Abstract
Dendroecological forskning bruger information lagret i træringe at forstå, hvordan enlige træer og endda hele skovøkosystemer reageret på miljøforandringer og endelig rekonstruere sådanne ændringer. Dette gøres ved at analysere vækst variationer tilbage i tiden og korrelere forskellige anlægsspecifikke parametre (for eksempel) temperatur optegnelser. Integration træ anatomiske parametre i disse analyser vil styrke rekonstruktioner, selv ned til intra-årlige opløsning. Vi har derfor forelægge en protokol om, hvordan man prøve, forberede og analysere træ eksemplar til almindelige makroskopiske analyser, men også for efterfølgende mikroskopiske analyser. Derudover introducerer vi en potentiel løsning til analyse af digitale billeder genereret fra almindelige små og store prøver at støtte tidsserier analyser. Protokollen viser de grundlæggende trin, som de kan på nuværende tidspunkt anvendes. Ud over dette er der et fortsat behov for forbedring af eksisterende teknikker, og udvikling af nye techniques, at registrere og kvantificere tidligere og igangværende miljømæssige processer. Traditionelle træ anatomiske forskning skal udvides til at omfatte økologiske oplysninger for dette forskningsfelt. Dette vil støtte Dendro-forskere, der har til hensigt at analysere nye parametre og udvikle nye metoder til at forstå de kort- og langsigtede effekter af specifikke miljømæssige faktorer på anatomi træagtige planter.
Introduction
Træer, samt buske, dværgbuske og endda urter, viser mangfoldige reaktionsmønstre i forbindelse med ændringer i deres miljø. Disse mønstre har været genstand for botanik og plantefysiologi siden midten af det 19. århundrede. Dengang forskning i træagtige planter fokuserede mest på træer og en beskrivende analyse af strukturen og variabilitet af årringe i en økologisk sammenhæng 1. Da Andrew Ellicott Douglass opfandt cross-dating teknik til træ-ring forskning 2, var dette økologiske sammenhæng mere eller mindre undertrykt af den nye evne til præcist datere træ fund i arkæologi. Cross-dating for første gang gjorde det muligt for præcis datering af træringe til kalenderåret, og er indtil nu som rygraden i træ-ring forskning inden for alle områder af sit program 1.
Sideløbende hermed siden slutningen af det 19. århundrede, træ anatomi udviklet sig til en vigtig forskning disciplin vedrørerd til mange andre områder af naturlige og anvendte videnskaber 3. To vigtige domæner indføres: systematisk træ anatomi, som er grundlaget for at identificere træ i arkæologi 4, og den anvendte træ anatomi, relateret til træ teknologi, fysiologi, patologi, og økologi 3,5.
I træ-ring forskning, i dag dendroecology defineres som et emne, der omfatter træ-ring relaterede undersøgelser, der fokuserer på miljøundersøgelser såsom geomorfiske processer (dendrogeomorphology), temperatur og nedbør rekonstruktioner (dendroclimatology), ændringer vandstand (dendrohydrology) eller endog gletscher svingninger ( dendroglaciology) 6. Da denne definition indikerer, har træ-ring analyser blevet stadig vigtigere inden for dating og rekonstruere miljømæssige processer, som (i) fortidens klima ved at analysere de årlige variationer i ring bredde 7,8, træ tæthed 9 eller isotoper 10, eller (ii) than tilbagefald mellemrum geomorfiske processer 11. Disse meget detaljerede undersøgelser om ring-bredde variationer og deres isotopiske indhold påvise behovet for at analysere ringe nærmere, dvs at studere anatomiske struktur af ringene. Men er detaljerede studier af træ anatomiske træk inden årringene relateret til miljøændringer sjælden 12,13. Selv om disse mikroskopiske træk kendes 14, har de sjældent blevet anvendt på et mikroskopisk niveau dendroecological forskning. Desuden præcis timing af disse reaktioner vækst i naturligt dyrkede træer, der er afgørende for nøjagtige dating formål, er sjældent blevet dokumenteret for nylig 15.
Hvad angår virkningerne af den globale opvarmning 16, til en forbedring af eksisterende og udvikling af nye teknikker registrere og kvantificere tidligere og igangværende miljømæssige processer er påkrævet, især med hensyn til klimapåvirkning forskning 11.Ved at udvide den traditionelle træ anatomiske forskning til et økologisk baseret træ anatomi 17, kan Dendro-forskere analysere nye parametre og udvikle nye metoder til at forstå de kort- og langsigtede virkninger af specifikke miljømæssige faktorer på anatomi træagtige planter 18. Detaljeret viden om variationer i forskellige celleparametre inden for de enkelte ringe tilknytning til bestemte drivere (f.eks mekaniske kræfter, klimavariationer) er den grundlæggende forudsætning for at forstå variabiliteten i træet ring formation. Sammenlignet med almindelige ring bredde målinger, identificere træ anatomiske variationer kræver mere komplekse og ekspansiv forberedelse teknikker, der kræver en masse arbejde og tid. Detaljerede procedurer prøve skæring, farvning og forankring er mangfoldige og er altid afhængig af formålet med undersøgelsen 19.
For makroskopisk analyse af ring bredde i nåletræer eller strukturer til antal, størrelse eller distribution af skibe i hårdttræ er overfladen af en prøve normalt poleret med fint sandpapir eller specielle slibemaskiner 20. En ulempe ved denne procedure er opfyldningen af de enkelte celler med støv, der forhindrer yderligere halvautomatisk mikroskopisk analyse 21. De bedste resultater for makroskopisk prøveforberedelse opnås, når prøvens overflade er skåret ved hjælp af et barberblad eller en anden skarp kniv.
Mens for små prøver, barberblade er et perfekt værktøj; større prøver fyldning kræver opskæring af plane flader over hele omfanget af kerner. I modsætning til slibning, er cellerne ikke er fyldt med støv, som muliggør yderligere forberedelse til den efterfølgende billedanalyse. Endvidere åbne celler lumen, de korrekt skåret cellevægge, og den plane overflade af hele prøven muliggøre anvendelsen af højfrekvente densitometri 22 til hele omfanget af kernen. For billedet analyser, overfladen af prøver (cellevægge) kan farves under anvendelse af mørk farve og de åbne celle lumen kan efterfølgende fyldes med hvidt kridt for at forbedre kontrasten mellem cellevæggen og lumen området 19,23. Denne temmelig enkel teknik muliggør en grundlæggende makroskopisk vurdering af større cellestrukturer for fartøjets størrelse målinger.
Disse teknikker til at skære plane flader er tilstrækkelige til makroskopiske analyser. For en detaljeret træ anatomiske (dvs. mikroskopisk) analyse, transmitteret lysmikroskopi er den mest almindelige metode, der anvendes i Dendro videnskaber. Xylem celler differentierer gennem komplekse processer omfatter celletype bestemmelse, celledeling, celledifferentiering og programmeret celledød 24. Da timingen og hastigheden, hvormed disse processer opstår bestemme celle anatomiske egenskaber, kan de miljømæssige forhold, der påvirker disse processer genererer anatomiske afvigelser i ringen struktur. Som en vigtig forudsætning for disse analyseres, skal være forberedt med en microtome 19 mikro sektioner. Ved udarbejdelsen prøver til sektionering, synligheden af tracheider eller fiber retning er afgørende. Det anbefales at bruge af hånd drevet glidende mikrotomer at skære mikro sektioner, fordi denne teknik letter høj kvalitet sektioner efter behov for billedet analyser 19. Afhængigt af det specifikke formål med en bestemt undersøgelse, er mikro sektioner skåret vinkelret på eller parallelt med den langsgående udstrækning af cellerne. Disse afsnit er derefter fotograferet under et mikroskop og celle dimensioner målt ved hjælp af specialiseret billede analyserer software.
Indtil for nylig var i stand til at forberede mikro sektioner begrænset til små prøver kun (ca. 1 cm x 1 cm). Det er acceptabelt at analysere enkeltstående begivenheder som forstyrrelser i bestemte år, men denne teknik tillader ikke den udvidede tidsserieanalyse nødvendig for miljømæssige rekonstruktioner. Denne indsats kan kun realisered gennem udvikling af nye, effektive og økonomiske forberedelsesprocedurer og analyseteknikker. I de senere år har medlemmerne af træ-ring laboratorium på det schweiziske føderale Research Institute WSL i Schweiz begyndte intensivt arbejde med dette emne. Som følge heraf har nye enheder og analysere teknikker blevet udviklet til at støtte tanken om at integrere træ anatomiske træk til en bred vifte af miljømæssige forskningsemner.
Protocol
1. stikprøver
- Core prøveudtagning
- For prøveudtagning træ stængler, udvinde mindst to kerner ved hjælp af en tilvækst corer fra hver stængel til at analysere dets udvikling vækst. Omstilling af stikprøver på opgaven forskning, fx til fælles klima rekonstruktioner tage kerner parallelt med skråningen. Når du arbejder med tropiske arter, tage mindst tre eller flere kerner.
- Brug en skærpet tilvækst corer (5, 10 eller 12 mm i diameter) og placer corer vinkelret på voksende akse af stilken.
BEMÆRK: For at få en kontrolleret og stabil position af corer Brug en pusher for at undgå bevægelser end dens rotation corer ved boring det ind i træet. Bore ind i stammen hele vejen ind i og gennem marv. Til kernen meget tæt træ (dvs. tropiske arter), bruge specielle omkonfigureres kædesavsolier organer med en adapter af tilvækst kerner, der tillader til centrale selv tætte skove som Diospyrus ebenum (Ebony). </ Li> - Brug en emhætte og fjerne den resulterende kerne fra træet. Vend ud corer og fjern den fra stammen.
- Læg et bestemt ID for den udtrukne kerne med en blød blyant ved at skrive på et bånd, som derefter placeres direkte på kernen. Gentag proceduren på den modsatte side af stilken.
- Opbevar de to prøver af træet i plast eller papir rør eller særlige kasser for at forhindre eventuelle skader.
BEMÆRK: Papir sugerør er gavnlige, især i tropiske miljøer, fordi de forhindrer kernerne fra støbning. - Endelig montere kernerne (fiber retning opretstående) på træ støtte bjælker. Brug koldt vand resistent trælim og lad dem tørre.
BEMÆRK: Monter aldrig kerner på træ understøtninger hvis formålet med undersøgelsen omfatter yderligere kemisk, isotop eller densitet analyse. Til disse formål, fastsætte kernerne i åbne kabelkanaler eller en enkelt faced bølgepap.
- Micro-core prøvetagning
- Brug en speciel stansning enhedeller nål med en åbning på 2 mm. Afhængigt af bark tykkelse bruge en mejsel til at fjerne en nødvendig del af bark.
- Anbring enheden vinkelret på den voksende aksen på skaftet som beskrevet ovenfor, og bruge en hammer til at trænge ind i veddet af stilken til ca. 2 cm i dybden.
- Drej nålen til at knække den resulterende mikro kerne inde i værktøjet og fjern det fra stammen. Opbevar mikro kerner i mikrocentrifugerør hætteglas og mærke dem.
- Disc prøveudtagning
- I særlige tilfælde (og især i troperne), fx ved prøvetagning stubbe og væltede træer eller når det er muligt, tage diske (tværsnit vinkelret på den voksende akse) med en motorsav. Du skal blot mærke skiverne og gemme dem indtil videre analyse.
BEMÆRK: Denne procedure prøveudtagning er mest almindeligt anvendt for alle tør-døde, historiske, arkæologiske og sub-fossilt materiale samt meget tætte løvtræer, der ikke tillader brug af tilvækst corers.
2. Prøvefremstilling
- Slibeskiver
- Placer skiverne på en slibemaskine og male overfladen med en sekvens af stadig fine slibemidler, startende med sandpapir af 80 korn, efterfulgt af 120, 220, 300-grus. En endelig polering med 400 grit er tilstrækkelig for de fleste nåletræer. For hårdttræ og især tropiske arter, brug slibning grits op til 1.200 for at skelne de vækst-rings grænser.
- Skæreplan overflader på kerner
- Fastgør tilvækst kerner i kernen indehaveren af et nyudviklet kerne mikrotom gør det muligt at skære plane overflader på kerner over hele deres udstrækning.
BEMÆRK: Ret orientering af kernen i holderen har retningen af prøven oprejst, som er i en ret vinkel i forhold til kniven på mikrotom fiber. - Løft kernen indtil det lidt rører bladet. Træk klingen, der er fastgjort på kugleleje vejledning over omfanget af kernen til cut fra en første del af toppen.
- Skub kniven bag kernen, løft prøveholderen med kernen omkring 10 pm og gentag skæring procedure. Gør dette indtil cirka en tredjedel af kernens diameter er skåret ned resulterer i en sammenhængende plan overflade.
- Fastgør tilvækst kerner i kernen indehaveren af et nyudviklet kerne mikrotom gør det muligt at skære plane overflader på kerner over hele deres udstrækning.
- Forberedelse mikro sektioner ved tilsætning af majsstivelse opløsning.
- For detaljeret billedanalyse af den anatomiske struktur, fix kerner eller andre prøver udskilt fra diske i indehaveren af en mikrotom. Placer microtome klinge, styret af et kugleleje vejledning af en nyudviklet slæde mikrotom på den øverste kant af prøven og trække over det.
- Skub klingen til at løfte prøven med omkring 20 til 30 um, og træk bladet over prøven igen. Gentag denne fremgangsmåde, indtil en kontinuerlig overflade på toppen af prøven er oprettet.
- Dæk resulterende overflade med en majsstivelse opløsning (10 g majsstivelse, 8 ml vand og 7 g af 100% glycerol) med en fælles børste.
BEMÆRK: stivelseskornene fylde de åbne celler i prøven til at stabilisere strukturen for den efterfølgende skæring af de tynde sektioner. - Løft prøven ved 15 pm, placere en pensel på overfladen af prøven, og træk bladet langsomt mod prøven begynder at afskære en tynd sektion (under børsten). Mens skæring, den resulterende sektion glider på bladet styret af børsten.
- Når hele sektionen er skåret, skal du fjerne mikro sektion fra bladet med en børste og vand (for at reducere friktion) og sted afsnittet på en glasplade til yderligere forberedelse. At forhindre dem tørring, dække dem med en lille mængde glycerol (33% = en del af 100% glycerol og to dele vand).
3. mikroobjektglas Forberedelse
- I den følgende fremstilling af permanente slides, først vaske glycerol væk fra mikro sektion med en pipette og vand.
- Dæk våde seIndsatsen med et par dråber Safranin (1 g Safranin pulver + 100 ml vand) og Astrablue (0,5 g Astra blå pulver + 2 ml 100% eddikesyre + 100 ml vand) for at skelne mellem forveddede og ikke-forveddede strukturer, men også for at forbedre kontrasten for den efterfølgende billedanalyse.
- Lad afsnittet hvile i 5 min er omfattet af farvestof og derefter vaske det væk med en pipette og vand igen.
- Så snart den overdrevne farvestof fjernes, dehydrere afsnittet med pipetter ved vask dem med en sekvens af 75% fortyndet, 96% og til sidst 100% ethanol.
- Brug pipetter at skylle prøver på objektglasset i stedet for at anbringe prøverne i et bad for at reducere behandlingstiden til to til 3 min for hele dehydrering processen.
BEMÆRK: Dehydrering med ethanol forhindrer skrøbelige prøver fra at bryde. - Derefter skylles afsnittet med 100% xylol.
BEMÆRK: Xylen er kræftfremkaldende og ventilation er obligatorisk i laboratoriet, når du bruger den. Andreprodukter findes udskiftning xylol, men hvis der er forsæt til at opbevare prøverne over længere tidsperioder (år, årtier) til en potentiel genanalyse, Canada balsam (trin 3.5.2) er den eneste indlejringsmedium der forbliver klart uden at ændre farve over tid. Desværre Canada balsam skal anvendes i kombination med xylol. - Så længe xylol slår mælket (hvidlig), gentages dehydrering proces, da det ikke er tilstrækkeligt dehydreret.
- Så snart xylol forbliver klar, dække sektion med et fald på 100% Canada balsam og dække det med et dækglas på mindst størrelsen af afsnittet.
BEMÆRK: Vær opmærksom på at fjerne luftbobler ved at trykke forsigtigt dækglasset ned. - Placer den resulterende mikro dias mellem to strimler af varmebestandige plastik og placere den på en metalplade. Anbring en vægt (fx en magnet) oven på objektglasset til at presse det ned for at holde sektionen fladt under følgende tørringsprocessen.
- Objektglassene anbringes i en ovn ved60 ° C i ca. 12 timer. Efter 12 timer, tage glider ud af ovnen og placere dem på en hylde for at lade dem afkøle til stuetemperatur (ca. 20 ° C). Efter afkøling fjernes vægten og plast bånd og rense dias ved hjælp af barberblade til at fjerne overskydende Canada balsam.
4. Visualisering celleindhold
- Forbered Nawashin opløsning 25.
- Der fremstilles en opløsning (A) med 5 g chromsyre, 50 ml 96% eddikesyre og 320 ml deioniseret vand. Forbered anden løsning (B) med 200 ml formalin med 175 ml deioniseret vand.
- Bland opløsning A og opløsning B i et 1: 1-forhold for at skabe den Nawashin opløsning.
- For at visualisere celleindholdet fastsætte prøven med Nawashin opløsning i 10 minutter for at stoppe alle nedbrydningsprocesser i cellen.
BEMÆRK: fiksering bevarer cellekerner giver mulighed for en vurdering af celle levetid (celle levetid = kerner tilstedeværende / kerner fraværende; tilstedeværelse or fravær af kernen angiver, om cellen er levende eller døde). - Efter fiksering vaskes sektionerne med vand til fuldt ud at fjerne Nawashin løsning, før farvning dem med Safranin-Astra blå og før yderligere farvning dem med picrinsyre-anilin blå (1 del mættet vandopløseligt anilin blå + 4 dele 10% pikrinsyre) .
- Opvarm forsigtigt prøven til ca. 80 ° C (i alle tilfælde under kogepunktet) at fremskynde farvning proces. For dehydrering og forankring af prøverne følge protokollen trin 3,4-3,8.
5. Forberedelse digitale billeder af anatomiske træk
- Opret digitale billeder af centrale overflader til fartøj analyse.
- Skær kerneoverfladen flyet ved hjælp af centrale mikrotomen og plette den resulterende overflade black ved blot at bruge en filt markør.
- Så snart farvestoffet tørres, gnide overfladen af kernen med kridt. Tryk kalken i cellerne ved blot at gnide kridt overoverfladen med en finger. Også fjerne overskuddet kridt ved denne procedure.
BEMÆRK: Som følge cellevæggene er sorte og lumen dele af fartøjerne er hvide. Denne kontrast er en forudsætning for en automatiseret billedanalyse. - Placer forberedt kerne under en kikkert mikroskop udstyret med et digitalt kamera. Tag en sekvens af lidt overlappende (ca.. 10%) billeder begynder på den ene side af kernen, indtil hele overfladen er fanget. Sy de enkelte billeder for at skabe et komplet billede af kernen overflade.
- Opret digitale billeder fra mikro dias
- Placer de rensede mikro dias under et mikroskop og tage overlappende billeder fra hele afsnittet.
- Definer en specifik forstørrelse afhængigt af strukturerne, der skal analyseres, i området mellem 40X og 1.000X forstørrelse.
- Sy de enkelte billeder for at skabe en komplet billede af sektionen. For at undgå eventuelle fordrejninger i syning proces, brug "; Plan "-type objektive linser med mikroskopet.
6. Kvantificering anatomiske træk
- For at detektere celler og ring grænserne ved hjælp af billedet analyseværktøj ROXAS18 eller lignende software, indlæse et komplet billede af en mikro sektion og den tilhørende rumlig kalibrering for at opnå kvantitative resultater i metriske enheder. Beregn den rumlige kalibrering ved at måle antallet af pixels mellem skalaerne i et mikrometer stage billeder taget med samme forstørrelse og dividere den opnåede værdi af skalaen afstand i metriske enheder (fx 1000 um).
- Vælg fra den medfølgende liste (forudsat i softwaren) en egnet konfiguration, før du starter den automatiske del af analysen.
BEMÆRK: En konfiguration er en tidligere optimeret sæt af programmets indstillinger, for eksempel, tager hensyn til farvning prøvens farve og størrelse og form vifte af cellerne, der skal detekteres. Skræddersyede konfigurationer dermedgøre det muligt at producere optimale resultater for forskellige arter og billedkvaliteter anerkendelse.- Vælg yderligere muligheder, såsom brugen af områder i det billede, der skal medtages eller udelukkes for at undgå, fx tomme billede margener eller revner i prøven, hvis det kræves.
- Start analysen ved at trykke på knappen Analyser. Hvis valgt, definerer områder i billedet, der skal medtages eller udelukkes ved hjælp af polygon, rektangel eller cirkel værktøj. Følgende automatisk analyse anvender fleksible algoritmer til at rette op på nogle billedet mangler (fx dårlig kontrast) og forbedre kontrasten baseret på kvaliteten af billedet.
- I særlige tilfælde (og især i troperne), fx ved prøvetagning stubbe og væltede træer eller når det er muligt, tage diske (tværsnit vinkelret på den voksende akse) med en motorsav. Du skal blot mærke skiverne og gemme dem indtil videre analyse.
Representative Results
Alle dendroecological analyser afhænger af nøjagtige prøver, uanset om skiver, kerner eller mikro kerner er truffet. Til dette brug for udstyr til at være i perfekt form (præcist skærpet) for at undgå mikrorevner i træ prøve. Ved udarbejdelsen af overflader på tilvækst kerner, er af afgørende betydning at anvende en kerne mikrotom. Evnen til at have åbne celler, som kan behandles yderligere for at forbedre kontrasten for billedet analyser og skib på måling (figur 1), er et første vigtigt skridt i retning af tilpasning af anatomiske strukturer i tidsserie-analyser. Undertiden massefylden af en hårdttræ prøve forhindrer anvendelse af en mikrotom. I så fald en ordentlig polering og efterfølgende fjernelse af overdreven savsmuld fra fartøjer med en kompressor eller vakuum er den bedste løsning.
For mere detaljerede analyser af mindre cellestrukturer som earlywood og latewood tracheiderne i nåletræer, er der behov for høj kvalitet mikro sektioner. Her PotentiAL artefakter såsom sekundære cellevægge bliver krængede den primære væg skal undgås (figur 2). Hvis disse artefakter forekommer i digitale billeder, en automatiseret analyse af celledimensioner er ikke længere mulig. Brug derefter artefakter manuelt korrigeres, hvilket er tidskrævende og i de fleste tilfælde resulterer i forkerte målinger af celle dimensioner. Den enkle anvendelse af en ikke-newtonsk væske, dvs en majsstivelse opløsning til toppen af prøven støtter stabiliteten af strukturen og samtidig reducere forekomsten af artefakter til et minimum (figur 2) 26. Denne anvendelse af majsstivelse, velegnet til alle træ prøver, herunder tropiske arter, gør anvendelsen af indlejring procedure til prøverne før opskæring overflødig.
Micro sektioner muliggøre en mere sikker bestemmelse af årringe. Dette er især tilfældet for nåletræer vokser på deres naturlige grænser, dvs. </ Em>, ved trægrænsen i høje alpine områder. Ekstremt smalle ringe er hyppige og svære at opdage makroskopisk (figur 3). I ekstreme tilfælde ringene bestå af en eller to rækker af earlywood celler og en række af flade latewood celler, som mangler (i modsætning til almindelige latewood celler) fortykkede cellevægge. Til dette de er bedre eller endda kun synlig, når du bruger mikro sektioner. Desuden kan tæthedsfluktuationer differentieres fra ring grænser tydeligere, hvilket forenkler påvisning af årringe især i Middelhavet og troperne (Figur 3).
Ved analyse af billeder ved en forstørrelse på 40X eller højere, enkelte celler er synlige og tykkelsen af deres cellevægge er også påviselige. Semi-automatisk analyse software gør det muligt at måle specifikke parametre langs definerede stier efter retning af deres tidsmæssige og rumlige udvikling (figur 4). Med dette, chanGES af enkelte parametre såsom celle lumen eller celle vægtykkelse kan bestemmes over hele omfanget af en årlig ring (figur 4). Dette kan gøres for alle ringene synlige i billedet, og det støtter fuldt ud behovet for en udvidet tidsserieanalyse.
Billede analyser kan også bruges til at bestemme de udviklingsmæssige faser af årringe i vækstperioden (figur 5). Ved analyse af billedet af et afsnit farvet med Safranin og Astra-blåt hjælp polariseret lys, selv de forskellige lignification, der begynder i den yderste hjørner af cellevæggene indtil hele lignification af det sekundære cellevæg, bliver synlige. Dette skyldes, forveddede (modne) cellevægge skinne i polariseret lys (figur 5). Detaljeret information kan relateres til miljødata dokumenteret for den pågældende vegetation periode til at bestemme for eksempel en mere detaljeret klima-vækst relati onship.
Figur 1. Eksempler på en mikro sektion og en forberedt plan overflade af en eg, herunder ring bredde og skibsstørrelse målinger Venstre:. Yderste del af en eg tilvækst kerne. Diameteren kerne 5 mm blev skåret ved hjælp af en kerne mikrotom. Overfladen blev derefter farvet sort ved hjælp af en filtpen og celler blev fyldt med kridt efter pletten var tørt. Til højre: grafen angiver ring bredde og skibsstørrelse målinger foretaget på overfladen af kernen vises til venstre. Ingen mikro sektioner var nødvendige for at gøre disse målinger på grund af den klare overflade skabt af kernen mikrotomen (modificeret efter 21). Nederst: Micro sektion afbrød en tilvækst kerne, farves, dehydreret og fikseret i Canada balsam. Tykkelse: 20 um, længde: 25 cm. g "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Billeder af mikro sektioner skæres uden stabilisering versus en sektion snit ved hjælp af majsstivelse løsning Venstre:. Micro sektion viser skære artefakter i earlywood tracheiderne af nåletræ. Prøven blev skåret uden indlejring og som et resultat af de forholdsvis tynde sekundære vægge earlywood celler blev udskilt den primære væg (blå pile). Til højre: Micro sektion uden nogen artefakter i earlywood tracheiderne af nåletræ. Dette afsnit (samme prøve som vist til venstre) blev skåret efter påføring af majsstivelse løsning med en børste på toppen af prøven overflade. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
. Figur 3. Eksempler på næppe påviselige årring grænser Venstre: Micro sektion af en tilvækst kerne (her: Europæisk Lærk), der viser en ring grænse (sort pil) angivet ved en enkelt række af flade latewood celler uden nogen fortykkelse af cellevægge. Denne ring vil ikke være synlig makroskopisk. Højre: Intra-årlige tæthed udsving (hvid pil) er almindelige i Middelhavet arter (micro sektion: Quercus Ilex). Den gradvise ændring af cellestrukturen mod latewood og tilbage til earlywood struktur (hvid pil) gør det muligt at differentiere tæthedsfluktuationer fra virkelige ring grænser (sort pil). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Illustration af lumen område og vægtykkelse målinger inden for en årlig ring af et nåletræ Top:. Cut-out billede, der viser en eksemplarisk resultater for Roxas analyse i et træ-ring af Pinus sylvestris (skovfyr). Ring grænser er vist med gult, og skitserer af tracheider lumina i cyan. For en radial fil (blå tracheider lumina) de målte celle vægtykkelser er repræsenteret af røde cirkler. Sort skala bar = 100 um. Nederst:. De intra-årlige ændringer i tracheider lumen område og tracheider celle-vægtykkelse for hele årring Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. example af en dannelse årring. Billedet er blevet taget til fange under et lysmikroskop med polariseret lys fra en Safranin og Astra-blå farvede mikro-sektion opnået fra en mikro-core samplet den 7. juli th, 2007 fra en Europæisk Lærk vokser i Lötschental på 1.300 m over havets overflade. På denne mikro-afsnittet af cambial celler, cellerne i udvidelsen fase, cellerne i vægfortykkelse fase og modne celler er genkendelige. Den tangentielle bredden af billedet dækker ~ 1 mm af veddet tværsnit. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
Udfordringerne for en vellykket og bæredygtig integration af træ anatomi i dendroecological forskning er, bortset fra mangfoldige analytiske problemer, hovedsagelig på grund af tekniske aspekter. Disse udfordringer spænder fra princippet prøveudtagning tilgange til at skabe høj kvalitet mikro sektioner og deres efterfølgende analyse 19.
Ved første øjekast, prøvetagning af kerner eller endda diske er en simpel procedure, der har været kendt i mange år nu. Der er mange ting, der kan gøres forkert og en lille unøjagtighed i prøvetagning kan resultere i alvorlige problemer under den videre udformning og analyse faser. Små unøjagtigheder som udkerning der er ikke ligefrem vinkelret på stamceller akse eller ved hjælp af en ufuldkomment skærpet corer er ikke et problem, hvis formålet med undersøgelsen er begrænset til at ringe bredde målinger. Men når der sigtes til mikroskopisk analyse af prøverne, kan en forkert retning prøvetagning medføre optiske fordrejninger afcellevægge, mens anvendelsen af stumpe corers resulterer i mikrorevner i kernen. Som et resultat, når de forsøger at skære mikro sektioner af disse kerner, de tynde sektioner blot falde fra hinanden og en effektiv forberedelse ikke længere garanteret. Det samme gælder for mikro-core stikprøver. Vil en stump spids resultere i højt tryk, når stanseorganet hamres ind i stammen træ. Derfor cambial lag vil blive komprimeret. De cambial celler (figur 5) er derfor klemt og kan ikke analyseres.
Disc prøveudtagning er faktisk den bedste strategi, når man analyserer vækst variationer at relatere dem til miljøændringer. Desværre er det simpelthen umuligt at tage diske fra alle træer, der er bestemt til at blive udtaget til yderligere analyser. Alligevel, især i tilfælde af tropisk dendrokronologi, er en vis mængde af stamceller diske behov i kombination med tilvækst kerner. Skiverne bruges som en base for at definere ring grænser og for at dette kan understøtte boundarerne defineret på grundlag af en analyse tilvækst kerner 12,27,28.
Fordele og ulemper ved slibning versus opskæring ofte diskuteret 1,11,21. Som det er nævnt ovenfor, den bedste fremgangsmåde afhænger altid af forskningsspørgsmålet og de parametre, der skal analyseres (makroskopisk eller mikroskopisk). Hvis isotopiske eller kemiske analyser er forventet i en yderligere bearbejdning trin, er det af største betydning, at slibestøv skabt ved slibning, som kan fylde i celle lumina over hele prøven, fjernes omhyggeligt ved støvsugning eller trykluft.
Skæring mikro sektioner er for alle mikroskopisk analyserer den mest hensigtsmæssige måde at forberede prøver til yderligere analyser. Først og fremmest er sektionen afbrød prøven, som derefter kan holdes uden kontaminering for potentielle yderligere analyser. Second disse afsnit mulighed for høje målinger af encellede parametre opløsning. Desuden undgår tidskrævende indlejringteknik ved hjælp af en majsstivelse opløsning 26 at stabilisere cellerne er en stor fordel i mikro sektionering.
En ulempe ved mikro sektionering er stadig den begrænsede stikprøvestørrelse resulterer i lange tilberedningstider. For serie realtid analyser gå tilbage i tiden gennem århundreder eller endda årtusinder, er der behov for at videreudvikle eksisterende skærende enheder 17,19, men også billedbehandling og analyse 18. Et første skridt i denne retning er udviklingen af kernen mikrotom 21, oprindelig fremstillet til at skære plane flader på kerner (figur 1). Nylige undersøgelser viste evnen til at klippe mikro sektioner af hele kerner ved hjælp af denne enhed (figur 1).
Høj kvalitet mikro afsnit indeholder det grundlæggende princip for en effektiv billedanalyse. Under billederne under et mikroskop er en almindelig procedure 19, men deres effektive analyse er stadig en opgave, der skalskal udvikles yderligere 17. Alle eksisterende billedanalyse systemer er semi-automatisk, dvs de har brug for at være mere eller mindre intenst kontrolleret af tekniker. I mange tilfælde har brug for de billeder, der skal rettes eller endda nye billeder skal gøres for at forbedre kontrasten for en bedre registrering af de strukturer af softwaren uden at ændre celle vægtykkelse i billedet.
Specialized billede analyseværktøjer såsom Roxas 18 WinCell eller særlige scripts til ImageJ 29 er i stand til at levere basale anatomiske data såsom celle nummer, celle dimension, cellevæg tykkelse og celle position under den årlige ring. Mange ekstra anatomiske målinger, der er relevante i en dendroecological sammenhæng kan beregnes ud fra disse grundlæggende målinger såsom størrelse af de største ledninger, størrelsesfordeling af ledninger, størrelse earlywood eller den første række af ledninger, (optisk) træ tæthed, intra-årlige profiler af ledningen størrelse og cellevægtykkelse, og gruppering mønstre af ledninger (ensom, multipla, etc.).
Brug af softwaren Roxas 18, er konturerne af ledningen lumina (dvs. vand ledende celle) og årlige ring grænser automatisk anerkendes og visuelt repræsenteret som overlejringer over originalbilledet. Algoritmer Detection for ledninger er baseret på farve, størrelse og information form, afsløring algoritmer til ring grænser op til den lokale forhold i hver enkelt ledning. En værktøjskasse giver os mulighed for manuelt at forbedre disse resultater ved direkte redigering af overlay-funktioner, dvs., slette, tilføje og ændre ring grænser og ledning skitserer. Efter redigering det endelige data output, herunder celle vægtykkelse (nåletræer), genereres automatisk og gemmes i et regneark. Fuldautomatiske systemer er i øjeblikket ikke tilgængelig, ikke engang for nåletræer, der viser en forholdsvis enkel struktur, men det er et mål for den fremtidige udvikling. Dette vil kraftigt støtte full integration af træ anatomiske parametre tidsserier analyser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Increment corer | http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en |
||
| Core-Microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Laboratory microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Trephor micro corer | http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp | ||
| Nawashin solution | Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid | ||
| Picric-Anilin blue | One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol | ||
| Safranin | Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 | ||
| Astra-blue | Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 | ||
| Ethanol | Linear Formula CH3CH2OH | ||
| Xylol (Xylene) | Linear Formula C6H4(CH3)2 | ||
| Canada Balsam | Embedding solution for microscopy | ||
| Roxas Software | http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN | ||
| ImageJ Software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| WinCell | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Schweingruber, F. H. Tree Rings and Environment: Dendroecology. , Haupt. Bern. (1996).
- Sheppard, P. R. Dendroclimatology: extracting climate from trees. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 1, 343-352 (2010).
- Wagenführ, R. Anatomie des Holzes: Strukturanalytik - Identifizierung - Nomenklatur - Mikrotechnologie. , DRW-Verlag Weinbrenner. (1999).
- Tennessen, D., Blanchette, R. A., Windes, T. C. Differentiating Aspen and Cottonwood in Prehistoric Wood from Chacoan Great House Ruins. Journal of Archaeological Science. 29, 521-527 (2002).
- Rowell, R. M. Handbook of Wood Chemistry and Wood Composites. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2005).
- Kaennel, M., Schweingruber, F. H. Multilingual Glossary of Dendrochronology. Terms and definitions in English, German, French, Spanish, Italian, Portuguese and Russian. , Haupt. Berne. (1995).
- Esper, J., Frank, D. C., Luterbacher, J., et al. A changing world: challenges for landscape research. On selected issues and challenges in dendroclimatology. Kienast, F. , Springer. Dordrecht. 113-132 (2007).
- Esper, J., Frank, D. C., Wilson, R. J. S., Büntgen, U., Treydte, K. Uniform growth trends among central Asian low and high elevation juniper tree sites. Trees. 21 (2), 141-150 (2007).
- Frank, D. C., Nievergelt, D., Esper, J. Summer temperature variations in the European Alps, AD 755-2004. Journal of Climate. 19 (2), 5606-5623 (2006).
- Treydte, K., et al. Millennium-long precipitation record from tree-ring oxygen isotopes in northern Pakistan. Nature. 440, 1179-1182 (2006).
- Heinrich, I. Dendrogeomorphology. The Encyclopedia of Quaternary Science. Elias, S. A. 2, Amsterdam, Elsevier. 91-103 (2013).
- Verheyden, A., De Ridder, F., Schmitz, N., Beeckman, H., Koedam, N. High-resolution time series of vessel density in Kenyan mangrove trees reveal a link with climate). New Phytologist. 167, 425-435 (2005).
- Abrantes, J., Campelo, F., García-González, I., Nabais, C. Environmental control of vessel traits in Quercus ilex under Mediterranean climate: relating xylem anatomy to function. Trees. 27, 655-662 (2013).
- Fengel, D., Wegener, G. W. ood Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions. , Kessel Verlag, Remagen. (2003).
- Heinrich, I., Gärtner, H., Monbaron, M. Tension wood formed in Fagus sylvatica and Alnus glutinosa after simulated mass movement events. IAWA-Journal. 28 (1), 39-48 (2007).
- Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom and New York, NY. (2013).
- Lucchinetti, S., Schweingruber, F. H. New perspectives for wood anatomical analysis in Dendrosciences: The GSL1-microtome). Dendrochronologia. 32 (1), 47-51 (2014).
- Arx, G., Carrer, M. ROXAS - a new tool to build centuries-long tracheid-lumen chronologies in conifers. Dendrochronologia. 32 (3), 290-293 (2014).
- Schweingruber, F. H. Microscopic Preparation Techniques for Plant Stem Analysis. , Verlag Dr Kessel, Remagen. (2013).
- Hoadley, R. B. Identifying wood: Accurate results with simple tools. , The Taunton Press. Newtown, CT. (1990).
- Nievergelt, D. The core-microtome. A new tool for surface preparation on cores and time series analysis of varying cell parameters. Dendrochronologia. 28 (2), 85-92 (2010).
- Von Schnakenburg, P., Bräuning, A., Helle, G. Detecting annual growth rhythms from high-frequency densitometry and carbon isotopes in tropical mountain rain forest trees in southern Ecuador. Tree Rings in Archaeology, Climatology and Ecology. Elferts, D., Brumelis, G., Gärtner, H., Helle, G., Schleser, G. 6, GFZ Potsdam. Potsdam. 96-99 (2008).
- Garcia Gonzalez, I., Fonti, P. Ensuring a representative sample of earlywood vessels for dendroecological studies: an example from two ring-porous species. Trees. 22 (2), 237-244 (2008).
- Fonti, P., et al. Studying global change through plastic responses of xylem anatomy in tree rings. New Phytologist. 185 (1), 42-53 (2010).
- Purvis, M. J., Collier, D. C., Walls, D. Laboratory techniques in Botany. , Butterworth, London. (1966).
- Schneider, L., Gärtner, H. The advantage of using non-Newtonian fluids to prepare micro sections. Dendrochronologia. 31 (3), 175-178 (2013).
- De Ridder, M., Vanden Bulcke, J., Van Ackera, J., Beeckman, H. Tree-ring analysis of an African long-lived pioneer species as a tool for sustainable forest management. Forest Ecology and Management. 304, 417-426 (2013).
- De Ridder, M., et al. A tree-ring based comparison of Terminalia superba climate–growth relationships in West and Central. Trees. 27 (5), 1225-1238 (2013).
- Redband, W. S. ImageJ. , U.S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij (1997).
