Summary
Burkholderia sartisoli RP037-mChe ile bir bütün hücre bioreporter deney, bir su doymamış model sisteminde hava dolu gözenekler köprü misel aktif taşıma sonra bakteriyel indirgenmesi için uygun bir organik kirlilik (örneğin, floren) fraksiyonları tespit etmek için geliştirilmiştir.
Introduction
Toprak yoğun bakteri gibi mikroorganizmalar 1,2 geniş bir yelpazede ile doldurulur. Ancak, bu yaşam koşulları, özellikle su durumu 3 açısından, zorlu. Bakteriler kalıcı heterojen ortamlarda 4 optimal koşulları aramak gerekir, ancak sürekli su filmlerin olmaması özgürce yaymak için onları engelleyen kısıtlı hareket 5 sonuçlanıyor. Ayrıca, çözünenlerin difüzyon hızları (örneğin, besinler) doymamış koşullarda 6 altında indirilir. Böylece, bakteri ve besin genellikle fiziksel ayrılır ve besin erişilebilirlik 3 sınırlıdır. Bunun bir sonucu olarak, sürekli bir su-fazı gerektirmez kimyasal bileşikler için bir taşıma vektörü, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için yardımcı olabilir. Aslında, bu tür mantar ve Oomycetes kadar mikroorganizmalar bu şekilde ulaşmak ve mobi hava dolu gözenekli boşluklar sayesinde büyümesini sağlayarak lifli bir büyüme formu geliştirdiklizing fiziksel uzun mesafelerde besin 7 ve 8 karbonlu maddeler ayrılır. Hatta bakteri 9 şekerler ve diğer enerji kaynakları sağlar biyolojik taşıma vektörü olarak hareket edebilir. Alım ve mantar organizmalarda taşıma aynı zamanda, Pythium ultimum 10 veya arbusküler mikoriza mantar 11 polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH), hidrofobik organik kirletici maddeler için gösterilmiştir. PAH her yerde ve suda az çözünen kirleticiler toprakta 12 olduğundan, Miseller-aracılı taşıma potansiyeli bakteriyel degraders için kirletici biyo artırmaya yardımcı olabilir. Kirletici taşıma miktarı kimyasal doğrudan ölçülebilir Oysa aşağılayıcı bakteri ve diğer organizmalar için misel tarafından taşınan kirleticilerin biyolojik kolaylıkla değerlendirilebilir edilemez, 10 anlamına gelir.
Aşağıdaki protokol myce etkisini değerlendirmek için bir yöntem sunardoğrudan bir şekilde bakteri degraders için kirletici biyo üzerinde lia; mikrobiyal ekosistemler üzerindeki kirleticilerin zamanmekansal etkisi hakkında bilgi toplama sağlar. Biz nasıl misel ulaşım vektörler aracılığıyla PAH-aşağılayıcı bioreporter bakteri ile bir fiziksel ayrılmış PAH noktası kaynağını bağlayarak toprakta hava-su arabirimleri taklit ayrıntılı bir doymamış evren sistemini kurmak açıklar. Havadaki ulaşım hariç Çünkü, bakteriler için PAH biyoyararlanım üzerine misel-temelli ulaşım etkisi izole bir şekilde ele alınabilir. Daha ayrıntılı olarak, üç halka PAH fluoren, misel organizma Pythium ultimum ve bioreporter bakteri Burkholderia sartisoli RP037-mChe 13 tarif evren kurulumları uygulanmıştır. bakteri B. sartisoli RP037-mChe başlangıçta hücre 14'e fenantren akıları çalışma yapılmıştır ve PAH akımının bir sonucu olarak, yeşil flüoresan protein (EGFP) geliştirilmiş ifade ederMCherry kurucu olarak ifade edilen kırmızı flüoresan oluşturan ise hücre. Muhabir inşaat ile ilgili detaylı bilgiler Tecon et al., Ön testlerde 13 ile verilir, bakteri yok yüzme ve sadece çok yavaş kaynaşma yeteneği ortaya çıkardı. Bu hif üzerine yoğun bir süspansiyon halinde tatbik edildiği zaman Phytium ultimum hif yavaş yavaş göç edebildi. Bakteriler aşağıdaki protokol agaroz gömülü olduğundan, hif üzerinde göç meydana gelmedi.
Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanarak, bioreporter bakteri mikrokosmlarından doğrudan görülebilir ve eGFP sentezlenmesi yazılım ImageJ yardımıyla (MCherry sinyale orantılı), hücrelerin miktarı ile ilgili olarak tayin edilebilir. Bu farklı senaryolarda niteliksel biyo karşılaştırarak izin verir (yani, daha yüksek veya daha düşük). GRİP P. misel nakliyeden sonra bio-yararlı olduğu bulunmuştur ultimum'a (yani, onu), negatif kontrol olarak daha yüksektir. Ayrıca, protokol kimyasal yollarla Miseller-aracılı taşıma miktarını ölçmek için ve aynı mikrokosmlarından silikon kaplı cam elyaf (SPME lifler) ile kirletici biyo doğrulamak açıklamaktadır. Bu evren kurulumu kullanarak sonuçları yayınlandı ve P. kombinasyonu için tartışılmıştır ultimum, fluoren ve B sartisoli RP037-mChe 15. Burada, odak potansiyeli daha uygulamalar için bu bilgiyi sağlamak için detaylı bir yöntem açıklama ve protokol potansiyel tuzaklar belirlenmesi yatıyor. Diğer uygulamalar (kontamine sitelerden örneğin,) çeşitli mantar, bakteri türlerini içerir ve diğer kirleticiler (örn, böcek ilaçları) veya kirletici kaynağı (örneğin, yaşlı topraklar) olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yemekleri, Slaytlar ve Kuluçka Odaları 1. Hazırlık
- Her mikrokozmos için aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: bir büyük plastik Petri kabı alt (d = 10 cm), modifiye edilmiş bir (adım 1.2) kapaklı küçük plastik Petri kabı alt (d = 5 sm) ve üç oyuğa sahip bir sayım bölmesi slayt.
