Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

水不飽和システムにおける有機汚染物質の輸送および生物学的利用能を評価するために、全細胞バイオレポーターアプローチ

doi: 10.3791/52334 Published: December 24, 2014

Summary

バークホルデリアsartisoli RP037-MCHEと全細胞バイオレポーターアッセイは、水飽和モデル系内の空気で満たされた細孔を橋渡し菌糸体により能動輸送後の細菌による分解に利用可能な有機汚染物質( すなわち、フルオレン)の画分を検出するために開発されました。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

土壌は、高密度に細菌などの微生物1,2の広い範囲によって入力されます。しかし、この生息地の条件は特に水の利用可能3換算で、挑戦的である。細菌は、恒久的に異機種環境4に最適な条件を探索する必要がありますが、連続した水膜の不在は、自由に広げるために、それらを妨げる制限されたモビリティ5になるさ。また、溶質の拡散速度( 例えば、栄養素)は、不飽和条件6の下に低下する。そのため、細菌や栄養素は、多くの場合、物理的に分離され、栄養のアクセシビリティは3に制限されている。結果として、連続的な水相を必要としない化学化合物のための輸送ベクターは、これらの制限を克服するのに役立つ可能性がある。実際には、そのような真菌および卵菌などの多くの微生物がそれによって達するとmobiは空気で満たされた孔隙を通して成長できるようにすること糸状成長形を開発したlizingも物理的な長距離での栄養素7と炭素質8物質を分離した。彼らは細菌9に糖及び他のエネルギー源を提供し、生物学的輸送ベクターとして作用することができる。菌糸生物における取り込みと輸送はまた、このようなピシウムultimum 10またはアーバスキュラー菌根菌11で中の多環芳香族炭化水素(PAH)などの疎水性有機汚染物質のために示されている。 PAHは、ユビキタスと難水溶性汚染物質の土壌中の12であるため、菌糸体媒介輸送は、潜在的な細菌の分解者のための汚染物質の生物学的利用能を高めるために役立つかもしれない。汚染物質輸送の総量は化学によって直接定量することができるのに対し、分解細菌および他の生物に菌糸体によって輸送汚染物質の生物学的利用能を容易に評価することができない、10を意味する。

以下のプロトコルmyceの影響を評価するための方法を提示する直接的な方法で細菌の分解者への汚染物質の生物学的利用能にLIA。それは微生物の生態系への汚染物質の時空間への影響に関する情報を収集することができます。私たちは、菌糸輸送ベクターを経由してPAH分解バイオレポーター細菌と物理的に分離されたPAHの点光源をリンクすることによって土壌中の空気 - 水界面を模倣精巧な不飽和縮図システムを設定する方法について説明します。空中輸送が除外されているため、細菌PAHのバイオアベイラビリティに菌糸ベースの輸送の効果は、単離された方法で研究することができる。より詳細には、3環のPAHフルオレン、菌糸生物ピシウムultimumとバイオレポーター細菌バークホルデリアsartisoli RP037-MCHE 13を説明小宇宙の設定で適用した。細菌B. sartisoli RP037-MCHE、もともとセル14にフェナントレンフラックスを研究するために構築されたとするPAHフラックスの結果として、緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現増強赤の蛍光を発するmCherryをを構成的に発現される細胞。レポーター構築に関する詳細な情報はTecon によって与えられている。予備試験では13、細菌は水泳とだけ非常に遅い群がる能力を認められなかった。それは、菌糸の上に高密度の懸濁液として適用された場合にピシウムultimumの菌糸にゆっくり移動することができました。細菌は以下のプロトコルでアガロースに包埋したので、菌糸上のマイグレーションが発生しなかった。

共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を用いて、バイオレポーター細菌はマイクロコズムで直接可視化することができるし、eGFPの発現は、ソフトウェアのImageJの助けを借りて(mCherryを信号に比​​例した)細胞の量に関連して定量することができる。これは、異なるシナリオに定性的生物学的利用能を比較することができ( すなわち、より高いまたはより低い)。 FLUはP.によって菌糸輸送後に生物学的に利用可能であることが見出されたultimum(すなわち、それは、)陰性対照よりも高かった。さらに、プロトコルは、化学的な手段を介して菌糸体媒介輸送の総量を定量化すると、同一のマイクロコズムにおけるシリコンコーティングされたガラス繊維(SPME繊維)を使用して、汚染物質の生物学的利用能を確認する方法について説明します。この小宇宙のセットアップを使用して結果が公表され、Pの組み合わせのために議論されてきたultimum、フルオレン及びB. sartisoli RP037-MCHE 15。ここでは、焦点は、潜在的なさらなる用途のためにこの知識を提供するために、詳細な方法の説明とプロトコルの潜在的な落とし穴の同定に位置しています。さらにアプリケーションは、さまざまな真菌、(汚染されたサイトからの例えば、)細菌種、および他の汚染物質( 例えば、殺虫剤)または汚染物質の供給( 例えば、高齢の土壌)を含むことができる。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

