Summary
Вся камера bioreporter проба с Burkholderia sartisoli RP037-МКТО был разработан для обнаружения фракции органического загрязнителя (т.е. флуорена) Доступные для бактериального разложения после активного транспорта по мицелия, соединяющих заполненные воздухом поры в ненасыщенной модели водной системы.
Introduction
Почва густонаселенных от широкого спектра микроорганизмов, таких как 1,2 бактерий. Однако условия в этой среде обитания являются сложными, особенно с точки зрения наличия воды 3. Бактерии постоянно нужно искать оптимальных условий в гетерогенных средах 4, но отсутствие непрерывных водных пленок приводит к ограничению подвижности 5 препятствуя им свободно распространяться. Кроме того, скорость диффузии растворенных веществ (например, питательных веществ) снижены при ненасыщенных условиях 6. Таким образом, бактерии и питательные вещества часто физически разделены и питательных доступность ограничивается 3. Как следствие, транспортный вектор химических соединений, которые не требуют непрерывного водную фазу может помочь преодолеть эти ограничения. В самом деле, многие микроорганизмы, такие как грибы и оомицетов разработали нитевидные формы роста, позволяющее им расти через заполненные воздухом поры, тем самым достигая и MOBIлизинг и физическое отделены питательные вещества 7 и углеродистую 8 веществ на большие расстояния. Они могут даже выступать в качестве биологических векторов транспорта, которые поставляют сахар и другие источники энергии бактерий 9. Поглощение и транспорт в мицелиальных организмов было также показано для гидрофобных органических загрязнителей, таких как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) в Pythium ultimum 10 или в эндомикоризными грибов 11. С ПАУ вездесущие и плохо растворимые загрязнения воды 12 в почве, мицелий-опосредованный транспорт может способствовать увеличению загрязнений биодоступность для потенциальных бактериальных деструкторов. В то время как общее количество переноса загрязняющих веществ может быть определена количественно, непосредственно химическими средствами 10, биодоступность загрязняющих веществ, транспортируемых в мицелии разрушающих бактерий и других организмов не может быть легко оценена.
Следующий протокол представляет собой метод оценки влияния myceЛия на загрязнений биодоступности бактериальных деструкторов в прямом порядке; это позволяет собирать информацию о пространственно-временной воздействия загрязняющих веществ на микробных экосистем. Мы опишем, как создать сложную ненасыщенный систему микрокосм имитации воздух-вода интерфейсы в почве, связывая физически отделены точечный источник ПАУ ПАУ унижающие bioreporter бактерий через мицелия транспортных векторов. Поскольку в воздухе транспортного исключается, эффект мицелия на основе транспорта на ПАУ биодоступность для бактерий могут быть изучены в изолированной образом. Более подробно, три кольца ПАУ флуорена мицелия организм Питиум ultimum и bioreporter бактерии Burkholderia sartisoli RP037-МКТО 13 были применены в описанных микромира установок. Бактерия B. sartisoli RP037-МКТО был первоначально построен для изучения фенантрена потоков в ячейку 14 и выражает усиленный зеленый флуоресцирующий белок (EGFP), в результате потока ПАУ вклетка, в то время как красный флуоресцирующих mCherry выражается конститутивно. Подробная информация о репортера строительства определяется Текон и др. 13 В предварительных испытаний, бактерия не выявлено плавание и только очень медленно способность роения. Было способны мигрировать медленно гифы Pythium ultimum, когда применяется в качестве плотной суспензии в верхней части гиф. Поскольку бактерии были встроены в агарозе в следующей методике, миграция на гиф не происходило.
Использование конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM), то bioreporter бактерии могут быть визуализированы непосредственно в микрокосмах и экспрессия EGFP может быть количественно по отношению к количеству клеток (пропорционального сигналу mCherry) с помощью программного обеспечения ImageJ. Это позволяет сравнивать биологическую качественно различных сценариев (например, выше или ниже). FLU было установлено, что биодоступной после мицелия транспорта П. ultimum (т.е. егобыл выше, чем в отрицательном контроле). Кроме того, протокол описывает, как количественно общее количество мицелия-опосредованного транспорта через химическими средствами и проверить загрязнений биодоступность с использованием кремниевых покрытием стекловолокна (SPME волокна) в идентичных микрокосмах. Результаты использования этой установки микрокосм были опубликованы и обсуждены на комбинации P. ultimum, флуорена и B. sartisoli RP037-МКТО 15. Здесь акцент лежит на подробным описанием метода и выявления потенциальных ловушек протокола, чтобы обеспечить эти знания для возможного дальнейшего применения. Дальнейшие применения могут включать различные грибковые, бактериальные виды (например, с загрязненных участков) и других загрязняющих веществ (например, пестициды) или по загрязнителям питания (например, в возрасте почвы).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка посуды, горки и инкубаторе
- Подготовьте следующие материалы для каждого микрокосма: одна большая пластиковая чашка Петри дно (d = 10 см), один модифицированный (см шаг 1,2) маленький пластиковый чашку Петри дно (d = 5 см) с крышками и один Счетной палаты слайд с тремя полостями.
- Взять нужное количество чашек Петри нижней части (D = 5 см). Удаление части краев с пилой точно соответствовать слайд (26 мм длиной ребра). Для стерилизации системы, впитать чашку Петри днища и крышки в 70% этаноле O / N и высушить их, по крайней мере, 2 ч в шкафу потока под УФ-светом. Храните чашки Петри в плотно закрывающийся пластиковый контейнер, который также подвергся воздействию УФ-излучения в течение 2 ч.
- Протрите необходимое количество слайдов с 70% этанола и воздушно-сухой их. Оберните слайдов в алюминиевую фольгу и поместить их в муфельной печи в течение 5 ч при 450 ° С для удаления возможных загрязнений. Подготовка стекла инкубаторе с крышками. Очистите с 70% этанола и подвергать открытые камеры УФ-свете, по крайней мере, 2 часа в кабинете потока.
Примечание: Большие Эксикаторы (диаметр около 30 см) с крышками могут быть использованы для этой цели; каждый эксикатор может вместить до десяти микромира установок.
2. Подготовка информации и культур
- Чтобы запустить 20 параллельных микромиры, получаем 100 мл модифицированной триптон-дрожжевой среде (MTY) 14, 150 мл 21C минимальной среде 16 (мм), 5 мл минимальной агаризованной среде (ММА; 0,5%, вес / объем), три картофельный агар с декстрозой (PDA пластины; 1,5%, вес / объем) для Р. ultimum, четыре пустые пластины, одна PDA пластину, содержащую 2 мг L -1 циклогексимид, четыре агарозном пластины (3%, вес / объем), содержащей 0,3 г мл -1 активированный уголь и 40 мг гриппа в 2 мг порциями.
- Подготовка Mty, содержащий 50 мг L -1 канамицина (канамицин эксплуатацию комплексред поддерживать EGFP репортерной плазмидой) и ММ, содержащей 10 мМ ацетата для бактериального культивирования. Используйте мм без ацетата подготовить 0,5% ММА для иммобилизации бактерий в микромире и разлить в чашки (каждый 20 мл) 1,5% КПК для выращивания Pythium ultimum и микромира установок.
- Привить некоторые гифы P. ultimum на три свежих чашках КДА и инкубировали в темноте при 25 ° С в течение примерно 72 ч. Затем убедитесь, что пластины зарастают полностью свежим и пушистым мицелием.
- Начните два культур B. sartisoli RP037-МКТО в 50 мл Mty из глицерина акций. Инкубируют при 30 ° С с 230 оборотов в минуту колбу вращательного движения O / N.
- Мера культура оптическая плотность (OD) при 578 нм и центрифуге при 1000 мкг в течение 10 мин (для В. sartisoli RP037-МКТО, как ожидается OD 578 составляет около 1,0 и клетки находятся в экспоненциальной фазе). Удалите супернатант и повторно приостанавливать клеткив соответствующем количестве ММ достичь OD 578 0,4. Посев 20 мл ММ, содержащей 50 мг L -1 канамицина с 400 мкл ресуспендировали клетки. Инкубируют при 30 ° С с 230 оборотов в минуту колбу вращательного движения O / N.
- Измерьте OD 578 культуры в мм (для В. sartisoli RP037-МКТО, как ожидается OD 578 составляет около 0,2 и клетки находятся в ранней экспоненциальной фазе). Центрифуга культуры в 2000 мкг в течение 10 мин и повторно приостанавливать клеток в соответствующем количестве ММ достичь OD 0,4. Смешайте 50 мкл клеточной суспензии с 500 мкл теплой жидкости, ММА в 2 мл пробирки и хранят при 50 ° С до использования. Используйте 150 мкл клеток в ММА для каждого микрокосма.
- Налейте пластин агарозном геле, содержащем активированный уголь. Расплава агарозы (3%; масса / объем) в дважды дистиллированной воде. Тщательно перемешать с активированным углем (0,3 г мл -1) и залить смесь в пластиковых чашках Петри(D = 10 см).
3. Микромир Монтаж
ПРИМЕЧАНИЕ:. Полный комплект микрокосм схематически на рисунке 1 Пожалуйста, обратитесь к рисунку 1 для всех последующих отдельных шагов. Следующие шаги описывают подготовку образца (SAM) с мицелия транспортных векторов и трех различных установок управления (CON AIR, CON ГПМ, CON POS). Резюме всех различных установок можно найти в таблице 1.
- Возьмите нужное количество чашек Петри и слайдов и подвергать их ультрафиолетовым светом под шкафом потока в течение 30 мин.
- Поместите небольшую чашку Петри, внутри большой и, подогнав слайд через зазор небольшой чашке Петри. Принимать одну выборку теплой клеточной суспензии в ММА и добавить 150 мкл в средней полости одного слайда. Повторите этот шаг до середины полости всех слайдов незаполнен ММА. Подождите 5 минут для MMA затвердеть.
- Используйте 1 см пробки буром выбивать круглых пятен с чистого PDA пластины. Поместите один участок на расстоянии 2 мм, рядом с ММА внутри малой чашке Петри. Добавьте к этому способствовать рост мицелия в настройке (PDA 3 на рисунке 1).
- Вырезать фигурные PDA патчи как механические барьеры. Используйте чистую и стерильную небольшой чашке Петри нижнюю часть и нажмите на КПК пластины. Использование шпателя сократить еще один небольшой кольцо на расстоянии 0,5 см в агар, что приводит к PDA-кольца.
- Вырежьте кусок, который точно вписывается в зазоре небольшой чашке Петри в настройках микромира и поместите его в щель на верхней части слайда. Убедитесь, что расстояние между ММА и круговой PDA барьера составляет около 2 мм. Закройте крышку небольшой чашке Петри осторожно вдавив ее в КПК барьера.
- Повторите шаги 3.4 и 3.4.1 с PDA пластину, содержащую 2 г L -1циклогексимида.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это настройка управления воздушного транспорта (CON AIR) по отношению к bioreporter клеток, так как мицелий ингибирует циклогексимидом и не зарастают ММА.
- Используйте 1 см пробки буром пробить круговые участки пустой PDA пластины. Используйте другой 0,5 см пробки буром, чтобы вырезать середину первого патча. Поместите в результате небольшой PDA-кольцо на расстоянии 1 мм, рядом с PDA барьера (PDA 1 на рисунке 1).
- Добавить 2 мг гриппа в отверстие PDA 1. Используйте 1 см пробка буром, чтобы вырезать круглые пятна с КПК пластин, заросших P. ultimum и поместите одну заплату (PDA 2 на рисунке 1) дно вниз на КПК кольцо так, чтобы мицелия коврик сталкивается кристаллы гриппа.
- Повторите предыдущий шаг, не добавляя кристаллы гриппа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это отрицательный настройки управления (CON NEG), чтобы определить фонфлуоресценция bioreporter клеток.
- Повторите предыдущий шаг, не добавляя кристаллы гриппа.
- Используйте 1 см пробки буром выбивать круглых пятен с агара, содержащего активированный уголь. Поместите четыре пятна в каждой установки микромира дальнейшее снижение газовой концентрации FLU (Рисунок 1).
- Подготовка положительного контроля (CON POS). Добавить несколько кристаллов гриппом 200 мкл ММА клеточной суспензии и поместить его в одну полость пустой слайд.
- Поместите чашку Петри (d = 10 см) с некоторым порошка активированного угля на нижней части инкубационной камере, чтобы минимизировать концентрацию газообразного гриппа в камере. Кроме того, место 4:56 50 мл стаканы стерильной водой на дне, чтобы поддерживать высокую влажность воздуха в камере.
- Передача микромира установок в инкубационных камерах и инкубировать при 25 ° С в течение 96 ч. Образцы Место беспорядочно в различных камерах роста, чтобы исключить эффекты местоположение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это время AP Инкубационныйкурсирует в оомицетов P. ultimum. Это может быть различным для других организмов.
- Передача микромира установок в инкубационных камерах и инкубировать при 25 ° С в течение 96 ч. Образцы Место беспорядочно в различных камерах роста, чтобы исключить эффекты местоположение.
4. конфокальной лазерной сканирующей микроскопии
- В идеале использовать установку CLSM с прямой микроскоп.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть оснащена обычными лазерами размещения например, 488, 561 и 633 нм линий для возбуждения или с перестраиваемой белого лазерного источника. - Используйте следующие параметры для коллекции изображений возбуждения: 490 нм (EGFP) и 585 нм (mCherry) на соответствующем интенсивности лазерного излучения (одновременное возбуждение); Диапазоны выбросов: от 500 до 550 нм (EGFP) и 605 нм до 650 нм (mCherry); Объектив: 63X NA 0,9 вода погружные (из-за своей долгой рабочей дистанции); шага для Z-стеки: 0,5 мкм.
- Открыть настройки микрокосм и использовать скальпель для удаления КПК 1, 2, 3 и барьер PDA. Положите покровным стеклом в верхней части ММА и аккуратно нажмите на него, чтобы удалить воздушные пузыри. Гора слайд на сцене микроскопа. Добавить каплю воды в верхней части гое крышка скольжения и использовать настройки mCherry найти bioreporter клеток в образце.
- Получить быстрый обзор образца и оптимизации сигнала к шуму с использованием тлеющего над-под таблицы поиска для красного (mCherry) и зеленый (EGFP), канал. Выберите случайное положение на образце для анализа флуоресценции bioreporter.
Примечание: гифы может показать аутофлюоресценция в диапазоне bioreporter излучения (например, зеленый автофлуоресцентной) 17. Будьте уверены, чтобы выбрать области без гиф, если это так. - Определить и записать Z-стеки для каждой позиции в зеленый (EGFP) и красный (mCherry) канала. Во избежание обесцвечивание образца при длительном воздействии света или эпифлуоресцентной лазерного света.
- Повторите предыдущий шаг для десяти случайных, равномерно распределенных позициях.
- Повторите все шаги, используя одни и те же настройки для всех образцов испытательного трека (SAM), Воздушная тюрьма, CON NEG и CON POS. 5. Анализ изображения
- Убедитесь в том, чтобы установить плагин logi_tool (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/).
- Откройте файл в ImageJ. Выберите "Разделить каналы" и закройте зеленый канал. Используйте макрос 'mCherry область ", представленную в качестве дополнительной файл кода для количественного площадь красной флуоресценции в Z-стека. Отрегулируйте предпочтительные настройки в макрос (выделены жирным шрифтом).
- Выход стол с измеренным пикселей выше порога (и выше определенного минимального размера) в z-стека.
ПРИМЕЧАНИЕ: сумма всех значений количество красных точек (область) в стеке.
- Выход стол с измеренным пикселей выше порога (и выше определенного минимального размера) в z-стека.
- Откройте файл в ImageJ. Выберите "Разделить каналы" и закройте красный канал. Используйте макрос 216; EGFP INT 'при условии, в качестве дополнительного файла кода для количественной оценки интенсивности зеленой флуоресценции в z-стека. Отрегулируйте предпочтительные настройки в макрос (выделены жирным шрифтом).
- Выход стол с средней интенсивности и площади всех зеленых объектов выше порога (и выше определенного минимального размера) в Z-стека. Чтобы вычислить полную интенсивность зеленых пикселей в стеке, умножать каждый, означают интенсивность по соответствующей области.
- Рассчитайте относительную EGFP индукции (EGFP REL):
(1)
Примечание: С mCherry выражается конститутивно, в результате значение EGFP отн является относительной мерой на сумму EGFP, выраженного определенного количества клеток. Пожалуйста, обратитесь к таблице 3 для получения дополнительной информации по расчету EGFP отн. - Обертка 15 мл ампулы 1 мл ГХ / МС флаконы и вставки в алюминиевую фольгу. Заполните испарения блюда с Na 2 SO 4; разместить все в муфельной печи в течение 5 ч при 450 ° С, чтобы удалить возможные загрязнения. Храните Na 2 SO 4 внутри активированного эксикаторе.
- Вырезать PDMS стекло с покрытием волокон в 0,5 см в длину. Вымойте волокна путем встряхивания в четыре раза 2 ч в свежей метанола. Повторите промывание шаги еще четыре раза с сверхчистой воды и хранения чистых волокон в сверхчистой воде в закрытой стеклянной пробирке.
- Подготовьте 1,5 л толуола / ацетона (3: 1, об / об), содержащей 10 мкг L -1 фенантрен-D 10.
- Выполните шаги 1, 2 и 3 протокола. Подготовка микрокосм без BIOReporter клетки для изучения FLU транспорт (SAM (-) и Воздушная тюрьма (-)) и с bioreporter клеток (SAM) для проверки деградации гриппа.
- Дополнительные (без bioreporter клеток): Место три PDMS покрытые стекловолокна (обычно используется для SPME экспериментов) как искусственное и количественно загрязнений раковиной внутри ММА SAM (-) с использованием тонких щипцов.
- Удалить стекловолокна с использованием тонких щипцов и передавать каждый в ГХ / МС флаконе со вставкой.
- Добавить 200 мкл толуола и встряхивают вертикально O / N и анализировать с помощью ГХ / МС. Используйте настройки, предоставленные в таблице 2.
- Передача ММА из полости среднего в стекл нный сосудик на 15 мл и добавляют около трех шпателей из Na 2 SO 4. Тщательно перемешать с помощью шпателя и добавить 10 мл растворителя. Vortex смеси и поколебать горизонтально O / N в темноте.
- Передача 1001; л образца в GC / MS флакон с вкладышем. Добавить 10 мкл аценафтилену-D 08 (10 мг L -1) и анализировать с помощью ГХ / МС по той же программе, как описано в 6.4.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа красный (mCherry) и зеленый (EGFP), флуоресценцию в Z-стеки, записанных, среди других вариантов свободное программное обеспечение ImageJ 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) может быть используемый.
(1) ПРИМЕЧАНИЕ: микрокосм установок также могут быть использованы для выполнения химической количественное перемещается количествах ГРИППА с или без абиотической загрязнений раковиной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленные здесь результаты уже опубликованы ранее 15. Пожалуйста, обратитесь к статье для детального механистического и экологической обсуждения.
После записи изображения с помощью CLSM, максимальный выступ интенсивность может быть проведено с использованием соответствующего программного обеспечения микроскопа или ImageJ, чтобы получить первый визуальное впечатление образца и контроля (рисунок 2). Позже, наборы данных могут быть спроектирован по-другому, чтобы показать значимые функции от конкретного программного обеспечения визуализации. Положительный контроль (CON POS) показывает явное EGFP индукции (рис 2а), в то время как контроль воздушного (CON AIR) имеет только справочный EGFP флуоресценции (рис 2б). EGFP флуоресценции в исследуемом образце (SAM) по-видимому, выше по сравнению с CON AIR, уи др не так отмечен как CON POS (рис 2С). Флуоресценции mCherry не зависит от деградации ПАУ и, следовательно, одинакова для всех образцов. Тем не менее, несколько повышенные сигналы EGFP не будут обнаружены с помощью этого метода и последующего анализа изображений имеет большое значение.
Для испытуемых микрокосм, визуальный осмотр был дополнен анализом изображений и расчета относительной EGFP индукции (см шаг 5 и далее протокола; рис 3). Зеленый фон флуоресценции для неиндуцированной В. sartisoli RP037-МКТО рассчитывается с CON NEG. В данных условиях, по сравнению индукции EGFP было установлено, что EGFP отн = 0,53. Никаких существенных различий не было обнаружено между CON NEG и Воздушная тюрьма (EGFP отн = 0,54; р> 0,95), таким образом, исключая любую паровой фазы FLU транспортные потоки в сторону от bioreporter клеток. Для CON POS, резко повышенные индукции EGFP (EGFP отн = 53,7) был найден, подтверждающие жизнеспособность клеток в ММА после 96 ч и представляющая максимальное индукции EGFP. В присутствии мицелия и гриппа (SAM), EGFP значительно индуцированных в клетках по сравнению с отрицательным контролем (EGFP отн = 1.15; р <0,001). Тем не менее, индукция EGFP является относительно низким по сравнению с положительным контролем (см таблице 3, пункт 8).
Транспорт гриппа по мицелия Р. ultimum в настройках микромира количественно химически (см Шаг 6 FF протокола; Рисунок 4). В присутствии гриппа и P. ultimum (SAM (-)), мицелий транснаходится примерно в 25 нг гриппа в 96 ч, которая эквивалентна скорости переноса 37.5pmold -1 см -1. Управление в отсутствие мицелия (CON AIR (-)) показали, газообразный FLU транспорта в ММА в диапазоне от 2 нг только течение 96 ч, т.е., индуцирование bioreporter путем паровой фазы-концентраций могут быть исключены. Когда B.sartisoli RP037-МКТО присутствовал (SAM), <1 нг гриппа был обнаружен в патче ММА. Это проверяется эффективное разложение бактериальной грипп после мицелий-опосредованной транслокации.
Это позволяет исследовать влияние бактериального разложения, т.е. мойки грипп, на ГРИППА транслокации путем добавления абиотическую загрязнений оседают на системы (см шаге 6.4.1 и след протокола). Таким образом, он способен определить количество гриппа, поглощенной волокнами и количество оставшегося в ММА и вышележащей гиф. Для Сэма(-), Общее количество перемещается независимо от наличия загрязнений раковиной (р> 0,9; 5А). Тем не менее, микрокосм, с увеличенной площадью захвата грипп был также протестирован, как описано подробно ранее 15. Там, значительное увеличение количества транслокации гриппа может быть обнаружен (фиг.5В).
Рисунок 1. Схематическое изображение и фото полной комплектацией микромира. Вид с верхней (A) и сбоку (B). Все агар участки были размещены в верхней части слайда с три небольших полостей. Два мг кристаллов ГРИППА были размещены внутри полости (d = 5 мм) в середине КПК 1. PDA 2 был недавно заросшие гиф Р. ultimum перед КПК 1. изогнутые PDA часть была помещена между КПК 2 и патч ММА создать механическое FLU барьер вместе с крышкой чашку Петри (d = 5 см). Четыре агар пластыри, содержащие активированный уголь помещали в установку, чтобы дополнительно уменьшить концентрацию газообразного гриппа. Фотографии полной микромира сверху (C) и Диагональный вид (D) без микроорганизмов и гриппа. 1А и 1В были изменены с разрешения Schamfuss и др. 15 Адаптировано с разрешения Schamfuss С. и др. Влияние мицелия на доступность флуорена ПАУ-разрушающие бактерии. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) Американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
PG "/>
Рисунок 2. Максимальные прогнозы интенсивности конфокальной микрофотографии лазерного сканирования. Микрофотографии являются визуализации mCherry и EGFP индукцию bioreporter бактерии B. sartisoli RP037-МКТО в ММА. Когда бактерии имели контакт с источником кристаллического гриппа в ММА (CON POS;), сигнал EGFP повышается по сравнению с контрольной группой (CON воздуха; б). Образцы с гриппом и P. ultimum (SAM; C) также показывают повышенный сигнал EGFP, однако менее выраженное, чем положительного контроля. mCherry выражается конститутивно и, следовательно, служит в качестве визуального контроля для обнаружения клеток. (Увеличение 630X, бар 20 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Относительная EGFP индукция в B.sartisoli RP037-Че за CON NEG, Воздушная тюрьма, и Сэм с мицелия и гриппа. Сравнение относительной EGFP индукции (EGFP REL) по B.sartisoli RP037-Че после 96 ч в отсутствие гриппа (CON NEG), в присутствии гриппа, но отсутствие P.ultimum (CON AIR) и в присутствии как грипп и P.ultimum (SAM). Статистически значимые различия в CON NEG отмечены звездочкой. Эксперименты проводились в независимых трижды за Воздушная тюрьма и
. (. Ср Рисунок 1) Рисунок 4. Химическая ГРИПП количественное Суммы гриппа в нг извлечены из пластыря ММА после 96 ч для паровой фазы транспорта без клеток (CON AIR (-)), мycelial транспорт без клеток (SAM (-)) и мицелия транспорт с клетками (SAM). Эта цифра была изменена с разрешения Schamfuss и др. 15 Адаптировано с разрешения Schamfuss С. и др. Влияние мицелия о доступности флуорена ПАУ-разрушающие бактерии. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) Американского химического общества.
Рисунок 5. Химическая ГРИПП количественное в присутствии абиотической загрязнений раковиной () Суммы гриппа в нг извлекается из ММА патч после 96 ч для мицелия транспорта с или без искусственного загрязнителя раковиной (SAM (. (Ср Рисунок 1). - ) с или без PDMS соально волокна). (B) Те же результаты для разнообразного испытательном треке с увеличенной площадью мицелия ГРИППА поглощения. Эта цифра была изменена с разрешения Schamfuss и др. 15 Адаптировано с разрешения Schamfuss С. и др. Влияние мицелия о доступности флуорена ПАУ-разрушающие бактерии. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) Американского химического общества.
| Имя | ГРИПП | Мицелий | Ячейки | Применение | Комментарии |
| SAM | + | + | + | CLSM | |
| ГХ / МС | |||||
| SAM (-) | + | - | ГХ / МС | Кроме того, можно с PDMS волокон, как искусственного загр раковиной | |
| Воздушная тюрьма | + | (+) | + | CLSM | мицелий только растет до PDA барьера; MMA не распространяется |
| Воздушная тюрьма (-) | + | (+) | - | ГХ / МС | мицелий только растет до PDA барьера; MMA не распространяется |
| CON NEG | - | + | + | CLSM | |
| CON POS | + | - | + | CLSM | клетки подвергается воздействию прямого кристаллов ГРИППА |
Таблица 1. Обзор всех типов образцов Резюме всех контрольных и тестовых образцов, включая приложения (bioreporter анализа - CLSM или химического количественного - GC / MS). И композиния (FLU, мицелий и bioreporter клетки).
| Печь | |
| Начальная температура | 50 ° С |
| Предварительное время | 2 мин |
| Ставка | 15 ° C мин -1 |
| Final Temp | 300 ° С |
| Конечное время | 6,33 мин |
| Инжектор (PTV) | |
| Объем впрыска | 0,5 мкл |
| Режим | без деления |
| Чистка | 2,00 мин |
| Очистить поток | 50,0 мл мин -1 |
| Начальная температура | 80 ° С |
| Предварительное время | 0,02 мин |
| Пандусы: Цена | 600 ° C мин -1 |
| Final Temp | 300 ° С |
| Конечное время | 10 мин |
| Колонка | |
| Модель | J & W DB-5MS |
| Номинальная длина | 20 м |
| Номинальный диаметр | 180 мкм |
| Номинальная толщина пленки | 0,18 мкм |
| Газ-носитель | гелий 0,8 мл мин -1 |
| MSD Transferline | 280 ° С |
| MSD | |
| Режим Sim | |
| MS Источник | 230 ° С |
| MS Quad | 150 ° С |
Таблица 2. Параметры GC / MS. Основная всех настроек для ГХ и МС, дuantify флуорена в микромире установок.
| ПОДВОДНЫЕ КАМНИ | КОММЕНТАРИЙ | |
| 1 | Предварительное рост и жизнеспособность тесты | Исследование роста мицелия организма выбора. Сколько времени потребуется для достижения патч ММА? Разве это тормозится циклогексимид барьер? Также проверьте останутся ли bioreporter клетки жизненно важное значение в ММА все время через плетения анализов. Если нет, то также можете добавить источник углерода в ММА, которое не приводит к индукции bioreporter. Исключить возможные взаимные ингибирование бактерий и мицелия. |
| 2 | Мицелиальным темпы роста | Темпы роста мицелия организма не должна быть слишком медленной, поскольку в противном случае в газовой фазе транспорт ПАУ возрастает при длительном времени инкубации. Протокол может быть адаптировандобавить ПАУ в более поздний момент времени, но опять же, мицелий в точке прививки не может быть больше неактивна. |
| 3 | Бактериальный мобильность | Если точка сканирования лазерного микроскопа используется и бактериальный штамм подвижна, записи и количественное определение Z-стеков может быть невозможно из-за движения внутри ММА. Таким образом, бактериальный движение должно быть предотвращено, например, за счет увеличения прочности ММА, с помощью CLSM с быстрым сканером или вращающемся диске лазерного микроскопа. |
| 4 | Парофазного транспортного | В паровой фазе перенос химического вещества (например, ПАУ) по отношению к bioreporter клеток, должны быть исключены, так как достаточно bioreporter клетки чрезвычайно чувствительны к воздействию химических веществ в паровой фазе. Это переломный момент всей протокола в целях предотвращения ложных положительных результатов, вызванных газовой транспорта. Газовая фазаКонцентрация может быть оценена с помощью химического анализа CON AIR (-) и концентрации в паровой фазе можно регулировать, например, путем добавления большего или меньшего агарозном участки с активированным углем. |
| 5 | Токсичность | Имейте в виду, что высокие концентрации тестируемого химическое вещество может оказывать токсическое воздействие на мицелия организма и / или бактерий. |
| 6 | Автофлуоресцентной | Проверьте, если выбран мицелия организм показывает некоторые аутофлуоресценцию в диапазоне от ожидаемого сигнала bioreporter. Будьте уверены, чтобы проверить на разных стадиях роста с аутофлуоресценция может варьироваться 17. Если аутофлуоресценция обнаружен, не забудьте записать Z-стеки в мицелии без районах. |
| 7 | Обесцвечивание | флуоресценции mCherry обычно прочны и не чувствительны к обесцвечиванию в прикладной биoreporter клетки. В отличие от этого, EGFP отбеливает довольно быстро. Таким образом, не использовать канал EGFP визуализировать образец до записи Z-стека. |
| 8 | индукция EGFP | Мы заметили, низкая индукция EGFP в SAM сравнению с CON POS. Это объясняется сильной пространственной ограничения и низкой доступности источника ГРИППА поддерживать очень низкую концентрацию в паровой фазе гриппа (см Последние результаты абзац). В зависимости от выбранного штамма bioreporter и химической, поглощение область на КПК 1 мая варьировать, чтобы увеличить транспортную скорость (фиг.5В). Тем не менее, он должен считать, что это также увеличивает паровой фазе транспорт по отношению к bioreporter клеток. |
| 9 | Расчет EGFP отн | Представленный метод расчета EGFP отн где интенсивность зеленой пикселей сравнениюв области красных пикселей является только одним из возможных вариантов. Пожалуйста, обратитесь к обсуждению для получения дополнительной информации. |
| 10 | Размер пикселя | Помните, что увеличение выбранного объектива и потенциально применяться коэффициент масштабирования влияет на размер пиксела изображения. Это должно быть принято во внимание перед анализом изображений. |
| 11 | Биодоступной фракции | Имейте в виду, что биодоступность транспортируемого соединения оценивается качественно (не количественно) с помощью индукции EGFP. Не были предприняты Нет корреляции вычисляется относительно EGFP-индукции и биологически фракции. Тем не менее, это может быть учтено в будущих приложениях. |
| 12 | Пределы обнаружения | Химическая обнаружения. Для химической количественного органических соединений, в широком диапазоне концентра, приведенные может быть надежно обнаружен. Мы обнаружили, суммы в диапазоне 0ng и 1,000ng. EGFP количественное. Мы сравнили относительную EGFP индукции в образцах без переноса загрязняющих веществ (т.е. 0ng транспортируется), с мицелия-опосредованный транспорт (например, между 20 и 40 нг транспортировке; ср цифры 4 и 5) и при непосредственном контакте с загрязнителей источника (то есть, максимальное доступная сумма). Эти три случая оказались также различимы с описанным способом. Тем не менее, мы не можем сделать более подробное заявление о разрешении относительной индукции EGFP. Этот вопрос может быть решен в будущем, связывая разные суммы загрязняющих веществ с коррелирующего EGFP индукции в микромире установок. |
| 13 | Петри материала | Блюда пластиковые чашки может привести к недооценке мицелия ПАУ транслокации и / или биодоступности. Это не должнобыть проблематичным, если качественные отчетность стремился. В случае точные количественные измерения необходимы, применение стеклянные чашки Петри следует рассматривать, несмотря на подготовку и обработку будет более неудобно. |
Таблица 3. Обсуждение возможных ошибок. Возможные подводные камни до и во время эксперимента и предлагаемых замечаний и опций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представлены настройки микрокосм зарекомендовали себя для изучения биодоступности пространственно разделенных химических веществ, унижающему человеческое достоинство организмов после поглощения и транспорта по мицелия. Потенциал в газовой фазе перенос частично летучих соединений предотвращается и бактериальные клетки bioreporter могут быть визуализированы без сложной подготовки проб и, таким образом, с минимальным нарушением чувствительной системы. В то же время, химический анализ образца может быть легко проведена позволяя для хорошего контроля полученных результатов и для количественного определения общего транспорта. Тем не менее, некоторые моменты должны быть тщательно рассматриваться до и во время проведения эксперимента. Важным моментом является то, чтобы сохранить микрокосм без каких-либо бактерий или химических перекрестного загрязнения. Это может быть сложным, так как многие микрокосм работают параллельно и, таким образом, большие инкубаторе (например, эксикаторах) обязательны для заполнения. Следовательно, очень важно, чтобы стерилизовать все детали тщательно до установки строиния. Еще одним важным пунктом может быть применение пластиковых чашках Петри для микрокосмах. Хотя ПАУ и bioreporter не войти в прямой контакт, какое-то количество ПАУ может быть поглощена пластика. Тем не менее, мы считаем, что это не является проблемой для описанного протокола, так как это привело бы к, если таковые имеются, в недооценке мицелия тьфу-транслокации и / или биодоступности. В любом случае, если требуется точная количественная, его следует рассматривать в обмене пластмассовых деталей с стеклянных деталей, хотя обработка будет более неудобным. Другие моменты, которые должны быть рассмотрены привлекать выбранной бактериальных и грибковых штаммов (возможно взаимное торможение, скорость роста, мобильность и возможность автофлуоресцентной), выбранные химические вещества (токсичного воздействия на микроорганизмы, волатильности, пределы обнаружения) и практических аспектов (отбеливание, ограничение EGFP индукция и расчет EGFP REL). Обзор возможных ошибок и соответствующих замечаний можно найти вТаблица 3.
Мы использовали эту модель установки микрокосм, чтобы продемонстрировать мицелия FLU транспорта и последующего бактериального разложения в ненасыщенного системы непосредственно на уровне взаимодействия клеток мицелия. Наша модель настройки может изменяться и корректироваться, чтобы удовлетворить различные потребности с различных бактериальных и грибковых штаммов, химических соединений и т.д. Таким образом, система может быть использована, например, (I), чтобы оценить влияние на мицелий бактерий в присутствии в противном случае ограниченного химического вещества (например, токсичное) источник, (II), чтобы предсказать влияние мицелия на биодоступность соединений по бактериальному разложению, (III) для изучения загрязнений биодоступность в зависимости от расстояния от бактерий к транспортному вектора или (IV) исследовать влияние различных химических источников (например, кристаллический, в почве или в растворенном виде). Тем не менее, настройка системы, чтобыlternate условия будет тонкий и должны быть проведены шаг за шагом, чтобы достичь четких результатов. До сих пор мы не тестировали систему на других бактериальных или грибковых штаммов и других соединений, чем ЛАГ. Однако, поскольку мицелия сети, как известно, транспортировки и другие загрязняющие вещества, чем ПАУ как пестициды 19 или растворимых веществ, таких как салицилат 20, мы считаем, что система может быть расширена до различных химических соединений, приведенных составной конкретных бактерий биосенсора.
Пожалуйста, обратите внимание, что в зависимости от приложенного bioreporter напрягать разные расчет EGFP отн могут быть предпочтительнее. Вместо того, чтобы уравнение (1) две следующие параметры могут быть применены:
(2)
(3)
Howeveг, в представленной уравнением протокола (1) была выбрана из-за следующих причин: интенсивность (I) EGFP сообщалось, коррелирует с потоком ПАУ в камеру 14, тогда как (II) mCherry сообщалось, чтобы показать значительные вариации для различных клеток 13 , Уравнение (2) и (3), в отличие от этого, может быть выбран, чтобы предотвратить ложную информацию от потенциальных легких предметов в образце. В любом случае, мы сравнили все три метода расчета друг с другом, в результате чего выявлено статистически значимых различий обнаружено не было. Тем не менее, из-за представленных вариаций интенсивности флуоресценции mCherry, рекомендуется использовать уравнение (1) или (2).
В конце концов, некоторые ограничения техники должны быть рассмотрены. Поскольку микрокосмы были разработаны, чтобы предотвратить газофазного переноса тестируемого соединения, мицелия поглощения соединения уменьшается. Это приводит к снижению скоростей транспортных чем можно было бы ожидать при беспрепятственного поглощения. Таким образом, чувствительность BioreШтамм портье должна быть достаточно высокой, чтобы обнаружить небольшие изменения в биодоступной фракции. Кроме того, установка будет, вероятно, не подходит для грибковых штаммов с низкой скоростью роста. В этом случае, долгосрочная инкубации может способствовать газофазного переноса примеси, таким образом, ведущей к ложно-положительных результатов. Можно было бы изменить установку таким образом, что загрязнения могут быть применены в более поздний момент времени. Тем не менее, гифы затем может быть уже неактивными или мертвым в точке прививки. Наконец, как указано выше, диапазон химических соединений, которые транспортируются мицелиальных сетей является большой. Тем не менее, наличие подходящего штамма bioreporter может быть ограничение ключевым фактором.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest | |||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 (pH 6.0) | |||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2% | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8 | |||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | |||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| ImageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
References
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
- Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
- Griffin, D. M. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 141-151 (1981).
- Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 1-22 (1981).
- Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
- Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
- Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
- Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
- Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
- Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
- Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
- Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
- Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. Manual of methods for general bacteriology. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).
- Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).
- Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
