Utnyttja Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cykloaddition för Pretargeted PET Imaging

Introduction

Under de senaste trettio åren har positronemissionstomografi (PET) blivit ett oumbärligt kliniskt verktyg vid diagnos och hantering av cancer. Antikroppar har länge ansetts lovande vektorer för leverans av positron-emitterande radioisotoper till tumörer på grund av deras utsökta affinitet och specificitet för cancer biomarkörer. ^1,2 emellertid den relativt långsamma in vivo farmakokinetik antikroppar mandat användning av radioisotoper med flera dagar fysiska halveringstider. Denna kombination kan ge höga stråldoser till de icke-målorgan för patienterna, en viktig komplikation som är av särskild klinisk betydelse, eftersom radioimmunoconjugates injiceras intravenöst och därför - till skillnad partiella kropps datortomografi - resultatet i absorberade doser i varje del av kroppen, oberoende av de avlästs vävnader.

För att kringgå detta problem, har betydande ansträngningar ägnats åt development PET imaging strategier som frikoppla radioisotop och måldelen därigenom utnyttja de fördelaktiga egenskaper antikroppar samtidigt lister deras inneboende farmakokinetiska begränsningar. Dessa strategier - oftast kallas pretargeting eller flerstegs inriktning - vanligtvis sysselsätter fyra steg: (1) administrering av en antikropp som kan binda både ett antigen och en radioligand; (2) ackumuleringen av antikropp i målvävnaden och dess clearance från blodet; (3) administrering av en liten molekyl radioligand; och (4) ligering in vivo av radioliganden till antikroppen, följt av den snabba elimineringen av överskott radioligand. ^3-8 I vissa fall är ett ytterligare renande ämne injiceras mellan stegen 2 och 3 i syfte att påskynda utsöndringen av varje antikropp som ännu binda tumören och förblir i blodet. ⁵

I stort sett, two typer pretargeting strategier är mest förekommande i litteraturen. Medan både har visat sig framgångsrika i prekliniska modeller, de har också viktiga begränsningar som har hindrat deras kliniska tillämpbarhet. Den första strategin är beroende av hög affinitet mellan streptavidinkonjugerat antikroppar och biotinmodifierade radiomarkörer; emellertid, har immunogeniciteten av de streptavidin-modifierade antikroppar visat sig vara ett oroande problem med avseende på translation. ^5,6,9,10 Den andra strategin, i kontrast, sysselsätter bispecifika antikroppar som har blivit genetiskt modifierade för att binda både en cancer biomarkör antigen och en liten molekyl radiomärkt hapten. ^3,11-14 Medan detta sistnämnda vägen är förvisso kreativ, är dess breda tillämplighet begränsad av komplexiteten, kostnaden och avsaknaden av modularitet hos systemet.

Nyligen, vi utvecklat och publicerat en pretargeted PET imaging metod som bygger på den omvända elektron efterfrågan Diels-Alder (IEDDA) cykloadditionsreaktion mellan trans -cyclooctene (TCO) och tetrazin (Tz;. Figur 1) ¹¹ Medan själva reaktionen har varit känt i årtionden, har IEDDA kemi upplevt en renässans på senare år som klickkemi biokonjugering teknik, vilket illustreras av fascinerande arbete av grupperna av Ralph Weissleder, Joseph Fox, och Peter Conti bl. ^12-15 Den IEDDA cykloadditionen har tillämpats i ett brett spektrum av inställningar, inklusive fluorescens avbildning med peptider, antikroppar och nanopartiklar samt kärnavbildning . med både radiohalogens och radiometaller ^16-26 Ligerings är högavkastande, ren, snabb (k _1> 30.000 M ^-1 sek ^-1), selektiv, och - kritiskt -. bioorthogonal ²⁷ Och medan ett antal typer av klickkemi - inklusive Cu-katalyserad azid-alkyn cykloadditioner, belastnings främjat azid-alkyn cykloadditioner och Staudinger LIGsamhet -. är bioorthogonal också, det är den unika kombinationen av snabba reaktionskinetik och bioorthogonality som gör IEDDA kemi så väl lämpad för pretargeting applikationer hela organismer ^28,29 Längs dessa linjer, är det viktigt att notera att färsk rapport från vår laboratorier var inte den första att tillämpa IEDDA kemi till pretargeting: den första rapporten från pretargeted avbildning med IEDDA uppstod från arbetet av Rossin, et al och innehöll en SPECT metodik som använder en ¹¹¹ In-märkta tetrazin ^30..