料理の調製、スライドとインキュベーションチェンバース

  1. 各小宇宙に次の材料を準備します。一つの大きなプラスチック製のペトリ皿の底部(D = 10cm)に、蓋と3空洞を有する1カウントチャンバースライドで(ステップ1.2を参照)、小さなプラスチック製のペトリ皿の底の(D = 5 cm)の修正1。
  2. ペトリ皿の底部の所望の数の(d = 5 cm)を取る。正確にスライド(26ミリメートルエッジ長)が合うようにのこぎりでつばの部分を削除します。システムを滅菌するため、70%エタノールのO / Nでペトリ皿の底と蓋を浸漬し、UV光下での流キャビネット中で少なくとも2時間のためにそれらを乾燥させる。また、2時間UV光にさらされていた密閉プラスチック容器、ペトリ皿に保管してください。
  3. 70%エタノールとを含むスライドの所望の数ワイプそれらを空気乾燥する。アルミホイルでスライドをラップし、可能な汚染を除去するために、450℃で5時間マッフル炉に入れます。 蓋付きガラスインキュベーション室を準備します。 70%エタノールで清掃し、流キャビネット内の少なくとも2時間のUV光にオープンチャンバーを公開。
    注:蓋付き大型デシケーター(30 -1付近の直径)は、この目的のために使用することができる。各デシケーターは10縮図のセットアップまで収容することができる。

メディアと文化の調製

  1. 、3; 20並列小宇宙を実行するには、修正されたトリプトン-酵母培地(MTY)の100ミリリットル14、約150ミリリットル21Cの最小培地16(MM)、最小培地寒天(0.5%、w / vのMMA)の5ミリリットルを取得ポテトデキストロース寒天培地(PDA; 1.5%、w / v)のP.ultimum 4つのブランクプレートを、2 mgのL -1シクロヘキシミド、4アガロースプレートを含むものPDAプレート(3%、w / v)と0.3を含むグラムml -1の活性炭および2mg部のFLU 40mgの。
  2. MTYはカナマイシン50 mgのL -1を含む準備(カナマイシンはrequirです細菌の培養のための10 mMの酢酸を含むのeGFPレポータープラスミドを維持するために編)およびMM。マイクロコズム中の細菌の固定化に0.5%のMMAを準備し、 ピシウムultimumと小宇宙のセットアップの培養に1.5%PDAのプレート(各20ml)に注ぎ、酢酸ずにMMを使用してください。
  3. P.のいくつかの菌糸を接種する3新鮮PDAプレート上のultimumとは、約72時間、25℃の暗所でインキュベートする。その後、プレートは新鮮でふわふわ菌糸体によって完全に生い茂っていることを確認してください。
  4. Bの二つの文化を開始グリセロールストックからMTYの50ミリリットルでsartisoli RP037-MCHE。 230 rpmで回転式フラスコ運動O / Nで30℃でインキュベートする。
  5. メジャー文化光学密度(OD)578 nmでの遠心10分間千×gで(B. sartisoli RP037-MCHEのために、期待されるOD 578が約1.0であり、細胞が対数期にあります)。上清を捨て、細胞を再懸濁OD 0.4の578到達するMMの適切な量で存在する。再懸 ​​濁した細胞の400μlの50 mgのL -1カナマイシンを含むMMの20ミリリットルを接種する。 230 rpmで回転式フラスコ運動O / Nで30℃でインキュベートする。
  6. MMにおける文化のOD 578を測定します(B. sartisoli RP037-MCHEのために、期待されるOD 578が約0.2であり、細胞が初期の指数期にあります)。遠心培養物を10分間2,000×gで0.4のODに達するためにMMの適切な量で細胞を再懸濁する。使用量になるまで50℃で2 mlチューブや店舗で暖かい、液体MMAの500μlの細胞懸濁液50μlを混ぜる。各小宇宙のためにMMAでの細胞の150μlのを使用してください。
  7. 活性炭を含むアガロースゲルのプレートを注ぐ。アガロース溶融(3%、w / v)の蒸留水で。活性炭(0.3グラムミリリットル-1)で十分に混合し、プラスチック製のペトリ皿に混合物を注ぐの(d = 10cm)に。

取付3.小宇宙

注:完全な縮図のセットアップを図1に概略的に示されている以下のすべての個々のステップについては図1を参照してください。。次の手順では、菌糸輸送ベクター3つの異なる制御のセットアップ(CONのAIR、CONNEG、CONPOS)を含むサンプル(SAM)の調製を記載している。すべての異なる設定の概要を表1に見出すことができる。

  1. ペトリ皿およびスライドの所望の数を取り、30分間流キャビネットの下UV光にそれらをさらす。
  2. 大きなものの中に小さなペトリ皿を置き、小さなペトリ皿の隙間を通ってスライドに合わせて。 MMAで暖かい細胞懸濁液の1サンプルを取り、1スライドの中央空洞に150μlを添加する。すべてのスライドの中央空洞があるまで、この手順を繰り返しますMMAでいっぱい。 MMAが固化するために、5分待ってください。
  3. 空白のPDAプレートから円形のパッチをパンチアウトするために1cmのコルクボーラーを使用してください。小さなペトリ皿の内側MMAの隣に2ミリメートルの距離で1パッチを置きます。 ( 図1のPDA 3)セットアップ中に菌糸の成長を促進するために、これを追加します。
  4. 機械的な障壁として湾曲したPDAのパッチをカット。清潔で無菌の小さなペトリ皿の底の部分を使用し、PDAプレートにそれを押してください。 PDA-リングになり寒天に0.5センチメートルの距離で別の小さいリングをカットするヘラを使用してください。
    1. 正確に小宇宙のセットアップの小さなペトリ皿の隙間に収まる部分を、切り出し、スライドの上にギャップ内に配置。 MMAと円形のPDAバリア間の距離は約2mmであることを確認してください。優しくPDA障壁にそれを押すと、小さなペトリ皿の蓋を閉じます。
    2. 繰り返します2グラムLを含むPDAプレートと3.4と3.4.1のステップ-1シクロヘキシミドの。
      注:菌糸がシクロヘキシミドによって阻害され、MMAを過剰成長しないので、これは、バイオレポーター細胞に対して空中輸送のための制御設定(CONのAIR)です。
  5. 空白のPDAプレートの円形のパッチをパンチアウトするために1cmのコルクボーラーを使用してください。最初のパッチの真ん中をカットするために別の0.5cmのコルクボーラーを使用してください。 PDA関門( 図1のPDA 1)の隣に1ミリメートルの距離で生じた小さなPDAリングを置きます。
  6. Pと生い茂ったPDAプレートから円形のパッチをカットするPDA 1.の穴に1cmのコルクボーラーをFLU 2mgのを追加します。 ultimumと菌糸マットはFLU結晶を向くようにPDAリングにダウンボトムを( 図1のPDA 2)1パッチを配置。
    1. FLU結晶を追加することなく、前の手順を繰り返します。
      注:これは、バックグラウンドを決定するために、負の制御設定(CON NEG)であるバイオレポーター細胞の蛍光。
  7. 活性炭を含む寒天から円形のパッチをパンチアウトするために1cmのコルクボーラーを使用してください。さらにガス状のFLU濃度( 図1)を減少させるために各小宇宙セットアップで4つのパッチを配置します。
  8. ポジティブコントロール(CONのPOS)を準備します。 MMAの細胞懸濁液の200μlにいくつかのFLU結晶を追加し、空のスライドの1のキャビティに入れて。
  9. チャンバ内の気体のFLUの濃度を最小限にするために、インキュベーションチャンバーの底部に、活性炭のいくつかの粉末とペトリ皿の(d = 10 cm)を置く。また、チャンバー内の高湿度を維持するために、底に滅菌水で四から五50ミリリットルビーカーを置く。
    1. インキュベーション室に縮図のセットアップを移し、96時間、25℃でインキュベートする。ランダムに異なる成長チャンバー内の場所サンプルは場所の影響を除外します。
      注:このインキュベーション時間のAP卵菌Pにプライultimum。これは、他の生物のために異なる場合があります。

4.共焦点レーザー走査顕微鏡

  1. 理想的には正立顕微鏡とCLSMのセットアップを使用しています。
    注:これは、励起のためのまたは調整可能白色レーザ光 ​​源と、例えば、488、561及び633nmのラインを提供し、従来のレーザーを装備することができる。
  2. 画像のコレクションのために、以下の設定を使用してください:励起:490 nmの(EGFP)と585 nmの(mCherryを)適切なレーザー強度(同時励起)で。放出範囲:500から550ナノメートル(EGFP)と605から650ナノメートル(mCherryを);対物レンズ:63X NA(その長作動距離のために)浸漬可能0.9水; Z-スタックのためのステップサイズ:0.5程度である。
  3. オープン縮図のセットアップやPDA 1、2、3、PDAの障壁を除去するための外科用メスを使用しています。 MMAの上にガラスカバースリップを入れて、気泡を除去するために軽く押してください。顕微鏡ステージ上にマウントスライド。目の上に水の液滴を追加します。Eカバースリップし、試料中のバイオレポーター細胞を見つけるためにmCherryを設定を使用します。
  4. サンプルの概要を取得し、赤のためのグロー·オーバー·アンダールックアップテーブルを用いて信号対雑音比を最適化する(mCherryを)と緑(EGFP)チャンネル。バイオレポーター蛍光を分析するために、試料上のランダムな位置を選択してください。
    注:菌糸はバイオレポーターの放出( 例えば、緑色の自己蛍光)17の範囲内の自家蛍光を示すことがある。このような場合は菌糸ない領域を選択してください。
  5. 定義し、緑(EGFP)、赤(mCherryを)チャネル内の各位置のためのzスタックを記録します。落射光やレーザー光に長時間露光することにより、試料の漂白は避けてください。
    1. 10ランダム、均等に分散ポジションの前の手順を繰り返します。
  6. テストコース(SAM)、CONのAIR、CONNEGとCONのPOSのすべてのサンプルに同じ設定を使用してすべての手順を繰り返します。
  7. 5.画像解析

    注:他のオプションの中でのフリーソフトウェアImageJを18(http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html)にすることができ、記録されたZ-スタックに赤(mCherryを)と緑(EGFP)の蛍光を分析するために、使用。