- Petri kabı alt parça istenilen sayıda (d = 5 sm) alın. Tam bir slayt (26 mm kenar uzunluğu) uygun bir testere ile ağzına kısmını çıkarın. Sistemi sterilize etmek için,% 70 etanol O / N Petri dipleri ve kapaklarını ıslatın ve UV-ışığı altında bir akış dolabında en az 2 saat onları kurutun. Ayrıca, 2 saat boyunca UV ışığına maruz kalan, sıkıca kapatılmış bir plastik kap içinde Petri kapları saklayın.
- % 70 etanol ile slaytlar istenilen sayıda silin onları havaya kurutun. Alüminyum folyo slaytlar sarın ve olası kirlilikler kaldırmak için 450 ° C'de 5 saat boyunca bir mufl ocağında koydu. Kapaklı cam kuluçka odaları hazırlayın. % 70 etanol ile temizleyin ve bir akış kabininde en az 2 saat UV ışığı açık odaları maruz.
Not: kapaklı büyük Desiccators (30 cm çap) bu amaç için kullanılabilir; Her kurutucu on microcosm kurulumları kadar ev olabilir.
Medya ve Kültürler 2. Hazırlık
- Değiştirilmiş tripton-maya ortamı (mty) 14, 21C minimal ortam 16 (MM), yaklaşık 150 mi, minimal ortam ağar 5 ml, 100 ml elde etmek, 20 paralel bir evrendir çalıştırmak için, üç (MMA,% 0.5 w / v) Patates dekstroz agar plakaları (PDA,% 1.5, ağ / hac), P. ultimum, dört boş levhalar, 2 mg L -1 sikloheksimid, dört agaroz plakaları içeren bir PDA plaka (3,% ağırlık / hacim) 0.3 g mi -1 aktif karbon ve 2 mg bölümler halinde FLU, 40 mg.
- MTY kanamisin 50 mg L -1 içeren hazırlayın (kanamisin requir olduğunuedilen bakteryel ekimi için, 10 mM asetat içeren eGFP raportör plazmid) ve MM korumak için. Mikrokosmlarından bakteri immobilizasyonu için% 0.5 MMA hazırlamak için asetat olmadan MM kullanın ve Pythium ultimum ve evren kurulumları ekimi için% 1.5 PDA plakaları (her biri 20 mi) dökün.
- P. bir hifaları inoküle Üç taze PDA plâkalarında ultimum'a ila yaklaşık 72 saat boyunca 25 ° C'de karanlıkta inkübe edilir. Sonra plakalar, taze ve kabarık misel tamamen büyümüş olduğundan emin olun.
- B. iki kültür Başlangıç bir gliserol stokundan mty 50 ml sartisoli RP037-mChe. 230 rpm'de döner şişe hareket O / N oranı ile 30 ° C'de inkübe edilir.
- Ölçü kültür optik yoğunluk (OD) 578 nm 'de ve santrifüj 10 dakika için 1000 x g'de (B. sartisoli RP037-mChe için beklenen OD 578 yaklaşık 1.0 olan ve hücreler, logaritmik faz olarak ifade edilmiştir). Süpernatantı atın ve hücreleri yeniden askıyaMM uygun bir miktarda bir OD 0.4 578 ulaşmak için. 50 mg L -1 yeniden süspanse hücrelerin 400 ul kanamisin içeren MM 20 ml aşılamak. 230 rpm'de döner şişe hareket O / N oranı ile 30 ° C'de inkübe edilir.
- MM kültür OD 578 ölçün (B. sartisoli RP037-mChe için, beklenen OD 578 yaklaşık 0.2 ve hücreleri erken üstel fazda vardır). Santrifüj kültür 10 dakika boyunca 2000 x g'de 0.4 OD ulaşmak için MM uygun miktarda hücrelerin yeniden askıya. Kullanıma kadar 50 ° C'de hücre 2 ml tüpler sıcak sıvı MMA 500 ul süspansiyon ve mağaza 50 ul karıştırın. Her mikrokozmos MMA hücre 150 ul kullanın.
- Aktive edilmiş karbon ihtiva eden agaroz jeli plakaları dökün. Agaroz eritin (% 3 ağ / hac) iki kere damıtılmış su içinde. (G mi -1 0.3), aktif karbon ile iyice karıştırın ve plastik Petri içine dökün(D = 10 cm) aktarılır.
Montaj 3. Microcosm
NOT:. Komple evren kurulumu Şekil 1'de şematik olarak tasvir edilmiştir aşağıdaki bireysel adımlar için Şekil 1'e bakınız. Aşağıdaki adımlar misel taşıma vektörleri ve üç farklı kontrol kurulumları (CON AIR, CON NEG, CON POS) ile bir numunenin (SAM) hazırlanmasını açıklayan. Farklı düzeneklerinin bir özeti, Tablo 1 'de bulunabilir.
- Petri kapları ve slaytlar istenen sayıda alın ve 30 dakika için bir akış kabinin altındaki UV ışığına maruz bırakmaktadır.
- Büyük bir içindeki küçük Petri kabı yerleştirin ve küçük Petri kabı boşluğu ile slayt uyacak. MMA sıcak hücre süspansiyonu bir örnek alın ve bir slayt orta boşluğuna 150 ul ekleyin. Tüm slaytların orta boşluklar kadar bu adımı tekrarlayınMMA ile dolu. MMA katılaşması için 5 dakika bekleyin.