Som vi diskuterat ovan har pretargeting metodik fyra ganska enkla steg (Figur 2). I protokollet till hands, kommer en pretargeted strategi för PET avbildning av kolorektal cancer som sysselsätter ett ⁶⁴ Cu-NOTA-märkta tetrazin radioligand och TCO-modifierad konjugat av huA33 kroppen beskrivas. Dock är en av dess gr slutligen modularitet denna metodikäter av tillgångar, såsom trans -cyclooctene delen kan fogas till varje icke-internaliserande antikropp, och tetrazin kan fästas på en mängd olika radioaktiva reportrar.

Protocol

ETIK UTTALANDE: Alla de in vivo djurförsök beskrivna utfördes enligt ett godkänt protokoll och under de etiska riktlinjerna i Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).

1. Syntes av Tz-Bn-NOTA

1. I ett litet reaktionskärl, lös 7 mg NH ₂ -Bn-NOTA (1,25 x 10 ^-2 mmol) i 600 | il NaHCOs ₃ buffert (0,1 M, pH 8,1). Kontrollera lösningens pH. Om det behövs, justera pH i lösningen till 8,1 med hjälp av små portioner av 0,1 M Na ₂ CO _3.
2. Lägg NH ₂ -Bn-NOTA lösning till 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 ^-3 mmol) i en 1,7 ml mikrocentrifugrör.
   OBS: Tz-NHS kan antingen vägas ut torr eller sattes från en stamlösning av torr DMF eller DMSO (<50 pl).
3. Låt den resulterande reaktionslösningen reagera under 30 min vid RTmed mild omröring.
4. Efter 30 minuter, rena produkten med användning av omvänd fas C ₁₈ HPLC-kromatografi för att avlägsna oreagerad NH ₂ -Bn-NOTA. NH ₂ -Bn-NOTA kan övervakas vid en våglängd på 254 nm, medan Tz-NHS och Tz-Bn-NOTA bäst övervakas vid en våglängd på 525 nm.
   OBS: Retentionstider är uppenbarligen mycket beroende av HPLC-utrustningen uppsättningen för varje laboratorium (pumpar, pelare, rör, etc.). Emellertid, för att presentera ett exempel, om en gradient av 0: 100 MeCN / _H2O (båda med 0,1% TFA) till 100: 0 MeCN / _H2O under 25 min och en analytisk 4,6 x 250 mm C ₁₈ kolonn används , retentionstiderna av Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, och NH ₂ -Bn-NOTA kommer att vara runt 15 min, 16,5 min och 10 min. Produkten kan renas från de övriga reaktionskomponenterna i antingen en enda körning eller flera körningar med en semipreparativ eller preparativ C ₁₈ HPLC-kolonn. ¹ H-NMR, analytical HPLC, och ESI-MS är alla metoder som kan användas för att kontrollera renheten hos den färdig Tz-Bn-NOTA gångare. ¹¹
5. Frysa insamlade HPLC elueringsmedlet hjälp av flytande kväve.
6. Linda frysta uppsamlingsröret i ogenomskinliga aluminiumfolie.
7. Placera den frysta uppsamlingsröret i en frystorkning kärl O / N för att avlägsna HPLC mobil fas.
8. Förvara den renade produkten (en ljus rosa fast substans) i mörker vid -80 ° C.
   OBS: Detta är en acceptabel stoppställe i förfarandet. Det ifyllda Tz-Bn-NOTA gångare är stabil i minst 1 år under dessa förhållanden.

2. Beredning av huA33-TCO Immunkonjugat

1. I en 1,7 ml mikrocentrifugrör, förbereda en 1 mg / ml (2,7 mM) lösning av TCO-NHS i torr DMF.
2. I en 1,7 ml mikrocentrifugrör, förbereda en 2 mg / ml (13,3 ^ iM) lösning av huA33 i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,4 (0,01 M PO _{4 ^3-,}
3. Med små alikvoter (<5 pl) av 0,1 M Na ₂ CO _3, justera pH hos antikropplösningen till 8,8-9,0. Använd antingen pH-papper eller en pH-mätare med en mikroelektrod för att övervaka pH och vara noga med att inte låta pH stiga över pH 9,0.
4. När antikroppslösningen är vid korrekt pH-värde, tillsätt en mängd TCO-NHS lösningen motsvarande 8 molekvivalenter av den aktiverade estern. Till exempel lägga 7.9 ìl av 1 mg / ml TCO-NHS-lösning (1,07 x 10 ^-7 mol TCO-NHS) till 1 ml av 2 mg / ml huA33 antikroppslösning (1,33 x 10 ^-8 mol huA33). Inte överstiger 5% DMF i volym i lösningen.
5. Blanda försiktigt lösningen genom att vända mikrocentrifugrör flera gånger.
6. Linda mikrocentrifugrör i ogenomskinliga aluminiumfolie.
7. Låt lösningen inkubera under 1 h vid RT med mild omröring.
8. Efter 1 h vid RT, rena den resulterande immunkonjugatet med användning av en i förväg packad disponibel size uteslutning avsaltningskolonn. Först, skölj storleksuteslutningskolonn såsom beskrivits av tillverkaren för att avlägsna eventuella förekommande konserveringsmedel på kolonnen under lagring. Lägg sedan till reaktionsblandningen till den storleksuteslutningskolonn, skölj kolonnen med 1,5 ml 0,9% steril saltlösning, och därefter samla upp produkten med användning av 2 ml av 0,9% steril saltlösning som elueringsmedel.
   OBS: Detta steg kommer att ge den färdiga huA33-TCO som en 2 ml lösning.
9. Mäta koncentrationen av den resulterande huA33-TCO på en UV-Vis spektrofotometer.
10. Om en högre koncentration är önskvärt, koncentrera huA33-TCO-lösning med användning av en centrifugfilterenhet med en 50.000 molekylvikt cut-off.
    OBS: Det är viktigt att notera att medan huA33 och en rad andra välkända antikroppar (t.ex. bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, och J591) är mycket toleranta för att koncentreras, kan aggregering och nederbörd uppträda då koncentrationen i andra fall. Forskare försöker detta procedure med en ny antikropp bör lita litteraturen eller sin egen kunskap om antikroppen i fråga med hänsyn till om de vill koncentrera antikroppen.
11. Förvara färdig huA33-TCO immunkonjugat vid 4 ° C i mörker.
    OBS: Detta är en acceptabel stoppställe i förfarandet. Det ifyllda mAb-TCO konjugat bör vara stabil i minst 3 månader under dessa lagringsförhållanden.

3. ⁶⁴ Cu Radiomärkning av Tz-Bn-NOTA

Anmärkning: Detta steg av protokollet innebär hantering och manipulering av radioaktivitet. Innan du utför dessa steg - eller gör något annat arbete med radioaktivitet - forskare bör rådgöra med sin hemmainstitutets Strålsäkerhetsmyndigheten avdelning. Vidta alla möjliga för att minimera exponeringen för joniserande strålning.

1. I en 1,7 ml mikrocentrifugrör, förbereda en 0,5 mg / ml (723 ^ M) lösning av Tz-Bn-NOTA.
2. I en 1,7 ml MicroCentrifuge röret, tillsätt 10 ìl av Tz-Bn-NOTA lösning (5 mikrogram) till 400 pl 0,2 M _NH4OAC pH 5,5 _buffert.
3. Med tanke på riktig radiokemisk notering bevarande, mäta och registrera mängden radioaktivitet i provet med hjälp av en doskalibrator före och efter de följande stegen i protokollet nedan (3,4-3,8). Detta kommer att hjälpa till med noggrann bestämning av radiokemiska avkastning.
4. Lägg 2000 iCi (74 MBq) av ⁶⁴ Cu till Tz-Bn-NOTA lösning.
   OBS: Typiskt ^[64 Cu] _CUCI2 levereras i en liten volym (<30 l) av 0,1 N HCl, och därmed endast små volymer (<10 l) av denna stamlösning behövs för radiomärkning reaktionen. Om större volymer av ^[64 Cu] _CuCl2 lager behövs, är radiomärkningsreaktionen toleranta att öka den totala reaktionsvolymen. Dock bör pH-värdet i radiomärkningsreaktionslösningen övervakas noggrant för att säkerställaatt det inte faller under pH 4,0.
5. Låt lösningen inkubera under 10 minuter vid RT med mild omröring.
6. Efter 10 minuters inkubering, rena produkten med användning av omvänd fas C ₁₈ HPLC-kromatografi. Retentionstider är uppenbarligen mycket beroende av HPLC-utrustningen uppsättningen för varje laboratorium (pumpar, pelare, rör, etc.). Emellertid, för att presentera ett exempel, om en gradient av 5:95 MeCN / _H2O (båda med 0,1% TFA) till 95: 5 MeCN / _H2O under 15 minuter användes, retentionstiden för ⁶⁴ Cu-Tz- Bn-NOTA bör vara cirka 9,8 minuter medan fri, icke komplexbunden ⁶⁴ Cu kommer eluera med lösningsmedelsfronten på runt 2-4 min.
7. Med användning av en rotationsindunstare, avlägsna HPLC-elueringsmedel.
8. Lös åter upp ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA produkten i 0,9% steril saltlösning.
   OBS: Med tanke på 12,7 tim fysiska halveringstid på ⁶⁴ Cu, är detta inte en acceptabel stoppställe i förfarandet. Utför syntesen av ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-INTEEtt omedelbart före injektionen av radioliganden, och följa steg 3,7 omedelbart för steg 4,5.

4. In vivo Pretargeted PET Imaging

OBS: Som i protokoll 3 §, detta steg av protokollet innefattar hantering och manipulering av radioaktivitet. Innan du utför dessa steg forskare bör rådgöra med sin hemmainstitutets Strålsäkerhetsmyndigheten avdelning. Vidta alla möjliga för att minimera exponeringen för joniserande strålning.

1. I en kvinnlig atymisk naken mus, subkutant implantat 1 x 10 ⁶ SW1222 kolorektal cancerceller och tillåta dessa att växa till en 100-150 mm ³ xenotransplantat (9-12 dagar efter inokulering). ¹¹
2. Späd en alikvot av huA33-TCO lösning från protokollenheten 2 till en koncentration av 0,5 mg / ml i 0,9% steril saltlösning.
3. Injicera 200 pl av huA33-TCO-lösning (100 | ig) i svansvenen av xenotransplantatet bärande mus.
4. Tillåt 24 h för ackumulering av den huA33-TCO i tumören av musen.
5. Späd ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA radioligand till en koncentration av 1,5 mCi / ml i 0,9% steril saltlösning.
6. Injicera 200 ìl av ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA radioligand lösning (300 ^ Ci, 11,1 MBq, 1,6 nmol av ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA, antar en specifik aktivitet av 6,7 MBq / nmol) i svansvenen av xenograft bärande möss.
7. Vid den önskade avbildningstiden punkt (t.ex., 2, 6, 12, eller 24 h efter injektion), söva musen med en 2% isofluran: syre gasblandning.
8. Placera musen på sängen av den lilla djuret PET-kamera. Upprätthålla anestesi under genomsökningen med hjälp av en isofluran 1%: syre gasblandning. Före placera djuret på skanner sängen, kontrollera anestesi använder toe-nypa-metoden och tillämpa veterinär salva för ögonen på musen för att förhindra uttorkning under anestesi.
9. Förvärva PET data för musen via en statiskskanna med minst 20 miljoner sammanfallande händelser med en energifönster 350-700 keV och en tillfällighet timing fönster 6 ns. Efter att ha avslutat förvärvet av bilden, inte lämna musen utan tillsyn och inte placera den i en bur med andra möss tills den har återfått medvetandet.

Representative Results

De inledande tre steg av experimentet - syntes av Tz-Bn-NOTA, konjugering av TCO till huA33, och den radiomärkning av Tz-Bn-NOTA konstruera (figurerna 3 och 4) - är mycket tillförlitliga. I fallet med förfarandet ovan, var Tz-Bn-NOTA konstruktion syntetiseras i högt utbyte och renhet. Den huA33 kroppen modifierades med 4,2 ± 0,6 TCO / mAb och Tz-Bn-NOTA radiomärktes med ⁶⁴ Cu för att ge den renade radioligand i> 99% radiokemisk renhet,> 85% förfall korrigerat avkastning, och en specifik aktivitet på ~ 6.7 MBq / nmol (Figur 5). Reaktiviteten hos huA33-TCO konjugat och tetrazin radioligand kan testas med hjälp av radioaktivt omedelbar tunnskiktskromatografi (ITLC). Detta görs genom att blanda den radiomärkta tetrazin (100 ^ Ci, 0,55 nmol, förutsatt en specifik aktivitet på 6,7 MBq / nmol) med ett litet överskott av huA33-TCO (50 mikrogram, 0,66 nmol) i phosphate-buffrad saltlösning (pH 7,4) vid RT under 5 min. Därefter, är ungefär 1 | iCi av lösningen i fläckar på en omvänd-fas C ₁₈ TLC-platta och tilläts torka. TLC körs i 9: 1 MeCN: _H2O, och plattan analyserades med en radioaktiv TLC plattläsare. Om klickreaktionen fungerar som planerat, bör den ligerade ⁶⁴ Cu-NOTA-A33 kvar på baslinjen; Om, å andra sidan, reaktionen misslyckas, kommer fri ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA visas vid eller nära lösningsmedelsfronten.

Går vidare till in vivo imaging experiment, i det protokoll som beskrivs ovan, var atymiska nakna möss med A33 antigen uttrycka, SW1222 kolorektal cancer xenografter anställda. Både akut biodistribution (n = 5 per tidpunkt) och PET imaging (n = 12) experiment visar att pretargeting strategin kan avgränsa den kolorektal tumörtillväxt med utmärkt bildkontrast och höga tumör-till-bakgrundsaktivitetsförhållanden (figur 6). Upptag av ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA i tumören framgår vid tidiga tidpunkter: 3,5% ± 0,6% ID / g och 4,1% ± 0,6% ID / g vid 1 timme och 4 timmar efter injektion, respektive. Men vid dessa tidiga punkter, är det lätt skyms av mängden radioaktivitet clearing genom tarmkanalen hos mus (11,9% ± 4,4% ID / g och 8,8% ± 3,4% ID / g i avföring vid 1 h och 4 hr pi, respektive). Under flera timmar, tömmer överskottet radioligand genom avföring (1,4% ± 0,5% ID / g vid 24 tim pi), och tumören blir mest framträdande i bilden (4,0% ± 0,9% ID / g vid 24 tim pi). Vid dessa senare tidpunkter, är tumören väl avgränsad i bilden, och tumör-till-bakgrundsaktivitetsförhållanden är ganska höga; till exempel, ger tumör strategin: muskel förhållanden av 26,6 ± 6,6 vid 12 tim pi och 27,0 ± 7,4 vid 24 tim pi Inte överraskande, kontrollexperiment med enbart ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-Nota, icke-specifika antikroppar, or huA33 utan konjugerade TCO delar alla resulterade i minimal upptag i tumören.