    1. logi_toolプラグイン(http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/)をインストールしてください。
    2. ImageJの中でファイルを開きます。 「スプリットチャネル」と密接な緑のチャンネルを選択します。 zスタックに赤色蛍光の面積を定量化するために補助コードファイルとして提供マクロ」mCherryをエリア」を使用してください。マクロで好みの設定を調整します(太字で示されている)。
      1. 出力は、Z-スタック内の測定ピクセルの閾値を上回る(と定義された最小サイズ以上)を持つテーブルです。
        注:すべての値の合計が、スタック内の赤色画素(領域)の総数である。
    3. ImageJの中でファイルを開きます。 「スプリットチャネル」と密接な赤のチャンネルを選択します。マクロを使用してください 216、Z-スタック内の緑色蛍光の強度を定量化するために補助コードファイルとして提供されたeGFP INT」。マクロで好みの設定を調整します(太字で示されている)。
      1. 出力は、zスタック内のすべての緑のオブジェクト閾値より上(と定義された最小サイズ以上)の平均強度と面積を持つテーブルです。スタック内の緑画素の強度を計算するには、対応するエリアによって各平均強度を掛けます。
    4. 相対のeGFP誘導(EGFPのREL)を計算します。
      式1 (1)
      NOTE:mCherryを構成的に発現されているので、のeGFP 相対の結果値は、細胞の一定量で表さeGFPの量の相対測定値である。またのeGFP RELの計算の詳細については、表3を参照してください。
    TLE "> 6。化学定量

    NOTE:小宇宙セットアップもまたは非生物的汚染物質、ヒートシンクなしに転FLU量の化学的定量化を行うために用いることができる。

    1. アルミ箔15 mlのガラスバイアルに1mlのGC / MSバイアル​​インサートを包む。をNa 2 SO 4皿を蒸発させて充填します。可能な汚染を除去するために、450℃で5時間マッフル炉ですべてを置く。活性化したデシケーターのNa 2 SO 4で内部に保管してください。
    2. 0.5cmの長さにPDMSコーティングされたガラス繊維をカットします。新鮮なメタノール中で4回2時間振盪することにより繊維を洗浄する。繰り返し洗浄は、超純水でさらに4回繰り返し、密封ガラスバイアル中で超純水できれいな繊維を格納する。
    3. トルエン/アセトン1.5Lの準備(3:1、v / v)の10μgのLはフェナントレン-1-d10を含む。
    4. ステップ1、2、プロトコルの3を実行します。 biorずに小宇宙を準備FLU劣化を確認し、バイオレポーター細胞(SAM)とFLU輸送() - - )、およびCONのAIR(SAM()研究するeporter細胞。
      1. (バイオレポーター細胞なし)オプション:SAMのMMA内部人工と定量化可能な汚染物質シンクとして(通常SPME実験に使用)ガラス繊維をコーティングした場所3 PDMS( - )は細かい鉗子を使用して。
      2. 細かい鉗子を用いてガラス繊維を取り出し、インサートGC / MSバイアル​​にそれぞれ1を移す。
      3. トルエン200μlを加え、O / N縦に振ると、GC / MSを経由して分析する。 表2に設けられた設定を使用します。
    5. 15ミリリットルのガラスバイアルに中央の空洞からMMAを転送し、Na 2 SO 4の3へらについて追加。スパチュラを用いて徹底的に混合し、溶剤の10ミリリットルを追加します。ボルテックス混合物を暗所で水平にO / Nを振る。
      1. 転送1001;インサートをGC / MSバイアル​​にサンプルのリットル。アセナフチレン-D 08(10 mgのL -1)を10μlを追加し、6.4.3に記載したのと同じプログラムを使用して、GC / MSを経由して分析する。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ここに示す結果は、すでに15以前を発表されている。詳細な機構的および環境的な議論のための記事を参照してください。

CLSMを介して画像記録した後、最大強度投影は、サンプルの第1の視覚的印象を制御( 図2)を得るために、各顕微鏡ソフトウェアまたはImageJをを用いて行うことができる。その後、データセットは、特定の可視化ソフトウェアによって意味のある特徴を示すために異なって投影することができる。ポジティブコントロール(CONのPOS)が空中コントロール(CONのAIR)のに対してのみ背景eGFP蛍光( 図2B)を示す、明確なeGFPの誘導( 図2A)を示している。試験サンプル(SAM)におけるeGFP蛍光はCON AIR、yに比べて上昇しているようらCON POS(図2C)としてマークされていないように。 mCherryを蛍光はPAH劣化から独立し、全ての試料について、したがって同様です。しかし、わずかに上昇したeGFP信号はこの方法では検出されず、その後の画像解析が不可欠である。

テスト微小生態系については、目視検査、画像解析及び相対eGFPの誘導の計算により補完された( 参照ステッププロトコルの5 ffは図3)。非誘導Bの緑のバックグラウンド蛍光sartisoli RP037-MCHEは、CONのNEGを用いて計算される。与えられた条件の下で、相対的なeGFPの誘導は、eGFPの相対であることが見出された = 0.53。有意差はCONのNEGCONのAIR(EGFP RELとの間で検出することができなかった = 0.54;のp> 0.95)、したがってバイオレポーター細胞に対する任意の気相FLU輸送を除く。 CON POS、高度に上昇したeGFP誘導(EGFP RELの場合 = 53.7)は96時間後にMMAでの細胞の活力を確認し、最大のeGFP誘導を表す発見された。菌糸及びFLU(SAM)の存在下で、eGFPを陰性対照(eGFPを相対に比べて細胞内で有意に誘導された = 1.15;てp <0.001)。しかし、eGFPの誘導が、陽性対照( 3 参照 、点8)に比べて比較的低い。

