Summary
Un ensayo de toda bioinformador celda con Burkholderia sartisoli RP037-MCHE fue desarrollado para la detección de fracciones de un contaminante orgánico (es decir, fluoreno) disponible para la degradación bacteriana después de transporte activo por micelios puente poros llenos de aire en un sistema modelo saturado de agua.
Introduction
El suelo está densamente poblada por una amplia gama de microorganismos tales como bacterias 1,2. Sin embargo, las condiciones en este hábitat son un reto, especialmente en términos de la disponibilidad de agua 3. Las bacterias de forma permanente deben buscar condiciones óptimas en entornos heterogéneos 4, pero la ausencia de películas de agua continuos está dando lugar a una movilidad restringida 5 obstaculizar a difundir libremente. Además, las tasas de difusión de solutos (por ejemplo, nutrientes) se reducen en condiciones no saturadas 6. De este modo, las bacterias y los nutrientes son a menudo separados físicamente y accesibilidad de nutrientes se limita 3. Como consecuencia de ello, un vector de transporte para compuestos químicos que no requiere una fase continua de agua podría ayudar a superar estas limitaciones. De hecho, muchos microorganismos como hongos y oomicetos han desarrollado una forma de crecimiento filamentoso que les permite crecer a través de los espacios de poros llenos de aire alcanzar y mobi con ellolizing nutrientes 7 y 8 carbonosos sustancias también separa física a través de largas distancias. Incluso pueden actuar como vectores biológicos de transporte que entregan los azúcares y otras fuentes de energía a las bacterias 9. La captación y el transporte en los organismos de micelio también se ha demostrado que los contaminantes orgánicos hidrofóbicos, como los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) en Pythium ultimum 10 o en hongos micorrícicos arbusculares 11. Desde HAP son contaminantes solubles en agua en todas partes y mal 12 en el suelo, el transporte micelios mediada podría ayudar a aumentar la biodisponibilidad del contaminante para potenciales degradadores bacterianas. Considerando que el importe total de transporte de contaminantes se puede cuantificar directamente por medios químicos 10, la biodisponibilidad de los contaminantes transportados por el micelio de bacterias que degradan y otros organismos no puede evaluarse fácilmente.
El siguiente protocolo presenta un método para evaluar el impacto de mycelia sobre la biodisponibilidad de contaminantes a degradadores bacterianas en forma directa; que permite la recopilación de información sobre el impacto espacio-temporal de los contaminantes sobre los ecosistemas microbianos. Se describe cómo configurar un elaborado sistema microcosmos insaturado imitando interfases aire-agua en el suelo mediante la vinculación de una fuente puntual PAH separados físicamente con bacterias bioinformador-PAH degradantes a través de vectores de transporte de micelio. Dado que el transporte aéreo se excluye el efecto de transporte basados micelio en HAP biodisponibilidad para las bacterias pueden ser estudiados de forma aislada. En más detalle, se aplicaron tres anillos PAH fluoreno, el organismo del micelio Pythium ultimum y la bacteria Burkholderia bioinformador sartisoli RP037-MCHE 13 en las configuraciones de microcosmos descritos. La bacteria B. sartisoli RP037-MCHE fue construido originalmente para estudiar los flujos de fenantreno a la célula 14 y expresa proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) como resultado del flujo de PAHla célula, mientras que la fluorescencia roja mCherry se expresa constitutivamente. La información detallada de la construcción reportera está dada por Tecon et al. 13 En pruebas preliminares, la bacteria no reveló la natación y única habilidad enjambre muy lento. Fue capaz de migrar lentamente en hifas de Pythium ultimum cuando se aplica como una suspensión densa en la parte superior de las hifas. Puesto que las bacterias se incluyeron en agarosa en el siguiente protocolo, no se produjo la migración en las hifas.
Usando microscopía de barrido láser confocal (CLSM), las bacterias bioinformador pueden ser visualizados directamente en los microcosmos y la expresión de eGFP se pueden cuantificar en relación con la cantidad de células (proporcional a la señal mCherry) con la ayuda de la ImageJ software. Esto permite la comparación de la biodisponibilidad cualitativamente en diferentes escenarios (es decir, mayor o menor). FLU se encontró que era biodisponible después del transporte del micelio de P. ultimum (es decir,fue mayor que en un control negativo). Además, el protocolo describe cómo cuantificar la cantidad total de micelios de transporte mediada a través de medios químicos y para verificar la biodisponibilidad de contaminantes usando fibras de vidrio revestida de silicio (fibras de SPME) en microcosmos idénticas. Los resultados basados en esta configuración microcosmos se han publicado y discutido por la combinación de P. ultimum, fluoreno y B. sartisoli RP037-MCHE 15. Aquí, la atención se centra en una descripción del método detallado y la identificación de los peligros potenciales del protocolo para proporcionar este conocimiento para potenciales aplicaciones adicionales. Otras aplicaciones pueden implicar varios hongos, especies bacterianas (por ejemplo, de zonas contaminadas), y otros contaminantes (por ejemplo, pesticidas) o contaminante de alimentación (por ejemplo, suelos de edad).
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Protocol
1. Preparación de platos, Diapositivas y Cámaras de incubación
- Prepare el siguiente material para cada microcosmos: un gran plástico Petri fondo del plato (d = 10 cm), uno modificado (véase el paso 1.2) pequeño plástico Petri fondo del plato (d = 5 cm) con tapas y una diapositiva cámara de recuento con tres cavidades.
- Tome el número deseado de Petri partes inferiores plato (d = 5 cm). Quitar parte del borde con una sierra para encajar exactamente una diapositiva (26 mm de longitud de borde). Para esterilizar el sistema, tomar fondos plato de Petri y tapas en 70% de etanol O / N y secarlos durante al menos 2 horas en una cabina de flujo bajo luz UV. Almacene las cajas de Petri en un recipiente de plástico cerrado herméticamente, que también había sido expuesto a la luz UV durante 2 h.
- Limpie el número deseado de diapositivas con etanol al 70% y aire secarlos. Envuelva diapositivas en papel de aluminio y los puso en un horno de mufla durante 5 horas a 450 ° C para eliminar posibles contaminaciones. Preparar cámaras de incubación de vidrio con tapas. Limpie con un 70% de etanol y exponer cámaras abiertas a la luz UV durante al menos 2 horas en una cabina de flujo.
NOTA: desecadores grandes (diámetro de alrededor de 30 cm) con tapas se puede utilizar para este propósito; cada desecador puede albergar hasta diez configuraciones de microcosmos.
2. Preparación de los medios de comunicación y Culturas
- Para ejecutar 20 microcosmos paralelas, obtener 100 ml de medio de triptona-levadura modificada (MTY) 14, aproximadamente 150 ml de medio mínimo 21C 16 (mm), 5 ml de agar mínimo medio (MMA; 0,5%, w / v), tres placas de agar de dextrosa de patata (PDA; 1,5%, w / v) para P. ultimum, cuatro placas en blanco, una placa de PDA que contiene 2 mg L -1 cicloheximida, cuatro placas de agarosa (3%, w / v) que contiene 0,3 g ml -1 carbón activado y 40 mg de la gripe en 2 porciones mg.
- Prepare MTY contiene 50 mg L -1 de kanamicina (kanamicina se requiered para mantener la eGFP plásmido reportero) y MM que contiene acetato 10 mM para el cultivo bacteriano. Utilice MM sin etilo para preparar 0,5% de MMA para la inmovilización de las bacterias en el microcosmos y verter en las placas (cada uno 20 ml) de 1,5% para el cultivo de PDA Pythium ultimum y microcosmos configuraciones.
- Inocular algunas hifas de P. ultimum en tres placas de PDA frescas e incubar en la oscuridad a 25 ° C durante aproximadamente 72 horas. A continuación, asegúrese de que las placas están cubiertas completamente por el micelio fresca y esponjosa.
- Iniciar dos culturas de B. sartisoli RP037-MCHE en 50 ml de Mty desde una acción de glicerol. Se incuba a 30 ° C con 230 rpm movimiento frasco rotativo O / N.
- Medida de la densidad de cultivo óptica (DO) a 578 nm y se centrifuga a 1000 xg durante 10 min (para B. sartisoli RP037-MCHE, la OD espera 578 es de aproximadamente 1,0 y las células están en fase exponencial). Desechar el sobrenadante y volver a suspender las célulasen una cantidad apropiada de MM para llegar a un OD 578 de 0,4. Inocular 20 ml de MM que contienen 50 mg L -1 kanamicina con 400 l de las células resuspendidas. Se incuba a 30 ° C con 230 rpm movimiento frasco rotativo O / N.
- Mida OD 578 de la cultura en la MM (por B. sartisoli RP037-MCHE, el OD esperado 578 es aproximadamente 0,2 y las células se encuentran en la fase exponencial). Cultura Centrifugar a 2000 xg durante 10 min y volver a suspender las células en una cantidad apropiada de MM para alcanzar una DO de 0,4. Mezclar 50 l de la suspensión celular con 500 l de MMA caliente, líquido en tubos de 2 ml y se almacena a 50 ° C hasta su uso. Utilice 150 l de células en las MMA para cada microcosmos.
- Verter en las placas de gel de agarosa que contiene carbón activado. Derretir de agarosa (3%; w / v) en agua bidestilada. Mezclar bien con carbón activado (0,3 g ml -1) y vierta la mezcla en placas Petri de plástico(D = 10 cm).
3. Microcosmos montaje
NOTA:. La configuración completa microcosmos se representa esquemáticamente en la Figura 1 Por favor refiérase a la Figura 1 para todos los siguientes pasos individuales. Los pasos siguientes se describen la preparación de una muestra (SAM) con los vectores de transporte de micelio y tres configuraciones diferentes de control (Con Air, NEG CON, POS CON). Un resumen de todas las diferentes configuraciones se puede encontrar en la Tabla 1.
- Tome número deseado de placas de Petri y toboganes y exponerlas a la luz UV bajo una campana de flujo durante 30 minutos.
- Coloque la pequeña placa de Petri en el interior de la grande y colocar la diapositiva a través del hueco de la pequeña placa de Petri. Tomar una muestra de la suspensión de células caliente en MMA y añadir 150 l en la cavidad medio de una diapositiva. Repita este paso hasta que las cavidades medias de todas las diapositivas sonlleno de MMA. Espere 5 min para el MMA se solidifique.
- Use un perforador de corcho 1 cm para perforar parches circulares de una placa de PDA en blanco. Coloque un parche a una distancia de 2 mm al lado de la MMA dentro de la pequeña placa de Petri. Añadir este para promover el crecimiento del micelio en la configuración (PDA 3 en la Figura 1).
- Cortar parches PDA curvas como barreras mecánicas. Use una pequeña placa de Petri parte inferior limpia y estéril y presiónelo en una placa de PDA. Utilice una espátula para cortar otro anillo más pequeño a una distancia de 0,5 cm en el agar que resulta en un anillo PDA.
- Corte un pedazo, que encaja exactamente en el hueco de la pequeña placa de Petri en la configuración de microcosmos y colocarlo dentro de la brecha en la parte superior de la diapositiva. Asegúrese de que la distancia entre el MMA y la barrera PDA circular es de aproximadamente 2 mm. Cierre la tapa de la pequeña placa de Petri presionando suavemente en la barrera PDA.
- Repita los pasos 3.4 y 3.4.1 con una placa de PDA que contiene 2 g L -1de cicloheximida.
NOTA: Esta es la configuración de controles para el transporte aéreo (CON AIRE) hacia las células bioinformador, ya que los micelios son inhibidas por la cicloheximida y no crecen en exceso MMA.
- Use un perforador de corcho 1 cm para perforar parches circulares de una placa PDA en blanco. Utilice otro perforador de corcho 0,5 cm para cortar el centro de la primera parche. Coloque el pequeño anillo PDA resultante a una distancia de 1 mm junto a la barrera de PDA (PDA 1 en la Figura 1).
- Añadir 2 mg de FLU en el agujero de PDA 1. Use un sacabocados 1 cm para cortar los parches circulares de placas PDA cubiertos de P. ultimum y coloque un parche (PDA 2 en la Figura 1) inferior hacia abajo sobre el anillo de PDA de manera que la esterilla micelial se enfrenta a los cristales de la gripe.
- Repita el paso anterior sin añadir cristales gripe.
NOTA: Esta es la configuración de control negativo (CON NEG) para determinar el fondofluorescencia de las células bioinformador.
- Repita el paso anterior sin añadir cristales gripe.
- Use un perforador de corcho 1 cm para perforar parches circulares del agar que contiene carbón activado. Coloque cuatro parches en cada configuración microcosmos para disminuir aún más la concentración GRIPE gaseoso (Figura 1).
- Preparar un control positivo (POS CON). Añadir algunos cristales gripe a 200 l de suspensión celular MMA y lo puso en una cavidad de una diapositiva vacía.
- Colocar una placa de Petri (d = 10 cm) con un poco de polvo de carbón activado en la parte inferior de la cámara de incubación para minimizar la concentración de FLU gaseoso en la cámara. También, coloque cuatro y cincuenta y seis minutos 50 ml vasos con agua estéril en la parte inferior para mantener una alta humedad en la cámara.
- Traslado configuraciones de microcosmos en cámaras de incubación e incubar a 25 ° C durante 96 horas. Colocar las muestras al azar en las diferentes cámaras de crecimiento para excluir los efectos de localización.
NOTA: Esta vez ap incubacióntelas al oomiceto P. ultimum. Podría ser diferente para otros organismos.
- Traslado configuraciones de microcosmos en cámaras de incubación e incubar a 25 ° C durante 96 horas. Colocar las muestras al azar en las diferentes cámaras de crecimiento para excluir los efectos de localización.
4. escaneo láser confocal Microscopía
- Ideal es utilizar una configuración MBRC con microscopio vertical.
NOTA: Puede ir equipada con láseres convencionales ofrenda por ejemplo, 488, 561 y 633 líneas nm para la excitación o con una fuente láser sintonizable blanco. - Utilice los siguientes parámetros para la colección de imágenes: Excitación: 490 nm (EGFP) y 585 nm (mCherry) en la intensidad del láser adecuado (excitación simultánea); rangos de emisión: 500 hasta 550 nm (eGFP) y 605-650 nm (mCherry); lente objetivo: 63X NA 0.9 sumergible de agua (debido a su distancia de trabajo); tamaño de paso para z-pilas: 0,5 micras.
- Microcosmos configuración abierta y utilizar un bisturí para extraer PDA 1, 2, 3 y la barrera PDA. Ponga una hoja de cubierta de vidrio en la parte superior de la MMA y presione suavemente para eliminar las burbujas de aire. Montaje de diapositivas sobre platina del microscopio. Añadir una gota de agua en la parte superior de le hoja de la cubierta y utilizar la configuración mCherry para encontrar células bioinformador en la muestra.
- Obtener una visión general rápida de la muestra y optimizar la relación señal-ruido usando un resplandor sobre-bajo tabla de consulta para el rojo (mCherry) y verde (EGFP) canal. Elija una posición aleatoria en la muestra a analizar la fluorescencia bioinformador.
NOTA: las hifas puede mostrar autofluorescencia en el rango de emisión bioinformador (por ejemplo, autofluorescencia verde) 17. Asegúrese de seleccionar áreas sin hifas si este es el caso. - Definir y registrar z-pilas para cada posición en el verde (EGFP) y el (mCherry) canal rojo. Evitar el blanqueo de la muestra por una larga exposición a la luz de epifluorescencia o luz láser.
- Repita el paso anterior para diez posiciones aleatorias, distribuidas de manera uniforme.
- Repita todos los pasos que utilizan los mismos ajustes para todas las muestras de la pista de pruebas (SAM), aire acondicionado, NEG CON y POS CON. Análisis 5. Imagen
- Asegúrese de instalar el plugin logi_tool (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/).
- Abrir el archivo en ImageJ. Seleccione "Los canales divididos" y cerca del canal verde. Utilice la macro 'mCherry zona »prevista como archivo de código adicional para cuantificar el área de fluorescencia roja en z-stack. Ajustar la configuración preferida en la macro (indicado en negrita).
- La salida es una tabla con los píxeles medidos por encima del umbral (y por encima del mínimo definido) en pila z.
NOTA: La suma de todos los valores es el número total de píxeles rojos (área) en la pila.
- La salida es una tabla con los píxeles medidos por encima del umbral (y por encima del mínimo definido) en pila z.
- Abrir el archivo en ImageJ. Seleccione "Los canales divididos" y cerca del canal rojo. Utilice la macro 216; eGFP int 'proporciona como archivo de código adicional para cuantificar la intensidad de la fluorescencia verde en la pila z. Ajustar la configuración preferida en la macro (indicado en negrita).
- La salida es una tabla con las intensidades medias y el área de todos los objetos de color verde por encima del umbral (y por encima del mínimo definido) en z-stack. Para calcular la intensidad total de píxeles verdes en la pila, se multiplican cada intensidad media por el área correspondiente.
- Calcular la inducción eGFP relativa (eGFP rel):
(1)
NOTA: Como mCherry se expresa constitutivamente, el valor resultante de eGFP rel es una medida relativa de la cantidad de eGFP expresado por una cierta cantidad de células. Por favor, consulte también la Tabla 3 para obtener más información sobre el cálculo de eGFP rel. - Envuelva 15 mL viales de vidrio, 1 ml de GC / MS viales e insertos en papel de aluminio. Rellene evaporación platos con Na 2 SO 4; colocar todo en horno de mufla durante 5 horas a 450 ° C para eliminar posibles contaminaciones. Guarde el Na 2 SO 4 en el interior de un desecador activado.
- Cortar fibras de vidrio recubierto de PDMS en 0,5 cm de longitud. Lávese las fibras agitando cuatro veces 2 horas en metanol fresco. Repetir el lavado pasos otros cuatro veces con agua ultrapura y almacenar fibras limpias en agua ultrapura en un vial de vidrio sellado.
- Preparar 1,5 L de tolueno / acetona (3: 1, v / v) que contiene 10 g L -1 fenantreno-d 10.
- Realice los pasos 1, 2 y 3 del protocolo. Preparar microcosmos sin bioreporter células para estudiar el transporte GRIPE (SAM (-) y CON AIRE (-)) y con células bioinformador (SAM) para verificar la degradación GRIPE.
- Opcional (sin células bioinformador): Coloque tres PDMS revestidas fibras de vidrio (generalmente utilizados para experimentos SPME) como disipador contaminante artificial y cuantificables dentro de MMA de SAM (-) utilizando unas pinzas finas.
- Eliminar las fibras de vidrio utilizando unas pinzas finas y poner cada uno en un GC / MS vial con parte.
- Añadir 200 l de tolueno y agitar verticalmente O / N y analizar a través de GC / MS. Utilice los ajustes previstos en la Tabla 2.
- Traslado de MMA de la cavidad central en un vial de vidrio de 15 ml y añadir unos tres espátulas de Na 2 SO 4. Mezcle bien con una espátula y añadir 10 ml de disolvente. Vortex la mezcla y agitar horizontalmente O / N en la oscuridad.
- Transferencia 1001; l de muestra en GC / MS vial con parte. Añadir 10 l de acenaftileno-d 08 (10 mg L -1) y analizar a través de GC / MS usando el mismo programa como se describe en 6.4.3.
NOTA: Analizar rojo (mCherry) y verde (EGFP) fluorescencia en los z-pilas grabados, entre otras opciones la ImageJ software libre 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) puede ser utilizado.
(1) NOTA: microcosmos configuraciones también se pueden usar para llevar a cabo la cuantificación química de cantidades GRIPE translocados con o sin un disipador de contaminante abiótico.
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Representative Results
Los resultados presentados aquí ya han sido publicados anteriormente 15. Por favor, consulte el artículo de detallada discusión mecanicista y ambiental.
Después de la grabación de imágenes a través de CLSM, una proyección de intensidad máxima se puede realizar utilizando el software ImageJ microscopio respectivo o para obtener una primera impresión visual de la muestra y los controles (Figura 2). Más tarde, los conjuntos de datos se pueden proyectar de manera diferente con el fin de mostrar características significativas por software específico de visualización. El control positivo (POS CON) muestra la inducción eGFP distinta (Figura 2), mientras que el control aéreo (AIR CON) exhibe sólo fondo eGFP fluorescencia (Figura 2B). eGFP fluorescencia en la muestra de ensayo (SAM) parece ser elevada en comparación con CON AIRE, yet no tan marcado como CON POS (Figura 2C). La fluorescencia mCherry es independiente de la degradación PAH y por lo tanto similar para todas las muestras. Sin embargo, las señales ligeramente elevados eGFP no serán detectados por este método y análisis de imagen posterior es esencial.
Para los microcosmos probados, la inspección visual se complementa con el análisis de imágenes y cálculo de inducción eGFP relativa (cf. paso 5 y siguientes del protocolo, figura 3). La fluorescencia de fondo verde para B. no inducido sartisoli RP037-MCHE se calcula con NEG CON. En las condiciones dadas, la inducción relativa eGFP se encontró que era rel eGFP = 0.53. No hay diferencia significativa se pudo detectar entre NEG CON y CON AIRE (rel eGFP = 0.54; p> 0,95) excluyendo así cualquier transporte GRIPE en fase vapor hacia las células bioinformador. Para POS CON, muy elevada inducción eGFP (eGFP rel = 53,7) se encontró que confirma la vitalidad de las células en MMA después de 96 h y que representa el máximo de inducción eGFP. En presencia de micelio y FLU (SAM), EGFP fue significativamente inducida en las células en comparación con los controles negativos (rel eGFP = 1,15; p <0,001). Sin embargo, la inducción eGFP es relativamente bajo en comparación con el control positivo (véase la Tabla 3, punto 8).
Transporte de la gripe por el micelio de P. ultimum en la configuración del microcosmos se cuantificó químicamente (cf. paso 6 y siguientes del protocolo; Figura 4). En presencia de la gripe y P. ultimum (SAM (-)), micelios transsituada a unos 25 ng de FLU dentro de 96 horas que equivale a una tasa de transporte de 37.5pmold -1 cm -1. Los controles en la ausencia de micelio (CON AIR (-)) revelaron transporte FLU gaseoso en la MMA en el intervalo de sólo 2 ng dentro de 96 h, es decir, la inducción de la bioinformador por-concentraciones en fase vapor podría ser excluida. Cuando B.sartisoli RP037-MCHE estaba presente (SAM), <se detectó 1 ng de la gripe en el parche de MMA. Esta degradación bacteriana FLU eficaz verificado con posterioridad a la translocación mediada por micelios.
Es posible investigar la influencia de la degradación bacteriana, es decir, de un fregadero FLU, en la translocación FLU mediante la adición de un disipador de contaminante abiótica al sistema (cf. paso 6.4.1 ff del protocolo). Por lo tanto, uno es capaz de cuantificar la cantidad de FLU absorbida por las fibras y la cantidad que queda en el interior de la MMA y hifas suprayacente. Por SAM(-), La cantidad total de translocado es independiente de la presencia de un disipador de contaminante (p> 0,9; Figura 5A). Sin embargo, un microcosmos con mayor área de captación de la gripe también se puso a prueba como se describe en detalle anteriormente 15. Allí, un aumento significativo de la cantidad FLU translocado pudo detectarse (Figura 5B).
Figura 1. Esquema y fotos de la configuración completa microcosmos. Vista desde la parte superior (A) y desde el lado (B). Todos los parches de agar se colocaron en la parte superior de un tobogán con tres pequeñas cavidades. Dos mg de cristales GRIPE se colocaron dentro de una cavidad (d = 5 mm) en el medio de PDA 1. PDA 2 estaba recién cubierto con hifas de P. ultimum frente PDA 1. Una pieza PDA curva se colocó entre PDA 2 y el parche de MMA a crear una barrera FLU mecánica junto con la tapa de una placa de Petri (d = 5 cm). Cuatro parches de agar que contienen carbono activado se colocaron en la configuración para disminuir aún más la concentración FLU gaseoso. Fotos del microcosmos completo de arriba (C) y visión diagonal (D) sin microorganismos y la gripe. Las figuras 1A y 1B se han modificado con el permiso de Schamfuss et al. 15 Adaptado con permiso de Schamfuss, S. et al. Impacto de micelios bacterias en la accesibilidad de fluoreno a pah-degradante. Environ. Sci. . Technol 47, 6908 hasta 6915. Derecho de Autor (2013) American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2. proyecciones de intensidad máxima de las micrografías confocal de barrido láser. Micrografías son la visualización de la inducción mCherry y eGFP de la bacteria B. bioinformador sartisoli RP037-MCHE en MMA. Cuando las bacterias tenían contacto a una fuente de FLU cristalina en MMA (POS CON; A), la señal de eGFP es elevada en comparación con los controles (CON AIR; B). Las muestras con FLU y P. ultimum (SAM; C) también muestran una señal elevada eGFP, sin embargo menos marcado que el control positivo. mCherry se expresa constitutivamente y por lo tanto sirve como un control visual para detectar las células. (Ampliación 630x, bar 20 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. relativa inducción eGFP en B.sartisoli RP037-Che para NEG CON, CON AIR y SAM con micelio y la gripe. La comparación de la relación de inducción eGFP (eGFP rel) por B.sartisoli RP037-Che después de 96 horas en ausencia de FLU (NEG CON), en presencia de la gripe, pero ausencia de P.ultimum (AIRE CON) y en presencia de ambos GRIPE y P.ultimum (SAM). Las diferencias estadísticamente significativas a NEG CON están marcados con un asterisco. Los experimentos se realizaron por triplicado independientes para aire acondicionado y
. (. Cf Figura 1) Figura 4. GRIPE Química cuantificación cantidades totales de FLU en ng extraído del parche MMA después de 96 horas para el transporte en fase de vapor sin células (CON AIRE (-)), mtransporte ycelial sin células (SAM (-)) y el transporte del micelio con células (SAM). Esta cifra se ha modificado con el permiso de Schamfuss et al. 15 Adaptado con permiso de Schamfuss, S. et al. Impacto de micelios sobre la accesibilidad de fluoreno a las bacterias que degradan HAP. Environ. Sci. . Technol 47, 6908 hasta 6915. Derecho de Autor (2013) American Chemical Society.
Figura 5. Química GRIPE cuantificación en la presencia de un receptor de contaminantes abióticos (A) Las cantidades totales de FLU en ng extraído del parche MMA después de 96 horas para el transporte del micelio con o sin disipador contaminante artificial (SAM (. (Cf figura 1.) - ) con o sin co PDMSfibras ATED). (B) Los mismos resultados para una pista de pruebas variada con una mayor área de captación GRIPE micelio. Esta cifra se ha modificado con el permiso de Schamfuss et al. 15 Adaptado con permiso de Schamfuss, S. et al. Impacto de micelios sobre la accesibilidad de fluoreno a las bacterias que degradan HAP. Environ. Sci. . Technol 47, 6908 hasta 6915. Derecho de Autor (2013) American Chemical Society.
| Nombre | GRIPE | Los micelios | Las células | Aplicación | Comentarios |
| SAM | + | + | + | MBRC | |
| GC / MS | |||||
| SAM (-) | + | - | GC / MS | también es posible con fibras de PDMS como disipador contaminante artificial | |
| CON AIRE | + | (+) | + | MBRC | micelios sólo crece hasta PDA barrera; MMA no cubierto |
| CON AIRE (-) | + | (+) | - | GC / MS | micelios sólo crece hasta PDA barrera; MMA no cubierto |
| CON NEG | - | + | + | MBRC | |
| POS CON | + | - | + | MBRC | células están directamente expuestos a los cristales GRIPE |
Tabla 1. Resumen de todos los tipos de muestra Resumen de todas las muestras de control y de prueba, incluyendo la aplicación (ensayo bioinformador - MBRC o cuantificación de sustancias químicas - GC / MS). Y composición (FLU, micelio y células bioinformador).
| Horno | |
| Temp inicial | 50 ° C |
| Tiempo inicial | 2 min |
| Tarifa | 15 ° C min -1 |
| Temp | 300 ° C |
| Tiempo final | 6.33 min |
| Inyector (PTV) | |
| Volumen de inyección | 0,5 l |
| Modo | splitless |
| Purga | 2.00 min |
| Flujo de purga | 50,0 ml min -1 |
| Temp inicial | 80 ° C |
| Tiempo inicial | 0.02 min |
| Rampas: Rate | 600 ° C min -1 |
| Temp | 300 ° C |
| Tiempo final | 10 min |
| Columna | |
| Modelo | J & W DB-5MS |
| Longitud nominal | 20 m |
| Diámetro nominal | 180 micras |
| Espesor de la película nominal | 0,18 micras |
| Gas portador | helio 0,8 ml min -1 |
| MSD Transferline | 280 ° C |
| MSD | |
| Modo de Sim | |
| MS Fuente | 230 ° C |
| MS Quad | 150 ° C |
Tabla 2. Ajustes para GC / MS. Resumen de todos los ajustes para GC y MS para qfluoreno uantify en las configuraciones de microcosmos.
| TRAMPAS | COMENTARIO | |
| 1 | Crecimiento preliminar y las pruebas de vitalidad | Estudiar el crecimiento del organismo del micelio de elección. ¿Cuánto tiempo se tarda en llegar el parche MMA? ¿Es inhibida por la barrera cicloheximida? También comprobar si las células permanecen bioinformador vital en MMA todo el tiempo a través de ensayos de espartería. Si no, también se puede añadir una fuente de carbono para la MMA que no da lugar a la inducción bioinformador. Excluir posible inhibición mutua de las bacterias y los micelios. |
| 2 | Tasa de crecimiento micelial | La tasa de crecimiento del organismo micelial no debería ser demasiado lento, porque de lo contrario el transporte en fase gaseosa de HAP aumenta con el tiempo de incubación prolongado. El protocolo puede ser adaptadoañadir HAP en un momento posterior, pero, de nuevo, los micelios en el punto de inoculación no pueden ser activos más. |
| 3 | Movilidad bacteriana | Si un punto microscopio láser de barrido se utiliza y la cepa bacteriana es móvil, la grabación y la cuantificación de z-pilas pueden resultar imposible debido al movimiento dentro de las MMA. Por lo tanto, el movimiento bacteriana debe impedirse, por ejemplo, mediante el aumento de la solidez de MMA, mediante el uso de CLSM con un escáner rápido o un microscopio láser de disco giratorio. |
| 4 | Transporte en fase de vapor | El transporte en fase de vapor de la sustancia química (por ejemplo, PAH) hacia las células bioinformador debe excluirse suficientemente ya que las células bioinformador son extremadamente sensibles a los productos químicos en la fase de vapor. Este es el punto crucial de todo el protocolo con el fin de evitar resultados falsos positivos causados por el transporte gaseoso. La fase gaseosaconcentración puede ser estimado a través de análisis químico de AIR CON (-) y las concentraciones de vapor de fase se puede ajustar por ejemplo mediante la adición de parches más o menos de agarosa con carbón activado. |
| 5 | Toxicidad | Tenga en cuenta, que las altas concentraciones de la sustancia de ensayo podrían tener efectos tóxicos sobre el organismo del micelio y / o bacterias. |
| 6 | Autofluorescencia | Compruebe si el organismo micelial elegido muestra algunos autofluorescencia en el rango de la señal de bioinformador esperado. Asegúrese de comprobar en las diferentes etapas de crecimiento desde autofluorescencia puede variar 17. Si se detecta la autofluorescencia, asegúrese de registrar z-pilas en zonas de micelio libre. |
| 7 | Blanqueamiento | mCherry fluorescencia es generalmente estable y no es sensible a la decoloración en la bi aplicadocélulas oreporter. En contraste, eGFP blanquea con bastante rapidez. Por lo tanto, no utilice el canal eGFP para visualizar la muestra antes de la grabación z-stack. |
| 8 | eGFP inducción | Nos dimos cuenta de una baja inducción eGFP en SAM comparó a CON POS. Esto se explica por la fuerte restricción espacial y baja accesibilidad de la fuente GRIPE mantener muy baja concentración en fase de vapor de FLU (cf. últimos resultados párrafo). Dependiendo de la cepa bioinformador elegido y química, la zona de captación en PDA 1 puede variarse para aumentar la velocidad de transporte (Figura 5B). Sin embargo, tiene que tener en cuenta que esto también aumenta el transporte en fase de vapor hacia las células bioinformador. |
| 9 | Cálculo de eGFP rel | El método de cálculo presentado para eGFP rel donde se compara la intensidad de píxeles verdesa la zona de píxeles rojos es sólo una posibilidad. Por favor, consulte la discusión para más información. |
| 10 | Tamaño de píxel | Tenga en cuenta que la ampliación de la lente elegido y un factor de zoom aplicado potencialmente afectan el tamaño de píxel de la imagen. Esto debe tenerse en cuenta antes del análisis de imagen. |
| 11 | Fracciones biodisponibles | Tenga en cuenta que la biodisponibilidad del compuesto transportado se evalúa cualitativamente (no cuantitativamente) a través de eGFP inducción. No se intentó la correlación de la eGFP-inducción relativa calculada y la fracción biodisponible. Sin embargo, esto puede abordarse en futuras aplicaciones. |
| 12 | Los límites de detección | Detección química. Para la cuantificación química de los compuestos orgánicos, una amplia gama de concentraciones se pueden detectar con fiabilidad. Detectamos cantidades en el 0NG gama y 1,000ng. cuantificación eGFP. Se comparó la inducción relativa eGFP en muestras sin transporte de contaminantes (es decir, 0NG transportado), con el transporte micelios mediada (es decir, entre 20 y 40 ng transportado; cf. Figuras 4 y 5) y con el contacto directo a la fuente contaminante (es decir, el máximo cantidad disponible). Estos tres casos resultaron ser bien distinguibles con el método descrito. Sin embargo, no podemos hacer una declaración más detallada sobre la resolución de la inducción relativa eGFP. Este problema puede abordarse en el futuro mediante la vinculación de diferentes cantidades de contaminantes con la correlación de inducción eGFP en las configuraciones de microcosmos. |
| 13 | Material de placa de Petri | Platos de plástico Petri pueden dar lugar a una subestimación de micelio translocación y / o biodisponibilidad HAP. Esto no deberíaser problemático, si las declaraciones cualitativas se aspiraban. En caso de que se requieren mediciones cuantitativas precisas, la aplicación de los platos de cristal de Petri se deben considerar a pesar de la preparación y manipulación será más incómodo. |
Tabla 3. Discusión de los posibles escollos. Posibles peligros antes y durante el experimento y los comentarios y las opciones propuestas.
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Discussion
La configuración microcosmos presentado resultó adecuado para estudiar la biodisponibilidad de los productos químicos separados espacialmente para degradar los organismos después de la captación y el transporte por micelios. Se evita el transporte en fase gaseosa potencial de los compuestos volátiles y parcialmente células bacterianas bioinformador puede visualizarse sin preparación de la muestra elaborada y por lo tanto con una perturbación mínima del sistema sensible. Al mismo tiempo, el análisis químico de la muestra puede ser fácilmente llevado a cabo lo que permite un buen control de los resultados obtenidos y para la cuantificación del transporte total. Sin embargo, algunos puntos tienen que ser considerados cuidadosamente antes y durante la realización del experimento. Un punto importante es mantener el microcosmos libre de cualquier contaminación cruzada de bacterias o químicos. Esto puede ser un reto, ya que muchos microcosmos se ejecutan en paralelo y por lo tanto, se requieren cámaras de incubación grandes (como desecadores). Por lo tanto, es crucial para esterilizar bien todas las piezas antes de la construc configuraciónción. Otro punto crítico puede ser la aplicación de placas Petri de plástico para el microcosmos. Aunque PAH y bioinformador no entran en contacto directo, una cierta cantidad de HAP puede ser absorbido por el material plástico. Sin embargo, consideramos que este no problemático para el protocolo descrito, ya que esto daría lugar, en su caso, en una subestimación de micelio HAP-translocación y / o biodisponibilidad. En cualquier caso, si se requiere la cuantificación precisa, se debe considerar el intercambio de las piezas de plástico con piezas de vidrio, aunque el manejo será más incómodo. Otros puntos que deben ser considerados incluyen las cepas escogidas bacterianas y fúngicas (posible inhibición mutua, la tasa de crecimiento, movilidad y posible autofluorescencia), los productos químicos elegidos (efectos tóxicos en microorganismos, la volatilidad, los límites de detección) y los aspectos prácticos (blanqueo, limitación de eGFP inducción y cálculo de eGFP rel). Un resumen de los peligros potenciales y los respectivos comentarios se pueden encontrar enTabla 3.
Utilizamos esta configuración microcosmos modelo para demostrar el transporte GRIPE micelial y la degradación bacteriana posterior en un sistema saturado directamente en un nivel de interacción célula-micelios. Nuestro modelo de configuración puede variarse y ajustarse para satisfacer diferentes necesidades con diversas cepas bacterianas y fúngicas, compuestos químicos, etc. Por lo tanto, el sistema podría ser utilizado por ejemplo (i) para evaluar la influencia de micelio sobre las bacterias en presencia de un producto químico restringido de otro modo (por ejemplo, tóxica) fuente, (ii) para predecir la influencia de micelio sobre la biodisponibilidad de compuestos para la degradación bacteriana, (iii) para estudiar la biodisponibilidad de contaminantes en función de la distancia de las bacterias al vector de transporte o (iv) para investigar el efecto de diferentes fuentes químicas (por ejemplo, cristalina, en el suelo o disueltos). Sin embargo, el ajuste del sistema a unacondiciones lternate serán delicado y debe ser llevado a cabo paso a paso con el fin de lograr resultados claros. Hasta ahora, no hemos probado el sistema para otras cepas bacterianas o fúngicas y otros compuestos que la HAP. Sin embargo, ya que las redes de micelio se conocen para transportar también otros contaminantes de HAP como pesticidas 19 o sustancias solubles como salicilato de 20, pensamos que el sistema se puede ampliar a diferentes compuestos químicos que figuran un biosensor bacteriana-compuesto específico.
Tenga en cuenta que dependiendo de la cepa bioinformador aplicado un cálculo diferente de eGFP rel podría ser preferible. En lugar de la ecuación (1) las dos siguientes opciones podrían ser aplicados:
(2)
(3)
However, en la ecuación de protocolo presentado (1) fue elegido debido a las siguientes razones: intensidad (i) eGFP se informó que se correlaciona con el flujo PAH a la célula 14 mientras que (ii) mCherry se informó para mostrar variaciones considerables para diferentes células 13 . La ecuación (2) y (3), en contraste, puede elegirse para impedir que la información falsa de posibles artefactos de luz en la muestra. En cualquier caso, se compararon los tres métodos de cálculo con los demás, con lo que se podían encontrar diferencias estadísticamente significativas. Sin embargo, debido a las variaciones reportadas en la intensidad de fluorescencia de mCherry, se recomienda utilizar la ecuación (1) o (2).
Al final, algunas limitaciones de la técnica debe ser considerado. Desde los microcosmos fueron diseñados para prevenir el transporte en fase gaseosa del compuesto ensayado, se reduce la captación de micelial del compuesto. Esto se traduce en tasas de transporte más bajos de lo esperado con la absorción sin obstáculos. Por lo tanto, la sensibilidad de la biorePorter cepa debe ser lo suficientemente alta como para detectar pequeños cambios en fracciones biodisponibles. Además, el programa de instalación probablemente no sea adecuado para cepas de hongos con una baja tasa de crecimiento. En este caso, la incubación largo plazo podría favorecer el transporte en fase gaseosa del contaminante lo que conduce a resultados positivos falsos. Podría ser posible modificar la configuración de una manera que el contaminante se puede aplicar en un punto de tiempo más tarde. Sin embargo, las hifas puede ser entonces ya inactivos o muertos en el momento de la inoculación. Por último, como se indicó anteriormente, la gama de compuestos químicos que son transportados por las redes de micelio es grande. Sin embargo, la disponibilidad de una cepa bioinformador apropiada podría ser un factor clave limitante.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest | |||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 (pH 6.0) | |||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2% | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8 | |||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | |||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| ImageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
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