Såsom kommer att diskuteras ytterligare nedan, detta pretargeting strategi - liksom alla pretargeting strategier - har ett antal variabler som kommer att kräva optimering när det tillämpas på nya antikropp / antigen-system. Två av de viktigaste är massan av mAb-TCO konstruktion injiceras och längden på intervallet mellan injektion av mAb-TCO konstruktion och injektion av radioliganden. Om mängden mAb-TCO konjugat är för hög eller intervalltiden mellan injektionerna är för kort, mängden fritt mAb-TCO i blodet går upp och sannolikheten för klickreaktioner förekommer i blodet i stället för vid tumör ökar. Till exempel i den ⁶⁴ Cu / huA33 system som diskuteras här, både administrering av 300 ^ g av huA33 (snarare än 100 pg) eller användning av en 12 h intervalltid (snarare än 24 h) resulterade i märkbara ökningar i than mängden radioaktivitet synlig i hjärtat av mus (figur 7A och Figur 7B, respektive). I båda dessa fall är klickreaktionen fortfarande klart inträffar vid tumören, vilket illustreras av den mängd tumörupptag vid tidiga tidpunkter; är emellertid också uppenbart att bildandet av radiomärkt antikropp i blodet. Även om detta är frestande att avfärda eftersom den radioaktivt märkta antikroppar bildats i blodet kommer fortfarande småningom hitta sin väg till tumören, denna något besegrar syftet med att använda en pretargeting metodik, eftersom radiomärkta antikroppen kommer att cirkulera långsamt innan det når tumören och därmed höja dosrater till icke-målorgan. Omvänt, om en för liten antikropp används, mängden upptag i tumören kommer naturligtvis att drabbas. Alltför långa intervalltider kan också minska nivåerna av tumörupptag på grund av långsam antikroppsinterna, transcyclooctene isomerisering eller antikropp / antigen utgjutelse. Diagnosen thESE problem är mer utmanande och kan inte uppnås enbart genom granskning av PET-data. Tydligt, måste upprätthållas en känslig balans. Därför rekommenderas det att alla utredare försöker tillämpa denna strategi till en ny antikropp / antigen-systemet använder stora mängder mAb-TCO konstruktion (≥ 200 ng) och korta intervalltider (≤ 24 tim) som utgångspunkter och optimera därifrån.

Figur 1. Den inversa elektron-demand Diels-Alder [4 + 2] cykloaddition klick ligering mellan tetrazin och transcyclooctene.

Figur 2. En illustration av de fyra stegen i pretargeting metodiken. Denna siffra är baserad på forskning som ursprungligen publicerades i JNM. Zeglis, BM et al. En pretargeted PET imaging strategi based på bioorthgonal Diels-Alder klick kemi. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 av Society of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Ett system för ändring av huA33 med TCO-NHS.

Figur 4. Ett system för syntes och ⁶⁴ Cu radiomärkning av Tz-Bn-NOTA. Denna siffra är baserad på forskning som ursprungligen publicerades i JNM. Zeglis, BM et al. En pretargeted PET imaging strategi baserad på bioorthgonal Diels-Alder klicka kemi. Journal of Medicine. Nuclear 54, 1389-1396 (2013). &# 169; 2013 av Society of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Ett radio HPLC spår av renat ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA.