P.の菌糸体によるインフルエンザの輸送小宇宙設定でultimumは (プロトコルの参照、ステップ6 FF; 図4)化学的に定量した。インフルエンザやPの存在下でultimum(SAM( - ))、菌糸トランス37.5pmold -1 cm -1での輸送速度に等しい96時間内のインフルエンザの25ngの周りに配置。菌糸体の非存在下での対照(CONのAIRは( - ))のみ、すなわち、気相濃度によるバイオレポーターの誘導を排除することができ、96時間以内に2NGの範囲でMMAに気体FLU輸送を明らかにした。 B.sartisoli RP037-MCHEは(SAM)に存在していた場合には、<インフルエンザの1ngはMMAパッチで検出された。これは菌糸体媒介転座の後に効果的な細菌FLUの劣化を検証した。

それは(プロトコルの参照、ステップ6.4.1 のff)システムに非生物的汚染物質シンクを追加することによって、FLU転に、FLUシンクの、すなわち 、細菌による分解の影響を調査することが可能である。従って、一つの繊維に吸収さFLU量とMMAと上菌糸の内部に残っ量を定量することができる。 SAMのために( - )、総転位する量は、汚染物質シンクの存在から独立した(p> 0.9; 図5A)。先に15で詳細に説明するようにしかし、増加したFLU取り込み面積の縮図も試験した。そこでは、転位しFLU量の有意な増加を検出することができた( 図5B)。

図1
図1.図面と完全な小宇宙セットアップの写真 。上部(A)から図及び側面から(B)。すべての寒天パッチは三つの小さな空洞を有するスライドの上に置いた。 FLU結晶の二mgのPDA 2はPの菌糸と新たに過成長であったPDA 1の中央空洞の(d = 5mm)を内部に配置したultimum直面PDA 1.湾曲したPDA片にPDA 2とMMAのパッチの間に配置したペトリ皿(D = 5センチ)の蓋と一緒に機械的なFLUバリアを作成します。活性炭を含む4寒天パッチはさらに、気体FLUの濃度を減少させるために、セットアップ中に入れた。上からの完全な小宇宙(C)と、微生物やインフルエンザのない対角ビュー(D)の写真。 図1Aおよび1Bは Schamfuss の許可を得て変更されている。15 Schamfuss、S. の許可を得て適応菌糸の影響PAH分解菌にフルオレンのアクセス可能に。 环境。 SCI。技術総合。47、6908から6915まで。著作権(2013)米国化学会。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

pgの "/>
共焦点レーザー走査顕微鏡写真の図2の最大強度投影。顕微鏡写真である バイオレポーター細菌BのmCherryをとのeGFP誘導を可視化するMMAでsartisoli RP037-MCHE。細菌はMMAにおける結晶FLU源に接触したときは(CONのPOS; A)、EGFPシグナルは、コントロール(; B CONのAIR)に比べて上昇している。インフルエンザやPとサンプルultimum(SAM; C)しかしよ ​​り少ない陽性対照よりもマークされ、上昇したEGFPシグナルを示している。 mCherryを、構成的に発現し、したがって細胞を検出するための視覚的なコントロールとして機能する。 (倍率630X、バーは20μm)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

「FO:キープtogether.withinページ= "常に"> 図3
インフルエンザの非存在下での96時間後にB.sartisoli RP037-ゲバラによる相対eGFPの誘発(EGFPのREL)菌糸体とFLU。比較とCONのNEG、CONAIRとSAMのためのB.sartisoli RP037-ゲバラ図3.相対eGFPを誘導 FLUしかしP.ultimum(CONAIR)の有無で(CONのNEG)、およびインフルエンザやP.ultimum(SAM)の両方の存在下で。統計的にCONのNEGに有意差はアスタリスクでマークされています。実験は、CONのAIR用に独立した三連で行い、そしてCONのNEG、ための重複。 1つのサンプルCONのPOSについて試験した及びeGFP のrelは 53.7と計算された。この数字は、細菌を分解PAHするSchamfuss 15フルオレンの接近にSchamfuss、S。ら菌糸の影響から許可を得て適応から許可を得て変更されている。 环境。 SCI。技術総合。47、6908から6915まで。著作権(2013)米国化学会。

図4
図4.化学FLUの定量化細胞を含まない気相輸送のための96時間(CONのAIR( - ))の後にMMAパッチ(CF 図1。)から抽出されたngの中FLUの合計額メートル、細胞とし、菌糸輸送(SAM) -細胞なしycelial輸送()SAM()。この数字は、細菌を分解PAHするSchamfuss 15フルオレンの接近にSchamfuss、S。ら菌糸の影響から許可を得て適応から許可を得て変更されている。 环境。 SCI。技術総合。47、6908から6915まで。著作権(2013)米国化学会。

図5
。MMAパッチから抽出されたngの中でインフルエンザの図5.非生物的汚染物質のシンクの存在下で化学FLUの定量を(A)合計金額人工汚染シンク(SAM(の有無にかかわらず菌糸輸送のための96時間後に(CF 図1を 。) - )またはPDMS COなしated繊維)。増加した菌糸FLU取り込み領域を有する多様なテストトラック用(B)と同じ結果。この数字は、細菌を分解PAHするSchamfuss 15フルオレンの接近にSchamfuss、S。ら菌糸の影響から許可を得て適応から許可を得て変更されている。 环境。 SCI。技術総合。47、6908から6915まで。著作権(2013)米国化学会。

名前 FLU 菌糸 細胞 アプリケーション 注釈
SAM + + + CLSM
GC / MS
SAM( - ) + - GC / MS も可能人工汚染物質シンクとしてPDMS繊維と
コン· エアー + (+) + CLSM 菌糸体だけのPDAバリアまで成長させる工程と、 MMAカバーされていない
CON AIR( - ) + (+) - GC / MS 菌糸体だけのPDAバリアまで成長させる工程と、 MMAカバーされていない
CON NEG - + + CLSM
CONのPOS + - + CLSM 細胞は直接FLU結晶にさらされている

表1.すべてのサンプルタイプの概要アプリケーションを含む、すべてのコントロールおよび試験サンプルの概要。(バイオレポーターアッセイ- CLSMまたは化学定量化- GC / MS)とcomposiン(FLU、菌糸とバイオレポーター細胞)。

オーブン
初期温度 50°C
初期時間 2分
レート 15℃分-1
決勝TEMP 300°C
最終的な時間 6.33分
インジェクター(PTV)
注入量 0.5μL
モードスプリットレス
パージ 2.00分
パージ流 50.0ミリリットル分-1
初期温度 80°C
初期時間 0.02分
スロープ:レート 600℃分-1
決勝TEMP 300°C
最終的な時間 10分
コラム
モデル J&W DB-5MS
呼び長さ 20メートル
呼び径 180ミクロン
公称フィルム厚 0.18ミクロン
キャリアガスヘリウム0.8ミリリットル分-1
MSDトランスファライン 280℃
MSD
SIMモード
MSソース 230°C
MSクワッド 150°C

表GC / MS用2. [設定]。QにGCとMSのためのすべての設定の概要小宇宙のセットアップでuantifyフルオレン。

落とし穴 COMMENT
1 予備的な成長と活力のテスト 選択肢の菌糸生物の増殖を研究。どのくらい時間がMMAパッチに到達するために時間がかかりますか?それはシクロヘキシミド障壁によって阻害されていますか?また、バイオレポーター細胞はMMAで編みアッセイによって全体の時間を重要な泊まるかどうかを確認します。そうでない場合、人はまた、バイオレポーターの誘導をもたらさないMMAの炭素源を追加することができる。細菌や菌糸の可能性相互抑制を除外します。
2 菌糸成長速度 PAHのそうでなければ、気相輸送が長期インキュベーション時間とともに増加するので、菌糸生物の成長率は、遅すぎることはありません。プロトコルに適合させることができる後の時点でのPAHを追加するには、しかし、その後、再び、接種点での菌糸体はもうアクティブではありません。
3 細菌モビリティ 点走査型レーザ顕微鏡を使用した細菌株が運動性である場合に、zスタックの記録および定量化によるMMAの内側に移動することが不可能であってもよい。従って、細菌の移動が速いスキャナまたは回転ディスクレーザー顕微鏡CLSMを用いて、MMAの堅牢性を増加させることにより、例えば 、防止されるべきである。
4 気相輸送 バイオレポーター細胞が気相中の化学物質に非常に敏感であるため、バイオレポーター細胞に対する化学物質( 例えば、PAH)の気相輸送が十分に排除しなければならない。これは、気体の輸送に起因する偽陽性の結果を防止するために、全体のプロトコルの重要なポイントである。気相( - )濃度は、CONのAIRの化学分析によって推定することができ、気相濃度活性炭多かれ少なかれアガロースパッチを追加することによって、例えば、調整することができる。
5 毒性 テスト化学物質の高濃度の菌糸生物および/または細菌に対する毒性作用を持っている可能性があることを、覚えておいてください。
6 自己蛍光 選択した菌糸生物が予想されるバイオレポーター信号の範囲でいくつかの自己蛍光を示しているかどうかを確認してください。自家蛍光が17を異なる場合がありますので、異なる成長段階で確認してください。自家蛍光が検出された場合は、菌糸のない地域でのzスタックを記録するようにしてください。
7 漂白 mCherryを蛍光は通常、安定しており、適用されるBIの漂白に敏感ではないoreporter細胞。これとは対照的に、EGFPをむしろすぐに漂白剤である。したがって、zスタックの記録に先立って、サンプルを視覚化するためのeGFPチャネルを使用しないでください。
8 eGFPを誘導 私たちは、CONのPOSに比べ、SAMが低いのeGFP誘導を気づいた。これは、FLU(参照最終結果段落)の非常に低い蒸気相濃度を維持するために、強力な空間的制約及びFLU源の低アクセス可能性によって説明される。選択されたバイオレポーター株と化学に依存して、PDA 1での取り込み領域は、輸送速度( 図5B)を増加させるために変えることができる。しかし、これはまた、バイオレポーター細胞に対する気相輸送を増加させることを考慮しなければならない。
9 eGFPのRELの計算 緑の画素の輝度を比較するために提示されたeGFP 相対計算方法赤色画素の領域にのみ1つの可能性である。詳細については、議論を参照してください。
10 画素サイズ 選ばれたレンズの倍率と、潜在的に適用されるズーム倍率が画像のピクセルサイズに影響を与えることに注意してください。これは、従来の画像解析に考慮しなければならない。
11 生物学的に利用可能な画分 輸送される化合物の生物学的利用能がeGFPの誘導を経由して(しない定量的)定性的に評価されていることに留意してください。計算された相対的なのeGFP-誘導および生物学的に利用可能画分の相関関係は試みられませんでした。しかし、これは将来のアプリケーションに対処することができる。
12 検出限界 化学的検出。有機化合物の化学定量concen広範囲のtrationsを確実に検出することができる。私たちは、範囲0ngと1,000ngの金額を検出した。 eGFPの定量。 (運ば20と40ngの間すなわち;参照は4および図5)当社は、菌糸体媒介輸送に、( すなわち、輸送0ng)汚染物質輸送することなく、サンプル中の相対的なeGFPの誘導を比較し、汚染源( すなわち、最大の直接接触を持つ利用可能な量)。これらの3つのケースが記載されている方法とよく区別可能であることが判明した。しかし、我々は相対的なeGFPの誘導の解像度により詳細な文を作ることができません。この問題は、縮図のセットアップにおける相関のeGFP誘導と異なる汚染物質の量を連結することにより、将来的に対処することができる。
13 ペトリ皿材料 プラスチック製のペトリ皿は、菌糸のPAH転座および/または生物学的利用能の過小評価になることがあります。これはいけない定性的な文が熱望されている場合、問題が発生する。ケースで正確な定量的な測定が、必要とされるガラスペトリ皿の適用は、より不便になる準備とハンドリングにもかかわらず、考慮されるべきである。

可能な落とし穴の表3.の議論。前および実験と提案したコメントとオプションの間に可能な落とし穴。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

提示縮図のセットアップは菌糸体による取り込みおよび輸送の後に生物を劣化させることに空間的に分離され、化学物質の生物学的利用能を研究するのに適して証明した。部分的に揮発性化合物の潜在的気相輸送が防止され、細菌のバイオレポーター細胞が重要なシステムの最小の妨害で、従って精巧なサンプル調製を必要とせずに可視化することができる。同時に、サンプルの化学分析が容易に得られる結果を良好に制御するために、総輸送の定量化を可能に行うことができる。しかし、いくつかの点を注意深く前および実験の実行中に考慮されなければならない。重要な点は、任意の細菌または化学的架橋汚染の自由微小生態系を維持することである。多くの微小生態系が並列で実行され、従って、(例えば、デシケーターなど)大きなインキュベーションチャンバーが必要とされるので、これは困難な場合があります。したがって、前のセットアップconstrucに慎重にすべての部品を殺菌することが重要であるる。別の重要な点は、マイクロコズムプラスチックペトリ皿のアプリケーションであってもよい。 PAHとバイオレポーターが直接接触し得ないが、PAHある量のプラスチック材料によって吸収されてもよい。これがもたらすであろうしかし、私たちは菌糸PAH-転座および/または生物学的利用能の過小評価で、もしあれば、記載されたプロトコルのために、この問題にはならないことを検討してください。正確な定量化が必要な場合に取り扱いが不便になるが、いずれにせよ、それは、ガラス部品と樹脂部品を交換することを考慮すべきである。考慮すべきその他の見所には、選択された化学物質や実用的な側面(微生物、ボラティリティ、検出限界に対する毒性作用)(漂白、eGFPの制限、選ばれた細菌や真菌株(可能な相互抑制、成長率、機動性と可能性自家蛍光)を伴うのeGFP RELの誘導および計算)。潜在的な落とし穴とそれぞれのコメントの概要が記載されています表3。

私たちは、直接細胞菌糸の相互作用のレベルで飽和システムの菌糸FLU輸送およびその後の細菌による分解を実証するために、このモデルの縮図のセットアップを使用していました。我々のモデルのセットアップを変えるとの存在下で細菌に対する菌糸の影響を評価するためにこのように、システムは、例えば(i)のために使用することができるなど 、種々の細菌及び真菌株、化学的化合物とのさまざまなニーズを満たすように調整することができるそうでなければ制限され、化学的( 例えば、毒性)源、(ii)は、細菌による分解のための化合物の生物学的利用能に対する菌糸の影響を予測するための(iii)の輸送ベクターへの細菌の距離に応じて汚染物質のバイオアベイラビリティを研究するために、または(iv)の異なる化学源( 例えば、結晶性、土壌中または溶解された)の効果を調査する。しかし、に対するシステムの調整lternate条件を繊細になり、明確な結果を達成するために、段階的に行われるべきである。これまでのところ、我々は他の細菌又は真菌株とPAH以外の化合物のためのシステムをテストしていません。菌糸ネットワークはまた、殺虫剤19またはサリチル酸20のような水溶性物質のようなPAH以外の汚染物質を輸送することが知られているので、我々はシステムが化合物固有の細菌のバイオセンサー与えられたの異なる化合物に拡張することができると思います。

のeGFP RELの異なる計算株適用バイオレポーターによっては望ましい場合がございますのでご了承ください。代わりに、式(1)の次の二つのオプションが適用され得る。

式2 (2)

式3 (3)