- Boş PDA plağından dairesel yamalar yumruk 1 cm mantar delici kullanın. Küçük Petri kabı içine MMA sonraki 2 mm mesafede bir yama yerleştirin. (Şekil 1 PDA 3) kurulumunda misel gelişimini teşvik etmek bu ekleyin.
- Mekanik bariyerler gibi kavisli PDA yamaları kesin. Temiz ve steril küçük Petri kabı alt kısmını kullanın ve PDA plaka içine bastırın. PDA-ring ile sonuçlanır agar içine 0.5 cm'lik bir mesafeden daha küçük bir halka kesmek için bir spatula kullanın.
- Tam evren kurulumunda küçük Petri kabı boşluğa uyan bir parça, kesin ve slayt üstüne boşluk içine yerleştirin. MMA ve dairesel PDA bariyer arasındaki mesafe yaklaşık 2 mm olduğundan emin olun. Yavaşça PDA bariyer içine bastırarak küçük Petri kabı kapağını kapatın.
- Tekrar 2 gr L içeren bir PDA plaka 3.4 ve 3.4.1 adımları -1bir sikloheksimid.
NOT: Mycelialar sikloheksimid tarafından inhibe edilir ve MMA sarmak yok çünkü bu, bioreporter hücrelerine karşı havadan taşıma (CON AIR) için kontrol kurulum.
- Boş bir PDA plaka dairesel yamalar yumruk 1 cm mantar delici kullanın. İlk yama ortasında kesip başka 0,5 cm mantar delici kullanın. PDA engeli (Şekil 1 'de PDA 1) yanında, 1 mm bir mesafede elde edilen küçük PDA halka yerleştirin.
- PDA 1. Kullanım delik P. ile büyümüş PDA plakaları dairesel yamalar kesip 1 cm mantar delici içine FLU 2 mg ekle ultimum'a ve misel mat GRİBİ kristalleri bakacak şekilde PDA halkası üzerine aşağı alt (Şekil 1 PDA 2) bir yama yerleştirin.
- GRİP kristalleri eklemeden önceki adımı tekrarlayın.
NOT: Bu arka plan belirlemek için negatif kontrol kurulumu (CON NEG) 'dirbioreporter hücrelerin floresans.
- GRİP kristalleri eklemeden önceki adımı tekrarlayın.
- Aktif karbon içeren agar dairesel yamalar yumruk 1 cm mantar delici kullanın. Ayrıca gaz GRİBİ konsantrasyonunu (Şekil 1) azaltmak için her evren kurulum dört yamaları yerleştirin.
- Bir pozitif kontrol (CON POS) hazırlayın. MMA hücre süspansiyonu 200 ul bazı GRİP kristalleri ekleyin ve boş bir slayt bir kavite koydu.
- Odasındaki gaz GRİP konsantrasyonunun asgariye düşürülmesi için enkübasyon odasının altındaki aktif karbon bir toz ile bir Petri kabı (d = 10 cm) yerleştirin. Aynı zamanda, bölme yüksek nemi kalıcı kılmak için alt steril su ile 4:56, 50 ml beher yerleştirin.
- Kuluçka odalarına evren kurulumları aktarın ve 96 saat süre ile 25 ° C'de inkübe edin. Rastgele farklı büyüme odaları yerleştirin örnekleri konum etkilerini dışlamak için.
NOT: Bu inkübasyon süresi apoomiset P. katlarının ultimum'a. Diğer organizmalar için farklı olabilir.
- Kuluçka odalarına evren kurulumları aktarın ve 96 saat süre ile 25 ° C'de inkübe edin. Rastgele farklı büyüme odaları yerleştirin örnekleri konum etkilerini dışlamak için.
4. Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi
- İdeal dik mikroskop ile CLSM kurulumu kullanın.
NOT: Bu geleneksel lazerler sunan örneğin, uyarma veya bir ayarlanabilir beyaz lazer kaynağı ile 488, 561 ve 633 nm hatları ile donatılmış olabilir. - Tahrik: görüntülerin toplanması için aşağıdaki ayarları kullanın 490 nm (eGFP) ve uygun lazer yoğunluğu (eşzamanlı uyarma) 585 nm (mCherry); emisyon aralıkları: 500 550 nm (eGFP) ve 605-650 nm (mCherry); objektif: (nedeniyle uzun çalışma mesafesi) 63X NA 0.9 su dalgıç; 0.5 mikron z-yığınları için adım boyutu.
- Açık evren kurulum ve PDA 1, 2, 3 ve PDA bariyer kaldırmak için bir neşter kullanabilirsiniz. MMA üstüne bir cam kapak kayma koyun ve hava kabarcıklarını çıkarmak için hafifçe bastırın. Mikroskop sahnede Dağı slayt. Th üzerine bir su damlasının eklemee kapak kayma ve numunedeki bioreporter hücreleri bulmak için MCherry ayarlarını kullanın.
- Numunenin hızlı bir bakış alın ve bir parıltı-over-under arama tablosu kırmızı için (mCherry) ve yeşil (eGFP) kanalını kullanarak sinyal gürültü oranı optimize. Bioreporter floresan analiz için numune üzerine rastgele bir pozisyon seçin.
NOT: hifler bioreporter emisyon (örneğin, yeşil otofloresans) 17 aralığında otofloresans gösterebilir. Bu durumda ise hif olmadan alanlarını seçmek için emin olun. - Define ve yeşil (eGFP) ve kırmızı (mCherry) kanal her pozisyon için z-yığınları kaydedin. Epifloresans ışığın yada lazer ışığın uzun süre maruz kalma, numunenin ağartma kaçının.
- On rastgele dağılmış pozisyonları için önceki adımı yineleyin.
- Test pisti (SAM), CON AIR, CON NEG ve CON POS tüm örnekler için aynı ayarları kullanarak tüm adımları tekrarlayın. 5. Görüntü Analizi
- Logi_tool eklentisi (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/) yüklemek için emin olun.
- ImageJ açık dosya. "Bölünmüş kanalları" ve yakın yeşil kanalı seçin. Z-yığını kırmızı floresan alanını ölçmek için ek kod dosyası olarak sağlanan makro 'MCherry alan' kullanın. Makro tercih ayarlarını yapın (kalın gösterilir).
- Çıktı z yığını ölçülen piksel eşiğinin üzerinde (ve tanımlanan minimum boyutu üzerinde) ile bir tablodur.
NOT: Tüm değerlerin toplamı yığını kırmızı piksel (bölge) toplam sayısıdır.
- Çıktı z yığını ölçülen piksel eşiğinin üzerinde (ve tanımlanan minimum boyutu üzerinde) ile bir tablodur.
- ImageJ açık dosya. "Bölünmüş kanalları" ve yakın kırmızı kanalı seçin. Makro kullanın 216; ek kod dosyası olarak verilen eGFP int 'z yığını yeşil floresan yoğunluğunu ölçmek için. Makro tercih ayarlarını yapın (kalın gösterilir).
- Çıktı z-yığını tüm yeşil nesnelerin eşiğin üstünde (ve tanımlanan minimum boyutu üzerinde) ortalama yoğunlukları ve alanı ile bir tablodur. Yığını yeşil toplam piksel yoğunluğunu hesaplamak için, her gelen bölgelere göre ortalama yoğunluğu çarpın.
- Göreceli eGFP indüksiyon (eGFP rel) hesaplayın:
(1)
Not: MCherry yapıcı bir şekilde ifade edildiği için, EGFP rel çıkan değer hücrelerinin belli bir miktar ile ifade edilen eGFP miktarı için göreli bir ölçümdür. Ayrıca eGFP rel hesaplanmasına ilişkin daha fazla bilgi için Tablo 3'e bakınız. - Alüminyum folyo ile 15 ml'lik cam şişeler, 1 ml GC / MS şişeleri ve ekler sarın. Na 2 SO 4 yemekleri buharlaşan doldurun; mümkün olan kirlilikler çıkarmak için 450 ° C'de 5 saat süre ile mufl ocağında tüm yerleştirin. Aktive edilmiş bir desikatör Na 2 SO 4 iç saklayın.
- 0.5 cm uzunluğunda içine PDMS kaplı cam elyaf kesin. Taze metanol içinde dört kez 2 saat sallayarak lifleri yıkayın. Tekrar yıkama ağzı kapalı bir cam şişe içinde ultra saf su içinde ultra saf su ve mağaza temiz lifleri ile diğer dört kez yineleyin.
- (: 1, h / h 3) ihtiva eden 10 ug L-1 fenantren-D 10, tolüen / aseton içinde 1.5 L hazırlayın.
- Adım 1, 2 ve protokol 3 yapın. Bior olmadan bir evrendir hazırlayınGRİP bozulmasını doğrulamak ve bioreporter hücreleri (SAM) ile () - (-) ve CON AIR SAM () eporter hücreleri GRİP taşıma çalışma.
- (Bioreporter hücreleri olmadan) Opsiyonel: SAM MMA içinde yapay ve ölçülebilir kirletici lavabo gibi (genellikle SPME deneyleri için kullanılan) cam elyaf kaplı Yeri üç PDMS (-) ince forseps kullanarak.
- Ince pensler kullanılarak bir cam elyafı çıkarın ve yerleştirilmiş bir GC / MS şişe içine her biri aktarın.
- Toluen 200 ul ekleyin ve dikey O / N sallamak ve GC / MS yoluyla analiz. Tablo 2'de verilen ayarları kullanın.
- 15 ml cam şişe içine orta boşluğundan MMA aktarın ve SO 4 Na 2 üç spatula hakkında ekleyin. İyice bir spatula kullanılarak karıştırılır ve çözücünün 10 ml ilave ediniz. Vortex karışımı ve karanlıkta yatay O / N sallayın.
- Transferi 1001, insert ile GC / MS şişe içine örnek l. Asenaftilen-d 08 (10 mg L-1) 10 ul ekle ve 6.4.3 tarif edildiği gibi aynı program kullanılarak GC / MS ile analiz edin.
NOT: Diğer seçenekler arasında özgür yazılım ImageJ 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) olabilir, kaydedilen z-yığınlar halinde kırmızı (mCherry) ve yeşil (eGFP) floresan analiz etmek kullanılır.
(1) Not: Microcosm kurulumları ayrıca veya abiyotik kirletici plakasız transloke GRİP miktarda kimyasal ölçümü gerçekleştirmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan sonuçlar daha önceki 15 yayınlanmıştır. Ayrıntılı mekanik ve çevresel tartışma maddeye bakınız.
CLSM üzerinden görüntü kaydı sonra, maksimum yoğunluk projeksiyon numunenin ilk görsel izlenim ve kontrolleri (Şekil 2) kazanmak için, ilgili mikroskop yazılımı veya ImageJ kullanılarak yapılabilir. Daha sonra, veri setleri belirli görselleştirme yazılımı tarafından anlamlı özelliklerini göstermek için farklı tahmin edilebilir. Pozitif kontrol (CON POS) havadan kontrol (CON AIR) ise yalnızca arka plan eGFP floresan (Şekil 2B) sergileyen, farklı eGFP indüksiyon (Şekil 2A) gösterir. Test örneği (SAM), eGFP floresan CON AIR, y kıyasla arttığı görünmektedirve CON POS (Şekil 2C) olarak işaretlenmiş değil. MCherry floresan PAH bozulması bağımsız ve tüm numuneler için, bu nedenle benzer. Bununla birlikte, hafif yüksek EGFP sinyalleri, bu metot ve sonraki görüntü analizi ile tespit edilemez esastır.
