Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

A Whole Cell Bioreporter tilgang til Vurdere Transport og biotilgængelighed organiske forureninger i vand Umættede Systems

doi: 10.3791/52334 Published: December 24, 2014

Summary

En helcelle bioreporter assay med Burkholderia sartisoli RP037-mChe blev udviklet for at detektere fraktioner af en organisk kontaminant (dvs. fluoren) til rådighed for bakteriel nedbrydning efter aktiv transport af mycelier brodannende luftfyldte porer i en vand umættet modelsystem.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Jord er tæt befolket af en bred vifte af mikroorganismer 1,2 såsom bakterier. Men forholdene i denne naturtype er udfordrende, især med hensyn til adgangen til vand 3. Bakterier permanent behov for at søge efter optimale betingelser i heterogene miljøer 4, men fraværet af kontinuerlige vand film medfører nedsat bevægelighed 5 hindre dem til at sprede sig frit. Desuden er diffusionshastigheder af opløste stoffer (fx næringsstoffer) sænket under umættede forhold 6. Således er bakterier og næringsstoffer ofte fysisk adskilt og tilgængelighed af næringsstoffer begrænses 3. Som følge heraf kan en transport vektor til kemiske forbindelser, som ikke kræver en kontinuerlig vandfase bidrage til at overvinde disse begrænsninger. Faktisk har mange mikroorganismer såsom svampe og Oomycetes udviklet en filamentøs vækstform gør dem i stand til at vokse gennem luftfyldte porer og dermed nå og mobiLIZING også fysisk adskilt næringsstoffer 7 og kulstofholdige 8 stoffer over lange afstande. De kan endda fungere som biologiske transport vektorer, som leverer sukker og andre energikilder til bakterier 9. Optagelse og transport i myceliske organismer er også blevet vist for hydrofobe organiske forurenende stoffer som polycykliske aromatiske hydrocarboner (PAH) i Pythium ultimum 10 eller i arbuskulære mykorrhizasvampe 11. Da PAH er allestedsnærværende og dårligt vandopløselige urenheder 12 i jord, kan mycelia-medieret transport bidrage til at øge forurenende biotilgængelighed for potentielle bakterielle degraders. Det samlede beløb for forurenende transport kan kvantificeres direkte af kemiske midler 10, biotilgængelighed af forurenende stoffer, der transporteres af mycelium til nedbrydende bakterier og andre organismer kan ikke vurderes nemt.

Følgende protokol præsenterer en metode til at evaluere virkningen af ​​myceLia om forurenende biotilgængelighed for bakterielle degraders på en direkte måde; det giver at indsamle oplysninger om den spatiotemporale konsekvenser af forurenende stoffer på mikrobielle økosystemer. Vi beskriver, hvordan man opretter en omfattende umættet mikrokosmos-system efterligner luft-vand-grænseflader i jord ved at forbinde et fysisk adskilt PAH punktkilde med PAH-nedbrydende bioreporter bakterier via myceliske transport vektorer. Fordi luftbåren transport er udelukket, kan effekten af ​​mycelial baserede transport på PAH biotilgængelighed for bakterier studeres i en isoleret måde. Mere detaljeret blev tre-ring PAH fluoren, mycelie organisme Pythium ultimum og bioreporter bakterien Burkholderia sartisoli RP037-mChe 13 anvendes i de beskrevne mikrokosmos opsætninger. Bakterien B. sartisoli RP037-mChe blev oprindeligt bygget til at studere phenanthren tilførsel til cellen 14 og udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) som et resultat af PAH fluxcellen, mens den røde fluorescerende mCherry udtrykkes konstitutivt. Detaljerede oplysninger om reporter konstruktion er givet af Tecon et al. 13 I indledende tests, bakterien viste ingen svømning og kun meget langsom sværmer evne. Det var i stand til at migrere langsomt på hyfer af Pythium ultimum, når den anvendes som en tæt suspension oven på hyfer. Da bakterier blev indlejret i agarose i følgende protokol gjorde migration på hyfer ikke forekomme.

Brug konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) kan bioreporter bakterier visualiseres direkte i mikrokosmer og ekspression af eGFP kan kvantificeres i forhold til mængden af ​​celler (proportional med mCherry signal) ved hjælp af softwaren ImageJ. Dette gør det muligt at sammenligne biotilgængelighed kvalitativt i forskellige scenarier (dvs. højere eller lavere). FLU blev fundet at være biotilgængeligt efter mycelial transport af P. ultimum (dvs. detvar højere end i en negativ kontrol). Endvidere protokollen beskriver, hvordan at kvantificere den samlede mængde mycelium-medieret transport via kemiske midler og at kontrollere forurening biotilgængelighed ved hjælp af silicium-coatede glasfibre (SPME fibre) i identiske mikrokosmos. Resultater ved hjælp af dette mikrokosmos setup er blevet offentliggjort og diskuteret for kombinationen af P. ultimum, fluoren og B. sartisoli RP037-mChe 15. Her er fokus ligger på en detaljeret metodebeskrivelse og identifikation af potentielle faldgruber i protokollen at give denne viden til potentielle yderligere ansøgninger. Yderligere anvendelser kan involvere forskellige svampeinfektioner, bakterielle arter (f.eks fra forurenede grunde), og andre forurenende stoffer (f.eks pesticider) eller forurenende-forsyning (f.eks alderen jord).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Fremstilling af retter, slides og Inkubationsbetingelser Chambers

  1. Forbered følgende materiale for hver mikrokosmos: én stor plast petriskål bund (d = 10 cm), en modificeret (se trin 1.2) små plastik petriskål bund (d = 5 cm) med låg og en optælling kammer slide med tre hulrum.
  2. Tag det ønskede antal petriskål bunddele (d = 5 cm). Tag en del af randen med en sav til præcis passe et dias (26 mm kantlængde). At sterilisere systemet, sættetid petriskål bunde og låg i 70% ethanol O / N og tør dem i mindst 2 timer i en strøm kabinet under UV-lys. Opbevar petriskåle i en tæt forseglet plastbeholder, der også havde været udsat for UV-lys i 2 timer.
  3. Tør det ønskede antal lysbilleder med 70% ethanol og luft-tørre dem. Wrap dias i alufolie og læg dem i en muffelovn i 5 timer ved 450 ° C for at fjerne eventuelle forureninger. Forbered glas inkubation kamre med låg. Rens med 70% ethanol og udsætte åbne kamre mod UV-lys i mindst 2 timer i en strøm kabinet.
    BEMÆRK: Store desiccators (diameter ca. 30 cm) med låg kan bruges til dette formål; hver ekssikkator kan huse op til ti mikrokosmos opsætninger.

2. Udarbejdelse af Medier og kulturer

  1. For at køre 20 parallelle mikrokosmer opnå 100 ml modificeret trypton-gær-medium (MTY) 14, ca. 150 ml 21C minimalmedium 16 (MM), 5 ml minimalmedium agar (MMA, 0,5% w / v), tre kartoffel-dextrose-agar-plader (PDA 1.5%, w / v) for P. ultimum, fire tomme plader, en PDA-plade indeholdende 2 mg L -1 cycloheximid fire agaroseplader (3%, w / v) indeholdende 0,3 g ml -1 aktiveret carbon og 40 mg af FLU i 2 mg portioner.
  2. Forbered MTY indeholdende 50 mg L -1 af kanamycin (kanamycin er required at opretholde EGFP reporter plasmid) og MM indeholdende 10 mM acetat for bakteriel dyrkning. Brug MM uden acetat at fremstille 0,5% MMA til immobilisering af bakterier i mikrokosmer og hæld plader (hver 20 ml) 1,5% PDA til dyrkning af Pythium ultimum og mikrokosmos opsætninger.
  3. Podes nogle hyfer af P. ultimum på tre friske PDA-plader og inkuberes i mørke ved 25 ° C i ca. 72 timer. Så sikre, at pladerne er overgroet helt ved frisk og fluffy mycelium.
  4. Start to kulturer af B. sartisoli RP037-mChe i 50 ml MTY fra et glycerol lager. Inkuber ved 30 ° C med 230 rpm roterende kolbe bevægelse O / N.
  5. Mål kultur optisk densitet (OD) ved 578 nm og der centrifugeres ved 1000 xg i 10 min (for B. sartisoli RP037-mChe den forventede OD 578 er ca. 1,0, og celler i eksponentiel fase). Kassér supernatanten og re-suspendere cellernei en passende mængde MM til at nå en OD 578 på 0,4. Podes 20 ml MM indeholdende 50 mg L -1 kanamycin med 400 pi af de resuspenderede celler. Inkuber ved 30 ° C med 230 rpm roterende kolbe bevægelse O / N.
  6. Mål OD 578 af kulturen i MM (for B. sartisoli RP037-mChe den forventede OD 578 er ca. 0,2, og celler i tidlig eksponentiel fase). Centrifuge kultur på 2.000 xg i 10 min og re-suspendere cellerne i en passende mængde MM til at nå en OD på 0,4. Bland 50 pi af cellesuspensionen med 500 pi varm, flydende MMA i 2 ml rør og opbevares ved 50 ° C indtil brug. Brug 150 pi celler i MMA for hver mikrokosmos.
  7. Hæld plader af agarosegel indeholdende aktivt kul. Smelt agarose (3% w / v) i dobbelt destilleret vand. Bland grundigt med aktivt kul (0,3 g ml -1), og hæld blandingen i plast petriskåle(D = 10 cm).

3. Microcosm Montering

BEMÆRK:. Den komplette mikrokosmos setup er afbildet skematisk i figur 1 henvises til figur 1 for alle følgende individuelle trin. De følgende trin beskriver fremstillingen af en prøve (SAM) med myceliske transport vektorer og tre forskellige kontrol opsætninger (Con Air, CON NEG, CON POS). En oversigt over alle de forskellige opsætninger, kan findes i tabel 1.

  1. Tag ønskede antal petriskåle og dias og udsætte dem for UV-lys under en strømning i 30 min.
  2. Placer lille petriskål inde den store og passer til glide gennem hullet i den lille petriskål. Tag en prøve af varm cellesuspension i MMA og tilsæt 150 pi i midten hulrum af et objektglas. Gentag dette trin, indtil de midterste hulrum alle dias erfyldt med MMA. Vent 5 min til MMA at størkne.
  3. Brug en 1 cm propbor at punch ud cirkulære patches fra en tom PDA plade. Anbring et plaster i en afstand af 2 mm ved siden af ​​MMA inde i lille petriskål. Føj dette til at fremme mycelievækst i setup (PDA 3 i figur 1).
  4. Skær buede PDA patches som mekaniske barrierer. Brug en ren og steril lille petriskål nederste del og tryk den ind i en PDA plade. Brug en spatel til at skære en anden mindre ring i en afstand af 0,5 cm ind i agar, hvilket resulterer i en PDA-ring.
    1. Klip et stykke, som netop passer ind i hullet i den lille petriskål i mikrokosmos setup og placere den inde i hullet på toppen af ​​dias. Sikre, at afstanden mellem MMA og den cirkulære PDA barriere er omkring 2 mm. Luk låget af den lille petriskål forsigtigt at trykke det i PDA barriere.
    2. Gentag trin 3.4 og 3.4.1 med en PDA plade indeholdende 2 g L -1cycloheximid.
      BEMÆRK: Dette er opsætningen for luftbåren transport (CON AIR) mod bioreporter cellerne kontrol, da mycelier hæmmes af cycloheximid og ikke overgrow MMA.
  5. Brug en 1 cm propbor at punch ud cirkulære pletter af en tom PDA plade. Brug en anden 0,5 cm propbor at skære ud midt i første patch. Placer resulterende lille PDA-ringen i en afstand på 1 mm ved siden af PDA barriere (PDA 1 i figur 1).
  6. Tilsæt 2 mg FLU ind i hullet på PDA 1. Brug en 1 cm propbor at skære cirkulære patches fra PDA-plader tilgroede med P. ultimum og placere et plaster (PDA 2 i figur 1) bund ned på PDA ring så myceliemåtten står influenza krystaller.
    1. Gentag forrige trin uden tilsætning INFLUENZA krystaller.
      BEMÆRK: Dette er den negative kontrol setup (CON NEG) for at bestemme baggrundenfluorescens bioreporter celler.
  7. Brug en 1 cm propbor at punch ud cirkulære patches fra agar indeholdende aktivt kul. Placer fire pletter i hvert mikrokosmos setup at falde yderligere den gasformige FLU koncentration (figur 1).
  8. Forbered en positiv kontrol (CON POS). Tilføj nogle INFLUENZA krystaller til 200 pi MMA cellesuspension og sætte det i et hulrum i et tomt dias.
  9. Placer en petriskål (d = 10 cm) med nogle pulver af aktivt kul på bunden af ​​rugekammeret at minimere gasformig FLU koncentration i kammeret. Også placere 4-5 50 ml bægre med sterilt vand i bunden for at opretholde en høj luftfugtighed i kammeret.
    1. Overfør mikrokosmos opsætninger i rugemaskine kamre og inkuberes ved 25 ° C i 96 timer. Anbring prøverne tilfældigt på de forskellige vækstkamre at udelukke placering effekter.
      BEMÆRK: Denne inkubationstid aplag til Ægsporesvampe P. ultimum. Det kan være anderledes for andre organismer.

4. Konfokal Laser Scanning Microscopy

  1. Ideelt bruge en CLSM setup med opretstående mikroskop.
    BEMÆRK: Det kan være udstyret med konventionelle lasere tilbyder fx 488, 561 og 633 nm linjer for excitation eller med en justerbar hvid laser kilde.
  2. Brug følgende indstillinger til samling af billeder: Excitation: 490 nm (eGFP) og 585 nm (mCherry) på passende laser intensitet (samtidig excitation); emission intervaller: 500-550 nm (eGFP) og 605-650 nm (mCherry); objektiv: 63X NA 0,9 vand immersible (på grund af sin lange arbejdsafstand); skridt størrelse til z-stakke: 0,5 um.
  3. Open mikrokosmos opsætning og bruge en skalpel for at fjerne PDA 1, 2, 3 og PDA barrieren. Sæt et glas dækglas oven på MMA og tryk den forsigtigt for at fjerne luftbobler. Mount slide på mikroskop scenen. Tilføj en dråbe vand på toppen af ​​the dækglas og brug mCherry indstillinger til at finde bioreporter celler i prøven.
  4. Få et hurtigt overblik over prøven og optimere signal støjforhold at bruge en glød-over-under opslagstabel for rød (mCherry) og grøn (eGFP) kanal. Vælg en tilfældig position på prøven for at analysere bioreporter fluorescens.
    BEMÆRK: hyfer kan vise autofluorescens i intervallet bioreporter emission (fx grøn autofluorescens) 17. Sørg for at vælge områder uden hyfer, hvis dette er tilfældet.
  5. Definer og registrere z-stakke for hver position i det grønne (eGFP) og røde (mCherry) kanal. Undgå blegning af prøven ved lang eksponering til epifluorescens lys eller laserlys.
    1. Gentag forrige trin for ti tilfældige, jævnt fordelt positioner.
  6. Gentag alle trin med de samme indstillinger for alle prøver af prøvebanen (SAM), CON AIR, CON NEG og CON POS.
  7. 5. Image Analysis

    BEMÆRK: For at analysere rød (mCherry) og grøn (eGFP) fluorescens i z-stakke er optaget blandt andre muligheder den gratis software ImageJ 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) kan være anvendes.

    1. Sørg for at installere logi_tool plugin (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/).
    2. Åbn fil i ImageJ. Vælg "split kanaler" og luk grønne kanal. Brug makro 'mCherry område «som supplerende kode fil at kvantificere området rød fluorescens i z-stak. Juster foretrukne indstillinger i makroen (angivet med fed skrift).
      1. Output er en tabel med de målte pixels over tærskel (og over den definerede mindstemål) i Z-stack.
        BEMÆRK: Summen af ​​alle værdier er det samlede antal af røde pixels (område) i stakken.
    3. Åbn fil i ImageJ. Vælg "split kanaler" og luk røde kanal. Brug makro 216; eGFP int 'som supplerende kode fil at kvantificere intensiteten af ​​grøn fluorescens i Z- stak. Juster foretrukne indstillinger i makroen (angivet med fed skrift).
      1. Output er en tabel med de gennemsnitlige intensiteter og areal af alle grønne objekter over tærskel (og over den definerede mindstemål) i z-stak. For at beregne den samlede intensitet af grønne pixels i stakken, multipliceres hver betyde intensitet af det tilsvarende område.
    4. Beregn den relative eGFP induktion (eGFP rel):
      Ligning 1 (1)
      BEMÆRK: Da mCherry udtrykkes konstitutivt, den resulterende værdi eGFP rel er et relativt mål for mængden af eGFP udtrykkes af en vis mængde af celler. I øvrigt henvises til tabel 3 for yderligere oplysninger om beregning af eGFP rel.
    TLE "> 6. Kemisk Kvantificering

    BEMÆRK: Microcosm opsætninger kan også anvendes til at udføre kemiske kvantificering af translokeres INFLUENZA mængder med eller uden en abiotisk forurenende vask.

    1. Wrap 15 ml hætteglas, 1 ml GC / MS hætteglas og skær i aluminiumsfolie. Fyld inddampningsdigel med Na 2 SO 4; placere alle i muffelovn i 5 timer ved 450 ° C for at fjerne eventuelle forureninger. Opbevar Na2SC 4 inde i en aktiveret ekssikkator.
    2. Skær PDMS-overtrukne glasfibre i 0,5 cm længde. Vask fibre ved at ryste fire gange 2 timer i frisk methanol. Gentag vasketrin yderligere fire gange med ultrarent vand, og opbevar rene fibre i ultrarent vand i et forseglet hætteglas.
    3. Forbered 1,5 l toluen / acetone (3: 1, v / v) indeholdende 10 ug L -1 phenanthren-D 10.
    4. Udfør trin 1, 2 og 3 i protokollen. Forbered mikrokosmos uden bioreporter celler til at studere FLU transport (SAM (-) og Con Air (-)) og med bioreporter celler (SAM) for at kontrollere FLU nedbrydning.
      1. Valgfri (uden bioreporter celler): Sted tre PDMS coatede glasfibre (normalt anvendes til SPME eksperimenter) som kunstig og kvantificerbare forurenende sink inde MMA af SAM (-) ved hjælp af fine pincet.
      2. Fjern glasfibre med fin pincet og overføre hver en i en GC / MS-hætteglas med indsats.
      3. Tilsæt 200 pi af toluen og rystes vertikalt O / N og analysere via GC / MS. Brug indstillingerne i Tabel 2.
    5. Overførsel MMA fra midten hulrum i et 15 ml hætteglas og tilsæt ca. tre spatler af Na 2 SO 4. Bland grundigt med en spatel, og der tilsættes 10 ml solvens. Vortex blandingen og ryst vandret O / N i mørke.
      1. Overfør 1001 l prøve i GC / MS hætteglas med indsats. Tilføj 10 pi acenaphthylen-d 08 (10 mg L -1) og analysere via GC / MS med det samme program som beskrevet i 6.4.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Resultaterne præsenteret her er allerede blevet offentliggjort tidligere 15. Se artiklen til detaljeret mekanistisk og miljømæssig diskussion.

Efter billedoptagelse via CLSM kan en maksimal intensitet projektion udføres ved hjælp af den respektive mikroskop software eller ImageJ at få et første visuelle indtryk af prøven og kontrollen (figur 2). Senere kan de datasæt projiceres anderledes for at vise meningsfulde funktioner efter specifikt visualisering software. Den positive kontrol (CON POS) viser tydelig eGFP induktion (figur 2A), mens den luftbårne kontrol (CON AIR) udviser kun baggrund eGFP fluorescens (figur 2B). eGFP fluorescens i prøven (SAM), synes at være forhøjet i forhold til CON AIR, yet ikke som markeret som CON POS (figur 2C). Den mCherry fluorescens er uafhængig af PAH nedbrydning og dermed ens for alle prøver. Imidlertid vil let forhøjede eGFP signalerne ikke påvises ved denne metode, og efterfølgende billedanalyse er afgørende.

For de testede mikrokosmos, var visuel inspektion suppleret med billedanalyse og beregning af relativ eGFP induktion (jf trin 5 ff i protokollen figur 3). Den grønne baggrund fluorescens for ikke-inducerede B. sartisoli RP037-mChe beregnes med CON NEG. Under de givne betingelser, blev den relative eGFP induktion sig at være eGFP rel = 0,53. Ingen signifikant forskel kunne påvises mellem CON NEG og Con Air (eGFP rel = 0,54; p> 0,95), hvilket udelukker enhver dampfase FLU transport mod bioreporter celler. For CON POS, stærkt forhøjet eGFP induktion (eGFP rel = 53,7) blev fundet bekræfter vitaliteten af ​​cellerne i MMA efter 96hr og repræsenterer den maksimale eGFP induktion. I nærvær af mycelier og FLU (SAM) blev eGFP inducerede betydeligt i cellerne sammenlignet med de negative kontroller (eGFP rel = 1,15; p <0,001). Imidlertid EGFP induktion er relativt lav sammenlignet med den positive kontrol (tabel 3, punkt 8).

Transport af FLU af mycelium af P. ultimum i mikrokosmos setup blev kvantificeret kemisk (jf trin 6 ff i protokollen, figur 4). I nærværelse af FLU og P. ultimum (SAM (-)), mycelium transplaceret omkring 25 ng af FLU inden 96hr hvilket svarer til en transport på 37.5pmold -1 cm -1. Kontroller i mangel af mycelium (CON AIR (-)) afslørede gasformigt FLU transport ind i MMA i området kun 2 ng inden 96hr, dvs kunne induktion af bioreporter ved damp-fase-koncentrationer udelukkes. Når B.sartisoli RP037-mChe var til stede (SAM), <1 ng af FLU blev påvist i MMA patch. Dette verificeres effektiv bakteriel FLU nedbrydning efter mycelierne-medierede translokation.

Det er muligt at undersøge indflydelsen af bakteriel nedbrydning, dvs. en FLU vask på FLU translokation ved tilsætning af en abiotisk forurenende vask til systemet (jf trin 6.4.1 ff i protokollen). Således er man i stand til at kvantificere mængden af ​​FLU absorberet af fibrene og mængden venstre inde i MMA og overliggende hyfer. For SAM(-), Det samlede translokeres mængde er uafhængig af tilstedeværelsen af et forurenende stof sink (p> 0,9; figur 5A). Imidlertid blev et mikrokosmos med øget FLU optagelse område også testet som beskrevet i detaljer tidligere 15. Der kunne en betydelig stigning i den translokeret FLU beløb påvises (figur 5B).

Figur 1
Figur 1. Skematisk tegning og fotos af det komplette mikrokosmos setup. Udsigt fra toppen (A) og fra siden (B). Alle agar plastre blev placeret på toppen af ​​et objektglas med tre små hulrum. To mg Flu krystaller blev anbragt inde i et hulrum (d = 5 mm) i midten af PDA 1. PDA 2 var frisk overgroet med hyfer af P. ultimum overfor PDA 1. En buet PDA stykke blev anbragt mellem PDA 2 og MMA patch til skabe en mekanisk FLU barriere sammen med låget på en petriskål (d = 5 cm). Fire agar plastre indeholdende aktivt kul blev placeret i opsætningen til yderligere at reducere gasformige FLU koncentration. Billeder af det komplette mikrokosmos fra top (C) og diagonal visning (D) uden mikroorganismer og influenza. 1A og 1B er blevet ændret med tilladelse fra Schamfuss et al. 15. Tilpasset med tilladelse fra Schamfuss, S. et al. Virkningen af mycelium om tilgængeligheden af fluoren PAH-nedbrydende bakterier. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

pg "/>
Figur 2. maksimal intensitet fremskrivninger af konfokal laser scanning micrographs. Mikrografier er visualisere mCherry og eGFP induktion af bioreporter bakterien B. sartisoli RP037-mChe i MMA. Når bakterierne havde kontakt til en krystallinsk FLU kilde i MMA (CON POS, A), er det eGFP signal forhøjede sammenlignet med kontroller (CON AIR, B). Prøver med FLU og P. ultimum (SAM; C) viser også en forhøjet eGFP signal imidlertid mindre udtalt end den positive kontrol. mCherry udtrykkes konstitutivt og tjener derfor som en visuel kontrol til påvisning af cellerne. (Forstørrelse 630x, bar 20 um). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

"FO: keep-together.within-side =" altid "> Figur 3
Figur 3. Relativ eGFP induktion i B.sartisoli RP037-Che for CON NEG, CON AIR og SAM med mycelier og influenza. Sammenligning af den relative eGFP induktion (eGFP rel) ved B.sartisoli RP037-Che efter 96hr i fravær af FLU (CON NEG), i nærvær af FLU, men fravær af P.ultimum (CON AIR) og i nærvær af både influenza og P.ultimum (SAM). Statistisk signifikante forskelle i forhold til CON NEG er markeret med en stjerne. Eksperimenter blev udført i selvstændige tre eksemplarer til CON AIR og CON NEG hhv. En prøve blev testet for CON POS og eGFP rel blev beregnet med 53,7. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Schamfuss et al. 15. Tilpasset med tilladelse fra Schamfuss, S. et al. Virkningen af mycelium på tilgængeligheden af fluoren at PAH-nedbrydende bakterier. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.

Figur 4
. (. CF Figur 1) Figur 4. Kemisk FLU kvantificering samlede mængder af FLU i ng udvundet fra MMA plaster efter 96hr for damp-fase transport uden celler (CON AIR (-)), mycelial transport uden celler (SAM (-)) og mycelial transport med celler (SAM). Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Schamfuss et al. 15. Tilpasset med tilladelse fra Schamfuss, S. et al. Virkningen af mycelium på tilgængeligheden af fluoren at PAH-nedbrydende bakterier. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.

Figur 5
Figur 5. Kemisk FLU kvantificering i nærværelse af en abiotisk forurenende vask (A) Samlede mængder af FLU i ng udvundet fra MMA plaster efter 96hr for mycelial transport med eller uden kunstig forurenende vask (SAM (. (Jf figur 1.) - ) med eller uden PDMS coated fibre). (B) samme resultater for en varieret prøvebane med øget mycelial FLU optagelse området. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Schamfuss et al. 15. Tilpasset med tilladelse fra Schamfuss, S. et al. Virkningen af mycelium på tilgængeligheden af fluoren at PAH-nedbrydende bakterier. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.

Navn FLU Mycelier Celler Ansøgning Kommentarer
SAM + + + CLSM
GC / MS
SAM (-) + - GC / MS også muligt med PDMS fibre som kunstige kontaminant sink
CON AIR + (+) + CLSM mycelia kun vokser op til PDA barriere; MMA ikke er omfattet
CON AIR (-) + (+) - GC / MS mycelia kun vokser op til PDA barriere; MMA ikke er omfattet
CON NEG - + + CLSM
CON POS + - + CLSM celler direkte udsat med influenza krystaller

Tabel 1. Oversigt over alle prøvetyper Oversigt over alle kontrol- og testprøver herunder ansøgning (bioreporter assay - CLSM eller kemisk kvantificering - GC / MS). Og samning (FLU, mycelier og bioreporter celler).

Ovn
Indledende temp 50 ° C
Initial tid 2 min
Rate 15 ° C min -1
Afsluttende temp 300 ° C
Sidste gang 6.33 min
Injector (PTV)
Injection Volume 0,5 pi
Tilstand splitless
Purge 2,00 min
Rensestrøm 50,0 ml min-1
Indledende temp 80 ° C
Initial tid 0,02 min
Ramper: Pris 600 ° C min -1
Afsluttende temp 300 ° C
Sidste gang 10 min
Kolonne
Model J & W DB-5MS
Nominel længde 20 m
Nominel diameter 180 um
Nominel lagtykkelse 0.18 pm
Bæregas helium 0,8 ml min-1
MSD Transferline 280 ° C
MSD
Sim-tilstand
MS Source 230 ° C
MS Quad 150 ° C

Tabel 2. Indstillinger for GC / MS. Oversigt over alle indstillinger for GC og MS til quantify fluoren i mikrokosmos opsætninger.

FALDGRUBER KOMMENTAR
1 Indledende vækst og vitalitet tests Undersøgelse væksten af ​​mycelial organisme af valg. Hvor lang tid tager det at nå MMA plaster? Er det hæmmes af cycloheximid barriere? Også kontrollere, om bioreporter celler forblive vital i MMA hele tiden via flettematerialer assays. Hvis ikke, man også kan tilføje en carbonkilde til MMA, som ikke resulterer i bioreporter induktion. Udeluk eventuel gensidig hæmning af bakterier og mycelium.
2 Mycelial vækstrate Vækstraten for mycelial organisme bør ikke være for langsom, for ellers transport af PAH gas-fase stiger med forlænget inkubationstid. Protokollen kan tilpassesat tilføje PAH på et senere tidspunkt, men så igen, kan mycelier på inokuleringspunktet ikke være aktive længere.
3 Bakteriel mobilitet Hvis der anvendes et punkt scanning laser mikroskop og bakteriestammen er bevægelige, registrering og kvantificering af z-stakke kan være umuligt på grund af bevægelse inde i MMA. Således bør bakteriel bevægelse forhindres, fx ved at øge holdbarheden af MMA, ved hjælp af CLSM med en hurtig scanner eller en roterende skive lasermikroskop.
4 Damp-fase transport Dampfase transport af kemikaliet (fx PAH) mod bioreporter celler skal udelukkes tilstrækkelig da bioreporter celler er ekstremt følsomme over for kemikalier i dampfase. Det er det afgørende punkt i hele protokol for at undgå falske positive resultater skyldes gasformig transport. Gasfasenkoncentration kan anslås ved kemisk analyse af Con Air (-) og damp-fase-koncentrationer kan justeres for eksempel ved at tilsætte mere eller mindre agarose pletter med aktiveret carbon.
5 Toksicitet Husk, at høje koncentrationer af det testede kemikalie kan have toksiske virkninger på mycelial organisme og / eller bakterier.
6 Autofluorescens Kontroller, om den valgte mycelial organisme viser nogle autofluorescens i området af den forventede bioreporter signal. Sørg for at tjekke på forskellige stadier vækst siden autofluorescens kan variere 17. Hvis der registreres autofluorescens, skal du sørge for at registrere z-stakke i mycelier-frie områder.
7 Blegning mCherry fluorescens er normalt stabilt og ikke følsomt over for blegning i det anvendte bioreporter celler. I modsætning hertil eGFP bleger temmelig hurtigt. Derfor skal du ikke bruge den eGFP kanal at visualisere prøven før z-stack optagelse.
8 eGFP induktion Vi har bemærket en lav eGFP induktion i SAM forhold til Con POS. Dette forklares med den stærke rumlige begrænsning og lav tilgængelighed af influenza, for at bibeholde koncentrationen meget lav damp-fase af FLU (jf sidste resultater afsnit). Afhængig af den valgte bioreporter stamme og kemiske, kan optagelsen området på PDA 1 varieres for at øge transporthastigheden (figur 5B). Det skal imidlertid tages i betragtning, at dette øger også dampfase transport mod bioreporter celler.
9 Beregning af eGFP rel Metoden til eGFP rel præsenterede beregning, hvor intensiteten af grønne pixels sammenlignestil området af røde pixels er kun en mulighed. Der henvises til diskussionen for yderligere information.
10 Pixelstørrelse Vær opmærksom på, at forstørrelsen af ​​den valgte linse og et potentielt anvendes zoomfaktor påvirke pixel størrelsen på billedet. Dette skal tages i betragtning før billedanalyse.
11 Biotilgængelige fraktioner Husk, at biotilgængeligheden af ​​den transporterede forbindelse vurderes kvalitativt (ikke kvantitativt) via eGFP induktion. Ingen korrelation af den beregnede relative eGFP-induktion og biotilgængelige fraktion blev forsøgt. Dette kan dog blive behandlet i fremtidige ansøgninger.
12 Detektionsgrænser Kemisk sporingsudstyr. For kemisk kvantificering af organiske forbindelser, en bred vifte af koncentioner kan detekteres pålideligt. Vi har registreret beløb i intervallet 0ng og 1,000ng. eGFP kvantificering. Vi sammenlignet relative eGFP induktion i prøver uden forurenende transport (dvs. 0ng transporteres), med mycelium-medieret transport (dvs. mellem 20 og 40 ng transporterede jf figur 4 og 5), og med direkte kontakt til det forurenende kilde (dvs. maksimalt disponible beløb). Disse tre tilfælde vist sig at være godt skelnes med den beskrevne fremgangsmåde. Men vi kan ikke gøre en mere detaljeret redegørelse for løsningen af ​​den relative eGFP induktion. Dette problem kan løses i fremtiden ved at sammenkæde forskellige forurenende beløb med den korrelerende eGFP induktion i mikrokosmos opsætninger.
13 Petriskål materiale Plastic petriskåle kan resultere i en undervurdering af mycelial PAH translokationen og / eller biotilgængelighed. Dette bør ikkevære problematisk, hvis kvalitative udsagn stræbte. I tilfælde kræves præcise kvantitative målinger, anvendelse af glas petriskåle bør overvejes trods forberedelse og håndtering vil være mere besværligt.

Tabel 3. Diskussion af mulige faldgruber. Mulige faldgruber før og under forsøget og foreslåede kommentarer og muligheder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De præsenterede mikrokosmos setup viste sig egnet til at studere biotilgængelighed af rumligt adskilte kemikalier for nedværdigende organismer efter optagelse og transport af mycelium. Potentiel transport af delvist flygtige forbindelser gas-fase forhindres og bakterielle bioreporter celler kan visualiseres uden omfattende prøveforberedelse og dermed med minimal forstyrrelse af følsomt system. Samtidig kan let udføres kemisk analyse af prøven tillader en god kontrol af de opnåede resultater, og til kvantificering af den samlede transport. Nogle punkter må imidlertid overvejes nøje før og mens de udfører eksperimentet. Et vigtigt punkt er at holde mikrokosmos fri for bakterielle eller kemiske cross forureninger. Det kan være en udfordring, da mange mikrokosmos køres parallelt og dermed er store inkubation kamre (f.eks desiccators), der kræves. Derfor er det afgørende at sterilisere alle dele grundigt, før opsætningen konstruktion. Et andet kritisk punkt kan være anvendelsen af ​​plast petriskåle til mikrokosmos. Selv PAH og bioreporter ikke kommer i direkte kontakt, kan en vis mængde af PAH absorberes af plastmaterialet. Men vi mener, det ikke problematisk for den beskrevne protokol, da dette ville resultere eventuelle i en undervurdering af mycelial PAH-translokationen og / eller biotilgængelighed. I hvert fald hvis præcis kvantificering er påkrævet, bør det overvejes at udveksle plastdelene med glas dele, selv om håndtering vil være mere besværligt. Andre punkter, der bør overvejes inddrage det udvalgte bakterielle og fungale stammer (mulig gensidig hæmning, vækstrate, mobilitet og eventuel autofluorescens), de valgte kemikalier (toksiske effekter på mikroorganismer, volatilitet, detektionsgrænser) og praktiske aspekter (blegning, begrænsning af eGFP induktion og beregning af eGFP rel). Et resumé af de potentielle faldgruber og respektive kommentarer kan findes iTabel 3.

Vi brugte denne model mikrokosmos setup at demonstrere mycelial FLU transport og efterfølgende bakteriel nedbrydning i umættet system, direkte på en celle-mycelia interaktion niveau. Vores model set-up kan varieres og tilpasses til at opfylde forskellige behov med forskellige bakterielle og fungale stammer, kemiske forbindelser, etc. Således kan systemet bruges for eksempel (i) at vurdere indflydelsen af mycelium på bakterier i nærværelse af en anden måde begrænset kemisk (f.eks, toxic) kilde, (ii) til at forudsige påvirkningen af mycelier på biotilgængeligheden af forbindelser for bakteriel nedbrydning, (iii) at undersøge forurenende biotilgængelighed afhængigt af afstanden af bakterier til transport vektor eller (iv) at undersøge effekten af forskellige kemiske kilder (f.eks krystallinsk, i jord eller opløst). Imidlertid tilpasning af systemet til enlternate betingelser vil være sart og skal gennemføres trinvis for at opnå klare resultater. Hidtil har vi ikke testet for andre bakterielle eller fungale stammer og andre forbindelser end PAH. Da vides myceliske netværk også til at transportere andre forurenende stoffer end PAH ligesom pesticider 19 eller opløselige stoffer som salicylat 20, mener vi dog, at systemet kan udvides til forskellige kemiske forbindelser givet en forbindelse-specifik bakteriel biosensor.