Howeverは、提示されたプロトコルの式(1)は、以下の理由により選択した:(ii)のmCherryを異なるセル13のためのかなりの変動を示すことが報告されたのに対し、(i)のeGFPの強度は、セル14にPAH束に相関することが報告された。式(2)および(3)対照的に、サンプル中の潜在的な光アーチファクトから虚偽の情報を防ぐように選択することができる。いずれのケースでは、統計的有意差は見つからなかったことにより、互いのすべての3つの計算方法を比較した。それでも、mCherryを蛍光強度の報告変動による、我々は、式を使用することを推奨する(1)又は(2)。

最後に、技術のいくつかの制限が考慮されるべきである。微小生態系を試験化合物の気相輸送を防止するように設計されたので、化合物の菌糸体の取り込みが減少する。これは、妨害されずに摂取して予想されるよりも低い輸送速度をもたらす。ビオレのため、感度ポーター株は、生物学的に利用可能な画分の小さな変化を検出するのに十分に高くなければならない。さらに、セットアップは、おそらく低い成長率との真菌株には適していないでしょう。この場合には、長期のインキュベーションは、このように、偽陽性の結果をもたらす汚染物質の気相輸送を好むかもしれない。これは、汚染物質は、後の時点で適用することができるように設定を変更することが可能であろう。しかし、菌糸はその後接種点ですでに非アクティブまたは死んだかもしれない。前述したように最後に、菌糸のネットワークによって輸送される化合物の範囲が大きいです。しかし、適切なバイオレポーター株の可用性が制限重要な要因である可能性があります。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal Microscope Leica TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM
GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD Agilent an equivalent GC/MS may be used
GC capillary column J&W 121-5522              Agilent
Cork borer Fisher Scientific 12863952 or any other
Cover slips Marienfeld 107222 High performance, No.1.5H
GC/MS insterts WICOM WIC 47080
GC/MS vials 2 ml WICOM WIC 41150
Lids / septa for screw cap vials DIONEX 49463 / 049464 
Lids for GC/MS vials WICOM WIC 43948/B
Objective Slides Menzel ordinary
PDMS coated glass fibers Polymicro Technologies, Inc. V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1
Petri Dishes small / big Greiner 633-102 / 628-102
Screw cap vials 40 ml DIONEX 48783 other glass vials may be used
Screw cap vials 60 ml DIONEX 48784 other glass vials may be used
Acenaphthylene d08 Dr. Ehrenstorfer C 20510100
Acetone Carl Roth 9372.2
Activated carbon Sigma-Aldrich 242276-1kg
Agarose Carl Roth 2267.4
Fluorene Fluka 46880
Kanamycin sulfate Carl Roth T832.2 50 mg L-1
Methanol Carl Roth P7171
Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest
Solution 1
Ammonium sulfate Carl Roth 3746.1 5 g L-1 
Magnesium chloride x 6 H2O Carl Roth 2189.1 1 g L-1
Calcium nitrate x 4 H2O Carl Roth P740.1 0.5 g L-1
Solution 2
Disodium phosphate Carl Roth P030.1 55.83 g L-1
Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1 20 g L-1
Solution 3 (pH 6.0)
Disodium EDTA MERCK 1084180250 0.8 g L-1
Iron(II) chloride x 4 H2O MERCK 1038610250 0.3 g L-1
Cobalt(II) chloride x 6 H2O Carl Roth T889.3 4 mg L-1
Manganese(II) chloride x 1 H2O Carl Roth 4320.2 10 mg L-1
Copper(II) sulfate Carl Roth P023.1 1 mg L-1
Sodium molybdate x 2 H2O Carl Roth 0274.1 3 mg L-1
Zinc chloride MERCK 1088160250 2 mg L-1
Lithium chloride Carl Roth P007.1 0.5 mg L-1
Tin(II) chloride x 2 H2O Carl Roth 4473.1 0.5 mg L-1
Boric acid Riedel-de-Haen              11606 1 mg L-1
Potassium bromide Carl Roth A137.1 2 mg L-1
Potassium iodide Carl Roth 6750.1 2 mg L-1
Barium chloride Carl Roth 4453.1 0.5 mg L-1
MMA Minimal medium + agarose 0.2%
Phenanthrene d10 Dr. Ehrenstorfer C 20920100
Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8
Potato Dextrose broth Difco/ Beckton Dickinson 254920
Bacto-agar Difco/ Beckton Dickinson 214040
Sodium acetate x 3 hydr. Carl Roth 6779.1
Sodium sulfate MERCK 1066495000
Toluene MERCK 1083252500
mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl
Yeast extract Merck 1037530500
Tryptone Serva 4864702
Sodium chloride Carl Roth 3957.1
ImageJ with logi tool plugin http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum strain 67-1 Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland
Burkholderia sartisoli RP037-mChe Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
  2. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
  3. Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
  4. Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
  5. Griffin, D. M. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. Soil Science Society of America. 141-151 (1981).
  6. Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. Soil Science Society of America. 1-22 (1981).
  7. Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
  8. Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
  9. Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
  10. Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
  11. Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
  12. Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
  13. Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
  14. Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
  15. Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
  16. Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. Manual of methods for general bacteriology. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).
  17. Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  19. Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).
  20. Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
水不飽和システムにおける有機汚染物質の輸送および生物学的利用能を評価するために、全細胞バイオレポーターアプローチ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).More

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter