Abstract
Dendroecological 연구는 하나의 나무와도 전체 산림 생태계가 환경 변화에 반응하고 마지막으로 이러한 변화를 재구성하는 방법을 이해하는 데 나이테에 저장된 정보를 사용합니다. 이 시간을 거슬러 성장 변화를 분석하고 (예를 들어) 온도 기록에 다양한 식물 특정 매개 변수의 상관 관계에 의해 이루어집니다. 이러한 분석에 나무 해부학 적 매개 변수를 통합하는 것은도 연내 해결에 이르기까지, 복원을 강화한다. 따라서 우리는 다음 현미경 분석을 위해 또한, 샘플 준비 및 일반 거시적 분석을위한 나무 표본을 분석하지만,하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 더욱이 우리는 시계열 분석 지원하는 공통 크고 작은 표본에서 생성 된 디지털 이미지를 분석하기위한 잠재적 인 해결책을 소개한다. 는 현재 이용 될 수있는 프로토콜은 기본 단계를 제시한다. 이 외에도 지속적으로 기존 기술의 개선에 대한 필요성, 및 t의 새로운 개발이있다echniques, 기록하고 과거와 지속적인 환경 프로세스를 정량화한다. 전통적인 나무 해부학 적 연구는 연구의이 분야에 대한 생태 학적 정보를 포함하도록 확장 될 필요가있다. 이 새로운 파라미터를 분석하여 목본 식물의 해부학 특정 환경 요인의 단기 및 장기 효과를 이해하기위한 새로운 방법을 개발하고자 dendro 과학자를 지원할 것이다.
Introduction
나무뿐만 아니라, 관목, 난장이 관목, 심지어 허브들은 환경의 변화에 관련된 다기관 응답 패턴을 보여준다. 이러한 패턴은 19 세기 중반 이후 식물학과 식물 생리학의 대상이되어왔다. 당시 우 디 식물에 대한 연구는 주로 나무와 생태 학적 맥락 1의 구조와 나이테의 변동을 설명하는 분석에 초점을 맞추었다. 앤드류 더글라스 엘리 컷은 나이테 연구 2의 크로스 데이트 기술을 발명 할 때,이 생태 학적 맥락은 다소 정확하게 고고학에 나무 결과를 데이트에 새로운 기능에 의해 억제되었다. 처음으로 크로스 데이트 연도에 나이테의 정확한 연대를 활성화하고 지금까지 그 응용 (1) 모든 분야의 나이테 연구의 중추로 간주됩니다.
이와 병행하여, 19 세기 말 이후, 목재 해부학은 중요한 연구 분야에 관련된 진화자연 및 응용 과학 (3) 많은 다른 분야에 D. 두 가지 주요 영역이 설정되어 나무 기술, 생리학, 병리학, 생태 3,5 관련된 고고학 4에서 나무를 식별하는 기준이되는 체계적인 나무 해부학, 및 적용 나무 해부학,.
나이테 연구에서는 dendroecology 요즘 같은 지형 프로세스 (dendrogeomorphology), 기온과 강수량 재구성 (dendroclimatology), 수위 변화 (dendrohydrology) 또는 빙하 변동 (같은 환경 연구에 초점을 맞추고 나이테 관련 연구를 포괄하는 주제로 정의된다 dendroglaciology) 6. 이 정의에서 알 수 있듯이, 나이테 분석은 (I) 링 폭 7, 8, 나무 밀도 9 연간 변화를 분석하여 과거의 기후 조건으로 데이트 및 환경 프로세스를 재구성 분야에서 점점 더 중요 해지고 10 동위 원소, 또는 한 (ⅱ) t그는 지형 프로세스 (11)의 간격을 재발. 고리 - 폭 변동 및 동위 원소 함량이 매우 대한 상세한 연구 링 해부학 적 구조를 연구하기 위해, 더 상세히, IE의 고리를 분석 할 필요성을 보여준다. 그러나, 환경 변화에 관련된 나이테 내 나무 해부학 적 특징에 대한 자세한 연구는 12, 13는 드물다. 이러한 미세한 기능 14 알려져 있지만, 그들은 거의 dendroecological 연구에 미세한 수준에 적용되지 않았다. 또한, 정확한 데이트 상업적 필수적인 자연스럽게 성장 나무, 이러한 성장 반응의 정확한 타이밍은 거의 최근 15 문서화되지 않았다.
지구 온난화 (16)의 효과에 관해서는, 기존 및 새로운 기술 개발의 개선은 특히 기후 영향 연구 (11)의 관점에서, 기록 및 필요한 과거 및 지속적인 프로세스 환경을 정량화한다.생태 학적 기반 목재 해부학 (17) 전통적인 나무 해부학 적 연구를 확장하여, dendro 과학자는 새로운 매개 변수를 분석하고 나무가 우거진 식물 (18)의 해부학의 특정 환경 요인의 장단기 효과를 이해하는 새로운 방법을 개발할 수 있습니다. 특정 드라이버 (예를 들면, 기계적 힘, 기후 변화)에 관한 개별 고리 내의 다른 세포 매개 변수의 변화에 대한 자세한 지식은 나무 고리 형성의 다양성을 이해하기위한 기본 요구 사항입니다. 공통 링 폭 측정에 비해 목재 해부학 변동을 식별하는 노력과 시간을 많이 필요로하고보다 복잡한 광대 제조 기술을 필요로한다. 샘플 절단, 염색, 그리고 삽입의 자세한 절차는 다양하다 항상 연구 (19)의 목적에 따라 달라집니다.
수, 크기 또는 DISTR에 대한 침엽수 또는 구조에 링 폭의 거시적 분석을 위해활엽수에 ibution 용기는 시료의 표면은 일반적으로 미세 연마 지 또는 특수 연삭 기계 (20)를 사용하여 연마된다. 이 절차의 단점은 더욱 반자동 현미경 분석 (21)를 먼지 방지 각 셀의 충전된다. 시료 표면이 면도날 또는 다른 날카로운 칼을 사용하여 절단 할 때 거시적 샘플 준비를위한 최상의 결과를 얻을 수있다.
작은 샘플 있지만, 면도날은 완벽한 도구입니다; 코어와 같은 더 큰 샘플은 코어의 전체 범위에 걸쳐 비행기 표면의 절단을 필요로한다. 샌딩 대조적으로, 세포는 연속 이미지 분석을 더 제조 할 수있다 먼지로 충전되지 않는다. 또한, 개방 셀 루멘, 적절히 절단 세포벽 전체 샘플의 평면 표면은 상기 코어의 전체 범위에 고주파 농도계 (22)의 응용을 가능하게한다. 이미지는, 샘플의 표면 (세포 분석에서벽) 진한 잉크를 사용하여 염색 될 수 있고, 개방 셀 루멘이어서 셀 벽 및 루멘 지역 19, 23의 대비를 향상시키기 위해 흰색 분필로 채워질 수있다. 이 기술은 비교적 간단 용기 크기 측정을위한보다 큰 셀의 기본적인 구조의 육안 평가를 가능하게한다.
평면 표면을 절단 이러한 기술은 거시적 분석 충분합니다. 자세한 나무 해부학의 경우 (즉, 현미경) 분석, 투과광 현미경 dendro 과학에 적용되는 가장 일반적인 방법입니다. 목부 세포는 세포 타입 결정, 세포 분열, 세포 분화를 포괄하는 복잡한 과정을 거쳐 분화 및 세포 사멸 (24) 프로그래밍. 이러한 과정은 세포 해부학 발생 특성을 결정하는 타이밍과 속도 때문에, 이러한 프로세스에 영향을 미치는 환경 조건은 고리 구조에서 해부학 편차를 생성 할 수있다. 이러한 분석을위한 중요한 전제 조건으로들, 마이크로 섹션은 마이크로톰 (19)를 준비해야. 단면위한 샘플을 제조하는 경우, 섬유 또는 tracheid 방향의 시인성을 매우 중요하다. 슬라이딩 마이크로톰 종동 손의 사용은 이미지 (19)에 필요한 분석으로이 기술은 고품질의 섹션을 용이하게하기 때문에 미세 부분을 절단하도록 권장한다. 특정 연구의 특정 목적에 따라, 마이크로 셀 섹션의 길이 정도에 수직 또는 평행하게 절단된다. 이러한 섹션들은 다음 현미경 아래에 촬영되는 화상을 전문화하여 측정 셀 사이즈 분석 소프트웨어.
최근까지, 마이크로 섹션을 준비하는 능력은 작은 샘플 크기 만 (약 1cm X 1cm)로 제한 하였다. 이것은 특정 년에 장애가 특징 단일 이벤트를 분석하는 것도 수용 가능하지만,이 기술은 환경 복원에 필요한 확장 된 시계열 분석을 허용하지 않는다. 이러한 노력은 실현 될 수있다새로운 효율적이고 경제적 인 제조 방법 및 분석 기술의 개발을 통해 좋아. 최근 몇 년 동안, 스위스의 스위스 연방 연구소 WSL의 나이테 실험실의 구성원은이 주제에 대한 집중적 인 작업을 시작했다. 결과적으로, 새로운 장치 및 분석 기술은 환경 연구 주제의 다양한 목재로 해부학 적 특징을 통합의 개념을 지원하도록 개발되었다.
Protocol
1. 샘플링 기법
- 코어 샘플링
- 샘플링 나무 줄기를 들어, 각각의 성장 발전을 분석하기 위해 줄기에서 증가 corer를 사용하여 두 개 이상의 코어의 압축을 풉니 다. 일반적인 기후 복원이 기울기 코어 평행을 위해, 예를 들어, 연구 작업에 샘플링의 위치를 다릅니다. 열대 종과 작업 할 때, 적어도 세 개 이상의 코어를 가지고.
