Summary
Isoleringen av individuella dopaminneuroner eller ventrala tegmentumområdet med direkt eller indirekt immunohistokemi demonstreras med hjälp av laser capture microdissection. Parametrar för isolering av vävnad från en glasskiva med hjälp av en infraröd laser och från membran diabilder som använder en kombination av en infraröd och ultraviolett laser diskuteras.
Abstract
Laser capture microdissection (LCM) används för att isolera en koncentrerad population av enskilda celler eller exakta anatomiska regioner av vävnad från vävnadssnitt på ett objektglas. När de kombineras med immunohistokemi, kan LCM användas för att isolera individuella celltyper baserade på en specifik proteinmarkör. Här, är LCM beskrivna tekniken för insamling av en specifik population av dopaminneuroner direkt märkta med tyrosinhydroxylas immunohistokemi och för isolering av dopaminneuron innehållande regionen av den ventrala tegmentala området med hjälp av indirekt tyrosinhydroxylas immunhistokemi på ett avsnitt intill de som används för LCM. En infraröd (IR) Avskiljning laser används för att både dissekera enskilda neuroner liksom den ventrala tegmentala området utanför glasskivor och på en LCM lock för analys. Fullständig dehydratisering av vävnaden med 100% etanol och xylen är kritisk. Kombinationen av IR-infångnings lasern och ultraviolett (UV) cutting laser används för att isolera enskilda dopaminneuroner eller ventrala tegmentumområdet när PEN membran diabilder. En PEN-membran slide har betydande fördelar jämfört med en glasskiva som det erbjuder bättre konsekvens i att fånga och samla celler, är snabbare att samla stora bitar av vävnad, är mindre beroende av uttorkning och resulterar i fullständigt avlägsnande av vävnad från bilden. Även borttagning av stora delar av vävnad från en glasskiva är genomförbart, det är betydligt mer tidskrävande och ofta lämnar några restvävnad bakom. Data som visas här visar att kan erhållas RNA av tillräcklig kvantitet och kvalitet med användning av dessa förfaranden för kvantitativ PCR-mätningar. Även RNA och DNA är de mest isolerade molekyler från vävnader och celler som samlats med LCM, isolering och mätning av mikroRNA, protein och epigenetiska förändringar i DNA kan också dra nytta av den förbättrade anatomiska och cellulära upplösning erhålls med hjälp LCM.
Introduction
All vävnad består av en heterozygot population av celler. Detta är särskilt relevant för hjärnvävnad, som består av olika morfologiskt och / eller neurokemiskt distinkta nervceller omgivna av olika typer av gliaceller (oligodendrocyter, mikroglia och astrocyter). Dessutom distinkta regioner i hjärnan, såsom områden av hjärnbarken eller hjärnstamskärnor, har specifika funktioner. Därför är förmågan att isolera specifika populationer av celler eller mycket små anatomiskt skilda områden, i kombination med analystekniker (dvs Q-PCR, microarrays, RNA-sekvense och proteomik), kan markant öka förståelsen för olika biologiska processer. LCM är en teknik som ger möjlighet att isolera mycket diskreta anatomiska områden eller specifika celler från vävnad på ett objektglas som ger en mycket mer homogen källa för vidare analys av olika molekyler, såsom RNA, mikroRNA, DNA och proteiner.
t "> Sedan LCM introducerades, har flera olika metoder använts för att microdissect celler från vävnad 1-3. De tidigaste metoder ingår direkt fastsättning av vävnad på en bild med hjälp av en infraröd (IR) laser och en termoplastisk film och en icke kontaktmetod med en ultraviolett (UV) skärande laser för att lösgöra en cell eller vävnad och insamling till ett rör. Därefter har LCM använts framgångsrikt på olika vävnader och celltyper och visat sig vara kompatibel med isolering av olika molekyler för nedströms analys inklusive RNA, mikroRNA, DNA och proteiner, inklusive enzymatisk aktivitet 1,4-7. Här LCM demonstreras med hjälp av ett LCM system som använder en skär UV laser och en capture IR-laser för att skära runt celler eller vävnader och kopplar den till en LCM mössa, respektive. använder Denna LCM systemet både IR infångnings laser för att smälta en plastfilm på ett lock över cellen eller vävnaden av intresse som fäster cellerna till plastfilmen och avlägsnar det från tHan vävnad med avlägsnandet av locket (Figur 1). Dessutom, i kombination med IR-laser, är tillgänglig för utskurna vävnaden eller cellerna av intresse från vävnad monterades på objektglas med ett membran isoleras därefter genom att fästa vävnad till LCM lock genom att använda IR-laser (fig 2) en UV-laser. En kort översikt över dessa tekniker hittas i figurerna 1 och 2.Flera variationer på denna teknik beskrivs till antingen isolera specifika celler med användning av direkt fluorescerande immunohistokemi och en indirekt immunohistokemi styrd teknik som används för isolering av en region av vävnad baserad på uttrycket av ett specifikt protein. Närmare bestämt är isoleringen av dopaminneuroner från substantia nigra och isolering av den ventrala tegmentala arean och den efterföljande isoleringen av RNA från färsk, frusen hjärnvävnad visas. Eftersom RNA är det mest labila av molekyler uppmätta (jämfört med DNA eller protein), steps att hjälpa till att bevara RNA integritet ingår och data visas på kvantitet och kvalitet av RNA som erhållits.
Protocol
OBS: Hjärnvävnad från möss används i enlighet med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur, och studieprotokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Mississippi State University.
1. Beredning av Slides och Tissue
- Använd antingen Silan-prep diabilder eller polyetennaftalat (PEN) membranglas.
- För RNA-isolering, doppglasen i RNas dekontamineringslösning, tvätta 3 gånger med RNas-fritt vatten och sedan dehydrera med en graderad serie av RNas-fri etanol och vakuumtorka under 30 minuter.
- Skär vävnadssnitt på 10 ìm tjocklek med hjälp av en kryostat och montera på de preparerade RNas gratis diabilder. Håll avsnitten frysta under snitt att bevara RNA kvalitet.
OBS: Se till att vävnaden är cirka 4 mm från kanterna på bilden som LCM kan inte ta bort vävnad som är för nära kanterna på bilden. In order att ta bort vävnad från en PEN-membran slide, se till att vävnaden är 4 mm från vänster, topp och botten och 7 mm från den högra sidan av bilden som är måtten på membranet som inte är knutna till bilden. - För isolering av enskilda cellpopulationer som använder direkt immunohistokemi, avsnitt vävnad på antingen Silan-prep diabilder eller PEN membran diabilder. För isolering av regioner av vävnad med hjälp indirekt immunohistokemi guidade tekniker, montera en uppsättning sektioner på en Silan-prep slide för immunohistokemi och alternativa sektioner på antingen en PEN-membran bild och / eller en silan-prep slide som ska användas för LCM.
2. Vävnads Förberedelse för Laser Capture - Rapid tyrosinhydroxilas Immunhistokemi för Direct Laser Capture för Immunoreaktiva celler
- Outline vävnad med en hydrofob penna och låt torka.
- Fix vävnad i aceton-metanol (1: 1) lösning vid -20 ° C under 10 min.
OBS: Our erfarenheten har visat att aceton-metanol fixering ledde mycket mer konsekvent immunohistokemi än aceton eller metanol ensam. - Skölj objektglaset i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 1% Triton (RNas-fritt).
- Täck sektioner med 100-200 pl PBS med 1% Triton med tyrosinhydroxylas antikropp utspädd 1: 100 med 400 U / ml RNasin. Inkubera under 5-10 min.
- Skölj hastigt i PBS två gånger och PBS-1% Triton.
- Täck vävnad med 100-200 pl av get-anti-kanin IgG märkt med Alexa Fluor 488 utspädd 1: 100 i PBS-1% Triton med 400 U / ml RNasin och 50 ng / ml DAPI. Inkubera under fem minuter.
- Skölj två gånger i PBS sedan dehydratisera 30 s i en graderad serie av RNas fri etanol (75% -75% -95% -95% -100% -100%).
- Inkubera i två tvättar xylen under 1 minut sedan 5 min.
- Ta bort diabilder från Xylen omedelbart före användning för LCM och låt lufttorka.
3. Vävnads Förberedelse för Laser Capture - TyrosinHydroxylas Immunohistokemi för Indirekt Laser Capture för Immunoreaktiva regioner
- Process en bild med sektioner intill sektioner monterade på silan-prep och / eller PEN membran diabilder för immunohistokemi.
OBS: Rutiner som används här liknar de tidigare rapporterats 5. För demonstrationsbilder, var diaminobenzidin (DAB) krom reaktion som används för att visualisera tyrosin hydroxylas nervceller av intresse. - För diabilder som används för LCM, fixa i 5 minuter i 100% aceton vid 4 ° C.
- Dehydrera vävnad i en graderad serie av RNas Fri etanol (75% -75% -95% -95% -100% -100%) under vardera 1 min.
- Inkubera i två tvättar xylen under 1 minut sedan 5 min.
- Ta bort diabilder från Xylen omedelbart före användning för LCM och låt lufttorka.
4. Använda laser Capture Microdissection System
OBS: Det LCM tillämpningsprogram har 10 Verktygs barer och 2 fönster för att styramicrodissection förfarande. Verktygs Bars: 1. Mikroskop, 2. Fånga Laser, 3. Skär Laser, 4. Studie, 5. Navigation, 6. Material, 7. Fånga Grupper, 8. mikrodissektion, 9. Font, 10. Anteckningar. Windows: 1. Live Video och 2. vägkarta.
- Öppna dörren genom att välja "Öppna dörren" fliken i Material verktygsfältet i LCM systemprogramvaran.
- Last glider på de tre tillgängliga platser. För denna demonstration, last en bild med tyrosin hydroxylas immunohistokemi visualiseras med DAB, en Silan-prep slide och en PEN-membran slide varje märkt för snabb fluorescerande tyrosinhydroxylas immunohistokemi. I ett typiskt experiment, använda antingen omärkt aceton fasta sektioner med en referens slide märkt för tyrosin hydroxylas med DAB eller diabilder direkt märkta med fluorescerande tyrosinhydroxylas för laser capture.
- Ladda LCM mössor på den tillgängliga platsen.
OBS: Makro och HS LCM mössor är tillgängliga för användning. Den typ av LCM locket för att använda deberor på husets antalet celler eller mängden av vävnad som skall uppsamlas. Makro diabilder listas för att samla upp till flera tusen celler medan HS caps kan samla flera hundra. De Macro diabilder möjliggöra mer vävnadsuppsamlings men kräver 50 | il lysbuffert. HS locket, när den används i kombination med adapter, kräver endast 10 pl av lyseringsbuffert som möjliggör större proportionell återhämtning av RNA. - Stäng luckan.
- Fyll på bilden för att aktivera färdplanen fönstret som ger en arbets utsikt över hela bilden, gör detta för val av regionen av intresse (Figur 3). Visa färdplanen på Live videofönstret för att navigera till området av intresse.
- I Material verktygsfältet, identifiera PEN membran glider genom att markera rutan ovanför skjutplatsen. Att leverera cap egenskaper, högerklicka på locken i materialverktyg fältet och välj "Cap försörjnings egenskaper". Markera rutorna ange position för locken och välj antingen MaCRO eller HS caps.
- Välj "Fluorescens" -fliken i mikroskop verktygsfältet för att slå på lysröret och låt lysröret att värma upp. Använd blå och UV-filter för att visualisera Alex Fluor 488 och DAPI, respektive. Använd "Justera Camera" fliken för att öka känsligheten av bilden för att se de fluorescerande cellerna.
- I Material verktygsfältet, högerklicka på ett lock och flytta den till bilden av intresse. Dubbelklicka på en plats i färdplanen för att välja region som visas i Live Video fönstret. Flytta locket runt på bilden genom att välja ett område på färdplanen (dubbel vänsterklick) och sedan högerklicka och välja "Placera locket på mittområdet."
- Innan du använder IR capture laser, sikta och justera den för styrka. Placera locket i en region av bilden bort från vävnaden. På Capture Laser verktygsfältet, välj "Aktivera". Justera Power (3-100 mW), Pulse (100-1.000.000 μ; Sek) och # Hits av lasern. Brand IR laser när locket är över en del av glid utan vävnad och kontrollera om lasern smälter tillräckligt LCM locket membranet.
OBS: Detta kallas vätning som smälter polymermembran på locket så att den kommer i kontakt glasskiva. Tillräcklig vätning syns som en mörk ring kondenserad till sliden med centrum av ringen klar (Se figur 4 för exempel på tillräcklig och otillräcklig smältning). Om vätning är inte tillräckligt, justera kraft och puls, och testa eld igen tills detta uppnås. Dessutom kan flera bränder hos lasern också användas. - När IR-laser intensitet justeras, högerklicka och välj "Capture laser är här" för att rikta lasern.
OBS: Detta steg talar om för datorn där IR capture laser syftar till vävnaden. Detta steg av att rikta lasern är kritisk och måste upprepas varje gång locket förflyttas eller målet ändras. 5. Laser Capture Microdissection Individuell dopaminneuroner bort av Silan-prep Slides - Flytta till regionen av intresse att fånga celler.
OBS: Exemplet isolera dopaminneuroner visas här. - För att fånga enskilda celler bort av en silan-prep slide, välj "LCM" -fliken sedan på "single point" ikonen i Microdissection verktygsfältet.
- I mikroskop verktygsfältet, använd "Shutter" fliken för att växla mellan fluorescens och ljusa fält med fluorescerande filter flikarna för att välja lämpliga filter och använda de mål flikar för att ändra förstoringen. När cellerna av intresse är synliga i Live videofönstret, justera punktstorleken som används för att markera celler av intresse för den ungefärliga storleken på cellerna. Gör detta genom att klicka på fliken Spot på Capture Laser verktygsfältet klicka på en sida av en färgad cell, följt genom att klicka på den motsatta sidan.
OBS: Detta beräknarFläckens diameter och visar värdet. - Markera cellerna av intresse genom att klicka på dem medan de "Single punkten" ikonen är vald. Gör detta för att placera en fläck markör på varje cell. Här är den blå filter och 10X objektivet används för att visualisera dopaminneuroner. Retest och rikta IR-laser på locket där det inte vävnaden under det som beskrivs i steg 4.9 och 4.10.
- När cellerna är markerade, välj "Gå - cut och fånga" fliken på Microdissection verktygsfältet och IR-laser utlöses automatiskt alls markerade celler utvalda. Dessutom, om det behövs, brand IR laser manuellt vid någon punkt av intresse (figur 5D).
- Flytta locket från sektionen och på en öppen region av sliden för att kontrollera om cellerna fångades på LCM locket. Se till att cellerna av intresse avlägsnas från sliden (figur 5B, E) och fäst till LCM locket (Figur 5C, F). Dokument thär processen genom att klicka på "Capture bilden" -fliken i mikroskop verktygsfältet.
- När du är klar att samla vävnad, ta bort locket genom att högerklicka på locket och välj "Flytta till" sedan "Ladda ur."
- För att fånga enskilda celler bort av PEN membran diabilder med både IR och UV-lasrar, välj "Klipp och Capture" fliken i Microdissection verktygsfältet. Välj "single point" fliken för att markera cellerna av intresse. Använd "Klipp linjen" fliken för att beskriva varje cell. Var noga med att testa IR-laser som beskrivs i steg 4,9 och 4,10 och testa UV-laser för att bestämma den minsta ljusstyrka nödvändigt att skära trodde PEN-membran och vävnad (figur 4 och 5)
- Välj "Fånga och Cut" fliken på Microdissection verktygsfältet. Vid insamling enskilda celler med hjälp av denna teknik, varasäker att avfyra den IR-laser först följt av UV-laser eftersom dessa små bitar kan gå förlorad om de skärs ut innan det placeras i LCM locket.
OBS: Denna process kan också göras manuellt genom bränning av IR-laser vid en punkt av intresse och cellerna skiss individuellt med UV-laser. - Efter uppsamling av cellerna av intresse, flytta LCM locket såsom beskrivet ovan i steg 5,7 för att bestämma om cellerna avlägsnades och fäst på locket (figur 6).
- När du är klar att samla vävnad, ta bort locket genom att högerklicka på locket och välja "Flytta till" sedan "Ladda ur."
- För att identifiera regionen av intresse, använd skjut behandlas för immunohistokemi.
OBS: För denna demonstration ventrala tegmentumområdet isoleras (figur 7A). - Ladda en LCM mössa och testa lasrar som i stegs 4.9 och 4.10.
OBS: Typiskt används en makro LCM lock användas, men en HS lock kan också användas (se figur 8). - För att isolera ett område av vävnad (dvs, den ventrala tegmentumområdet) från Silan-prep slide, välj "LCM" -fliken i Microdissection verktygsfältet, välj sedan "polygon-exteriör" -fliken. Disposition regionen av intresse i Live Video fönstret. Beroende av storleken på området för insamling, skissera regionen av intresse vid låg förstoring (2X mål). För insamling dock instrumentet använder 10X objektivet så justera och rikta IR-laser under 10X målet innan fånga.
- Välj "Go - fånga och cut" fliken i Microdissection verktygsfältet.
OBS: Datorn kommer automatiskt att skjuta IR laser hela markerade området (Figur 7F, I). Om LCM membranet inte har smält tillräckligt i hela området, kan lasern avfyras människannuellt eller hela processen upprepas. - Flytta LCM locket bort av vävnaden för att avgöra hur väl vävnaden uppsamlades.
OBS: Ett pass med den här metoden ger oftast någon vävnad bakom på bilden (se Figure7G). Om detta inträffar, upprepa valet och fånga steg ovan. Upprepa detta steg kan öka mängden vävnad samlas (Figur 7J). - När du är klar att samla vävnad, lossa locket genom att högerklicka på locket och välja "Flytta till" sedan "Ladda ur."
- Använd skjut behandlas för immunohistokemi som en guide för att välja region av intresse från vävnaden på PEN-membran slide som ovan.
- Välj "Klipp och Capture" fliken i Microdissection verktygsfältet. Välj fliken "Klipp Line" och beskriver hur regionen av intresse att använda immunohistocheMistry märkt slide som guide.
OBS: Programmet kommer automatiskt att lägga fläckar för IR laser för att fästa vävnad till locket. Använd "single point" fliken för att lägga till ytterligare punkter för att bättre säkra vävnaden till locket. - Enligt 10X objektiv, prov eld och sikta IR och UV laser som beskrivs i 4.9 och 4.10. Testa att UV-laser kan penetrera membranet på bilden och att denna minskning motsvarar den plats på datorskärmen. Använd en UV-laser styrka som är precis tillräckligt för att skära membranet och vävnad men skadar inte den vävnad (figur 5).
- Välj "Go - fånga och cut" fliken i Microdissection verktygsfältet.
OBS: Datorn kommer automatiskt att avfyra IR-laser på alla märkta fläckar inom vävnaden att koppla den till locket sedan eld UV laser för att kapa glid PEN-membran och vävnader (figur 7C). Ytterligare IR smälta fläckar kan vara nödvändigt att på lämpligt sätt fästa tisstämma till LCM mössa, som även kan läggas till manuellt. - Flytta LCM locket bort av vävnaden för att avgöra om vävnaden avlägsnades från sektionen (Figur 7C) och fäst vid locket (Figur 7C).
- När du är klar att samla vävnad, för att ta bort locket, högerklicka på locket och välj "Flytta till" sedan "Ladda ur."
- För att samla RNA från de infångade cellerna eller vävnaden, inkubera LCM locket membranet i RNA lysisbuffert under 30 min vid 37 ° C.
NOTERA: För HS mössor, är en adapter tillgängliga som möjliggör användning av endast 10 | il lysbuffert på överdelen och fäster vid en 0,5 ml mikrocentrifugrör. De Macro lock kräver 50 pl lyseringsbuffert och fäster direkt till en 0,5 ml mikrocentrifugrör. - Efter inkubation snurra lysbuffert ned i 0,5 ml mikrocentrifugrör.
- För att säkerställa fullständig lys av alla celler or vävnad, skala bort LCM locket membranet av locket och placera i lysbufferten.
- För att testa för RNA integritet, användning RNA isolerats från vävnaden kvar på objektglaset efter LCM att mäta RNA integritet.
OBS: På grund av den begränsade prov RNA erhålls med LCM, är det normalt sett inte praktiskt att testa RNA integriteten på LCM isolerade RNA dock RNA från den kvarvarande vävnaden ger en god indikator på något RNA nedbrytning på grund av fixering, immunohistokemi och tid under LCM förfarande.
6. Laser Capture av individuell dopaminneuroner bort av PEN Membrane Slides
7. Fånga Ventrala tegmentområdet från Silan-prep Slides
8. Fånga Ventrala tegmentområdet från PEN Membrane Slides
9. Isolering av RNA
Representative Results
Den mikrofoto i figurerna 6 och 7 visar de funktioner för isolering av individuella dopaminneuroner. Den nuvarande anatomiska upplösningen är cirka 5-10 um som den minsta punktstorlek som kan konsekvent produceras på LCM caps att isolera en cell. Den enda begränsningen för isolering av specifika celltyper är förmågan att visualisera celler. Även LCM kan isolera enskilda dopaminneuroner sker kontaminering av delar av angränsande omärkta celler troligen. Därför är det slutliga provet en koncentrerad samling av dopaminneuroner, inte en ren population av dopaminneuroner. Denna teknik är också kapabel att isolera små områden av vävnad såsom diskreta kärnor eller regioner i hjärnan som visas med isoleringen av den ventrala tegmentumområdet. Tidigare publikationer har visat denna användning i hjärnvävnad samt att isolera patologisk vävnad från normal vävnad 5,11.
(Figur 10A). För att mäta RNA-kvantitet med Q-PCR, ett intervall av koncentrationer av hela hjärnan RNA och RNA från dopaminneuroner var omvänt transkriberade och β-aktin-gen mättes genom att använda Q-PCR såsom tidigare beskrivits 5. Baserat på dessa mätningar genomfördes en koncentration av 3,55, 6,82 och 20,58 pg / l beräknat från 50, 100 och 200 dopaminneuroner, respektive (Figur 10B).
För att demonstrera hur isolering av dopaminneuroner jämföras med isolering av hela ventral tegmentala område med LCM, dopamin neuronspecifika gener (Nurr1, tyrosinhydroxylas, och dopamintransportörer) mättes med Q-PCR i dessa två olika typer av prov och jämfördes med uttryck av β-aktin (fig 11). Eftersom lägre C t-värden genereras med en högre koncentration av den intressanta genen, en minskning i AC t indikerar ett ökat uttryck av de dopamin neuron generna i förhållande till β-aktin. Detta visar hur isolering av enskilda dopaminneuroner koncentrerar expressionen av dopamin neuron specifika gener. I de ventrala tegmentala området sampel, dopamin neuron specifika gener utspädd ut som andra celler (icke-dopaminerga neuroner och gliaceller) kommer också samlas in som uttrycker β-aktin men inte uttrycker dopamin neuron gener.
es / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg "/> 
Figur 2. Laser fånga med hjälp av infraröda (IR) fånga laser och ultraviolett (UV) skärande laser. För att förvärva större områden av vävnad eller underlätta återvinningen av celler med UV-laser, är vävnad monterad på en bild med ett membran ansluten till sliden längs utsidan hörnet (PEN membran diabilder). LCM lock placeras på than vävnad och IR infångnings laser används för att smälta lockmembranet och fäst vävnad till LCM locket (Steg 1 och 2). UV skärlaser används därefter för att skära genom sliden membranet och vävnaden (Steg 3 och 4), så att när locket avlägsnas vävnaden avlägsnas från sliden och kvarstår på LCM locket (steg 5). 
Figur 3. Laser Capture Microdissection System färdplanen. Denna Laser Capture Microdissection System har plats för 3 diabilder i taget. När diabilder laddas in i mikroskopet, är låg förstoring färdplanen bilder för varje bild som genereras. Välja ett område om färdplanen bilden flyttar Live bildfönstret till den regionen. För demonstrationsändamål, var musen mesencephalon uppställd i 10 um avsnitt på 3 diabilder. Den första bilden var märkt för tyrosin hydroxylas immunoreactivity använder diaminobenzidin som krom (A). Sektioner monterades på antingen Silan-prep diabilder (B) eller PEN membran diabilder (C). Båda dessa diabilder märktes med hjälp av snabba fluorescerande tyrosinhydroxylas immunohistokemi. Pilar i (C) visar fästandet av PEN membranet till objektglaset. Ingen vävnad utanför denna gräns kan samlas med LCM. 
Figur 4. Använda IR-infångnings lasern. IR infångnings laser används för att smälta LCM locket membranet att fästa vävnad till LCM locket och avlägsna den från resten av vävnaden. IR capture laser måste vara tillräcklig styrka för att smälta LCM locket membranet tillräckligt att kontakta den underliggande vävnaden och glasskiva. Bilden ovan visar när lasern var otillräcklig för att smälta membranettill bilden (vänster två prickar). När det smälta membranet vidrör glasskiva, kan observeras (rätt plats) en tjock svart kontur. Intensiteten av lasern kan justeras genom att ändra Power (3-100 mW), Pulse (100-1,000,000 ^ sek) och # Träffar i lasern. Dessutom upprepad bränning av den IR-laser på samma ställe kan också ytterligare smälta membranet. Syftet med IR-laser behöver justeras helst LCM locket förflyttas eller när målet ändras. Skalstreck = 100 | im. 
Figur 5. Användning av UV-skärlaser. UV skärande laser används för att skära genom PEN membranet och vävnad. Före att använda minsta intensitet som krävs för att skära igenom membranet och vävnaden måste avgöra eftersom UV-laser kan skada vävnaden. Ovan är de tre platserna (pilar) av olika UV laser intensiteter visas med vänster strålpunkt räcker till 10 ìm sektioner, mittpunkten för tjockare sektioner och rätt plats visar en UV-laser intensitet som är för hög. Skala bar = 100 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 6. Direkt isolering av tyrosinhydroxylas immunreaktiva neuroner som använder IR-laser. Dopaminneuroner visas efter en snabb fluorescerande märkning för tyrosinhydroxylas (A). När IR-laser avfyras smälter LCM locket membranet över dessa neuroner (D), avlägsnande av locket plockar dessa celler bort av sliden (B, E). Dessa neuroner kan sedan visualiseras som fäst till LCM locket (C, F). Skalstreck = 250 | im.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 7. Direkt isolering av tyrosin hydroxylas immunoreaktiva neuroner från PEN membran diabilder med hjälp av IR och UV-lasrar. Tyrosinhydroxylas märkta nervceller visas ovan (A). Dessa neuroner kan fästas LCM lock genom att använda IR-laser och skärs från PEN membran sliden med hjälp av UV-laser (B). Skala bar = 250 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 8. Indirekt isolering av den ventrala tegmentala området med hjälp av tyrosinhydroxylas immunreaktivitet. Placeringen av dopaminneuroner i ventrala tegmentala arean visualiserades i en sektion med användning av standard immunhistokemiska tekniker (A och E). Denna immunohistokemi märkt avsnitt användes som en mall för att lokalisera den ventrala tegmentala arean i ofärgade intilliggande sektioner (B och F). Använda UV-laser, var den ventrala tegmentala område kopplade till LCM locket med IR-laser och skärs från sliden med UV-laser (C och D) och visas fäst till en HS LCM lock (D). Den ventrala tegmentala region isolerad från Silan-prep diabilder med enbart IR laser visas också kopplad till en makro cap (FK). Observera att mer än ett försök som behövs för att samla in det mesta av vävnad från denna region (Jämför G och J). Skalstreck = 500 | im.pload / 52336 / 52336fig8large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 9. RNA kvalitet. Representativa elektroferogram och tillhörande gel bilder av kommersiellt tillgängliga hela hjärnan RNA (A) och RNA isolerat från sektioner efter acetonfixering och LCM (B) eller snabb fluorescerande tyrosinhydroxilas immunohistokemi och LCM (C). Även RNA kvalitet reducerades i avsnitten behandlas för immunohistokemi, jämfört med hela hjärnan RNA, de elektroferogrammen visar mestadels intakt RNA baserad på förekomsten av rRNA S18 och S28 toppar. Hel hjärna RNA-koncentrationen var 6,487 pg / pl med en RIN av 8,2. Aceton fixerad vävnad RNA-koncentrationen var 5,036 pg / pl med en RIN av 2,6. RNA erhållet efter immunohistokemi h ad en koncentration av 4,474 pg / l och RIN var inte tillgänglig. 
Figur 10. RNA kvantitet. För att bestämma mängden RNA i nervceller som erhållits med LCM, var en standardkurva av RNA koncentrationer som produceras med hjälp av en fluorospectrometer och Q-PCR. För fluorospectrometer mätningarna (A), visar stor graf det högre området av RNA belopp och den lilla graf visar känsligheten hos denna analys ned till 10 pg / pl. Koncentrationerna av RNA som erhållits från 50, 100 och 200 dopaminneuroner var 17,3, 24,8 och 50,9 pg / l, respektive. Använda Q-PCR för att mäta RNA belopp (B), koncentrationen av RNA som erhållits från 50, 100 och 200 dopaminneuroner var 3,55, 6,82 och 20,58 pg / l, respektive.
Figur 11. Koncentration av dopamin neuron specifika gener med isolering av enskilda dopaminneuroner. Skillnaden i C t (AC t) mellan dopamin neuron specifika gener (Nurr1, tyrosin hydroxylas och dopamintransportörer) och β-aktin i prover av dopaminneuroner i ventrala tegmentumområdet isolerade med LCM jämfört med uttryck i dissektioner av hela ventrala tegmentala regionen visas. Eftersom lägre C t-värden genereras med en högre koncentration av den intressanta genen, en minskning i AC t indikerar ett ökat uttryck av de dopamin neuron generna i förhållande till β-aktin som andra celler (icke-dopaminerga neuroner och gliaceller) kommer samlas upp i de ventrala tegmentala området prover som uttrycker β-aktin men inte uttrycker dopamin neuron gener.
Discussion
LCM är en kraftfull teknik för dissekering av diskreta populationer av celler eller regioner av vävnad från vävnadssnitt på ett objektglas och den efterföljande isoleringen av RNA, mikroRNA, DNA och proteiner. Användningen av LCM i kombination med analys med hjälp teknik med hög kapacitet såsom microarray, nästa generations RNA sekvense, epigenetisk analys av DNA och proteomik blir mer och mer vanligt som känsligheten av dessa tekniker förbättrar och mängden utgångsmaterial som behövs reduceras 8-12. Med LCM är ett bättre anatomisk upplösning uppnås för ett prov, och förståelse från nedströms åtgärder av dessa prover har ökat avsevärt. En nackdel med LCM är att det ger ett koncentrerat prov av cellerna av intresse, men inte nödvändigtvis att en ren population av celler. Gränserna för precisionen innebär att det blir några föroreningar från intilliggande vävnad. Dock gör denna teknik koncentreras cellerna av intresseatt minimera effekter associerade med omgivande vävnad och celler och maximera de experimentella effekter på cellerna av intresse.
Direkt kontra Indirekt Immunohistokemi
Eftersom LCM utnyttjas för närvarande i första hand för isoleringen och mätning av RNA, hålla RNA intakt är ett mycket viktigt kriterium. Underhålla RNA integritet är den viktigaste grunden för användningen av indirekt immunohistokemi att vägleda vävnad dissektion som tar bort behovet av att färga vävnaden direkt vilket kan försämra RNA (Figur 10). När den experimentella frågan kräver dock isolering av en specifik population av celler, såsom dopaminneuroner, är direkt fluorescerande immunohistokemi krävs. Med hjälp av en snabb immunohistokemi märkningsprotokoll kan minimera nedbrytningen av RNA under förfarandet. De korta inkubationstider är på grund av användningen av höga koncentrationer av primär och sekundär antiorgan, koncentrationer som är runt 10-20 gånger högre än vad som är nödvändigt för konventionell immunhistokemi med en 2 h inkubation. Om emellertid längre inkubationstider krävs, använde Brown och Smith höga saltbuffertar för att hämma RNA nedbrytning och få bra kvalitet RNA med långa inkubationstider (upp till 20 h) 13. Kan också användas Detta tillvägagångssätt om det finns betydande tid som krävs mellan märkning av vävnaden och att få tillgång till en LCM-system.
Val av diabilder - PEN-membran, Silan-prep och obestrukna glasskivor
Användningen av obestrukna glas för LCM har rapporterats 14. I vårt laboratorium, har Silan-prep diabilder befunnits vara ett optimalt val, eftersom denna beläggning fäster tillräckligt vävnaden till bilden för immunohistokemi utan förlust av vävnad men fortfarande tillåter fastsättning av vävnad till LCM mössor och avlägsnande från bilden . Obelagda glasskivor harvisade vissa vävnadsförlust med immunohistokemi förfarandet. Om indirekt immunohistokemi används blir dock vävnads behålla ett mindre problem. Med rätt uttorkning, fånga celler eller vävnad bort av silan-prep diabilder har inte varit ett problem. Var och en av de olika metoder för att isolera nervceller eller hjärnregioner som beskrivs i detta dokument har fördelar och nackdelar. För isolering av individuella dopaminneuroner, användning av silan-prep diabilder har fördelen av bättre optik och är billigare än PEN membranglasen. Nackdelen är att ibland fånga celler kan vara svårt om det inte finns tillräckligt uttorkning (se nedan) och en del vävnad kan lämnas på objektglaset. Fördelen med de PEN membran diabilder är att använda en kombination av IR laser och UV laser säkerställer att dopaminneuroner kommer att samlas. Underlåtenhet att samla celler från en PEN membran diabilder inträffar nästan aldrig, eftersom det är mindre beroende av uttorkning än glas. En ytterligare en fördel är att UV-laser kan användas för att mer nära approximera formen på nervceller av intresse, jämfört med en cirkel för att fånga neuroner bort av glasskivor med IR-laser. För isolering av regioner av vävnad, PEN membran bilderna är vida överlägsen och motivera den extra kostnaden. Detta tillvägagångssätt resulterar i fullständigt avlägsnande av all vävnad skärs ut på membranet, är mycket snabbare än att fånga ett stort område av vävnad med hjälp av IR-laser ensam och tjockare vävnadssnitt kan samlas. Genom att bara använda IR laser kräver att LCM locket membranet är helt smält över hela vävnadsområdet. Dessutom är ofullständig samling av vävnaden typiska och oftast kräver flera försök. Även om detta tar längre tid än att isolera vävnad från PEN-membran slide, om den tillgängliga vävnaden redan är på en glasskiva eller en UV-laser inte är tillgänglig, detta är en möjlig lösning som de flesta av vävnaden kan samlas (Figur 8J).
ove_content "> Kritiska stegDe 100% etanol inkubationer är ett av de viktigaste stegen. För att samla in celler från Silan-prep diabilder krävs fullständig dehydratisering av vävnaden. Därför kommer något vatten inte bort, vilket är förenat mestadels med 100% etanol inkubation påverka förmågan att plocka upp celler från bilderna. För att lösa detta problem, ofta ändrar 100% etanollösningar som absorption av vatten från luften eller överföring från tidigare tvättsteg kan påverka uttorkning. Dessutom är molekylsiktar som används för att absorbera all förorening vatten. LCM-systemet bör helst ligga i ett litet rum med en avfuktare för att hålla låg fuktighet.
Goda kryostatsnitt är kritiska för korrekt LCM. Sektioner måste vara platt med veck i vävnaden minimeras. Veck i vävnaden kommer att öka avståndet mellan LCM locket och hindra den från att kontakta than vävnad. Det blir då svårt att tillräckligt smälta membranet locket på vävnaden. För glas, vanligen snittjocklek måste vara mellan 6 och 12 um. Tjockare sektioner kan fångas med pennan membran diabilder.
LCM erbjuder en teknisk kapacitet att göra mycket exakta dissektioner av vävnad och celler från objektglas. Detta ökar dramatiskt upplösningen för vidare analys jämfört med brutto dissektion av vävnadsstycken. Även LCM kan vara tid och arbetskrävande, inte kräver omfattande utbildning eller kompetens och, när den kombineras med andra teknik med hög kapacitet, kan avsevärt förbättra förståelsen av en biologisk process då separata celler eller anatomiska regioner används.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veritas Laser Capture Microdissection System | Life Technologies, Grand Island, NY | Newer model is now sold | |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0211 | |
| CapSure HS LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0213 | |
| PEN Membrane slides | Life Technologies, Grand Island, NY | s4651 | |
| Silane prep-slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S4651 | |
| 95% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7148 | |
| 100% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Rnase Free Triton | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8787 | |
| Molecular Sieve | EDM Millipore, Billerica, MA | MX1583D | |
| Anti-Tyrosine hydroxyase antibody | EDM Millipore, Billerica, MA | Ab152 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies, Grand Island, NY | A-11008 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2939AA | |
| Stratagene MX 3005P | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 401513 | |
| Nanodrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ||
| Quant-iT RiboGreen | Life Technologies, Grand Island, NY | R11490 | |
| RNaseZap | Life Technologies, Grand Island, NY | AM9780 |
References
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Schutze, K., Lahr, G. Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells. Nature biotechnology. 16, 737-742 (1998).
- Schutze, K., Posl, H., Lahr, G. Laser micromanipulation systems as universal tools in cellular and molecular biology and in medicine. Cellular and Molecular Biology. 44, 735-746 (1998).
- Vandewoestyne, M., Van Nieuwerburgh, F., Van Hoofstat, D., Deforce, D. Evaluation of three DNA extraction protocols for forensic STR typing after laser capture microdissection. Forensic Science International Genetics. 6, 258-262 (2012).
- Eells, J. B., Wilcots, J., Sisk, S., Guo-Ross, S. X. NR4A gene expression is dynamically regulated in the ventral tegmental area dopamine neurons and is related to expression of dopamine neurotransmission genes. Journal of Molecular Neuroscience. 46, 545-553 (2012).
- Seelan, R. S., et al. Epigenetic analysis of laser capture microdissected fetal epithelia. Analytical Biochemistry. 442, 68-74 (2013).
- Kim, W., et al. miR-126 contributes to Parkinson's disease by dysregulating the insulin-like growth factor/phosphoinositide 3-kinase signaling. Neurobiology of Aging. 35, 1712-1721 (2014).
- Bohm, C., et al. Effects of antidepressant treatment on gene expression profile in mouse brain: cell type-specific transcription profiling using laser microdissection and microarray analysis. Journal of Neurochemistry. 97, Suppl 1. 44-49 (2006).
- Kadkhodaei, B., et al. Transcription factor Nurr1 maintains fiber integrity and nuclear-encoded mitochondrial gene expression in dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2360-2365 (2013).
- Miller, R. A., et al. Quantitative Proteomics in Laser Capture Microdissected Sleep Nuclei From Rat Brain. Journal of Neurogenetics. , (2014).
- Roberts, E., et al. Application of laser capture microdissection and protein microarray technologies in the molecular analysis of airway injury following pollution particle exposure. Journal of Toxicology and Environmental Health. A. 67, 851-861 (2004).
- Yuferov, V., Nielsen, D., Butelman, E., Kreek, M. J. Microarray studies of psychostimulant-induced changes in gene expression. Addiction Biology. 10, 101-118 (2005).
- Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15, 2364-2374 (2009).
- Curran, S., McKay, J. A., McLeod, H. L., Murray, G. I. Laser capture microscopy. Molecular Pathology. 53, 64-68 (2000).
