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Environment

Une approche Cell biorapporteur entières pour évaluer transport et la biodisponibilité des contaminants organiques dans les systèmes insaturés eau

doi: 10.3791/52334 Published: December 24, 2014

Summary

Toute une analyse de biorapporteur cellulaire avec Burkholderia sartisoli RP037-MCHE a été développé pour détecter fractions d'un contaminant organique (par exemple, le fluorène) disponible pour la dégradation bactérienne après le transport actif par mycéliums de pontage des pores remplis d'air dans un système de modèle insaturé de l'eau.

Introduction

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Le sol est densément peuplé par une large gamme de micro-organismes tels que les bactéries 1,2. Cependant, les conditions dans cet habitat sont difficiles, notamment en termes de disponibilité de l'eau 3. Les bactéries ont besoin en permanence à la recherche de conditions optimales dans des environnements hétérogènes quatre, mais l'absence de films d'eau continues se traduit par une mobilité restreinte 5 les empêchant de se propager librement. En outre, les taux de diffusion de solutés (par exemple, les éléments nutritifs) sont abaissés dans des conditions insaturés 6. Ainsi, les bactéries et les nutriments sont souvent physiquement séparés et l'accessibilité des éléments nutritifs est limitée 3. Par conséquent, un vecteur de transport pour des composés chimiques qui ne nécessite pas une phase aqueuse continue peut aider à surmonter ces limitations. En fait, de nombreux micro-organismes tels que les champignons et oomycètes ont développé une forme de croissance filamenteuse leur permettant de se développer à travers les pores remplis d'air et atteindre ainsi mobilizing aussi physique nutriments 7 et 8 substances carbonées séparé sur de longues distances. Ils peuvent même agir comme des vecteurs de transport biologiques qui fournissent des sucres et d'autres sources d'énergie à 9 bactéries. Absorption et le transport dans les organismes de mycélium a également été montré pour les polluants organiques hydrophobes tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) dans Pythium ultimum 10 ou à 11 champignons mycorhiziens. Depuis HAP sont des contaminants solubles dans l'eau omniprésents et mal 12 dans le sol, le transport de mycélium médiation pourrait aider à augmenter la biodisponibilité des contaminants bactériens pour dégradeurs potentiels. Considérant que le montant total de transport de contaminants peut être quantifiée directement par des moyens chimiques 10, la biodisponibilité des contaminants transportés par mycélium bactéries dégradant et d'autres organismes ne peut être évaluée facilement.

Le protocole suivant présente une méthode pour évaluer l'impact de mycelia sur la biodisponibilité des contaminants bactériens à dégradeurs d'une manière directe; il permet la collecte d'informations sur l'impact spatio-temporelle des contaminants sur les écosystèmes microbiens. Nous décrivons comment mettre en place un système de microcosme insaturé élaborée imitant interfaces air-eau dans le sol en reliant une source ponctuelle de HAP séparés physiquement avec biorapporteur bactéries HAP dégradants par des vecteurs de transport mycéliens. Parce que le transport aérien est exclu, l'effet du transport mycélium basée sur les HAP biodisponibilité pour les bactéries peut être étudié de manière isolée. Dans le détail, le RP037-MCHE de trois anneaux HAP fluorène, l'organisme mycélium Pythium ultimum et de la bactérie Burkholderia biorapporteur 13 ont été appliquées dans les configurations décrites microcosme. La bactérie B. sartisoli RP037-MCHE a été construit pour étudier phénanthrène flux à la cellule 14 et exprime améliorées protéine fluorescente verte (eGFP) à la suite de la HAP aux fluxla cellule, alors que la fluorescence rouge mCherry est exprimé de façon constitutive. Des informations détaillées sur la construction rapporteur est donnée par Tecon et al. 13 Dans les tests préliminaires, la bactérie n'a pas révélé de natation et seulement la capacité d'essaimage très lent. Il a été en mesure de migrer lentement hyphes de Pythium ultimum lorsqu'il est appliqué comme une suspension dense sur le dessus des hyphes. Comme les bactéries ont été intégrés dans l'agarose dans le protocole suivant, la migration sur les hyphes n'a pas eu lieu.

En utilisant la microscopie confocale à balayage laser (CLSM), les bactéries biorapporteur peuvent être visualisées directement dans les microcosmes et l'expression de eGFP peut être quantifiée par rapport à la quantité de cellules (proportionnelle au signal mCherry) à l'aide de la ImageJ logiciel. Ce permet de comparer la biodisponibilité qualitativement différents scénarios (ce est à dire, supérieur ou inférieur). FLU est révélée être biodisponible après le transport du mycélium de P. ultimum (ie, ilétait plus élevé que dans un contrôle négatif). En outre, le protocole décrit comment quantifier la quantité totale de transport de mycélium à médiation par des moyens chimiques et de vérifier la biodisponibilité des contaminants en utilisant des fibres de verre revêtu de silicium (fibres SPME) dans des microcosmes identiques. Résultats en utilisant cette configuration microcosme ont été publiés et discuté pour la combinaison de P. ultimum, le fluorène et B. sartisoli RP037-MCHE 15. Ici, l'accent est mis sur une description détaillée de la méthode et l'identification des pièges potentiels du protocole de fournir cette connaissance pour d'autres applications potentielles. D'autres applications peuvent impliquer différents fongique, espèces bactériennes (par exemple, provenant de sites contaminés), et d'autres contaminants (par exemple, les pesticides) ou d'un contaminant d'alimentation (par exemple, les sols âgés).

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Protocol

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1. Préparation de plats, des diapositives et incubation Chambers

  1. Préparer le matériel suivant pour chaque microcosme: une grande boîte de Petri en plastique inférieure (d = 10 cm), une modification (voir l'étape 1.2) petite boîte de Petri en plastique inférieure (d = 5 cm) avec des couvercles et une chambre de comptage diapositive avec trois cavités.
  2. Prenez le nombre désiré de Petri parties inférieures plat (d = 5 cm). Enlever une partie du bord avec une scie pour se adapter exactement une diapositive (26 mm de longueur d'arête). Pour stériliser le système, faire tremper Petri fond plat et les couvercles dans 70% d'éthanol O / N et les sécher pendant au moins 2 heures dans une hotte à flux sous lumière UV. Rangez les boîtes de Pétri dans un récipient en plastique hermétiquement fermés, qui avait également été exposés à la lumière UV pendant 2 h.
  3. Essuyez le nombre désiré de diapositives avec 70% d'éthanol et de les sécher à l'air. Enveloppez les lames dans du papier d'aluminium et les mettre dans un four à moufle pendant 5 heures à 450 ° C pour éliminer d'éventuelles contaminations. Préparer chambres d'incubation de verre munis de couvercles. Nettoyez-les avec 70% d'éthanol et d'exposer chambres ouvertes à la lumière UV pendant au moins deux heures dans une hotte à flux.
    NOTE: Pour les dessiccateurs (diamètre d'environ 30 cm) avec des couvercles peut être utilisé à cet effet; chaque dessiccateur peut accueillir jusqu'à dix configurations de microcosme.

2. Préparation des milieux et cultures

  1. Pour exécuter 20 microcosmes parallèles, obtenir 100 ml de milieu tryptone-levure modifiée (MTY) 14, environ 150 ml de 21C milieu minimal 16 (MM), 5 ml de milieu agar minimal (MMA; 0,5%, p / v), trois des plaques de gélose de dextrose de pomme de terre (PDA; 1,5%, p / v) pour P. ultimum, quatre plaques vierges, une plaque de PDA contenant 2 mg L -1 cycloheximide, quatre plaques d'agarose (3%, poids / volume) contenant 0,3 g ml -1 charbon actif et 40 mg de la grippe en deux parties mg.
  2. Préparez MTY contenant 50 mg L -1 de kanamycine (kanamycine est required pour maintenir la eGFP plasmide rapporteur) et MM contenant de l'acétate 10 mM pour la culture bactérienne. Utilisez MM sans l'acétate de préparer 0,5% de MMA pour l'immobilisation des bactéries dans les microcosmes et versez plaques (chacune 20 ml) de 1,5% PDA pour la culture de Pythium ultimum et le microcosme configurations.
  3. Inoculer un certain hyphes de P. ultimum sur trois plaques de PDA frais et incuber dans l'obscurité à 25 ° C pendant environ 72 heures. Puis assurer que les plaques sont envahies par mycélium complètement fraîche et mousseuse.
  4. Lancer deux cultures de B. sartisoli RP037-MCHE dans 50 ml de MTY à partir d'un stock de glycérol. Incuber à 30 ° C avec 230 rpm mouvement rotatif ballon O / N.
  5. culture de mesurer la densité optique (DO) à 578 nm et centrifuger à 1000 g pendant 10 min (pour RP037-MCHE B., l'OD prévu 578 est d'environ 1,0 et les cellules sont en phase exponentielle). Rejeter le surnageant et remettre en suspension les cellulesdans une quantité appropriée de MM pour atteindre une DO 578 de 0,4. Inoculer 20 ml de MM contenant 50 mg L -1 kanamycine avec 400 pi des cellules remises en suspension. Incuber à 30 ° C avec 230 rpm mouvement rotatif ballon O / N.
  6. Mesurer OD 578 de la culture MM (pour RP037-MCHE B., l'OD prévu 578 est d'environ 0,2 et les cellules sont en phase exponentielle précoce). culture Centrifuger à 2000 xg pendant 10 min et remettre en suspension les cellules dans une quantité appropriée de MM pour atteindre une DO de 0,4. Mélanger 50 ul de la suspension cellulaire avec 500 pi de chaud, MMA liquide dans tubes de 2 ml et conserver à 50 ° C jusqu'à l'utilisation. Utilisez 150 pi de cellules dans le MMA pour chaque microcosme.
  7. Pour des plaques de gel d'agarose contenant du charbon actif. Faire fondre agarose (3%; p / v) dans de l'eau distillée deux fois. Mélanger soigneusement avec du charbon actif (0,3 g ml -1) et versez le mélange dans des boîtes de Petri en plastique(D = 10 cm).

3. Microcosm montage

NOTE:. La configuration complète de microcosme est représenté schématiquement à la figure 1 Se il vous plaît se référer à la figure 1 pour toutes les mesures individuelles suivantes. Les étapes suivantes décrivent la préparation d'un échantillon (SAM) avec des vecteurs de transport mycéliens et trois configurations de contrôle différents (CON AIR, CON NEG, CON POS). Un résumé de toutes les différentes configurations peut être trouvé dans le tableau 1.

  1. Prenez nombre désiré de boîtes de Pétri et les diapositives et de les exposer à la lumière UV sous une hotte à flux pendant 30 min.
  2. Placez la petite boîte de Petri à l'intérieur du grand et ajuster la diapositive à travers la fente de la petite boîte de Petri. Prélever un échantillon de la suspension cellulaire chaud en MMA et ajouter 150 ul dans la cavité milieu d'une diapositive. Répétez cette étape jusqu'à ce que les cavités moyennes de toutes les diapositives sontrempli de MMA. Attendez 5 min pour le MMA se solidifier.
  3. Utilisez un perce-bouchon de 1 cm à punch out taches circulaires d'une plaque de PDA vide. Placer une pièce à une distance de 2 mm à côté de l'intérieur du MMA petite boîte de Petri. Ajouter ce pour favoriser la croissance du mycélium dans la configuration (PDA 3 sur la figure 1).
  4. Couper les correctifs de PDA courbes que des barrières mécaniques. Utilisez une partie inférieure petite boîte de Petri propre et stérile et l'enfoncer dans une plaque de PDA. Utilisez une spatule pour couper un autre petit anneau à une distance de 0,5 cm dans la gélose qui se traduit par un PDA-anneau.
    1. Découpez un morceau, ce qui correspond exactement à l'écart de la petite boîte de Petri dans la configuration du microcosme et le placer dans l'espace au-dessus de la diapositive. Se assurer que la distance entre le MMA et le pare-PDA circulaire est d'environ 2 mm. Fermez le couvercle de la petite boîte de Petri appuyant doucement dans la barrière de PDA.
    2. Répéter les étapes 3.4 et 3.4.1 avec une plaque de PDA contenant 2 g L -1de cycloheximide.
      NOTE: Ce est la configuration de contrôle pour le transport aérien (CON AIR) vers les cellules de biorapporteur, depuis mycélium sont inhibés par le cycloheximide et ne envahissent pas MMA.
  5. Utilisez un perce-bouchon de 1 cm à punch out taches circulaires d'une plaque de PDA vide. Utilisez un autre perce-bouchon de 0,5 cm pour découper le milieu du premier patch. Placez le petit PDA torique résultant à une distance de 1 mm à côté de la barrière de PDA (assistant personnel 1 sur la figure 1).
  6. Ajouter 2 mg de la grippe dans le trou du PDA 1. Utilisez un 1 cm perce-bouchon à découper taches circulaires de plaques de PDA envahis par P. ultimum et placez un patch (PDA 2 de la figure 1) en bas vers le bas sur l'anneau de PDA afin que le mycélium est confrontée à des cristaux de grippe.
    1. Répétez l'étape précédente sans ajouter cristaux de grippe.
      NOTE: Ce est la configuration de contrôle négatif (CON NEG) pour déterminer fondfluorescence des cellules biorapporteur.
  7. Utilisez un perce-bouchon de 1 cm à punch out taches circulaires de l'agar contenant du charbon actif. Placez quatre correctifs dans chaque configuration de microcosme pour diminuer encore la concentration de GRIPPE gazeux (Figure 1).
  8. Préparer un contrôle positif (CON POS). Ajoutez quelques cristaux de Grippe À 200 pi de MMA suspension cellulaire et le mettre dans une cavité d'un diaporama vide.
  9. Placer une boîte de Petri (d = 10 cm) avec de la poudre de charbon actif sur le fond de la chambre d'incubation pour réduire au minimum la concentration de FLU gazeux dans la chambre. Aussi, placer quatre à cinq 50 ml béchers avec de l'eau stérile sur le fond de maintenir une forte humidité dans la chambre.
    1. Transfert configurations de microcosme dans les chambres d'incubation et incuber à 25 ° C pendant 96 heures. Placer les échantillons au hasard dans les différentes chambres de croissance pour excluent les effets de localisation.
      NOTE: Ce ap temps d'incubationnappes à l'P. oomycète ultimum. Il pourrait être différente pour d'autres organismes.

4. confocale à balayage laser

  1. Idéalement utiliser une configuration CLSM avec microscope droit.
    NOTE: Il peut être équipé avec des lasers conventionnels offrant par exemple, 488, 561 et 633 lignes nm pour l'excitation ou avec une source laser accordable blanc.
  2. Utilisez les paramètres suivants pour la collecte d'images: Excitation: 490 nm (eGFP) et 585 nm (mCherry) à l'intensité du laser approprié (excitation simultanée); fourchettes d'émissions: de 500 à 550 nm (eGFP) et de 605 à 650 nm (mCherry); objectif: 63X NA 0,9 immergé de l'eau (en raison de sa longue distance de travail); taille de pas pour Z-piles: 0,5 um.
  3. Configuration microcosme Ouvrir et utiliser un scalpel pour enlever PDA 1, 2, 3 et la barrière PDA. Mettez une lamelle de verre sur le dessus de la MMA et appuyez doucement pour éliminer les bulles d'air. Mont diaporama sur scène de microscope. Ajouter une goutte d'eau sur le dessus de ee lamelle et utiliser les paramètres mCherry pour trouver cellules biorapporteur dans l'échantillon.
  4. Obtenez un aperçu rapide de l'échantillon et d'optimiser le rapport signal sur bruit en utilisant un canal lueur-dessus-dessous table de consultation pour le rouge (mCherry) et vert (eGFP). Choisissez une position aléatoire sur l'échantillon à analyser fluorescence biorapporteur.
    REMARQUE: hyphes peut montrer autofluorescence dans la gamme des émissions de biorapporteur (par exemple, auto-fluorescence verte) 17. Ne oubliez pas de sélectionner des zones sans hyphes si ce est le cas.
  5. Définir et enregistrer z-piles pour chaque position dans le vert (eGFP) et le (mCherry) canal de rouge. Évitez blanchiment de l'échantillon par une longue exposition à la lumière de épifluorescence ou la lumière laser.
    1. Répétez étape précédente pendant dix positions hasard, également répartie.
  6. Répétez toutes les étapes en utilisant les mêmes paramètres pour tous les échantillons de la piste d'essai (SAM), CON AIR, CON NEG et CON POS.
  7. Analyse 5. Image

    REMARQUE: Pour analyser rouge (mCherry) et vert (eGFP) fluorescence dans les z-piles enregistrées, entre autres options la ImageJ du logiciel libre 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) peut être utilisé.

    1. Veillez à installer le plugin logi_tool (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/).
    2. Ouvrir le fichier dans ImageJ. Sélectionnez «canaux split" et canal vert à proximité. Utilisez la «zone mCherry 'macro fourni sous forme de fichier de code supplémentaire pour quantifier domaine de la fluorescence rouge en z-stack. Réglez les paramètres préférés dans la macro (indiquées en gras).
      1. La sortie est un tableau avec les pixels mesurées dessus du seuil (et au-dessus de la taille minimale définie) dans la pile z.
        NOTE: La somme de toutes les valeurs est le nombre total de pixels rouges (région) dans la pile.
    3. Ouvrir le fichier dans ImageJ. Sélectionnez «canaux split" et le canal rouge proche. Utilisez la macro 216; eGFP int 'fourni sous forme de fichier de code supplémentaire pour quantifier l'intensité de la fluorescence verte dans la pile z. Réglez les paramètres préférés dans la macro (indiquées en gras).
      1. La sortie est un tableau avec les intensités moyennes et de la zone de tous les objets verts-dessus du seuil (et au-dessus de la taille minimale définie) en z-stack. Pour calculer l'intensité totale de pixels verts dans la pile, multiplier chaque intensité par la zone correspondante signifie.
    4. Calculer l'induction eGFP relative (eGFP rel):
      Equation 1 (1)
      Remarque: Comme mCherry est exprimée de manière constitutive, la valeur résultante de eGFP rel est une mesure relative de la quantité de eGFP exprimée par un certain nombre de cellules. Se il vous plaît se référer au tableau 3 pour plus d'informations sur le calcul des eGFP rel.
    TLE "> 6. Quantification chimique

    REMARQUE: les configurations de Microcosm peuvent également être utilisés pour effectuer la quantification chimique de translocation montants GRIPPE avec ou sans un dissipateur contaminant abiotique.

    1. Enveloppez 15 ml des flacons en verre, flacons / MS 1 ml de GC et inserts en feuille d'aluminium. Remplissez évaporation plats avec Na 2 SO 4; placer tous dans le moufle pendant 5 heures à 450 ° C pour éliminer d'éventuelles contaminations. Rangez le Na 2 SO 4 à l'intérieur d'un dessiccateur activé.
    2. Couper fibres de verre enduit PDMS dans 0,5 cm de longueur. Laver fibres en secouant quatre fois 2 heures dans du méthanol frais. Répétez étapes de lavage, un autre quatre fois à l'eau ultra pure et de fibres propres magasins dans l'eau ultra pure dans un flacon de verre scellé.
    3. Préparer 1,5 L de toluène / acétone (3: 1, v / v) contenant 10 pg L -1 phénanthrène-d 10.
    4. Effectuer les étapes 1, 2 et 3 du protocole. Préparer microcosmes sans biorcellules eporter pour étudier le transport GRIPPE (SAM (-) et CON AIR (-)) et avec des cellules biorapporteur (SAM) de vérifier la dégradation de la grippe.
      1. En option (sans cellules biorapporteur): Placez trois PDMS revêtus fibres de verre (habituellement utilisés pour des expériences de SPME) que évier contaminant artificielle et quantifiable l'intérieur MMA de la SAM (-) à l'aide de pinces fines.
      2. Enlever les fibres de verre en utilisant une pince fine et de transférer chacun dans un GC / MS flacon avec insert.
      3. Ajouter 200 pi de toluène et secouer verticalement O / N et d'analyser par GC / MS. Utilisez les paramètres fournis dans le tableau 2.
    5. Transfert MMA de la cavité dans un milieu 15 ml flacon en verre et ajouter environ trois spatules de Na 2 SO 4. Bien mélanger avec une spatule et ajouter 10 ml de solvant. Vortex le mélange et secouer horizontalement O / N dans l'obscurité.
      1. Transférer 1001; l d'échantillon dans GC / MS flacon avec insert. Ajouter 10 pi de acénaphtylène-d 08 (10 mg L -1) et d'analyser par CG / MS en utilisant le même programme que décrit au point 6.4.3.

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Representative Results

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Les résultats présentés ici ont déjà été publiés plus tôt 15. Se il vous plaît se référer à l'article de discussion mécaniste et environnementale détaillée.

Après l'enregistrement d'image par CLSM, une projection d'intensité maximale peut être réalisée en utilisant le logiciel de microscope respective ou ImageJ pour gagner une première impression visuelle de l'échantillon et les contrôles (figure 2). Plus tard, les ensembles de données peuvent être projetés différemment pour montrer des caractéristiques significatives par des logiciels spécifiques de visualisation. Le contrôle positif (CON POS) montre l'induction eGFP distincte (figure 2A), alors que le contrôle aérien (CON AIR) ne présente fond eGFP fluorescence (figure 2B). eGFP fluorescence dans l'échantillon d'essai (SAM) semble être élevée par rapport à CON AIR, yet pas aussi marquée que CON POS (figure 2C). La fluorescence mCherry est indépendant de la dégradation des HAP et donc similaire pour tous les échantillons. Cependant, les signaux eGFP peu élevées ne seront pas détectés par cette méthode et l'analyse d'image suivante est essentielle.

Pour les microcosmes testés, inspection visuelle a été complétée par l'analyse d'images et le calcul de l'induction par rapport eGFP (cf. étape 5 et suivants du protocole; Figure 3). Le fond vert fluorescence pour B. non induit sartisoli RP037-MCHE est calculé avec CON NEG. Dans les conditions indiquées, l'induction par rapport eGFP a été jugée rel eGFP = 0,53. Aucune différence significative n'a pu être détectée entre CON NEG et CON AIR (rel eGFP = 0,54; p> 0,95) excluant ainsi tout transport FLU en phase vapeur vers les cellules de biorapporteur. Pour CON POS, très élevée induction eGFP (eGFP rel = 53,7) a été trouvé confirmant la vitalité des cellules de MMA après 96h et représentant l'induction maximale eGFP. En présence de mycélium et de la grippe (SAM), eGFP a été induite de manière significative dans les cellules par rapport aux contrôles négatifs (rel eGFP = 1,15; p <0,001). Cependant, l'induction eGFP est relativement faible par rapport au contrôle positif (cf. tableau 3, point 8).

Transport de la grippe par le mycélium de P. ultimum dans la configuration du microcosme a été quantifiée chimiquement (cf. étape 6 et suivants du protocole; Figure 4). En présence de la grippe et P. ultimum (SAM (-)), mycélium transsitué à environ 25 ng de la grippe dans les 96h qui équivaut à un taux de 37.5pmold -1 cm -1 de transport. Commandes en l'absence de mycélium (CON AIR (-)) ont révélé transport GRIPPE gazeux dans le MMA dans la gamme de seulement 2ng sein 96h, ce est à dire, l'induction de la biorapporteur par phase vapeur-concentrations pouvait être exclue. Lorsque B.sartisoli RP037-MCHE était présent (SAM), <1 ng de la grippe a été détectée dans le patch MMA. Cette dégradation effective vérifié FLU bactérienne suite à la translocation de mycélium médiation.

Il est possible d'étudier l'influence de la dégradation bactérienne, ce est à dire, d'un évier de grippe, la grippe translocation en ajoutant un évier contaminant abiotique au système (cf. étape 6.4.1 et suivants du protocole). Ainsi, on est en mesure de quantifier le montant de la grippe absorbée par les fibres et le montant laissé à l'intérieur de la MMA et hyphes sus-jacente. Pour SAM(-), La quantité totale de translocation est indépendant de la présence d'un contaminant évier (p> 0,9; figure 5A). Cependant, un microcosme avec augmentation de la surface d'absorption GRIPPE a également été testé comme décrit en détail plus tôt 15. Là, une augmentation significative de la quantité de FLU translocation n'a pu être détecté (figure 5B).

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique et des photos de l'installation complète de microcosme. Vue du haut (A) et du côté (B). Tous les patchs de gélose ont été placées sur une lame avec trois petites cavités. Deux mg de cristaux de GRIPPE ont été placés à l'intérieur d'une cavité (d = 5 mm) dans le milieu de PDA PDA 1. 2 était fraîchement envahi par les hyphes de P. ultimum face PDA 1. Un morceau de PDA incurvée a été placée entre le PDA et le patch 2 MMA créer une barrière FLU mécanique avec le couvercle d'une boîte de Petri (d = 5 cm). Quatre parcelles d'agar contenant du charbon actif ont été placés dans la configuration de diminuer encore la concentration de FLU gazeux. Photos du microcosme complète de haut (C) et vue en diagonale (D) sans micro-organismes et la grippe. Figures 1A et 1B ont été modifiés avec la permission de Schamfuss et al. 15 Adapté avec la permission de Schamfuss, S. et al. Incidence de mycélium bactéries sur l'accessibilité des fluorène aux HAP dégradant. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Droit d'auteur (2013) American Chemical Society. Se il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. projections intensité maximale de micrographies confocale à balayage laser. Micrographies sont la visualisation de l'induction mCherry eGFP et de la bactérie B. biorapporteur sartisoli RP037-MCHE en MMA. Lorsque les bactéries ont été en contact à une source de la grippe cristallin en MMA (CON POS; A), le signal eGFP est élevé par rapport aux témoins (CON AIR; B). Les échantillons de la grippe et P. ultimum (SAM; C) montrent également un signal eGFP élevée, mais moins marquée que le contrôle positif. est exprimé de façon constitutive mCherry et sert donc un contrôle visuel pour détecter des cellules. (Grossissement 630X, bar 20 um). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

"Fo: keep-together.within-page =" always "> Figure 3
Figure 3. relative induction eGFP dans B.sartisoli RP037-Che pour CON NEG, CON AIR et SAM avec mycélium et de la grippe. Comparaison de la eGFP induction relative (eGFP rel) par B.sartisoli RP037-Che après 96h en l'absence de la grippe (CON NEG), en présence de la grippe, mais absence de P.ultimum (CON AIR) et en présence de deux grippe et P.ultimum (SAM). Des différences statistiquement significatives à CON NEG sont marqués par un astérisque. Les expériences sont réalisées en triple indépendants pour CON AIR et CON NEG, respectivement. Un échantillon a été testé pour CON POS et eGFP rel a été calculé avec 53,7. Ce chiffre a été modifié avec la permission de Schamfuss et al. 15 Adapté avec la permission de Schamfuss, S. et al. Incidence de mycélium sur l'accessibilité des fluorène aux bactéries dégradant les HAP. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Droit d'auteur (2013) American Chemical Society.

Figure 4
. (. Cf figure 1) Figure 4. GRIPPE chimique de quantification des quantités totales de la grippe en ng extrait de la pièce MMA après 96h pour le transport en phase vapeur sans cellules (CON AIR (-)), mtransports ycelial sans cellules (SAM (-)) et le transport avec des cellules de mycélium (SAM). Ce chiffre a été modifié avec la permission de Schamfuss et al. 15 Adapté avec la permission de Schamfuss, S. et al. Incidence de mycélium sur l'accessibilité des fluorène aux bactéries dégradant les HAP. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Droit d'auteur (2013) American Chemical Society.

Figure 5
Figure 5. GRIPPE chimique quantification dans la présence d'un contaminant évier abiotique (A) Les quantités totales de la grippe en ng extrait de la pièce MMA après 96h pour le transport du mycélium avec ou sans évier contaminant artificielle (SAM (. (Cf figure 1). - ) avec ou sans co PDMSfibres ATED). (b) Même résultats pour une piste d'essai varié avec augmentation de la surface d'absorption de GRIPPE mycélium. Ce chiffre a été modifié avec la permission de Schamfuss et al. 15 Adapté avec la permission de Schamfuss, S. et al. Incidence de mycélium sur l'accessibilité des fluorène aux bactéries dégradant les HAP. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Droit d'auteur (2013) American Chemical Society.

Nom GRIPPE Mycélium Cellules Application Commentaires
SAM + + + CLSM
GC / MS
SAM (-) + - GC / MS également possible avec PDMS fibres que l'évier contaminant artificielle
CON AIR + (+) + CLSM mycélium que de plus en plus jusqu'à PDA barrière; MMA ne sont pas couverts
CON AIR (-) + (+) - GC / MS mycélium que de plus en plus jusqu'à PDA barrière; MMA ne sont pas couverts
CON NEG - + + CLSM
CON POS + - + CLSM cellules sont directement exposés à cristaux DE LA GRIPPE

Tableau 1. Aperçu de tous les types d'échantillons Résumé de tous les échantillons de contrôle et de test, y compris l'application (dosage de biorapporteur - CLSM ou la quantification chimique - GC / MS). Et Composition (FLU, mycélium et les cellules biorapporteur).

Four
Température initiale 50 ° C
Temps initial 2 min
Taux 15 ° C min -1
Température finale 300 ° C
Temps final 6,33 min
Injecteur (PTV)
Volume d'injection 0,5 ul
Mode splitless
Purge 2,00 min
flux de purge 50,0 ml min -1
Température initiale 80 ° C
Temps initial 0,02 min
Rampes: Taux 600 ° C min -1
Température finale 300 ° C
Temps final 10 min
Colonne
Modèle J & W DB-5MS
Longueur nominale 20 m
Diamètre nominal 180 um
Épaisseur de film nominale 0,18 um
Gaz vecteur hélium 0,8 ml min -1
MSD ligne de transfert 280 ° C
MSD
Mode Sim
MS Source 230 ° C
MS Quad 150 ° C

Tableau 2. Paramètres pour GC / MS. Résumé de tous les paramètres pour GC et MS à qfluorène uantify dans les configurations de microcosme.

PIÈGES COMMENTAIRE
1 La croissance préliminaire et tests de vitalité Étudier la croissance de l'organisme mycélium de choix. Combien de temps faut-il pour atteindre le patch MMA? Elle est inhibée par la barrière de cycloheximide? Également vérifier si les cellules biorapporteur restent vital dans MMA tout le temps par l'intermédiaire des essais à tresser. Sinon, on peut aussi ajouter une source de carbone au MMA qui ne donne pas lieu à biorapporteur induction. Exclure possible inhibition mutuelle de bactéries et de mycélium.
2 Taux de croissance du mycélium Le taux de l'organisme mycélium de croissance ne devrait pas être trop lent, parce que sinon le transport en phase gazeuse de HAP augmente avec le temps d'incubation prolongée. Le protocole peut être adaptéajouter HAP à un moment ultérieur, mais là encore, mycélium au point d'inoculation peuvent ne plus être actif.
3 La mobilité bactérienne Si un point microscope à balayage laser est utilisé et la souche bactérienne est mobile, l'enregistrement et la quantification des z-piles peut être impossible en raison de mouvement à l'intérieur de MMA. Ainsi, le mouvement bactérienne devrait être empêchée, par exemple, en augmentant la solidité de MMA, à l'aide d'un scanner CLSM rapide ou un microscope laser à disque tournant.
4 Le transport en phase vapeur Le transport en phase vapeur de la substance chimique (par exemple, HAP) vers les cellules biorapporteur doit être exclu car les cellules suffisamment biorapporteur sont extrêmement sensibles aux produits chimiques dans la phase vapeur. Ce est le point crucial de l'ensemble du protocole afin d'éviter des résultats faussement positifs causés par le transport gazeux. La phase gazeuseconcentration peut être estimé par analyse chimique de AIR CON (-) et les concentrations en phase vapeur peut être ajustée par exemple en ajoutant plus ou moins de patches d'agarose avec du charbon actif.
5 Toxicité Gardez à l'esprit, que des concentrations élevées de la substance d'essai pourraient avoir des effets toxiques sur l'organisme et / ou des bactéries du mycélium.
6 Autofluorescence Vérifiez si l'organisme mycélium choisi montre une certaine auto-fluorescence dans la gamme du signal de biorapporteur attendu. Soyez sûr de vérifier à différents stades de croissance depuis autofluorescence peut varier 17. Si autofluorescence est détecté, assurez-vous d'enregistrer z-piles dans les zones exemptes mycélium.
7 Blanchiment mCherry fluorescence est généralement stable et non sensible à blanchiment dans le bi appliquéeoreporter cellules. En revanche, eGFP blanchit assez rapidement. Par conséquent, ne pas utiliser le canal eGFP de visualiser l'échantillon avant l'enregistrement z-stack.
8 eGFP induction Nous avons remarqué une faible induction eGFP dans SAM comparé à CON POS. Cela se explique par la restriction spatiale forte et faible accessibilité de la source de GRIPPE de maintenir très faible concentration en phase vapeur de la grippe (cf. derniers résultats paragraphe). En fonction de la souche de biorapporteur choisi et chimique, la zone de capture à la PDA 1 peut être modifiée pour augmenter la vitesse de transport (Figure 5B). Cependant, il doit être considéré que cela augmente également le transport en phase vapeur vers les cellules biorapporteur.
9 Calcul de la eGFP rel La méthode de calcul présentée pour eGFP rel où l'intensité de pixels verts est comparéeà la zone de pixels rouges est seulement une possibilité. Se il vous plaît se référer à la discussion pour plus d'informations.
10 La taille du pixel Se il vous plaît être conscient que le grossissement de la lentille choisi et un facteur de zoom appliqué potentiellement affecter la taille de pixel de l'image. Ceci doit être pris en considération avant l'analyse de l'image.
11 Fractions biodisponibles Gardez à l'esprit que la biodisponibilité du composé transporté est évaluée qualitativement (pas quantitativement) via eGFP induction. Aucune corrélation de la eGFP-induction relative calculée et la fraction biodisponible a été tentée. Cependant, ceci peut être traitée dans des applications futures.
12 Les limites de détection La détection chimique. Pour la quantification chimique des composés organiques, un large éventail de concentions peuvent être détectés de manière fiable. Nous avons détecté des quantités dans la plage de 0 ng et 1,000ng. quantification eGFP. Nous avons comparé par rapport induction eGFP dans les échantillons sans le transport des contaminants (c.-à-0NG transporté), avec le transport de mycélium médiation (ce est à dire, entre 20 et 40 ng transporté; cf. figures 4 et 5) et par contact direct avec la source de contamination (ce est à dire, au maximum montant disponible). Ces trois cas se sont avérés être bien distinguer le procédé décrit. Cependant, nous ne pouvons pas faire une déclaration plus détaillée sur la résolution de l'induction par rapport eGFP. Ce problème peut être abordé à l'avenir en liant différentes quantités de contaminants avec l'induction eGFP corrélation dans les configurations de microcosme.
13 Petri matériau plat Plats de Petri en plastique peuvent entraîner une sous-estimation de la translocation du mycélium HAP et / ou la biodisponibilité. Cela ne devrait pasêtre problématique, si les états qualitatifs sont aspirées. Dans le cas des mesures quantitatives précises sont nécessaires, l'application de verre boîtes de Petri doivent être considérées malgré une préparation et la manipulation sera plus gênant.

Tableau 3. Discussion sur les pièges possibles. Des pièges possibles avant et pendant l'expérience et les commentaires et les options proposées.

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Discussion

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La configuration du microcosme présenté est avéré approprié pour étudier la biodisponibilité des produits chimiques spatialement séparés pour les organismes après absorption et le transport par mycélium dégradant. Potentiel de transport en phase gazeuse de composés volatils en partie est empêchée et les cellules bactériennes biorapporteur peut être visualisé sans préparation de l'échantillon complexe, et donc avec une perturbation minimale du système sensible. Dans le même temps, l'analyse chimique de l'échantillon peut être facilement réalisée pour permettre un bon contrôle des résultats obtenus et, pour la quantification du transport total. Cependant, certains points doivent être examinés avec soin avant et pendant l'exécution de l'expérience. Un point important est de garder les microcosmes libre de toute contamination croisées bactériennes ou chimiques. Cela peut être difficile, car de nombreux microcosmes sont exécutés en parallèle et donc, de grandes chambres d'incubation (comme dessiccateurs) sont nécessaires. Par conséquent, il est crucial pour stériliser soigneusement toutes les pièces avant la construc de configurationtion. Un autre point critique peut être l'application des boîtes de Petri en plastique pour les microcosmes. Bien que les HAP et les biorapporteur ne obtiennent pas en contact direct, une certaine quantité de HAP peut être absorbée par la matière plastique. Cependant, nous considérons que ce pas problématique pour le protocole décrit, puisque cela entraînerait, le cas échéant, une sous-estimation de l'HTAP-translocation et / ou la biodisponibilité du mycélium. En tout cas, si une quantification précise est nécessaire, il doit être considéré comme l'échange des pièces en plastique avec des pièces de verre, bien que la manipulation sera plus gênant. Autres points qui devraient être considérés impliquent les souches choisies bactériennes et fongiques (possible inhibition mutuelle, taux de croissance, la mobilité et possible autofluorescence), les produits chimiques choisis (effets toxiques sur les micro-organismes, la volatilité, les limites de détection) et les aspects pratiques (blanchiment, limitation de l'eGFP induction et calcul de eGFP rel). Un résumé des pièges potentiels et observations respectives peut être trouvée dansTableau 3.

Nous avons utilisé cette configuration microcosme de modèle pour démontrer transport GRIPPE mycélium et la dégradation bactérienne ultérieure dans un système insaturé directement sur un niveau d'interaction cellulaire mycélium. Notre modèle set-up peut être modifiée et ajustée pour répondre aux différents besoins avec différentes souches bactériennes et fongiques, des composés chimiques, etc. Ainsi, le système pourrait être utilisé par exemple (i) d'évaluer l'influence de mycélium sur les bactéries en présence de un produit chimique à d'autres restrictions (par exemple, toxique) la source, (ii) de prévoir l'influence du mycélium sur la biodisponibilité des composés de la dégradation bactérienne, (iii) pour étudier la biodisponibilité des contaminants en fonction de la distance de bactéries au vecteur de transport ou (iv) pour étudier l'effet des différentes sources de produits chimiques (par exemple, cristallin, dans le sol ou dissous). Cependant, l'ajustement du système à unlternate conditions seront délicate et devraient être menées étape par étape afin d'obtenir des résultats clairs. Jusqu'à présent, nous ne avons pas testé le système pour d'autres souches bactériennes ou fongiques et d'autres composés que les HAP. Cependant, puisque les réseaux mycéliens sont connus pour transporter également d'autres contaminants que les HAP comme les pesticides ou les 19 substances solubles comme salicylate 20, nous pensons que le système peut être étendu à différents composés chimiques donnés un biocapteur bactérienne composé spécifique.

Se il vous plaît noter que selon la souche biorapporteur appliqué un autre calcul de eGFP rel pourrait être préférable. Au lieu de l'équation (1) les deux options suivantes pourraient être appliquées:

Equation 2 (2)

Équation 3 (3)

However, dans l'équation de protocole présenté (1) a été choisi pour les raisons suivantes: l'intensité (i) de eGFP a été signalé en corrélation avec le flux de HAP à la cellule 14 alors que (ii) mCherry a été signalé à montrer des variations considérables pour différentes cellules 13 . L'équation (2) et (3), en revanche, peut être choisie pour éviter de fausses informations artefacts potentiels de lumière dans l'échantillon. En tout cas, nous avons comparé les trois méthodes de calcul avec l'autre, dans lequel aucune différence statistiquement significative n'a pu être trouvée. Pourtant, en raison des variations signalées dans l'intensité de fluorescence de mCherry, nous recommandons d'utiliser l'équation (1) ou (2).

En fin de compte, certaines limitations de la technique doivent être considérés. Étant donné que le microcosme ont été conçus pour empêcher le transport en phase gazeuse du composé testé, l'absorption du composé de mycélium est réduite. Il en résulte des taux de transport plus faibles que ce qui serait prévu à l'absorption sans entrave. Par conséquent, la sensibilité de la biorePorter souche doit être suffisamment élevée pour détecter de petits changements dans les fractions biodisponibles. En outre, la configuration ne sera probablement pas adapté pour les souches de champignons avec un taux de croissance faible. Dans ce cas, l'incubation à long terme pourrait favoriser le transport en phase gazeuse du contaminant conduisant ainsi à des résultats faussement positifs. Il pourrait être possible de modifier la configuration de façon que le contaminant peut être appliquée à un point de temps plus tard. Cependant, les hyphes peut alors être déjà inactive ou mort au point d'inoculation. Enfin, comme indiqué ci-dessus, la gamme de composés chimiques qui sont transportés par les réseaux mycéliens est grande. Cependant, la disponibilité d'une souche de biorapporteur appropriée pourrait être un facteur limitant.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal Microscope Leica TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM
GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD Agilent an equivalent GC/MS may be used
GC capillary column J&W 121-5522              Agilent
Cork borer Fisher Scientific 12863952 or any other
Cover slips Marienfeld 107222 High performance, No.1.5H
GC/MS insterts WICOM WIC 47080
GC/MS vials 2 ml WICOM WIC 41150
Lids / septa for screw cap vials DIONEX 49463 / 049464 
Lids for GC/MS vials WICOM WIC 43948/B
Objective Slides Menzel ordinary
PDMS coated glass fibers Polymicro Technologies, Inc. V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1
Petri Dishes small / big Greiner 633-102 / 628-102
Screw cap vials 40 ml DIONEX 48783 other glass vials may be used
Screw cap vials 60 ml DIONEX 48784 other glass vials may be used
Acenaphthylene d08 Dr. Ehrenstorfer C 20510100
Acetone Carl Roth 9372.2
Activated carbon Sigma-Aldrich 242276-1kg
Agarose Carl Roth 2267.4
Fluorene Fluka 46880
Kanamycin sulfate Carl Roth T832.2 50 mg L-1
Methanol Carl Roth P7171
Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest
Solution 1
Ammonium sulfate Carl Roth 3746.1 5 g L-1 
Magnesium chloride x 6 H2O Carl Roth 2189.1 1 g L-1
Calcium nitrate x 4 H2O Carl Roth P740.1 0.5 g L-1
Solution 2
Disodium phosphate Carl Roth P030.1 55.83 g L-1
Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1 20 g L-1
Solution 3 (pH 6.0)
Disodium EDTA MERCK 1084180250 0.8 g L-1
Iron(II) chloride x 4 H2O MERCK 1038610250 0.3 g L-1
Cobalt(II) chloride x 6 H2O Carl Roth T889.3 4 mg L-1
Manganese(II) chloride x 1 H2O Carl Roth 4320.2 10 mg L-1
Copper(II) sulfate Carl Roth P023.1 1 mg L-1
Sodium molybdate x 2 H2O Carl Roth 0274.1 3 mg L-1
Zinc chloride MERCK 1088160250 2 mg L-1
Lithium chloride Carl Roth P007.1 0.5 mg L-1
Tin(II) chloride x 2 H2O Carl Roth 4473.1 0.5 mg L-1
Boric acid Riedel-de-Haen              11606 1 mg L-1
Potassium bromide Carl Roth A137.1 2 mg L-1
Potassium iodide Carl Roth 6750.1 2 mg L-1
Barium chloride Carl Roth 4453.1 0.5 mg L-1
MMA Minimal medium + agarose 0.2%
Phenanthrene d10 Dr. Ehrenstorfer C 20920100
Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8
Potato Dextrose broth Difco/ Beckton Dickinson 254920
Bacto-agar Difco/ Beckton Dickinson 214040
Sodium acetate x 3 hydr. Carl Roth 6779.1
Sodium sulfate MERCK 1066495000
Toluene MERCK 1083252500
mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl
Yeast extract Merck 1037530500
Tryptone Serva 4864702
Sodium chloride Carl Roth 3957.1
ImageJ with logi tool plugin http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum strain 67-1 Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland
Burkholderia sartisoli RP037-mChe Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland

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Une approche Cell biorapporteur entières pour évaluer transport et la biodisponibilité des contaminants organiques dans les systèmes insaturés eau
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Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).More

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).

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