- 날카롭게 증가 corer (직경 5, 10 또는 12 mm)를 사용하고 줄기의 성장 축에 수직 corer를 놓습니다.
참고 : 나무로 시추 할 때의 회전 이외의 corer의 움직임을 방지하기 위해 푸셔를 사용 corer의 제어 및 안정적인 위치를 이동하십시오. 유입 및 속을 통해 줄기에 완전히 보어. 핵심 매우 빽빽한 나무 (즉, 열대 종)에, Diospyrus의 ebenum 같은 핵심도 조밀 한 숲에 수 증가 코어 어댑터 (흑단)와 특수 재구성 톱 몸을 사용합니다. </ 리> - 추출기를 사용하여 나무에서 생성 된 코어를 제거합니다. corer을 켜고 줄기에서 제거합니다.
- 그 핵심에 직접 배치 된 테이프에 작성하여 부드러운 연필을 사용하여 추출 된 핵심에 특정 ID를 추가합니다. 스템의 반대측에있는 절차를 반복한다.
- 손상을 방지하기 위해 플라스틱 또는 종이 튜브 또는 특수 상자에 트리의 두 샘플을 저장합니다.
주 : 성형에서 코어를 방지하기 때문에 종이 빨대 열대 환경에서 특히 유용합니다. - 마지막으로, 나무 지원 빔에 코어 (섬유 방향 수직)를 탑재합니다. 차가운 물에 강한 목재 접착제를 사용하고 건조 할 수 있습니다.
참고 :이 연구의 목적은 더 화학적, 동위 원소 또는 밀도 분석을 포함하는 경우 나무 지원에 코어를 장착하지 마십시오. 이러한 목적을 위해, 오픈 케이블 도관 또는 단일 얼굴 골판지의 코어를 고정합니다.
- 마이크로 코어 샘플링
- 특수 펀칭 장치를 사용또는 2mm의 개구와 바늘. 껍질의 두께에 따라 껍질의 필요한 부분을 제거하기 위해 부정 행위를 사용합니다.
- 전술 한 바와 같이 줄기에 성장 축에 수직 장치를 놓고 깊이 약 2cm로 줄기의 물관에 침투하는 망치를 사용합니다.
- 도구 내부 결과 마이크로 코어를 끊고 줄기에서 분리 바늘을 돌립니다. 마이크로 원심 튜브에 마이크로 코어를 저장하고 레이블을.
- 디스크 샘플링
- 젊고 아름다운 여자와 쓰러진 나무 또는 가능한을 샘플링 할 때 특별한 경우 (특히 열대 지방), 예를 들면, 체인 톱 (성장 축에 수직 단면을) 디스크에 걸릴. 단순히 디스크에 라벨을 추가로 분석 할 때까지 저장합니다.
참고 :이 샘플링 방법이 가장 일반적으로 증가 corers의 사용을 허용하지 않는 모든 건조 죽은, 역사, 고고학 및 하위 화석 재료뿐만 아니라, 매우 조밀 한 활엽수 적용됩니다.
2. 샘플 준비
- 디스크 샌딩
- 샌딩 기계에 디스크를 삽입하고 120, 220, 300 그릿이어서 80 그릿의 사포로 시작 점차 미세한 지립의 시퀀스를 사용하여 표면을 연마. 400 그릿으로 최종 연마는 대부분의 침엽수에 충분하다. 활엽수와 특히 열대 종의 경우, 사용은 성장 링 경계를 구분하기 위해 1200 밀가루를 샌딩.
- 코어에 평면 표면을 절단
- 자신의 전체 범위에 걸쳐 코어에 평면 표면을 잘라 수 있도록 새로 개발 된 핵심 마이크로톰의 핵심 홀더에 증가 코어를 수정합니다.
주 : 마이크로톰 나이프에 직각 인 직립 샘플의 섬유 방향을 갖도록 홀더 내의 코어의 방향을 교정. - 그것은 약간 블레이드에 닿을 때까지 코어를 들어 올립니다. 입방 코어의 범위에 걸쳐 볼 베어링지도 상에 고정 블레이드를 당겨상부의 제 1 부분을 t.
- 코어 뒤에 칼을 뒤로 밀어 코어와 약 10 μm의 샘플 홀더를 들어 올려 절단 절차를 반복합니다. 코어의 직경의 약 1/3 연속 평면의 결과로 삭감 될 때까지이 작업을 수행합니다.
- 자신의 전체 범위에 걸쳐 코어에 평면 표면을 잘라 수 있도록 새로 개발 된 핵심 마이크로톰의 핵심 홀더에 증가 코어를 수정합니다.
- 옥수수 전분 용액을 첨가하여 마이크로 섹션을 준비.
- 해부학 적 구조의 상세한 이미지 분석을 위해, 코어 또는 다른 샘플 마이크로톰의 홀더에 디스크에서 물적 분할 수정. 샘플의 상단에 새로 개발 된 썰매 마이크로톰의 볼 베어링 지침에 의해 인도 마이크로톰 블레이드를 놓고 그 위에 당깁니다.
- 약 20 내지 30 ㎛로하여 샘플을 들어 올려 다시 샘플을 통해 블레이드를 끌어 블레이드를 다시 밀어 넣습니다. 샘플의 상단에 연속 표면이 생성 될 때까지이 절차를 반복합니다.
- 그 결과 옥수수 녹말 용액으로 표면 (옥수수 전분 10g, 물 8 mL를 100 % 글리세의 7g을 커버일반 브러쉬 리터).
참고 : 전분 입자가 얇은 부분의 연속 절단 구조를 안정화 샘플의 오픈 셀을 채우기. - 15 ㎛의 샘플에 의해 리프트 샘플의 표면 상에 브러쉬를 배치하고 (브러시 아래) 얇은 부분을 절단하기 시작 샘플을 향해 서서히 블레이드를 당긴다. 절단하는 동안, 결과 부분은 브러시에 의해 유도 블레이드에 슬라이드.
- 전체 부분이 절단되면, 브러시와 물 블레이드에서 마이크로 섹션을 제거 (마찰을 줄이기 위해) 추가로 준비를위한 유리 슬라이드에 섹션을 배치합니다. 건조 해지는 것을 방지하기 위해, 글리세롤의 소량 (33 % = 100 % 글리세롤의 일부 및 물 두 부분)을 사용하여 커버.
3. 마이크로 슬라이드 준비
- 영구 슬라이드의 다음과 같은 준비를 위해, 먼저 피펫 물과 마이크로 절에서 멀리 글리세롤을 씻는다.
- 자체 젖은 커버Safranin 몇 방울 ction의 및 Astrablue (+ 2 ml의 100 % 아세트산의 물 + 100 ㎖의 아스트라 청색 분말 0.5 g) (Safranin 분말을 물 + 100 ㎖ 1 g)을 lignified 비 lignified 구분할 구조뿐만 아니라, 후속 분석을위한 화상 콘트라스트를 향상시키기 위해.
- 염료에 의해 커버 5 분 섹션 나머지를하자 다시 펫 및 물로 씻어.
- 즉시 과도한 색소가 제거 될 때, 희석 된 75 %, 96 %의 서열 최종적 100 % 에탄올로 세척하여 피펫으로 탈수 부.
- 피펫을 사용하는 대신, 전체 탈수 공정에 약 2 분 내지 3까지의 처리 시간을 감소시키기 위해 욕에서 샘플을 배치하는 유리 슬라이드에 샘플을 린스한다.
참고 : 에탄올로 탈수가 파손 깨지기 쉬운 샘플을 방지 할 수 있습니다. - 그 후 100 % 크 실롤이있는 부분을 씻어.
참고 : 크실렌은 암을 유발하고 사용할 때 환기가 실험실에서 의무입니다. 다른제품은 크 실롤를 교체 존재하지만, 잠재적 인 재분석 더 긴 기간 (년, 수십 년)을 통해 샘플을 저장하는 의도가있는 경우, 캐나다 발삼 (단계 3.5.2)은 시간이 지남에 따라 색상을 변경하지 않고 명확한 유지 만 포함 매체입니다. 불행하게도 캐나다 발삼은 크 실롤와 함께 사용되어야합니다. - 충분히 탈수없는만큼 크 실롤이 (희끄무레) 우유를 회전으로, 탈수 과정을 반복한다.
- 즉시 분명 크 실롤 채로 있다면, 100 % 캐나다 발삼의 드롭 부 커버 부와의 적어도 크기의 커버 유리로 커버.
참고 : 아래로 부드럽게 커버 유리를 눌러 기포를 제거하는주의하십시오. - 내열 플라스틱의 두 조각 사이에 생성 된 마이크로 슬라이드를 놓고 금속판에 놓습니다. 다음 건조 과정에서 평평한 부분을 유지하기 위해 아래로 눌러 슬라이드의 상단에 (예를 들어, 자석) 무게를 놓습니다.
- 오븐에서에서 슬라이드를 배치약 12 시간 동안 60 ° C에서. 12 시간 후, 오븐에서 슬라이드를 타고 그들을 RT (약 20 ° C)까지 식을 수 있도록 선반에 배치합니다. 차가울 때, 무게와 플라스틱 스트립을 제거하고 잉여 캐나다 발삼을 제거하기 위해 면도날을 사용하여 슬라이드를 청소합니다.
4. 셀 내용을 시각화
- Nawashin 솔루션 (25)을 준비합니다.
- 크롬산 5g, 96 % 아세트산 50 ㎖, 탈 이온수 320 mL를 용액 (A)을 준비한다. 탈 이온수 175 mL를 포르말린 200㎖의 다른 용액 (B)를 준비한다.
- Nawashin 솔루션을 만들 : 1 비율로 1 용액 A와 용액 B를 섞는다.
- 10 분은 셀 내의 모든 분해 프로세스를 중지하는 셀 내용을 시각화하기 위해, Nawashin 솔루션 샘플을 수정합니다.
참고 : 고정은 세포의 수명 (전지 수명 = 현재 핵 / 핵이 존재의 추정을 허용 세포 핵을 보존, 존재 오셀이) 살아 있거나 죽어 여부를 핵의 R의 부재를 나타냅니다. - 고정 후, 완전히 Safranin-아스트라 파란색과 추가 피크르산 아닐린 블루로 염색하기 전에 (1 부 포화 수용성 아닐린 10 % 피크르산의 블루 + 4 부분)을 염색하기 전에 Nawashin 솔루션을 제거하기 위해 물에 절을 씻어 .
- 조심스럽게 염색 과정을 가속화 (비점 이하의 임의의 경우)에 대해 80 ° C로 샘플을 가열한다. 샘플의 탈수 및 내장하는 프로토콜은 3.4-3.8 단계를 따르십시오.
5. 해부학 적 특징의 디지털 이미지를 준비
- 혈관 분석을 위해 핵심 표면의 디지털 이미지를 생성합니다.
- 코어 마이크로톰을 사용하여 코어 표면을 평면 컷 단순히 펠트 마커를 사용하여 얻어진 표면에 검은 얼룩.
- 즉시 건조 염료로서, 흰색 분필 코어의 표면을 문질러. 단순히 위에 분필을 문질러 세포에서 분필을 눌러손가락을 사용하여 표면. 또한이 절차에 의해 분필 흑자를 제거합니다.
주 : 셀벽 블랙이고 혈관의 내강 부분 백색 결과. 이것은 콘트라스트를 자동 화상 분석을위한 전제 조건이다. - 디지털 카메라가 장착 된 쌍안 현미경 아래 준비 코어를 놓습니다. 약간 겹치는 순서 가라 (약 70도. 10 %) 전체면이 될 때까지 포착 된 이미지는 상기 코어의 일측에 시작. 핵심 표면의 전체 이미지를 만들 수있는 하나의 이미지를 스티치.
- 마이크로 슬라이드에서 디지털 이미지 만들기
- 현미경으로 청소 마이크로 슬라이드를 놓고 전체 부분의 이미지를 중첩 걸릴.
- 구조에 따라 특정 배율을 정의하면 40X 배율 1000 배와 사이의 범위를 분석한다.
- 섹션의 하나의 완전한 이미지를 만들 수있는 하나의 이미지를 스티치. 바느질 과정에서 가능한 왜곡을 방지하기 위해, "사용; 계획 "현미경의 대물 렌즈를 - 형.
6. 정량화 해부학 적 특징
- 이미지 분석 공구 ROXAS18 또는 유사한 소프트웨어를 사용하여 세포 및 링 테두리를 검출하기 위해, 마이크로 미터 단위 섹션과 정량적 결과를 얻기 위해 교정 연관된 공간의 전체 이미지를로드. 같은 배율로 촬영과 측정 단위의 규모 간격에 의해 얻어진 값을 나누어 마이크로 미터 스테이지 이미지의 비늘 사이의 픽셀 수 (예를 들어, 1000 μm의)를 측정하여 공간 교정을 계산합니다.
- (소프트웨어에서 제공) 제공된 목록의 자동 분석을 시작하기 전에 일부 적절한 구성에서 선택한다.
주 : 구성은 예를 들어, 검출 될 고려 시료와 세포의 크기 및 형상 범위의 색 얼룩을 얻어, 프로그램 설정 이전에 최적화 된 세트이다. 따라서 맞춤형 구성다른 종과 이미지 품질을위한 최적의 인식 결과를 얻을 수 있습니다.- 이러한 포함 또는 방지하기 위해 제외 할 수있는 이미지의 영역의 사용과 같은 추가 옵션을 선택 예를 들어, 샘플 빈 이미지 마진 또는 균열, 필요한 경우.
- 분석 버튼을 눌러 분석을 시작합니다. 선택한 경우, 포함 또는 다각형, 사각형 또는 원 도구를 사용하여 배제되어야 이미지의 영역을 정의한다. 다음의 분석은 자동 화상의 품질에 기초하여 콘트라스트를 약간 화상 결함 (예를 들어, 불량한 콘트라스트)를 향상시키기 위해 정정가요 알고리즘을 사용한다.
- 젊고 아름다운 여자와 쓰러진 나무 또는 가능한을 샘플링 할 때 특별한 경우 (특히 열대 지방), 예를 들면, 체인 톱 (성장 축에 수직 단면을) 디스크에 걸릴. 단순히 디스크에 라벨을 추가로 분석 할 때까지 저장합니다.
Representative Results
모든 dendroecological 분석은 정확한 샘플에 따라 상관없이 디스크, 코어, 또는 마이크로 코어는 촬영하는 경우. 이를 위해, 장치는 나무 시료 내의 마이크로 크랙을 방지하기 위해 (정확하게 날카롭게) 최적 형상으로 할 필요가있다. 증분 코어에 표면을 제조 할 때, 코어 마이크로톰의 사용은 필수적이다. 또한 이미지를 분석하고 선박의 크기 측정 (그림 1)에 대한 대비를 강화하기 위해 처리 할 수 열려있는 세포를 가지고 할 수있는 능력은 일련의 분석 시간에 해부학 적 구조의 적응을 향한 중요한 첫 단계이다. 때로는 나무 샘플의 밀도는 마이크로톰의 사용을 방지 할 수 있습니다. 이 경우 적절한 연마 및 압축기 또는 진공 용기에서 과도한 톱밥의 후속 제거는 최선의 방법입니다.
earlywood와 침엽수에 latewood tracheids 같은 소형 셀 구조의 자세한 분석을 위해, 고품질의 마이크로 섹션이 필요하다. 여기에, potenti이러한 이차 전지 벽으로 알 유물은 기본 벽 필요 피할 수있다 (그림 2)을 벗겨된다. 이러한 아티팩트는 디지털 이미지에서 발생하는 경우, 셀 사이즈의 자동 분석이 더 이상 가능하지 않다. 유물은 수동으로 시간과 세포 차원의 부정확 한 측정에서 대부분의 경우 결과에 인 수정 될 필요가있다. (도 2) (26)를 최소로 아티팩트의 발생을 감소시키면서 시료의 상부에 비 뉴턴 유체, 즉, 옥수수 전분 용액의 애플리케이션은 간단한 구조의 안정성을 지원한다. 열대 나무 종을 포함한 모든 샘플에 적합한 옥수수 전분,이 애플리케이션은 중복 절단 전에 샘플 매립 순서를 적용한다.
마이크로 섹션 연간 반지의보다 안전한 결정을 할 수 있습니다. 특히 침엽수, 즉 자연 제한, 성장에 대한 경우 </ EM>, 높은 고산 지역에서 트리 라인에서. 매우 좁은 링 (그림 3) 육안으로 감지하기 자주 어렵다. 극단적 인 경우, 고리 earlywood 셀의 하나 또는 두 개의 행과 육화 셀벽 (공통 latewood 셀들에 대비하여) 평탄화 부족 latewood 셀의 하나의 행으로 구성. 마이크로 섹션을 사용하는 경우이 들어 그들은 더 나은 또는 만 볼 수 있습니다. 또한, 밀도 변동은 특히 지중해와 열대 (그림 3) 연간 반지의 검출을 단순화, 더 명확하게 링 경계를 구별 할 수 있습니다.
40X 이상의 배율에서 이미지를 분석 할 때, 단일 세포를 볼 수 있으며 그 셀벽의 두께도 검출 가능하다. 반자동 분석 소프트웨어는 공간적 현상 (도 4)의 다음 정의 방향 경로를 따라 특정 매개 변수의 측정을 가능하게한다. 이와, 짱예컨대 세포 또는 세포 내강 벽 두께로서 단일 파라미터는 GES 연륜 (도 4)의 전체 범위에 걸쳐 결정될 수있다. 이것은 이미지 내의 모든 가시 고리에 대해 수행 될 수 있고, 이는 완전히 확장 된 시계열 분석을위한 필요성을 지원한다.
이미지 분석은 또한 식물 기간 (도 5) 내의 나이테의 발달 단계를 결정하는데 사용될 수있다. Safranin 및 아스트라 블루 이차 세포벽 전체 lignification까지 셀 벽의 최 외측 모서리에서 시작하여, 편광 lignification 심지어 다른 단계를 이용하여 염색 부분의 화상을 분석 할 때, 표시된다. lignified (성숙) 세포벽이 편광 (그림 5)에 빛나는 때문이다. 상세 정보는 예를 상세 기후 성장 relati 대한 판별 각 식물 기간 문서화 환경 데이터에 관련 될 수있다 onship.
그림 1. 마이크로 섹션의 예 링 폭과 용기의 크기 측정을 포함하는 오크의 준비 평면 왼쪽 :. 오크 증가 코어의 바깥 쪽 부분입니다. 5mm 직경의 코어는 코어 마이크로톰을 사용하여 절단 하였다. 표면은 펠트 마커를 사용하여 블랙 염색하고 염색 건조 후 세포는 흰색 분필로 가득 차 있었다. 오른쪽 : 그래프는 왼쪽에 표시된 코어의 표면에서 수행 링 폭과 용기의 크기 측정을 표시합니다. 어떤 마이크로 섹션으로 인해 (21 후 수정) 핵심 마이크로톰에 의해 생성 된 명확한 표면에 이러한 측정을 할 필요가 없습니다. 아래 : 마이크로 섹션은 탈수, 염색 캐나다 발삼 고정, 증가 코어를 차단. 두께 : 20 μm의 길이 : 25cm. g "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 마이크로 섹션 2. 이미지는 옥수수 전분 용액을 사용하여 섹션 컷 대 안정화없이 잘라 왼쪽 :. 마이크로 섹션은 침엽수의 earlywood의 tracheids에서 아티팩트를 절단 표시합니다. 샘플은 포함시키지 않고 절단하고 결과로서 earlywood 셀 오히려 이차 얇은 벽은 기본 벽 (파란색 화살표)를 물적 분할 하였다. 오른쪽 : 침엽수의 earlywood의 tracheids의 모든 유물없이 마이크로 섹션. 이 섹션 (왼쪽 그림과 같이 동일한 샘플)을 시료 표면의 상단에 브러시로 옥수수 녹말 용액을 도포 한 후 절단 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 그림 거의 검출 연륜 경계 3. 예 왼쪽 : 세포 벽의 비후없이 평평 latewood 세포의 단일 행으로 표시 링 경계 (검은 색 화살표)를 표시 : (릭스의 탈락 여기) 증가 코어의 마이크로 섹션. 이 반지는 거시적으로 볼 수 없습니다. 오른쪽 : 연내 밀도 변동 (흰색 화살표) 지중해 종에 공통 (마이크로 섹션 : 신 꽝). 다시 earlywood 구조 (흰색 화살표)에 latewood와 향해 셀 구조의 점진적 변화가 실제 링 경계에서 밀도 변동 (검은 색 화살표)를 구별 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 침엽수 연륜 내 루멘 지역과 벽 두께 측정 4. 그림 위 :. Pinus sylvestris의 (구주 소나무)의 나이테에서 록 사스 분석의 실시 결과를 보여주는 잘라낸 이미지. 링 테두리는 노란색으로 표시하고 시안에 tracheid 내강의 설명된다. 하나의 반경 파일 (블루 tracheid 내강)에 측정 된 셀 벽 두께는 적색 원으로 표시된다. 블랙 스케일 바 = 100 μm의. 아래 :. tracheid 루멘 지역 전체 연간 링 tracheid 세포 벽 두께의 내 연간 변경 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. Exampl성형 연륜의 전자. 이미지가에서 성장 릭스의 탈락에서 7 일 2007 년 7 월 샘플링 마이크로 코어에서 얻은 Safranin와 아스트라 블루 스테인드 마이크로 섹션에서 편광과 광학 현미경으로는 포착되었습니다 Lötschental 해발 1,300m에서. 이 섹션에있는 마이크로 - 셀 cambial, 위상 확대 세포 비후 단계에서 세포와 성숙 세포를 인식 할 수있다. 이미지의 접선 폭은 목부 단면의 ~ 1mm를 다루고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
dendroecological 연구에 나무 해부학의 성공적이고 지속 가능한 통합의 과제 떨어져 매니 폴드 분석 문제에서 주로 기술적 인 측면이다. 원칙적으로 샘플링 고품질 마이크로 섹션과 이후의 분석 (19)를 만드는 접근에서 이러한 도전은 다양합니다.
언뜻보기에, 코어 또는 디스크의 샘플링은 이제 여러 해 동안 알려져있다 간단한 절차입니다. 잘못을 수행 할 수 있습니다 샘플링의 작은 부정확 후속 준비 및 분석 단계에서 심각한 문제가 발생할 수있는 많은 것들이 있습니다. 연구의 목적은 측정 폭을 울리도록 제한되어있는 경우 이러한 스템 축 또는 불완전 날카롭게 corer를 사용하여 수직으로 정확하게하지 코어 링과 같은 작은 부정확성은 문제가되지 않습니다. 시료의 현미경 분석을 목표로 그러나, 잘못된 샘플링 방향의 광학 왜곡이 발생할 수 있습니다세포벽, 코어 내의 마이크로 크랙 무딘 corers 결과를 사용한다. 이들 코어의 미세 부분을 절단하려고 할 때 결과적으로, 얇은 부분은 따로 따로 떨어지지 않고 효율적인 제조는 더 이상 보장된다. 같은 마이크로 코어 샘플링 마찬가지입니다. 구멍을 뚫는이 줄기 나무에 망치로 때 무딘 팁은 고압 발생합니다. 따라서 cambial 층은 압축됩니다. cambial 세포 (도 5) 결과적으로 압착되고 분석 될 수 없다.
디스크 샘플링은 참으로 성장 변화를 분석하는 것은 환경 변화로 관련하는 최선의 전략이다. 불행히도 추가 분석을 위해 샘플링하기위한 모든 나무에서 디스크를 가지고 단순히 불가능하다. 그럼에도 불구하고, 특히 열 나이테 경우, 스템 디스크가 일정량 증가 코어와 함께 필요하다. 디스크는 반지의 경계를 정의하는 기준으로 사용되며,이를 위해 boundar을 지원하기 위해이거는 증가 코어 12,27,28 분석에 기초하여 정의.
절단 대 샌딩의 장점과 단점은 자주 1,11,21을 설명합니다. 그것은 위에서 언급 된 바와 같이, 절차는 항상 가장 연구 문제에 의존하고 매개 변수 (육안 또는 현미경) 분석한다. 동위 원소 또는 화학 분석이 상기 작업 공정에 투영되는 경우, 전체 시료 위에 세포 내강으로 채울 수 샌딩 만든이 연마 분진 신중 진공 또는 압축 공기에 의해 제거하는 것이 매우 중요하다.
모든 현미경 추가 분석을 위해 샘플을 준비하는 가장 적절한 방법을 분석 마이크로 섹션을 절단한다. 우선, 다음 섹션은 상기 분석에서 잠재적 오염없이 유지 될 수있는 샘플, 차단된다. 둘째 이러한 섹션은 단일 세포 매개 변수의 고해상도 측정 할 수 있습니다. 또한, 시간 낭비를 피 매립셀을 안정화시키기 콘스타치 용액 26을 사용하여 기술은 마이크로 단면에서 큰 장점이다.
마이크로 절편의 단점은 여전히 긴 준비 시간의 결과로 제한된 표본의 크기입니다. 실제 시계열 세기 또는 천 위에 시간을 거슬러가는 분석에서, 상기 기존 절단 장치 (17, 19), 그러나 화상 처리 및 분석 (18)의 개발이 요구되고있다. 이러한 방향으로의 첫 번째 단계는 초기 코어에 평면 표면 (도 1)를 잘라 제조 마이크로톰 코어 (21)의 개발이다. 최근의 테스트는이 장치 (그림 1)를 사용하여 전체 코어의 마이크로 부분을 절단 할 수있는 능력을 밝혔다.
고품질 마이크로 섹션 효과적인 이미지 분석하는 기본 원리를 제공한다. 현미경으로 이미지를 촬영하는 것은 일반적인 절차 (19)이지만, 그 효과 분석은 여전히 필요로하는 작업입니다상기 (17)을 개발한다. 기존의 모든 화상 분석 시스템들은 다소 강하게 기술자에 의해 제어 될 필요, 즉 반자동이다. 많은 경우에, 화상 보정 할 필요가 심지어 새로운 이미지는 이미지 내의 칸막이 벽의 두께를 변경하지 않고 소프트웨어에 의한 구조의 더 등록 콘트라스트를 향상시키기 위해 수행되어야한다.
이러한 사스 18 WinCell 또는 ImageJ에 29 대 특정 스크립트와 같은 전문화 된 이미지 분석 공구는 셀 번호, 셀 사이즈, 셀 벽 두께 및 연륜 내의 셀 위치 등의 기본 해부학 적 데이터를 제공 할 수있다. dendroecological 맥락에서 관련된 많은 추가적인 해부학 메트릭은 이러한 큰 도관 크기, 도관 크기 분포, earlywood 또는 도관의 첫 번째 행의 크기 (광) 목재 밀도 연내 이러한 기본적인 측정으로부터 계산 될 수있다 도관 크기 및 칸막이 벽의 프로파일두께 및 도관 (독방, 배수 등)의 그룹화 패턴.
소프트웨어 로하스 (18)를 사용하여, 도관 내강 (즉, 물을 수행하는 세포)와 연륜 경계의 개요가 자동으로 인식하고 시각적으로 원본 이미지 위에 오버레이로 표시됩니다. 도관에 대한 검색 알고리즘은 색상, 크기 및 형상 정보, 각 도관의 지역 상황에 링 테두리에 대한 탐지 알고리즘을 기반으로합니다. 도구 상자는 우리가 직접 수동으로, 즉, 오버레이 편집 기능을 삭제, 추가 및 링 테두리를 수정하고 도관 설명하여 이러한 결과를 향상시킬 수 있습니다. 편집 한 후, 셀 벽 두께 (침엽수)를 포함한 최종 출력 된 데이터는 자동으로 생성하고, 스프레드 시트에 저장. 완전 자동화 된 시스템은 현재 사용하지 않는 경우에도 비교적 간단한 구조를 나타내는 침엽수를 들어, 사용할 수 없습니다, 그러나 이것은 앞으로의 개발 목표입니다. 이것은 푸 강하게지지 할시계열 나무 해부학 적 매개 변수의 LL 통합 분석한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Increment corer | http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en |
||
| Core-Microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Laboratory microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Trephor micro corer | http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp | ||
| Nawashin solution | Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid | ||
| Picric-Anilin blue | One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol | ||
| Safranin | Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 | ||
| Astra-blue | Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 | ||
| Ethanol | Linear Formula CH3CH2OH | ||
| Xylol (Xylene) | Linear Formula C6H4(CH3)2 | ||
| Canada Balsam | Embedding solution for microscopy | ||
| Roxas Software | http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN | ||
| ImageJ Software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| WinCell | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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