Bemærk, at afhængigt af den anvendte bioreporter belaste en anden beregning af eGFP rel kunne være at foretrække. I stedet for ligning (1) følgende to muligheder kunne anvendes:

Ligning 2 (2)

Ligning 3 (3)

HoweveR, i den præsenterede protokol ligning (1) blev valgt på grund af følgende årsager: (i) eGFP intensitet blev rapporteret at korrelere med PAH flux til cellen 14 henviser (ii) mCherry blev rapporteret at vise betydelige variationer for forskellige celler 13 . Ligning (2) og (3), derimod, kan vælges til at forhindre falske oplysninger fra potentielle lys artefakter i prøven. I alle tilfælde, vi sammenlignet alle tre beregningsmetoder med hinanden, hvorved der kunne findes ingen statistisk signifikante forskelle. Stadig på grund af de indberettede variationer i fluorescens intensitet mCherry, anbefaler vi at bruge ligning (1) eller (2).

I sidste ende bør nogle begrænsninger af teknikken overvejes. Da mikrokosmer blev designet til at forhindre gas-fase transport af den testede forbindelse, er mycelial optagelse af forbindelsen reduceres. Dette resulterer i lavere transportpriser end man ville forvente med uhindret optagelse. Derfor følsomhed Bioreporter stamme skal være høj nok til at detektere små ændringer i biotilgængelige fraktioner. Endvidere vil opsætningen sandsynligvis ikke være egnet til svampestammer med lav vækst. I dette tilfælde kan langvarig inkubation favorisere gasfase-transport af det forurenende stof således fører til falsk-positive resultater. Det kan være muligt at ændre opsætningen på en måde, som det forurenende stof kan påføres på et senere tidspunkt. Imidlertid kan hyfer derefter allerede inaktive eller død på indpodningsstedet. Endelig, som angivet ovenfor, vifte af kemiske forbindelser, som transporteres med myceliske net er stor. Tilgængeligheden af ​​en passende bioreporter stamme, kan dog være en begrænsende nøglefaktor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal Microscope Leica TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM
GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD Agilent an equivalent GC/MS may be used
GC capillary column J&W 121-5522              Agilent
Cork borer Fisher Scientific 12863952 or any other
Cover slips Marienfeld 107222 High performance, No.1.5H
GC/MS insterts WICOM WIC 47080
GC/MS vials 2 ml WICOM WIC 41150
Lids / septa for screw cap vials DIONEX 49463 / 049464 
Lids for GC/MS vials WICOM WIC 43948/B
Objective Slides Menzel ordinary
PDMS coated glass fibers Polymicro Technologies, Inc. V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1
Petri Dishes small / big Greiner 633-102 / 628-102
Screw cap vials 40 ml DIONEX 48783 other glass vials may be used
Screw cap vials 60 ml DIONEX 48784 other glass vials may be used
Acenaphthylene d08 Dr. Ehrenstorfer C 20510100
Acetone Carl Roth 9372.2
Activated carbon Sigma-Aldrich 242276-1kg
Agarose Carl Roth 2267.4
Fluorene Fluka 46880
Kanamycin sulfate Carl Roth T832.2 50 mg L-1
Methanol Carl Roth P7171
Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest
Solution 1
Ammonium sulfate Carl Roth 3746.1 5 g L-1 
Magnesium chloride x 6 H2O Carl Roth 2189.1 1 g L-1
Calcium nitrate x 4 H2O Carl Roth P740.1 0.5 g L-1
Solution 2
Disodium phosphate Carl Roth P030.1 55.83 g L-1
Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1 20 g L-1
Solution 3 (pH 6.0)
Disodium EDTA MERCK 1084180250 0.8 g L-1
Iron(II) chloride x 4 H2O MERCK 1038610250 0.3 g L-1
Cobalt(II) chloride x 6 H2O Carl Roth T889.3 4 mg L-1
Manganese(II) chloride x 1 H2O Carl Roth 4320.2 10 mg L-1
Copper(II) sulfate Carl Roth P023.1 1 mg L-1
Sodium molybdate x 2 H2O Carl Roth 0274.1 3 mg L-1
Zinc chloride MERCK 1088160250 2 mg L-1
Lithium chloride Carl Roth P007.1 0.5 mg L-1
Tin(II) chloride x 2 H2O Carl Roth 4473.1 0.5 mg L-1
Boric acid Riedel-de-Haen              11606 1 mg L-1
Potassium bromide Carl Roth A137.1 2 mg L-1
Potassium iodide Carl Roth 6750.1 2 mg L-1
Barium chloride Carl Roth 4453.1 0.5 mg L-1
MMA Minimal medium + agarose 0.2%
Phenanthrene d10 Dr. Ehrenstorfer C 20920100
Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8
Potato Dextrose broth Difco/ Beckton Dickinson 254920
Bacto-agar Difco/ Beckton Dickinson 214040
Sodium acetate x 3 hydr. Carl Roth 6779.1
Sodium sulfate MERCK 1066495000
Toluene MERCK 1083252500
mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl
Yeast extract Merck 1037530500
Tryptone Serva 4864702
Sodium chloride Carl Roth 3957.1
ImageJ with logi tool plugin http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum strain 67-1 Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland
Burkholderia sartisoli RP037-mChe Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
  2. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
  3. Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
  4. Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
  5. Griffin, D. M. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. Soil Science Society of America. 141-151 (1981).
  6. Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. Soil Science Society of America. 1-22 (1981).
  7. Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
  8. Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
  9. Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
  10. Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
  11. Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
  12. Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
  13. Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
  14. Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
  15. Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
  16. Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. Manual of methods for general bacteriology. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).
  17. Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  19. Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).
  20. Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
A Whole Cell Bioreporter tilgang til Vurdere Transport og biotilgængelighed organiske forureninger i vand Umættede Systems
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).More

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter