Summary
Um ensaio de todo Bioreporter celular com Burkholderia sartisoli RP037-MCHE foi desenvolvido para detectar frações de um contaminante orgânico (ou seja, fluoreno) disponível para a degradação bacteriana após o transporte ativo por micélio ponte poros cheios de ar em um sistema modelo insaturada água.
Introduction
O solo é densamente povoada por uma vasta gama de microorganismos tais como bactérias 1,2. No entanto, as condições deste habitat são desafiadoras, especialmente em termos de disponibilidade de água 3. Bactérias permanentemente precisa procurar condições ótimas em ambientes heterogêneos 4, mas a ausência de filmes contínuos de água está resultando em mobilidade restrita 5 impedindo-os a se espalhar livremente. Além disso, as taxas de difusão dos solutos (por exemplo, nutrientes) são reduzidos sob condições não saturadas 6. Assim, as bactérias e os nutrientes são muitas vezes fisicamente separados e acessibilidade nutriente é limitada 3. Como conseqüência, um vetor de transporte de compostos químicos que não exige uma fase contínua de água pode ajudar a superar essas limitações. De fato, muitos microorganismos como fungos e oomycetes desenvolveram uma forma de crescimento filamentosas que lhes permite crescer através de poros cheios de ar e atingindo assim mobilizing também física nutrientes 7 e 8 carbonáceos substâncias separadas por longas distâncias. Eles podem até atuar como vetores de transporte biológicos que entregam açúcares e outras fontes de energia para as bactérias 9. Absorção e transporte de organismos micélio também foi mostrado para os poluentes orgânicos hidrofóbicos, tais como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) em Pythium ultimum 10 ou em fungos micorrízicos arbusculares 11. Desde PAH são contaminantes solúveis em água onipresentes e mal 12 no solo, transporte mediado por micélio pode ajudar a aumentar a biodisponibilidade de contaminantes para os potenciais degradadores bacterianas. Considerando que o montante total de transporte de contaminantes pode ser quantificada diretamente por meios químicos 10, biodisponibilidade de contaminantes transportados por micélio de bactérias que degradam e outros organismos não podem ser avaliados facilmente.
O protocolo a seguir apresenta um método para avaliar o impacto da mycelia sobre a biodisponibilidade de contaminantes bacterianos para degradadores de forma direta; ele permite que a coleta de informações sobre o impacto espaço-temporal de contaminantes nos ecossistemas microbianos. Nós descrevemos como configurar um sistema de microcosmo insaturada elaborado imitando as interfaces ar-água no solo, ligando uma fonte pontual PAH fisicamente separado com bactérias Bioreporter HAP-degradante através de vectores de transporte de micélio. Como o transporte pelo ar é excluído, o efeito do transporte micelial-baseado em PAH biodisponibilidade para as bactérias podem ser estudados de forma isolada. Em mais detalhe, foram aplicados três anéis HAP fluoreno, o organismo micelial Pythium ultimum e o Bioreporter bactéria Burkholderia sartisoli RP037-MCHE 13 nas configurações descritas microcosmos. A bactéria B. sartisoli RP037-MCHE foi originalmente construído para estudar os fluxos fenantreno para a célula 14 e expressa a proteína verde fluorescente melhorada (eGFP), como resultado do fluxo de PAHa célula, enquanto que a fluorescência vermelha mCherry é expressa constitutivamente. Informações detalhadas sobre a construção repórter é dada pelo Tecon et al. 13 Em testes preliminares, a bactéria não revelaram natação e apenas capacidade swarming muito lento. Era capaz de migrar lentamente em hifas de Pythium ultimum, quando aplicado como uma suspensão densa no topo das hifas. Uma vez que as bactérias foram embebidas em agarose na seguinte protocolo, a migração em hifas não ocorreu.
Usando a microscopia confocal por varrimento laser (MCVL), as bactérias Bioreporter pode ser visualizado directamente em microcosmos e expressão de eGFP pode ser quantificada em relação à quantidade de células (proporcional ao sinal de mCherry) com a ajuda do software ImageJ. Isto permite comparar qualitativamente a biodisponibilidade em diferentes cenários (isto é, maior ou menor). FLU foi encontrado para ser biodisponível após o transporte micelial por P. ultimum (isto é,foi maior do que no controlo negativo). Além disso, o protocolo descreve como para quantificar a quantidade total de transporte mediado por micélio através de meios químicos e para verificar a biodisponibilidade de contaminantes usando fibras de vidro revestidas com silicone (fibras de SPME) em microcosmos idênticos. Resultados usando esta configuração microcosmo têm sido publicados e discutidos para a combinação de P. ultimum, fluoreno e B. sartisoli RP037-MCHE 15. Aqui, o foco recai sobre a descrição do método detalhado e a identificação de potenciais armadilhas do protocolo para fornecer esse conhecimento para os potenciais novos pedidos. Outras aplicações podem envolver vários fungos, espécies de bactérias (por exemplo, de locais contaminados), e outros contaminantes (por exemplo, pesticidas) ou contaminante de alimentação (por exemplo, solos envelhecidos).