Test mikrokosmlarından için, görsel denetim görüntü analizi ve bağıl eGFP indüksiyon hesaplama ile tamamlanmıştır (bakınız adım protokolünün 5 ff; Şekil 3). olmayan kaynaklı B. yeşil arka plan floresan sartisoli RP037-mChe CON NEG ile hesaplanır. Verilen şartlar altında, göreceli EGFP indüksiyon EGFP gör olduğu bulunmuştur = 0.53. Anlamlı bir fark (eGFP rel CON NEG ve CON AIR arasında tespit edilebilir = 0.54; p> 0.95), böylece bioreporter hücrelerine karşı herhangi bir buhar-fazlı FLU taşıma hariç. CON POS için, son derece yüksek eGFP indüksiyon (eGFP rel = 53.7) 96hr sonra MMA hücrelerin canlılığını teyit ve maksimum eGFP indüksiyon temsil bulundu. Misel ve FLU (SAM) varlığında, EGFP (negatif kontrol ile karşılaştırıldığında hücrelerin önemli ölçüde EGFP rel indüklenmiştir = 1.15; p <0.001). Ancak, eGFP indüksiyon pozitif kontrol (bkz Tablo 3, gelin 8) göre nispeten düşüktür.
P. misel tarafından FLU Ulaşım ultimum'a evren kurulum (Şekil 4 bakınız adım protokolünün 6 ff) kimyasal ölçüldü. GRİP ve P. varlığında ultimum'a (SAM (-)), Miseller trans37.5pmold -1 cm -1 bir nakil oranı eşittir 96hr içindeki FLU 25ng hakkında yer. Miseller yokluğunda kontrol eder (CON HAVA (-)), sadece, yani, buhar fazlı konsantrasyonları ile bioreporter indüksiyonu dahil edilebilir, 96hr içinde 2ng aralığında MMA gaz halinde GRİP taşıma saptandı. B.sartisoli RP037-mChe (SAM), mevcut olduğu zaman, <FLU 1ng MMA yama saptandı. Miseller-aracılı translokasyon sonra bu doğrulanmış etkili bakteri GRİBİ bozulması.
Bu sistemde (bkz adım protokolünün 6.4.1 ff) bir abiyotik kirletici lavabo ekleyerek GRİP translokasyon üzerine bir GRİP lavabo bakteriyel bozulma, yani, etkisini araştırmak mümkündür. Bu nedenle, tek bir elyaf tarafından emilen FLU miktarı ve MMA ve üstteki hif içinde kalan miktarını ölçmek edebilmektedir. SAM için(-) Toplam transloke miktar kirletici lavabo mevcudiyetinde bağımsız olarak (p> 0.9, Şekil 5A). Daha önce, 15 ayrıntılı olarak tarif edildiği gibi, ancak, artan GRİP alım alanı ile bir modeli de test edilmiştir. Orada, Transloke GRİP miktarının belirgin bir artış (Şekil 5B) tespit edilebilir.
Şekil 1. Şematik çizim ve tam evren kurulum fotoğraflar. En iyi (A) 'dan ve yandan (B). Tüm agar yamalar, üç küçük boşlukları olan bir slayt üzerine yerleştirildi. GRİP kristaller İki mg PDA 1. ortasında PDA 2, bir boşluğun (d = 5 mm) içine yerleştirilmiştir P. hif ile taze büyümüş PDA 1. bakan ultimum'a bir kavisli PDA parçası PDA 2 ve MMA yama arasına yerleştirilmiştir bir petri kabının (d = 5 cm) kapak ile birlikte bir mekanik GRİP engel teşkil etmektedir. Aktive edilmiş karbon ihtiva eden dört agar yamalar, ayrıca, gaz halindeki GRİP konsantrasyonunu azaltmak için kurulum yerleştirildi. Mikroorganizmaların ve GRİP olmadan üst (C) ve çapraz görüntüsü (D) tam microcosm Resimleri. Şekil 1A ve 1B Schamfuss ark izni ile modifiye edilmiştir. 15 Schamfuss, S. ve ark izniyle uyarlanmıştır. Misel Etkisi fluoren erişilebilirlik için bakteri PAH'a-alçaltıcı. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Telif Hakkı (2013) American Chemical Society. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
pg "/>
Konfokal lazer tarama mikrograflarından Şekil 2. Maksimum yoğunluk projeksiyonlar. Mikrograflar vardır bioreporter bakteri B. MCherry ve eGFP indüksiyon görselleştirme MMA sartisoli RP037-mChe. Bakteriler MMA bir kristalin GRİBİ kaynağına temas vardı (CON POS A), eGFP sinyal kontrollerine (CON AIR B) karşılaştırıldı yükselmiş edilir. GRİP ve P. ile örnekler ultimum'a (SAM C) de ancak az pozitif kontrol daha belirgin bir yüksek eGFP sinyalini göstermektedir. MCherry, yapıcı şekilde tanımlanmış ve bu nedenle hücrelerin tespit etmek için görsel bir kontrol olarak kullanıldı. (Büyütme 630X, 20 bar mikron). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
FLU yokluğunda 96hr sonra misel ve GRİP B.sartisoli RP037-Che göreceli eGFP indüksiyon (eGFP rel) olarak. Karşılaştırılması CON NEG, CON AIR ve SAM için B.sartisoli RP037-Che Şekil 3. Bağıl eGFP indüksiyon GRİP ama P.ultimum (CON AIR) yokluğunda varlığında (CON NEG), ve GRİP ve P.ultimum (SAM) hem varlığında. İstatistiksel CON NEG önemli farklılıklar bir yıldızla işaretlenmiştir. Deneyler CON AIR için bağımsız üç kez yapıldı ve
. (. Cf Şekil 1) Şekil 4. Kimyasal GRİBİ miktar MMA yama çıkarılan ng içinde FLU toplam miktarları hücreleri olmadan buhar fazlı taşımacılığı için 96hr sonra (CON AIR (-)), mhücrelerle ve misel taşımacılığı (SAM) - hücrelerin olmadan ycelial ulaşım () SAM (). Bu rakam bakteri-aşağılayıcı PAH için Schamfuss ark. 15 fluoren erişilebilirliği üzerinde Schamfuss, S. ve ark. Misel Etkisi izniyle uyarlanmıştır izni ile modifiye edilmiştir. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Telif Hakkı (2013) American Chemical Society.
Şekil 5. Bir abiyotik kirletici lavabo varlığında kimyasal GRİP miktar (A) MMA yama çıkarılan ng içinde FLU toplam tutarları ile veya yapay kirletici lavabo olmadan misel taşıma (SAM için 96hr sonra (. (Cf Şekil 1). - ) veya PDMS co olmadanated lifler). Artan misel GRİBİ alımı alanı ile zengin bir test pisti için (B) Aynı sonuçlar. Bu rakam bakteri-aşağılayıcı PAH için Schamfuss ark. 15 fluoren erişilebilirliği üzerinde Schamfuss, S. ve ark. Misel Etkisi izniyle uyarlanmıştır izni ile modifiye edilmiştir. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Telif Hakkı (2013) American Chemical Society.
| Isim | GRİP | Miseller | Hücreler | Uygulama | Yorumlar |
| SAM | + | + | + | CLSM | |
| GC / MS | |||||
| SAM (-) | + | - | GC / MS | de mümkündür yapay kirletici dağıtma tertibatı olarak PDMS liflerle | |
| CON AIR | + | (+) | + | CLSM | Miseller sadece PDA bariyere büyüyor; MMA kapsamında değildir |
| CON AIR (-) | + | (+) | - | GC / MS | Miseller sadece PDA bariyere büyüyor; MMA kapsamında değildir |
| CON NEG | - | + | + | CLSM | |
| CON POS | + | - | + | CLSM | hücreler, GRİP kristaller maruz |
Tüm örnek türleri Tablo 1. Genel uygulama (bioreporter deneyi - CLSM veya kimyasal miktarının - GC / MS) da dahil olmak üzere tüm kontrol ve test örneklerinin özeti. Ve bileşimindeyon (FLU, Miseller ve bioreporter hücreleri).
| Fırın | |
| İlk geçici | 50 ° C |
| İlk kez | 2 dakika |
| Oran | 15 ° C min -1 |
| Nihai geçici | 300 ° C |
| Nihai zaman | 6.33 dk |
| Enjektör (PTV) | |
| Enjeksiyon Hacmi | 0.5 ul |
| Kip | yarıksız |
| Tasfiye | 2.00 dakika |
| Temizle akışı | 50.0 ml dk -1 |
| İlk geçici | 80 ° C |
| İlk kez | 0.02 dk |
| Rampaları: Puan | 600 ° C min -1 |
| Nihai geçici | 300 ° C |
| Nihai zaman | 10 dakika |
| Sütun | |
| Model | J & W DB-5MS |
| Nominal uzunluk | 20 m |
| Nominal çap | 180 um |
| Nominal film kalınlığı | 0.18 mikron |
| Taşıyıcı gaz | 0.8 mi dak helyum -1 |
| MSD geçiş hattı | 280 ° C |
| MSD | |
| Sim modu | |
| MS Kaynak | 230 ° C |
| MS Quad | 150 ° C |
Tablo q GC ve MS tüm ayarları GC / MS. Özet 2. Ayarlarevren kurulumları uantify fluorendir.
| Tuzaklar | YORUM | |
| 1 | Ön büyüme ve canlılık testleri | Seçim misel organizmanın büyümesini inceleyin. Ne kadar MMA yama ulaşmak için sürer? O sikloheksimid bariyer tarafından engellenir? Ayrıca bioreporter hücreleri MMA örme deneyleri aracılığıyla bütün zaman hayati kalmak olmadığını kontrol edin. Aksi takdirde, bir de bioreporter indüksiyon ile sonuçlanmaz MMA bir karbon kaynağı eklenebilir. Bakteri ve misel olası karşılıklı engellenmesini hariç. |
| 2 | Misel büyüme oranı | PAH, aksi takdirde gaz-fazlı transport uzun kuluçka süresi ile artar, çünkü misel organizmanın büyüme oranının çok yavaş olmamalıdır. Protokol uyarlanabilirdaha sonraki bir zaman noktasında PAH eklemek için, ama sonra tekrar, aşılama noktasında Miseller artık aktif olmayabilir. |
| 3 | Bakteriyel hareketlilik | Bir nokta tarayıcı lazer mikroskobu kullanılır ve bakteri suşu, hareketli olduğunuz z-yığınlarının kayıt ve miktar nedeniyle MMA içinde hareket imkansız olabilir. Böylece, bakteriyel hareketi hızlı bir tarayıcı veya dönen bir disk lazer mikroskobu ile CLSM kullanarak, MMA sağlamlığı artırarak, örneğin, önlenmelidir. |
| 4 | Buhar-faz taşıma | Bioreporter hücreleri buhar fazında kimyasallara karşı son derece duyarlı olduğundan bioreporter hücrelere doğru kimyasal (örneğin, PAH) buhar fazlı taşıma yeterince ekarte edilmelidir. Bu gaz taşıma nedeniyle yanlış pozitif sonuçları önlemek amacıyla tüm protokolün önemli bir noktadır. Gaz fazı(-) konsantrasyonu CON AIR kimyasal analizi ile tahmin edilebilir ve buhar fazlı konsantrasyonları aktif karbon ile az ya da çok agaroz yamalar eklenerek, örneğin ayarlanabilir. |
| 5 | Toksisite | Test kimyasal yüksek konsantrasyonlarda misel organizma ve / veya bakteriler üzerinde toksik etkilere sahip olabileceğini aklınızda bulundurun. |
| 6 | Otoflöresans | Seçilen misel organizma beklenen bioreporter sinyal aralığında bazı otofloresansı gösterir olmadığını kontrol edin. Otofloresans 17 değişebilir çünkü farklı büyüme aşamalarında kontrol ettiğinizden emin olun. Otofloresans tespit edilirse, Miseller-serbest bölgelerde z-yığınları kayıt emin olun. |
| 7 | Ağartma | MCherry floresan genellikle istikrarlı ve uygulamalı bi ağartma duyarlı değildiroreporter hücreleri. Buna karşılık, eGFP oldukça hızlı beyazlatır. Bu nedenle, z-yığın kayıt öncesinde örnek görselleştirmek için eGFP kanalı kullanmayın. |
| 8 | eGFP indüksiyon | Biz SAM düşük eGFP indüksiyon POS CON kıyaslandığında fark ettim. Bu FLU çok düşük buhar fazlı konsantrasyonunu (bkz son sonuçlar paragraf) korumak için güçlü mekansal kısıtlama ve GRİP kaynağının düşük erişilebilirlik ile muhasebeleştirilir. Seçilen bioreporter gerilme ve kimyasal bağlı olarak, PDA 1 de alım alanı taşıma hızı (Şekil 5B) geliştirmek için değiştirilebilir. Ancak, bu da bioreporter hücrelere doğru buhar fazı taşınmasını artırır dikkate alınmalıdır. |
| 9 | EGFP rel hesaplanması | Yeşil piksel yoğunluğu karşılaştırıldığında eGFP rel sunulan hesaplama yöntemiKırmızı piksel alanına sadece bir olasılık olduğunu. Daha fazla bilgi için tartışmaya bakınız. |
| 10 | Piksel boyutu | Seçilen lensin büyütme ve potansiyel uygulanan yakınlaştırma faktörü görüntünün piksel boyutunu etkilediğini unutmayın. Bu, görüntü analizi öncesinde dikkate alınmalıdır. |
| 11 | Biyolojik olarak fraksiyonlar | Taşınan bileşik biyoyararlılığı eGFP indüksiyon yoluyla (değil nicel) nitel değerlendirilir aklınızda bulundurun. Hesaplanan nispi eGFP-indüksiyon ve biyolojik olarak fraksiyonun korelasyon çalışıldı. Ancak, bu gelecek uygulamalarda ele alınabilir. |
| 12 | Deteksiyon limitleri | Kimyasal algılama. Organik bileşiklerin miktarının, konsantrasyonunda geniş bir aralığı içinyerel yönetim bu güvenilir bir şekilde tespit edilebilir. Biz aralık 0NG ve 1,000ng tutarlara algıladı. eGFP ölçümü. (; Bakınız 4 Şekil 5, yani 20 ve taşınan 40ng arasında) ve kirletici kaynağına doğrudan temas ile (yani, maksimum Biz Miseller-aracılı taşıma ile ulaşım kirletici olmayan örneklerde göreceli eGFP endüksiyon (yani, taşınan 0NG) karşılaştırıldı Mevcut miktar). Bu üç durum tarif edilen yöntem ile de ayırt edilebilir olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, göreceli eGFP indüksiyon kararı üzerine daha ayrıntılı bir açıklama yapamaz. Bu sorun evren kurulumları ilişkilendirerek eGFP indüksiyon farklı kirletici miktarlarını bağlayarak gelecekte ele alınabilir. |
| 13 | Petri kabı malzemesi | Plastik Petri kapları misel PAH translokasyon ve / veya biyo-düşük hesaplanmasına sebep olabilir. Bu olmamalınitel ifadeler talip ise, sorunlu. Durumda kesin kantitatif ölçüm gereklidir cam Petri kapları uygulanması daha zor olacaktır yapılan hazırlamalar ve işlemler rağmen dikkate alınmalıdır. |
Olası tuzaklar Tablo 3. tartışılması. Önce ve deney ve önerilen yorumlar ve seçenekler sırasında olası tuzaklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
sunulan evren kurulum misel tarafından alımı ve ulaşım sonra organizmaların aşağılayıcı mekansal ayrılmış kimyasalların biyolojik çalışma uygun kanıtladı. Kısmen uçucu bileşiklerin potansiyel gaz-faz taşıma önlenir ve bakteriyel bioreporter hücrelerinin hassas sistemin minimum rahatsızlık ile böylece ayrıntılı numune hazırlama olmadan görsel ve edilebilmektedir. Aynı zamanda, numunenin kimyasal analizi, kolay bir elde edilen sonuçların iyi kontrolü için, toplam taşıma ölçümü için izin yapılabilir. Ancak, bazı noktalar dikkatle önce ve deney yaparken dikkat edilmesi gerekir. Önemli bir nokta, herhangi bir bakteriyel ya da kimyasal çapraz kontaminasyonundan evrendir tutmaktır. Birçok mikrokozmosları paralel çalışacak ve böylece, (örneğin desiccators gibi) büyük kuluçka odaları gerekli çünkü bu, zor olabilir. Bu nedenle, bu kurulum yapılmasıyla dikkatle önce tüm parçaları sterilize etmek çok önemlidiryon. Başka bir kritik nokta mikrokosmlarından için plastik Petri uygulama olabilir. PAH, bioreporter doğrudan temasa olmamakla birlikte, PAH bir miktar plastik malzemesi tarafından emilebilir. Bu yol açacağı Ancak, misel PAH translokasyon ve / veya biyo-düşük hesaplanmasına içinde, eğer varsa, tarif edilen protokol için bu sorunlu düşünün. Kesin miktar gerekli ise, kullanım daha zahmetli olacaktır, ancak herhangi bir durumda, bu, cam parçaları, plastik parça değişimi dikkate alınmalıdır. Düşünülmelidir diğer noktalar belirleniyor bakteri ve mantar suşları (mümkünse karşılıklı inhibisyon, büyüme hızı, hareketlilik ve olası otofloresans), seçilen kimyasallar ve pratik yönleri (ağartma, eGFP sınırlama (mikroorganizmalar, volatilite, algılama sınırları üzerinde toksik etkiler) dahil indüksiyon ve eGFP rel hesaplama). Potansiyel tuzaklar ve ilgili yorumların bir özeti bulunabilirTablo 3.
Biz doğrudan hücre-Miseller etkileşim düzeyinde bir doymamış sistemde misel GRİBİ taşıma ve sonraki bakteriyel bozulmayı göstermek için bu model evren kurulum kullanılır. Bizim modeli kurulumu değişebilmektedir ve mevcudiyetinde bakteriler üzerinde misel etkisini değerlendirmek için Böylece sistem, örneğin, (i) için kullanılabilir, vb, çeşitli bakteriyel ve fungal türler, kimyasal bileşikler, farklı ihtiyaçları karşılamak üzere ayarlanabilir bir başka sınırlı kimyasal (örneğin, zehirli) kaynağı, (ii) bakteriyel bozulma bileşiklerin biyo-kullanılabilirliği üzerindeki misellerini etkisini tahmin etmek, (iii) taşıma vektörünün veya bakterilerin mesafeye bağlı olarak kirletici biyolojik çalışma (iv) Farklı kimyasal kaynaklardan (örneğin, kristal, toprakta veya çözünmüş) etkisini araştırmak için. Bununla birlikte, sistemin ayarlanmasılternate koşullar hassas olacak ve net sonuçlar elde etmek için adım adım yapılmalıdır. Şimdiye kadar, diğer bakteriyel veya mantar suşları ve PAH dışındaki bileşikler için sistemi test değil. Misel ağlar pestisitler 19 veya salisilat 20 gibi çözünür maddeler gibi PAH daha da diğer kirlilikleri taşımak için bilinen çünkü Ancak, biz sistemin bir bileşik özgü bakteriyel biyosensör verilen farklı kimyasal bileşiklere genişletilebilir olduğunu düşünüyorum.
Uygulanan bioreporter bağlı eGFP rel farklı bir hesaplama tercih olabilir zorlanma lütfen unutmayın. Bunun yerine Denklem (1), aşağıdaki iki seçenekleri uygulanabilir:
(2)
(3)
However, sunulan protokol denklemi (1) aşağıdaki nedenlerden dolayı seçildi: (ii) MCherry farklı hücreler 13 için önemli farklılıklar göstermektedir bildirildi ise (i) eGFP yoğunluğu hücresine 14 PAH akı ilişkilendirmek bildirildi . Denklem (2) ve (3), bunun aksine, örnek olarak olası ışık el yapımı yanlış bilgi önlemek için tercih edilebilir. Herhangi bir durumda, istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulundu olabilir, böylece birbirleri ile üç hesaplama yöntemleri karşılaştırıldı. Yine de, mCherry floresan yoğunluğu bildirilen değişimlerden dolayı, bu denklemi kullanılarak tavsiye (1) veya (2).
Sonuç olarak, tekniğin bazı sınırlamalar dikkate alınmalıdır. Mikrokozmosları test edilen bileşiğin gaz fazı taşınmasını önlemek için tasarlanmış olduğundan, bileşiğin misel alımı azaltılır. Bu engellenmeden alımı sureti ile tahmin edilenden daha düşük taşıma oranlarının yüksek olmasıyla sonuçlanır. Biore Bundan dolayı, bu, duyarlılığıporter suşu biyolojik olarak kesirler küçük değişiklikleri tespit etmek yeterince yüksek olmalıdır. Dahası, kuruluş muhtemelen düşük büyüme hızı ile mantar suşları için uygun olmayacaktır. Bu durumda, uzun süreli inkübasyon böylece yanlış pozitif sonuçlara yol açan kirletici gaz fazı taşıma tercih olabilir. Bu kirletici daha sonraki bir zaman noktasında uygulanan bir şekilde kurulumu değiştirmek mümkün olabilir. Ancak, hif sonra aşılama noktasında zaten inaktif veya ölmüş olabilir. Yukarıda belirtildiği gibi, son olarak, misel ağlar tarafından taşınan bir kimyasal bileşikler sınıfı için büyük. Ancak, uygun bir bioreporter zorlanma durumu sınırlayıcı bir anahtar faktör olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest | |||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 (pH 6.0) | |||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2% | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8 | |||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | |||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| ImageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
References
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
- Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
- Griffin, D. M. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 141-151 (1981).
- Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 1-22 (1981).
- Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
- Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
- Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
- Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
- Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
- Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
- Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
- Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
- Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. Manual of methods for general bacteriology. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).
- Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).
- Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
