLU摄取区域。这个数字已被修改与许可Schamfuss 等 15改编许可，从Schamfuss，S. 等菌丝体的影响对芴的无障碍PAH降解菌。ENVIRON。科幻。 TECHNOL。47，6908-6915。版权所有（2013）美国化学学会。
| 名字 | FLU | 菌丝体 | 细胞 | 应用 | 评论 |
| SAM | + | + | + | CLSM | |
| GC / MS法 | |||||
| SAM（ - ） | + | - | GC / MS法 | 也有可能用的PDMS纤维作为人造污染物宿 | |
| CON AIR | + | （+） | + | CLSM | 菌丝体只有成长到PDA屏障; MMA不包括 |
| CON AIR（ - ） | + | （+） | - | GC / MS法 | 菌丝体只有成长到PDA屏障; MMA不包括 |
| CON NEG | - | + | + | CLSM | |
| CON POS | + | - | + | CLSM | 细胞直接暴露于流感晶体 |
表1.所有样品类型的所有控制和测试样本，包括应用程序（bioreporter法-激光共聚焦显微镜或化学定量- GC / MS）的摘要。并且composi化（FLU，菌丝体和bioreporter细胞）。
| 烤箱 | |
| 初始温度 | 50℃ |
| 初始时间 | 2分钟 |
| 率 | 15℃分钟-1 |
| 最终温度 | 300℃ |
| 最后一次 | 6.33分钟 |
| 喷油器（PTV） | |
| 进样量 | 0.5微升 |
| 模式 | 不分流 |
| 清洗 | 2.00分钟 |
| 吹扫流 | 50.0毫升分钟-1 |
| 初始温度 | 80℃ |
| 初始时间 | 0.02分钟 |
| 坡道：速率 | 600℃分钟-1 |
| 最终温度 | 300℃ |
| 最后一次 | 10分钟 |
| 柱 | |
| 型号 | J＆W DB-5MS |
| 标称长度 | 20米 |
| 公称通径 | 180微米 |
| 标称膜厚 | 0.18微米 |
| 载气 | 氦0.8毫升分钟-1 |
| MSD Transferline | 280℃ |
| MSD | |
| SIM卡模式 | |
| MS来源 | 230℃ |
| MS四 | 150℃ |
表2.设置为GC和MS为q的所有设置GC / MS。总结uantify芴的缩影设置。
| 陷阱 | COMMENT | |
| 1 | 初步的增长和活力测试 | 研究选择的菌丝生物体的生长。多长时间才能达到的MMA补丁？是它抑制了放线菌酮障碍？还要检查是否bioreporter细胞保持至关重要的MMA经编结试验的全部时间。如果不是，人们还可以添加碳源在MMA不导致bioreporter诱导。排除细菌和菌丝体可能相互抑制。 |
| 2 | 菌丝生长速度 | 菌丝生物体的生长速率不应该太缓慢，因为否则气相PAH的传输与培养时间的延长而增加。该协议可以适于添加PAH在稍后的时间点，但随后又，菌丝体在接种点可能不活跃了。 |
| 3 | 流动性细菌 | 如果一个点的扫描激光显微镜的使用量和细菌菌株是游动，的Z-堆栈记录和定量可能是不可能的，由于甲基丙烯酸甲酯的内部运动。因此，细菌的运动应被防止， 例如，通过增加的MMA的坚固性，通过使用激光共聚焦显微镜具有快速扫描仪或旋转盘的激光显微镜。 |
| 4 | 气相输送 | 化学（ 例如，PAH）朝向bioreporter细胞气相传输必须被充分地排除在外，因为bioreporter细胞是在汽相化学品极为敏感。这是整个协议，以防止由气体输送假阳性结果的关键点。气相（ - ）浓度可通过空中监狱的化学分析来估计和气相浓度可以通过用活性炭添加更多或更少的琼脂糖补丁进行调整，例如。 |
| 五 | 毒性 | 请记住，高浓度测试化学物质可能对菌丝生物体和/或细菌的毒性作用。 |
| 6 | 自体荧光 | 检查，如果所选择的菌丝生物体示出了在预期bioreporter信号的范围有些自体荧光。一定要检查在不同的生长阶段，因为自体荧光可能会有所不同17。如果自体荧光检测，确保菌丝体中无记录的区域Z-栈。 |
| 7 | 漂 | mCherry荧光通常是稳定的，在应用双漂白不敏感oreporter细胞。相比之下，绿色荧光蛋白而快速漂白。因此，不要使用绿色荧光蛋白通道可视化之前，Z-一叠记录的样本。 |
| 8 | 绿色荧光蛋白的诱导 | 我们注意到一个较低的绿色荧光蛋白诱导SAM相比CON POS。这是占了强烈的空间限制和低FLU来源无障碍FLU保持非常低的气相浓度（参见最后结果段）。取决于所选择的bioreporter应变和化学，在PDA 1的摄取区域可以被改变，以提高传输速率（ 图5B）。然而，必须考虑到，这也增加了气相运输朝向bioreporter细胞。 |
| 9 | 绿色荧光蛋白相对的计算 | 所提出的计算方法的eGFP 相对其中绿色像素的强度进行比较到的红色像素的区域中只有一个可能性。请参考以获取更多信息的讨论。 |
| 10 | 像素尺寸 | 请注意，所选择的透镜的放大倍数和潜在的应用缩放因子的影响的图像的像素大小。此之前，必须将图像的分析考虑。 |
| 11 | 生物利用分数 | 请记住，在运送化合物的生物利用度是定性通过绿色荧光蛋白诱导评估（不定量）。计算出的绿色荧光蛋白的相对感应及生物药效部分无相关性进行了尝试。然而，这也可以在将来的应用程序处理。 |
| 12 | 检测限 | 化学检测。对于有机化合物的化学定量分析，广泛concen的trations能够可靠地检测到。我们检测范围0ng和1,000ng金额。绿色荧光蛋白定量。我们比较了相对的eGFP感应样品中无污染物的运输（ 即 0ng运输），与菌丝体介导的转运（ 即，介于20和40ng运输;比照图4和5）中，用直接接触的污染物源（ 即，最大可用量）。这三种情况被证明是很好区分与所描述的方法。但是，我们不能在相对绿色荧光蛋白诱导的分辨率作出更详细的说明。这个问题可能在未来通过将不同的污染物数量与相关绿色荧光蛋白诱导的缩影设置加以解决。 |
| 13 | 培养皿材料 | 塑料培养皿可能导致菌丝PAH易位和/或生物利用度的低估。这不应该是有问题的，如果定性描述的向往。如果精确的定量测量需要，应用的玻璃培养皿中，应考虑，尽管准备和处理会更不方便。 |
表3.讨论可能的陷阱。之前和实验，并提出意见和选择过程中可能存在的缺陷。
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Discussion
所提出的缩影设置证明适合学习的空间分离的化学品的生物利用度，以降低摄取和运输的菌丝体后的生物。防止部分挥发性化合物的潜在的气相输送与细菌bioreporter细胞可以可视化，而不精心样品制备并因此与敏感的系统的干扰最小。同时，样品的化学分析可以容易地进行，允许有一个良好的控制获得的结果的和的总运输定量。然而，一些点必须仔细之前和在执行实验审议。很重要的一点就是保持微观无任何细菌或化学交叉污染。这可以是具有挑战性的，因为许多微观并行运行并且因此，大孵化室（如干燥器）是必需的。因此，关键的是要消毒所有部分之前仔细地设置construc化。另一个关键点可能是塑料培养皿申请的缩影。虽然PAH和bioreporter没有得到直接接触，PAH的一些量可以由塑料材料所吸收。然而，我们认为这不是问题所描述的协议，因为这会导致，如果有的话，在菌丝PAH-易位和/或生物利用度的低估。在任何情况下，如果需要精确的定量，它应该被认为是交换塑件与玻璃件，虽然处理会更加不方便。应考虑的其他点包括从选择的细菌和真菌菌株（可能相互抑制，生长速度，机动性和可能的自发荧光），所选择的化学品和实际问题（漂白，绿色荧光蛋白的限制（对微生物，波动性，检出限毒性作用）诱导和绿色荧光蛋白相对计算）。潜在的陷阱和各自的意见摘要中可以找到表3中 。
我们用这个模型缩影设置展示菌丝FLU运输和随后的细菌降解的不饱和系统直接在细胞菌丝体相互作用的水平。我们的模型的建立，可以改变和调整，以满足各种细菌和真菌菌株，化合物， 等。因此，该系统可被用于例如（ⅰ）不同的需求，以评估在存在菌丝体上的细菌的影响一个另有限制化学（ 例如，毒性）源，（ii）向预测菌丝体上用于细菌降解的化合物的生物利用度的影响，（ 三 ），研究的污染物的生物利用度取决于细菌到传输向量或距离（ⅳ）研究不同化学源（ 例如，晶状的，在土壤中或溶解的）的影响。然而，该系统的一种调整lternate条件将是微妙的，应以达到清晰的效果进行了分步实施。到目前为止，我们还没有测试系统对其他细菌或真菌菌株和其他化合物比PAH。然而，由于菌丝网络已知也运送其他污染物比的PAH象杀虫剂19或可溶物质，如水杨酸20，我们认为，该系统可扩展到给定的化合物的特定的细菌生物传感器不同的化学化合物。
请注意，根据所施加的应变bioreporter一个不同的计算的eGFP 相对的可能是优选的。代替等式（1）的以下两个选项可以应用：
（2）
（3）
HoweveR，所呈现的协议方程（1）中被选择，由于以下几个原因：（ⅰ）eGFP的强度报告给相关的PAH的磁通到电池14，而（ⅱ）mCherry据报道，显示出相当大的变化为不同的小区13 。式（2）及（3），与此相反，可以选择，以防止潜在的光假象样品中的虚假信息。在任何情况下，我们比较了所有三种计算方法彼此，由此无统计学显著差异可能被发现。尽管如此，由于在mCherry的荧光强度的变化报道，我们建议使用等式（1）或（2）。
最后，该技术的一些限制，应考虑。由于微观被设计以防止测试化合物的气相输送，该化合物的菌丝摄取降低。这导致较低的传输率比预期的要与不受阻碍地摄取。在碧柔的。因此，在灵敏度看门应变必须足够高，以检测在生物可利用的级分的微小变化。此外，设置将可能不适合的真菌菌株具有低生长速率。在这种情况下，长期的培养可能青睐从而导致假阳性结果的污染物的气相输送。它可能是可以修改的设置中，该污染物可以在稍后的时间点被应用的方式。然而，菌丝届时可能已经不活动或死在接种点。最后，如上所述，化学化合物的其通过菌丝网络传送的范围大。然而，适当的bioreporter菌株的可用性可能是限制性的关键因素。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest | |||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 (pH 6.0) | |||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2% | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8 | |||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | |||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| ImageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
References
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