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Protocol
1. Preparação de pratos, slides e incubação Chambers
- Prepare o seguinte material para cada microcosmo: um grande plástico Petri fundo prato (d = 10 cm), um modificado (veja o passo 1.2) plástico pequeno Petri fundo prato (d = 5 cm) com tampas e uma contagem de slides de câmara com três cavidades.
- Pegue o número desejado de Petri partes inferiores prato (d = 5 cm). Retire parte da borda com uma serra para caber exatamente um slide (26 mm comprimento da aresta). Para esterilizar o sistema, embeber fundo do prato de Petri e tampas em etanol a 70% O / N e secá-las para, pelo menos, 2 horas numa câmara de fluxo de luz ultravioleta. Armazenar as placas de Petri em um recipiente de plástico hermeticamente fechado, o qual também tinha sido exposta à luz UV durante 2 h.
- Limpar o número desejado de lâminas com etanol a 70% e ar-secá-las. Enrole slides em folha de alumínio e colocá-los em uma mufla durante 5 horas a 450 ° C, para remover eventuais contaminações. Prepare câmaras de incubação de vidro com tampas. Limpe com 70% de etanol e expor câmaras abertas à luz UV por pelo menos 2 horas em uma câmara de fluxo.
NOTA: dessecadores grandes (diâmetro de cerca de 30 cm) com tampas podem ser utilizadas para esta finalidade; cada secador pode abrigar até dez configurações microcosmo.
2. Preparação de Mídia e Cultura
- Para executar 20 microcosmos paralelas, obter 100 ml de meio de triptona de levedura modificada (MTY) 14, cerca de 150 ml de meio mínimo 16 21C (MM), 5 ml de meio mínimo de agar (MMA; 0,5%, w / v), três placas de agar de dextrose de batata (PDA; 1,5%, w / v) para P. ultimum, quatro placas em branco, uma placa de PDA contendo 2 mg L-1 de ciclo-heximida, quatro placas de agarose (3%, w / v) contendo 0,3 g ml -1 de carvão activado e 40 mg de FLU, em porções de 2 mg.
- Prepare MTY contendo 50 mg L-1 de canamicina (canamicina é required para manter o plasmídeo repórter eGFP) e MM contendo 10 mM de acetato de cultivo bacteriano. Use MM sem acetato para preparar 0,5% MMA para a imobilização de bactérias nos microcosmos e despeje placas (a cada 20 ml) de 1,5% PDA para o cultivo de Pythium ultimum e microcosmo setups.
- Inocular algumas hifas de P. ultimum em três placas de PDA fresco e incuba-se no escuro a 25 ° C durante cerca de 72 horas. Em seguida, garantir que as placas são cobertas completamente por micélio fresco e macio.
- Inicie duas culturas de B. sartisoli RP037-MCHE em 50 ml de MTY de um estoque de glicerol. Incubar a 30 ° C com 230 rpm movimento frasco rotativo S / N.
- Cultura Medir a densidade óptica (DO) a 578 nm e centrifugar a 1000 xg durante 10 min (para B. sartisoli RP037-MCHE, o OD 578 esperado é de cerca de 1,0 e as células estão em fase exponencial). Elimine o sobrenadante e re-suspender as célulasem uma quantidade apropriada de MM para atingir uma OD 578 de 0,4. Inocular 20 ml de MM contendo 50 mg L-1 canamicina com 400 ul das células ressuspensas. Incubar a 30 ° C com 230 rpm movimento frasco rotativo S / N.
- Medir OD 578 da cultura em MM (por B. sartisoli RP037-MCHE, o OD 578 esperado é de cerca de 0,2 e as células estão em fase exponencial precoce). Cultura Centrifugar a 2.000 x g durante 10 minutos e re-suspender as células em uma quantidade apropriada de MM para atingir uma DO de 0,4. Misturar 50 ul da suspensão celular com 500 ul de quente, MMA líquido em tubos de 2 ml e armazenar a 50 ° C, até utilização. Use 150 ul de células no MMA para cada microcosmo.
- Verter em placas de gel de agarose que contém carvão activado. Derreter de agarose (3%; w / v) em água duplamente destilada. Misture bem com carvão ativado (0,3 g ml -1) e despeje a mistura em pratos de plástico de Petri(D = 10 cm).
3. Microcosmo Montagem
NOTA:. A configuração completa microcosmo está representado esquematicamente na Figura 1 Por favor, consulte a Figura 1 para todas as seguintes etapas individuais. Os passos seguintes são descrevendo a preparação de uma amostra (SAM) com vetores de transporte de micélio e três configurações de controle diferentes (Con Air, CON NEG, CON POS). Um resumo de todos os setups diferentes podem ser encontrados na Tabela 1.
- Tome número desejado de pratos e slides de Petri e expô-los à luz UV sob uma câmara de fluxo para 30 min.
- Coloque a placa de Petri pequena dentro da grande e encaixar o slide com a abertura da pequena placa de Petri. Pegue uma amostra da suspensão de células quente no MMA e adicionar 150 mL na cavidade meio de um slide. Repita este passo até as cavidades médias de todos os slides sãopreenchido com o MMA. Esperar 5 min para o MMA para solidificar.
- Use uma rolha broca um centímetro para perfurar para fora manchas circulares de uma placa de PDA em branco. Coloque um adesivo de uma distância de 2 mm junto ao MMA dentro da pequena placa de Petri. Adicionar esta para promover o crescimento micelial na configuração (PDA 3 na Figura 1).
- Corte remendos PDA curvas como barreiras mecânicas. Use uma parte do fundo pequena placa de Petri limpo e esterilizado e pressioná-lo em uma placa de PDA. Usar uma espátula para cortar outro anel menor a uma distância de 0,5 cm no agar que resulta em um anel de PDA.
- Corte um pedaço, que se encaixa exatamente na abertura da pequena placa de Petri na configuração do microcosmo e colocá-lo dentro do fosso na parte superior do slide. Assegure-se que a distância entre o MMA e a barreira PDA circular é de cerca de 2 mm. Feche a tampa da pequena placa de Petri pressionando-o suavemente na barreira PDA.
- Repita os passos 3.4 e 3.4.1 com uma placa PDA contendo 2 g L -1de cicloheximida.
NOTA: Esta é a configuração de controle para o transporte a bordo (CON AIR) para as células Bioreporter, desde mycelia são inibidos pela cicloheximida e não crescer demais MMA.
- Use uma rolha broca um centímetro para perfurar para fora manchas circulares de uma placa de PDA em branco. Use outro 0,5 centímetros cortiça broca para cortar a metade do primeiro patch. Inserir o PDA-anel pequeno resultante a uma distância de 1 mm junto à barreira PDA (PDA 1 na Figura 1).
- Adicionar 2 mg de FLU para o buraco de PDA 1. Use de 1 cm de cortiça broca para cortar manchas circulares de placas de PDA cobertas de P. ultimum e colocar um adesivo (PDA 2 na Figura 1) para baixo sobre a parte inferior do anel de PDA de modo que o tapete micelar está voltado para os cristais de FLU.
- Repita o passo anterior, sem adição de cristais gripe.
NOTA: Esta é a configuração de controle negativo (CON NEG) para determinar fundofluorescência de células Bioreporter.
- Repita o passo anterior, sem adição de cristais gripe.
- Use uma rolha broca um centímetro para perfurar para fora manchas circulares do agar contendo carvão ativado. Coloque quatro sistemas em cada configuração microcosmo para diminuir ainda mais a concentração FLU gasoso (Figura 1).
- Prepare um controlo positivo (CON POS). Adicione alguns cristais gripe para 200 mL de suspensão de células MMA e colocá-lo em uma cavidade de um slide de vazio.
- Coloque uma placa de Petri (d = 10 cm), com um pouco de pó de carvão activado na parte inferior da câmara de incubação para minimizar a concentração de GRIPE gasoso na câmara. Além disso, coloque 4-5 50 ml copos com água estéril no fundo, para manter a umidade alta na câmara.
- Transferir configurações microcosmos em câmaras de incubação e incubar a 25 ° C durante 96 h. Colocar as amostras aleatoriamente nas diferentes câmaras de crescimento para excluir efeitos de localização.
NOTA: Este tempo de incubação aplonas para o P. oomiceto ultimum. Poderia ser diferente para outros organismos.
- Transferir configurações microcosmos em câmaras de incubação e incubar a 25 ° C durante 96 h. Colocar as amostras aleatoriamente nas diferentes câmaras de crescimento para excluir efeitos de localização.
4. Confocal Laser Scanning Microscopy
- O ideal é usar uma configuração CLSM com microscópio vertical.
NOTA: Pode ser equipado com lasers convencionais 488, 561 e 633 linhas nm para excitação ou com uma fonte de laser branco tunable oferta por exemplo,. - Utilize as seguintes definições para a coleta de imagens: Excitação: 490 nm (eGFP) e 585 nm (mCherry) na intensidade do laser apropriado (excitação simultânea); gamas de emissão: 500-550 nm (eGFP) e 605-650 nm (mCherry); lente objetiva: 63X NA 0,9 immersible água (devido à sua longa distância de trabalho); tamanho do passo para Z-stacks: 0,5 m.
- Abrir configuração microcosmos e usar um bisturi para remover PDA 1, 2, 3 e a barreira PDA. Coloque uma lamela de vidro no topo do MMA e pressione-o suavemente para remover as bolhas de ar. Mount slides no palco microscópio. Adicionar uma gotícula de água na parte superior do poe tampa de deslizamento e usar as configurações mCherry para encontrar células Bioreporter na amostra.
- Obter uma visão geral da amostra e otimizar a relação sinal-ruído, utilizando um brilho-over-under tabela de pesquisa para o vermelho (mCherry) e verde (eGFP) canal. Escolha uma posição aleatória na amostra para analisar Bioreporter fluorescência.
NOTA: hifas pode mostrar autofluorescência na gama de emissão Bioreporter (por exemplo, a autofluorescência verde) 17. Certifique-se de selecionar áreas sem hifas se este for o caso. - Defina e registre-z pilhas para cada posição no verde (eGFP) eo (mCherry) canal vermelho. Evitar o branqueamento da amostra por exposição prolongada à luz ou luz laser de epifluorescência.
- Repita o passo anterior para dez aleatórios, posições distribuídas uniformemente.
- Repita todas as etapas usando as mesmas configurações para todas as amostras da pista de testes (SAM), CON AIR, CON NEG e CON POS. Análise 5. Imagem
- Certifique-se de instalar o plugin logi_tool (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/).
- Abrir arquivo em ImageJ. Selecione "canais Dividido" e perto do canal verde. Use a macro 'área mCherry' fornecido como arquivo suplementar código para quantificação da área de fluorescência vermelha no z-stack. Ajustar as definições preferidas no macro (indicado em negrito).
- A saída é uma tabela com os pixels medidos acima do limite (e acima do tamanho mínimo definido) na pilha z.
NOTA: A soma de todos os valores é o número total de pixels vermelhos (área) na pilha.
- A saída é uma tabela com os pixels medidos acima do limite (e acima do tamanho mínimo definido) na pilha z.
- Abrir arquivo em ImageJ. Selecione "canais Dividido" e perto canal vermelho. Use a macro 216; eGFP int 'fornecido como arquivo de código complementar para quantificar a intensidade de fluorescência verde na pilha z. Ajustar as definições preferidas no macro (indicado em negrito).
- A saída é uma tabela com as intensidades médias e área de todos os objetos verdes acima do limite (e acima do tamanho mínimo definido) em z-stack. Para calcular a intensidade total de pixels verdes na pilha, multiplique cada intensidade pela área correspondente dizer.
- Calcula-se a indução eGFP relativa (eGFP rel):
(1)
Observação: Uma vez que é expresso constitutivamente mCherry, o valor resultante de eGFP rel é uma medida relativa para a quantidade de eGFP expressa por uma certa quantidade de células. Por favor, consulte a Tabela 3 para obter mais informações sobre o cálculo do eGFP rel. - Enrole 15 ml frascos de vidro, 1 ml frascos GC / MS e inserções em folha de alumínio. Encha evaporação pratos com Na 2 SO 4; colocar tudo em forno de mufla durante 5 h a 450 ° C para remover possíveis contaminações. Guarde o Na 2 SO 4 dentro de um secador ativado.
- Cortar PDMS fibras de vidro revestidas de 0,5 cm de comprimento. Lave fibras agitando quatro vezes 2 horas em metanol fresco. Repita as etapas de lavagem mais quatro vezes com água ultrapura e armazenar fibras limpas em água ultrapura num frasco de vidro selado.
- Prepare a 1,5 L de tolueno / acetona (3: 1, v / v) contendo 10 mg L -1 fenantreno-10 d.
- Siga as etapas 1, 2 e 3 do protocolo. Prepare microcosmos sem bioucélulas eporter estudar transporte FLU (SAM (-) e CON AIR (-)) e com células Bioreporter (SAM) para verificar a degradação FLU.
- Opcionais (sem células Bioreporter): Coloque três PDMS revestidas de fibras de vidro (geralmente utilizados para experiências SPME) como pia contaminante artificial e quantificável dentro MMA do SAM (-) usando uma pinça fina.
- Retire as fibras de vidro usando uma pinça fina e transferir cada um em um GC / MS frasco com insert.
- Adicionar 200 mL de tolueno e agitar verticalmente S / N e analisar através de GC / MS. Use as configurações definidas no Quadro 2.
- Transferir MMA a partir da cavidade do meio para um frasco de vidro de 15 ml e adicionar cerca de três espátulas de Na 2 SO 4. Misture bem com uma espátula e adicione 10 ml de solvente. Vortex da mistura e agitar horizontalmente O / N no escuro.
- Transferir 1001; l de amostra em GC / MS frasco com insert. Adicionar 10 ul de acenaftileno-d 08 (10 mg L-1) e analisar através de GC / MS usando o mesmo programa como descrito em 6.4.3.
NOTA: Para analisar vermelho (mCherry) e verde (eGFP) fluorescência na z-stacks gravadas, entre outras opções a ImageJ software livre 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) pode ser utilizado.
(1) NOTA: configurações microcosmos também pode ser usado para realizar a quantificação de quantidades química GRIPE translocados com ou sem um dissipador de contaminante abiótico.
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Representative Results
Os resultados aqui apresentados já foram publicados anteriormente 15. Por favor, consulte o artigo para discussão mecanicista e ambiental detalhado.
Após a gravação de imagem via CLSM, a projeção de intensidade máxima pode ser realizada utilizando o respectivo software microscópio ou ImageJ para ganhar uma primeira impressão visual da amostra e os controles (Figura 2). Mais tarde, os conjuntos de dados podem ser projetadas de forma diferente, a fim de mostrar características significativas de software de visualização específica. O controle positivo (POS CON) mostra indução eGFP distinta (Figura 2A), enquanto que o controle no ar (AIR CON) exibe somente fundo eGFP fluorescência (Figura 2B). eGFP fluorescência na amostra de teste (SAM) parece ser elevada em comparação com CON AIR, yet não tão marcado como CON POS (Figura 2C). A fluorescência mCherry é independente da degradação HAP e, por conseguinte, semelhante em todas as amostras. No entanto, os sinais ligeiramente elevadas eGFP não irá ser detectado por este método e análise de imagem subsequente é essencial.
Para os microcosmos testados, a inspecção visual foi complementado por análise de imagem e cálculo de indução eGFP relativa (cf. passo 5 e seguintes do protocolo; Figura 3). A fluorescência de fundo verde para B. não-induzido sartisoli RP037-MCHE é calculado com CON NEG. Nas condições dadas, a indução relativa eGFP foi encontrado para ser rel eGFP = 0,53. Não houve diferença significativa pôde ser detectada entre NEG CON e CON AIR (rel eGFP = 0,54; p> 0,95), excluindo, assim, qualquer transporte FLU em fase de vapor para as células Bioreporter. Para CON POS, indução muito elevado eGFP (eGFP rel = 53,7) foi encontrado confirmando a vitalidade das células em MMA depois 96hr e representando a indução máxima eGFP. Na presença de micélios e FLU (SAM), eGFP foi significativamente induzida em células em comparação com os controlos negativos (rel eGFP = 1.15; p <0,001). No entanto, a indução eGFP é relativamente baixo em comparação com o controlo positivo (cf. Tabela 3, ponto 8).
Transporte de FLU por micélio de P. ultimum na configuração microcosmo foi quantificada quimicamente (cf. etapa 6 ff do Protocolo; Figura 4). Na presença de gripe e P. ultimum (SAM (-)), micélio translocalizado a cerca de 25 ng do FLU dentro 96hr o que equivale a uma taxa de transporte de 37.5pmold -1 cm -1. Os controlos na ausência de micélios (AR CON (-)) revelou transporte GRIPE gasoso no MMA no intervalo de 2 ng apenas dentro 96hr, isto é, a indução da Bioreporter por em fase de vapor-concentrações podiam ser excluídos. Quando B.sartisoli RP037-MCHE estava presente (SAM), <1 ng da gripe foi detectada no patch MMA. Este eficaz degradação bacteriana FLU verificada após a translocação mediada por micélio.
É possível investigar a influência da degradação bacteriana, ou seja, de uma pia FLU, em FLU translocação através da adição de um dissipador de contaminante abiótica ao sistema (cf. passo 6.4.1 ff do protocolo). Assim, consegue-se quantificar a quantidade de GRIPE absorvida pelas fibras e a quantidade deixada no interior do MMA e hifas sobrejacente. Para SAM(-), A quantidade total é translocado independente da presença de um dissipador de contaminante (p> 0,9; Figura 5A). No entanto, um aumento da área de microcosmos com FLU absorção também foi testada como descrito em detalhe anteriormente 15. Ali, um aumento significativo da quantidade GRIPE translocado poderiam ser detectados (Figura 5B).
Figura 1. Desenho esquemático e fotos da instalação completa microcosmo. Vista de cima (A) e a partir do lado (B). Todos os emplastros de agar foram colocados em cima de uma lâmina com três pequenas cavidades. Dois mg de cristais GRIPE foram colocados dentro de uma cavidade (d = 5 mm) em meio de PDA 1. PDA 2 foi recentemente coberto com hifas de P. ultimum enfrentando PDA 1. Um pedaço PDA curva, foi colocado entre PDA 2 eo patch para MMA criar uma barreira mecânica GRIPE juntamente com a tampa de uma caixa de Petri (d = 5 cm). Quatro manchas de ágar contendo carvão ativado foram colocados na configuração para diminuir ainda mais a concentração FLU gasoso. Fotos do microcosmo completo de cima (C) e vista diagonal (D) sem microorganismos e gripe. Figuras 1A e 1B foram modificados com a permissão de Schamfuss et al. 15 Adaptado com permissão de Schamfuss, S. et al. Impacto da mycelia bactérias sobre a acessibilidade dos fluorene para pah-degradante. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2. projeções intensidade máxima de micrografias confocal de varredura a laser. Micrografias são visualizar a indução da bactéria B. Bioreporter mCherry e eGFP sartisoli RP037-MCHE no MMA. Quando as bactérias tinham contacto com uma fonte GRIPE cristalino em MMA (CON POS; A), o sinal de eGFP é elevado em comparação com os controlos (AR CON; B). As amostras com FLU e P. ultimum (SAM; C) também exibem um sinal eGFP elevada, no entanto menos acentuada do que o controlo positivo. mCherry é expresso constitutivamente e portanto serve como um controlo visual para detectar as células. (Ampliação 630X, bar 20 m). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Relativa indução eGFP em B.sartisoli RP037-Che para NEG CON, CON AIR e SAM com micélio e FLU. Comparação da indução eGFP relativa (eGFP rel) por B.sartisoli RP037-Che após 96hr, na ausência de FLU (NEG CON), na presença de FLU, mas ausência de P.ultimum (AR CON) e na presença de ambos, FLU e P.ultimum (SAM). As diferenças estatisticamente significativas ao CON NEG são marcados por um asterisco. Os experimentos foram realizados em triplicatas independentes para CON AIR e
. (. Cf Figura 1) Figura 4. Chemical FLU quantificação As quantidades totais de FLU em ng extraído do patch de MMA após 96hr para o transporte em fase de vapor, sem células (CON AIR (-)), mtransporte ycelial sem células (SAM (-)) e transporte micelial com células (SAM). Esta figura foi modificado com a permissão de Schamfuss et al. 15 Adaptado com permissão de Schamfuss, S. et al. Impacto da micélio sobre a acessibilidade dos fluorene a bactérias degradadoras de PAH. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.
Figura 5. Chemical FLU quantificação na presença de um coletor de contaminante abiótico (A) As quantidades totais de FLU em ng extraído do patch de MMA após 96hr para o transporte micelial com ou sem pia contaminante artificial (SAM (. (Cf Figura 1). - ) com ou sem co PDMSfibras ated). (B) Os mesmos resultados de uma pista de testes variados com o aumento da área de captação FLU micelial. Esta figura foi modificado com a permissão de Schamfuss et al. 15 Adaptado com permissão de Schamfuss, S. et al. Impacto da micélio sobre a acessibilidade dos fluorene a bactérias degradadoras de PAH. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.
| Nome | FLU | Mycelia | Células | Aplicação | Comentários |
| SAM | + | + | + | MCVL | |
| GC / MS | |||||
| SAM (-) | + | - | GC / MS | também possível com fibras PDMS como pia contaminante artificial | |
| CON AIR | + | (+) | + | MCVL | micélio só cresce até barreira PDA; MMA não abrangidos |
| CON AIR (-) | + | (+) | - | GC / MS | micélio só cresce até barreira PDA; MMA não abrangidos |
| CON NEG | - | + | + | MCVL | |
| CON POS | + | - | + | MCVL | células são directamente expostos à cristais GRIPE |
Tabela 1. Visão geral de todos os tipos de amostras Resumo de todas as amostras de controle e de teste, incluindo aplicação (ensaio Bioreporter - MCVL ou quantificação de substâncias químicas - GC / MS). E composição (FLU, micélio e as células Bioreporter).
| Forno | |
| Temperatura inicial | 50 ° C |
| Tempo inicial | 2 min |
| Taxa | 15 ° C min @ 1 |
| Temperatura final | 300 ° C |
| Tempo Final | 6.33 min |
| Injector (PTV) | |
| Volume de Injecção | 0,5 ul |
| Modo | splitless |
| Purga | 2.00 min |
| Fluxo de purga | 50.0 ml min -1 |
| Temperatura inicial | 80 ° C |
| Tempo inicial | 0.02 min |
| Rampas: Taxa | 600 ° C min-1 |
| Temperatura final | 300 ° C |
| Tempo Final | 10 min |
| Coluna | |
| Modelo | J & W DB-5MS |
| Comprimento nominal | 20 m |
| Diâmetro nominal | 180 pm |
| Espessura nominal | 0,18 mm |
| Gás de arrastamento | hélio de 0,8 ml min -1 |
| MSD Transferline | 280 ° C |
| MSD | |
| Modo de SIM | |
| MS Fonte | 230 ° C |
| MS Quad | 150 ° C |
Tabela 2. Definições para GC / MS. Resumo das definições para GC e MS para qfluorene uantify nos setups microcosmo.
| ARMADILHAS | COMENTÁRIO | |
| 1 | Crescimento preliminar e testes de vitalidade | Estudar o crescimento micelial de organismo de escolha. Quanto tempo demora para chegar o patch MMA? É inibida pela barreira cicloheximida? Além disso, verifique se as células Bioreporter ficar vital no MMA o tempo todo através de ensaios para entrançar. Se não, pode-se também adicionar uma fonte de carbono para o MMA, que não resulta na indução Bioreporter. Excluir possível inibição mútua de bactérias e micélio. |
| 2 | Taxa de crescimento micelial | A taxa de crescimento do organismo micelial não deve ser muito lenta, porque caso contrário o transporte em fase gasosa de HAP aumenta com o tempo de incubação prolongado. O protocolo pode ser adaptadoadicionar PAH em um ponto de tempo mais tarde, mas, novamente, micélio no ponto de inoculação pode não ser mais em atividade. |
| 3 | Mobilidade bacteriana | Se um ponto de microscópio de varredura a laser é utilizado e da estirpe bacteriana é móvel, a gravação e quantificação de z-stacks pode ser impossível devido ao movimento dentro do MMA. Assim, o movimento bacteriana deve ser evitada, por exemplo, através do aumento da solidez de MMA, usando CLSM com um scanner rápido ou um microscópio a laser de disco giratório. |
| 4 | Transporte em fase de vapor | Transporte em fase de vapor de produto químico (por exemplo, HAP) para as células Bioreporter devem ser excluídos, uma vez suficientemente Bioreporter células são extremamente sensíveis aos agentes químicos na fase de vapor. Este é o ponto crucial de todo o protocolo, a fim de evitar resultados falso-positivos causados pelo transporte gasoso. A fase gasosaconcentração pode ser estimado através de análise química de AR CON (-) e as concentrações em fase de vapor pode ser ajustado, por exemplo, pela adição de mais ou menos manchas de agarose com carvão activado. |
| 5 | Toxicidade | Tenha em mente, que as altas concentrações da substância química testada pode ter efeitos tóxicos sobre o organismo e / ou bactérias micelial. |
| 6 | Autofluorescence | Verificar se o organismo escolhido micelial mostra alguns autofluorescência na gama do sinal de Bioreporter esperado. Não deixe de conferir em diferentes estágios de crescimento desde autofluorescência pode variar 17. Se autofluorescência é detectado, não se esqueça de registrar z-stacks em áreas livres de micélio. |
| 7 | Branqueamento | mCherry fluorescência é geralmente estável e não sensíveis ao clareamento no bi aplicadoscélulas oreporter. Em contraste, eGFP branqueia rapidamente. Portanto, não use o canal eGFP visualizar a amostra antes da gravação z-stack. |
| 8 | indução eGFP | Percebemos uma baixa indução eGFP na SAM Comparado ao controle POS. Este é contabilizado pela forte restrição espacial e baixa acessibilidade da fonte FLU para manter concentração muito baixa em fase de vapor de FLU (cf. últimos resultados parágrafo). Dependendo da estirpe Bioreporter escolhido e química, a área de absorção no PDA 1 podem ser variados para aumentar a taxa de transporte (Figura 5B). No entanto, tem que ser considerado que isto também aumenta o transporte em fase de vapor para as células Bioreporter. |
| 9 | Cálculo de eGFP rel | O método de cálculo apresentada para eGFP rel onde a intensidade de pixels verdes é comparadopara a área de pixels vermelhos é apenas uma possibilidade. Por favor, consulte a discussão para mais informações. |
| 10 | O tamanho do pixel | Por favor, esteja ciente de que a ampliação da lente escolhida e um fator de zoom potencialmente aplicada afetar o tamanho do pixel da imagem. Isto deve ser levado em consideração para análise de imagem. |
| 11 | Frações biodisponíveis | Tenha em mente que a biodisponibilidade do composto transportado é avaliado qualitativamente (e não quantitativamente) via indução eGFP. Não houve correlação do eGFP-indução em relação calculada e a fracção biodisponível foi tentada. No entanto, isto pode ser abordado em futuras aplicações. |
| 12 | Os limites de detecção | Detecção de substâncias químicas. Para a quantificação química de compostos orgânicos, uma vasta gama de concentratrações pode ser detectada de forma confiável. Detectamos montantes no 0ng gama e 1,000ng. eGFP quantificação. Comparamos indução relativa eGFP em amostras sem transporte de contaminantes (ie, 0ng transportados), com transporte mediado por micélio (ou seja, entre 20 e 40 ng transportados; cf. Figuras 4 e 5) e com o contato direto com a fonte contaminante (ou seja, máximo montante disponível). Estes três casos provado ser bem distinguidos com o método descrito. No entanto, não podemos fazer uma declaração mais detalhada sobre a resolução da indução relativa eGFP. Esse problema pode ser abordada no futuro, ligando diferentes quantidades de contaminantes com a indução correlacionando eGFP nos setups microcosmo. |
| 13 | Material de placa de Petri | Pratos de plástico de Petri pode resultar em uma subestimação do micelial translocação e / ou biodisponibilidade PAH. Isto não deveser problemático, se declarações qualitativas são aspirava. No caso, são necessárias medidas quantitativas precisas, aplicação de placas de Petri devem ser consideradas, apesar preparação e manuseamento será mais inconveniente. |
Tabela 3. Discussão de possíveis armadilhas. Possíveis armadilhas antes e durante o experimento e os comentários e opções propostas.
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Discussion
A configuração microcosmo apresentado mostrou adequado para estudar a biodisponibilidade de substâncias químicas separadas espacialmente para degradar organismos após a absorção e transporte por micélio. Transporte em fase gasosa potencial de compostos voláteis parcialmente é impedido e células Bioreporter bacterianas podem ser visualizados sem elaborada a preparação da amostra e, portanto, com o mínimo de perturbação do sistema sensível. Ao mesmo tempo, a análise química da amostra pode ser facilmente conduzida para permitir um bom controlo dos resultados obtidos e para a quantificação de transporte total. No entanto, alguns pontos devem ser cuidadosamente considerados antes e durante a realização do experimento. Um ponto importante é manter os microcosmos livre de quaisquer contaminações cruzadas bacterianas ou químicos. Isso pode ser um desafio, uma vez que muitos microcosmos são executados em paralelo e, portanto, câmaras de incubação grandes (como exsicadores) são obrigatórios. Por isso, é crucial para esterilizar as peças cuidadosamente antes da constru configuraçãoção. Outro ponto crítico pode ser a aplicação de pratos de plástico de Petri para os microcosmos. Apesar de PAH e Bioreporter não entrar em contato direto, uma certa quantidade de HAP pode ser absorvida pelo material plástico. No entanto, entendemos que este não problemático para o protocolo descrito, já que isso resultaria, se houver, em uma subestimação do micelial PAH-translocação e / ou biodisponibilidade. Em qualquer caso, se é necessária uma quantificação precisa, ele deve ser considerado trocando as peças de plástico com peças de vidro, apesar de manipulação irão ser mais inconveniente. Outros pontos que devem ser considerados envolver as linhagens escolhidas bacterianas e fúngicas (possível inibição mútua, taxa de crescimento, mobilidade e possível autofluorescência), os produtos químicos escolhidos (efeitos tóxicos sobre os microorganismos, volatilidade, limites de detecção) e aspectos práticos (branqueamento, limitação das eGFP indução e cálculo de eGFP rel). Um resumo das armadilhas potenciais e respectivos comentários podem ser encontrados emTabela 3.
Usamos essa configuração microcosmo modelo para demonstrar transporte FLU micelial e degradação bacteriana subseqüente em um sistema insaturado diretamente em um nível de interação célula-micélio. O nosso modelo de set-up podem ser variadas e ajustadas para satisfazer necessidades diferentes com várias estirpes bacterianas e fúngicas, compostos químicos, etc. Assim, o sistema poderia ser utilizado, por exemplo, (i) para avaliar a influência do micélio de bactérias na presença de um produto químico de outra forma restrito (por exemplo, toxicidade) fonte, (ii) para prever a influência dos micélios sobre a biodisponibilidade de compostos de degradação bacteriana, (iii) para estudar a biodisponibilidade contaminante em função da distância das bactérias para o vector de transporte ou (iv) para investigar o efeito de diferentes fontes químicas (por exemplo, cristalina, no solo ou dissolvidos). No entanto, a adaptação do sistema para umcondições lternate vai ser delicado e deve ser conduzido passo a passo, a fim de alcançar resultados claros. Até agora, nós não testei o sistema para outras estirpes bacterianas ou fúngicas e outros compostos que PAH. No entanto, uma vez que as redes de micélio são conhecidos para transportar também outros contaminantes que PAH como pesticidas 19 ou substâncias solúveis, como o salicilato de 20, nós pensamos que o sistema pode ser expandido para diferentes compostos químicos dado um biosensor bacteriana específica do composto.
Por favor, note que, dependendo da Bioreporter aplicada esticar um cálculo diferente de eGFP rel pode ser preferível. Em vez da equação (1) os dois seguintes opções podem ser aplicadas:
(2)
(3)
However, na equação protocolo apresentado (1) foi escolhido devido às seguintes razões: intensidade (i) eGFP foi relatado para correlacionar o fluxo HAP para a célula 14 enquanto que (ii) mCherry foi relatado que mostram variações consideráveis para diferentes células 13 . A equação (2) e (3), em contraste, podem ser escolhidas para evitar que a informação falsa de potenciais artefactos de luz na amostra. Em qualquer caso, comparamos os três métodos de cálculo com o outro, em que não há diferenças estatisticamente significativas poderia ser encontrado. Ainda assim, devido às variações descritas na intensidade de fluorescência de mCherry, recomendamos o uso da equação (1) ou (2).
No final, algumas limitações da técnica devem ser considerados. Uma vez que os microcosmos foram concebidos para evitar o transporte em fase gasosa do composto testado, a absorção do composto micelial é reduzida. Isto resulta em taxas de transporte mais baixas do que seria de esperar com a absorção sem impedimentos. Assim, a sensibilidade do Bioreporteiro estirpe deve ser suficientemente elevada para detectar pequenas mudanças na fracções biodisponíveis. Além disso, a instalação, provavelmente, não será adequado para cepas fúngicas com uma taxa de crescimento baixa. Neste caso, a incubação a longo prazo pode favorecer o transporte em fase gasosa do contaminante assim conduzindo a resultados falsos positivos. Pode ser possível modificar a configuração de uma maneira que o contaminante pode ser aplicada em um ponto de tempo posterior. No entanto, as hifas podem, então, ser já inativo ou morto no ponto de inoculação. Finalmente, como acima mencionado, a gama de compostos químicos que são transportados pelas redes de micélio é grande. No entanto, a disponibilidade de uma estirpe Bioreporter adequado pode ser um factor fundamental limitador.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest | |||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 (pH 6.0) | |||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2% | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8 | |||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | |||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| ImageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
References
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
- Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
- Griffin, D. M. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 141-151 (1981).
- Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 1-22 (1981).
- Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
- Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
- Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
- Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
- Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
- Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
- Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
- Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
- Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. Manual of methods for general bacteriology. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).
- Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).
- Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