Figur 6. PET bilder av ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA / A33-TCO pretargeting strategi. Möss som bär subkutana SW1222 xenotransplantat (100-150 mm ³⁾ administrerades huA33-TCO (100 mikrogram) via svansvenen injektion. Efter 24 timmar, var samma mössen administrerades ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 iCi]) via svansvenen injektion och därefter avbildas 2, 6, 12, och 18 timmar efter administrering av radiofarmakon. Transverse (överst) och koronala (nederst) plana bilderna skär centrum av tumörerna. Höga nivåer av upptag i tarmen vid tidiga tidpunkter (dvs, 2 och 6 h) i stort sett klara med 12 tim, lämnar tumören (vit pil) tydligt avgränsad från alla icke-målvävnad med 12 och 18 timmar efter injektion. Denna siffra är baserad på forskning som ursprungligen publicerades i JNM. Zeglis, BM et al. En pretargeted PET imaging strategi baserad på bioorthgonal Diels-Alder klicka kemi. Journal of Medicine. Nuclear 54, 1389-1396 (2013). © 2013 av Society of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7. PET bilder av suboptimala pretargeting experiment. (A) Möss bearing subkutana SW1222 xenotransplantat (100-150 mm ^3, pil) administrerades huA33-TCO (100 mikrogram) via svansvenen injektion. Efter 12 timmar, var samma mössen administrerades ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 xCi]) svansvenen injektion. (B) Möss med subkutana SW1222 xenotransplantat (100-150 mm ^3, pil) administrerades A33-TCO (300 mikrogram) via svansvenen injektion. Efter 24 timmar, var samma mössen administrerades ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 xCi]) svansvenen injektion. I båda fallen, mössen avbildas 12 timmar efter injektion av ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA. I båda panelerna, tvärgående (topp) och koronala (bottom) plana bilder korsar centrum av tumörerna. Medan pretargeting strategin delineates tydligt tumören i båda fallen, resultaten i båda dessa bilder är undermåliga jämfört med dem som visas i figur 6. I både 7A och 7B, det finns enbetydande mängd bakgrundsaktivitet upptag i hjärtat. Enligt villkoren i figur 7A, är detta troligen resultatet av huA33-TCO konstruera inte ges tillräckligt med tid för att lokalisera i tumören. Enligt villkoren i figur 7B, är detta sannolikt en konsekvens av att injicera för mycket huA33-TCO och har överskotts immunkonjugat fortfarande cirkulerar i blodet, även 24 timmar efter injektion. Denna siffra är baserad på forskning som ursprungligen publicerades i JNM. Zeglis, BM et al. En pretargeted PET imaging strategi baserad på bioorthgonal Diels-Alder klicka kemi. Journal of Medicine. Nuclear 54, 1389-1396 (2013). 2013 av Society of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den huvudsakliga fördelen med denna pretargeted PET imaging strategi är att den kan avgränsa tumörer med mål-till-bakgrundsbild kontrast på bara en bråkdel av bakgrunds stråldos som produceras av direkt märkta antikroppar. Till exempel i den kolorektal cancer avbildningssystemet beskrivs här, var data från akut biodistribution experiment används för att utföra dosimetri beräkningar för ⁶⁴ Cu-baserade pretargeting strategi tillsammans med direkt-märkt ⁶⁴ Cu-NOTA-huA33 och ⁸⁹ Zr-DFO-huA33. Dessa beräkningar visar tydligt de dosimetriska fördelarna med pretargeting systemet, särskilt jämfört med den mer kliniskt relevant ⁸⁹ Zr-märkt antikropp. Den effektiva dosen av pretargeting strategin är 0,0124 mSv / MBq, medan den för ⁸⁹ Zr-DFO-huA33 är över 30 gånger högre: 0,4162 mSv / MBq. Den dosimetrisk fördelen med pretargeting är mindre uttalad om man jämför med de ⁶⁴ Cu-märkt ettntibody (0,0359 mSv / MBq), även om den fördelaktiga effekten fortfarande existerar.

En av de viktigaste styrkor av detta IEDDA pretargeting metodik är dess modularitet: trans -cyclooctene kan läggas till varje antikropp som inte internalisera, och ett brett utbud av last kan fästas på tetrazin. Faktum är vår främsta motivation för att skriva detta protokoll för att andra forskargrupper för att använda denna metod med olika antikropp / antigen / radioisotoper system. Längs dessa linjer, anser vi att det är viktigt att ta itu med ett antal frågor som forskare bör tänka på när anpassa detta metodik för andra system.

För det första är valet av antikroppen oerhört viktigt. Enkelt uttryckt, måste antikroppen vara icke-internaliserande eller internaliserad i mycket långsam takt. Medan de ideala kinetiska parametrar har ännu inte fastställts, antikroppen och den reaktiva trans -cyclooctene det bär måste vara påutsidan av cellen, för interna och kvarstad av antikroppen före injektionen av radioliganden skulle dramatiskt minska antalet in vivo klicka reaktioner. I det system som beskrivs här, huA33 mål antikroppar och binder till A33-antigen, en trans glykoprotein uttryckt i> 95% av alla kolorektala cancrar. Viktigare har det visat sig att även efter att binda dess mål, förblir huA33 antikropp / antigenkomplex på ytan av cellen i dagar. ^31-33 Medan nödvändigheten av en icke-internaliserande antikropp är visserligen en begränsning till strategin, en brett utbud av icke-internalise antikroppar är kända, kanske notably TAG72 inriktning CC49 antikropp som Rossin, et al. har utforskat i sin utmärkta pretargeting arbete. ^30,34,35

För det andra, detta pretargeting strategi - som alla andra - kräver betydande optimering. Förutom identiteten av enntibody och tetrazin radioliganden, måste två kritiska variabler beaktas: mängden antikroppar injiceras och intervalltiden mellan injektioner av antikroppen och radioliganden. Vi har tagit upp båda dessa variabler i avsnittet Representativa resultat ovan, men att upprepa kort, om någon för mycket antikroppar eller för kort intervall tid är anställd, betydande mängder mAb-TCO konjugat kvar i blodet vid tiden för injektionen av radioliganden. Detta, i sin tur, kommer att resultera i den in vivo-klick ligering inträffar i blodet snarare än vid tumören, bildar cirkulerande, radiomärkt antikropp som endast långsamt kommer att ackumuleras i tumören med tiden. Omvänt, om någon för lite antikropp eller för lång intervall tid används, kommer den slutliga mängden radioaktivitet i tumören vara suboptimalt. Enligt vår mening, att utföra rigorösa avbildning, eller helst, akuta biodistributionsdata experiment med direkt märkt antikropp itself före eventuella pretargeting experiment är det mest tillförlitliga sättet att lära sig om hur mycket antikroppar behövs och den ideala intervallet tid efter den första injektionen av antikropps konstruktion. För olika injicerade massor av radiomärkt mAb, kommer dessa experiment ge konkreta uppgifter om både clearance av radioimmunoconjugate från blodet och dess ackumulering i tumören, vilket möjliggör val av de mest lovande förutsättningar för pretargeting experimenten.

Slutligen måste farmakokinetiken av tetrazin baserade radioligand beaktas när man väljer en lämplig radioisotop. I det system som beskrivs här, är det radiomärkta Tz-Bn-NOTA delen utsöndras från kroppen via tarmen med en biologisk halveringstid på cirka 3-4 timmar, vilket gör ⁶⁴ Cu den positron-emitterande radioisotop med de mest kompletterande fysiska halv liv. Tyvärr är den biologiska halveringstiden av tetrazin delen för lång för att det ska vara förenligt med the snabbare ruttnande radiometall ⁶⁸ Ga (t _1/2 = 68 min). I detta fall skulle varje radioaktivitet i tumören avklinga genom flera halveringstider innan överskottet radioligand åtgärdat från kroppen. Som ett resultat, skulle bilderna måste anskaffas vid tidiga tidpunkter, då tumör-till-bakgrundsaktivitetsförhållanden förblir låg ³⁶ Helst skulle framtida generationer av tetrazin radioligander konstrueras -. Kanske via PEGylering, glykation, eller på annat sätt - att utsöndra från kroppen snabbare. Detta skulle möjliggöra radiomärkning med snabbare ruttnande radioisotoper, såsom ⁶⁸ Ga och ¹⁸ F, vilket i sin tur skulle ytterligare stärka dosimetriska fördelarna med pretargeted avbildningsstrategin. Ytterst, eftersom forskare anpassa denna teknik för användning med andra radioisotoper för bildåtergivning (t.ex., ¹²⁴ I, ¹¹¹ I, ¹⁸ F, ⁸⁹ Zr, ⁶⁸ Ga, etc) eller terapi (t.ex. 177 Lu, ²²⁵ Ac, ¹²⁵ I, etc.), kommer nya tetrazin baserade ligander behöver utvecklas för att inkorporera olika kelatbildare eller radiomärkning av prostetiska grupper. Den grundlig undersökning av farmakokinetiken för dessa nya konstruktioner kommer att vara avgörande för att säkerställa fördelaktiga matcher mellan clearance egenskaperna hos ligander och den fysiska halveringstiden av radionuklider.

I slutändan hoppas vi verkligen att andra forskare ser löftet om detta pretargeting teknik och anställa den med nya antikropp / antigen-system. Medan föregående stycken visar att denna anpassning inte alltid kan vara enkel, är det vår övertygelse att denna metod skulle kunna ha en betydande inverkan på kärnavbildning, målinriktad radionuklid terapi, och därefter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C