Abstract
Dendroecological forskning bruker informasjon som er lagret i årringer å forstå hvordan enkelttrær og selv hele skogøkosystemer svart på miljøendringer og til slutt rekonstruere slike endringer. Dette gjøres ved å analysere vekstvariasjoner tilbake i tid og samkjøre ulike plantespesifikke parametre (for eksempel) temperaturrekorder. Integrering tre anatomiske parametre i disse analysene vil styrke rekonstruksjoner, helt ned til intra-årlig oppløsning. Vi derfor presentere en protokoll om hvordan å prøve, forberede og analysere tre eksemplar for vanlige makroskopiske analyser, men også for påfølgende mikroskopiske analyser. Videre kan vi innføre en potensiell løsning for å analysere digitale bilder generert fra vanlige små og store prøver å støtte tidsserieanalyser. Protokollen viser de grunnleggende trinn som de i dag kan anvendes. Utover dette, er det et stadig behov for forbedring av de eksisterende teknikker og utvikling av nye techniques, å registrere og kvantifisere tidligere og pågående miljøprosesser. Tradisjonelle tre anatomisk forskning må utvides til å omfatte økologisk informasjon til dette forskningsfeltet. Dette ville støtte dendro forskere som har tenkt å analysere nye parametere og utvikle nye metoder for å forstå de kortsiktige og langsiktige effekter av spesifikke miljøfaktorer på anatomi av treaktige planter.
Introduction
Trær, samt busker, dvergbusker, og selv urter, viser manifold reaksjonsmønstrene knyttet til endringer i deres miljø. Disse mønstrene har vært gjenstand for botanikk og plantefysiologi siden midten av 19-tallet. Tilbake da, forskning på treaktige planter fokusert mest på trær og en beskrivende analyse av struktur og variasjon av årringer i en økologisk sammenheng en. Når Andrew Ellicott Douglass oppfant cross-dating teknikk for tre-ring forskning 2, var dette økologisk sammenheng mer eller mindre undertrykt av den nye muligheten til å nøyaktig dato tre funn i arkeologi. Cross-dating for første gang aktivert nøyaktig datering av årringer til kalenderåret, og er til nå betraktet som ryggraden i tre-ring forskning innen alle felt av sin søknad en.
Parallelt siden slutten av 19-tallet, tre anatomi utviklet seg til et viktig forskningsdisiplin forholderd til mange andre felt av naturlige og anvendt vitenskap tre. To hovedområder etableres: den systema tre anatomi, noe som er grunnlaget for identifisering av tre i arkeologiske 4, og den anvendte trevirke anatomi, relatert til tre-teknologi, fysiologi, patologi og økologi 3,5.
I tre-ring forskning, dendroecology i dag er definert som et emne som omfatter årringer relaterte studier som fokuserer på miljøundersøkelser som geomorphic prosesser (dendrogeomorphology), temperatur og nedbør rekonstruksjoner (dendroklimatologi), vannstandsendringer (dendrohydrology) eller bre svingninger ( dendroglaciology) 6. Som denne definisjonen indikerer, har årringer analyser blitt stadig viktigere innen dating og rekonstruere miljøprosesser som (i) siste klimaforhold ved å analysere årlige variasjoner i ring-bredde 7,8, tre tetthet 9 eller isotoper 10, eller (ii) than tilbakefall intervaller på geomorphic prosesser 11. Disse meget detaljerte studier om ringbreddevariasjoner og deres isotoper innhold demonstrere behovet for å analysere ringer i nærmere detalj, dvs, for å studere den anatomiske strukturen av ringene. Men detaljerte studier av tre anatomiske trekk innenfor årringene knyttet til miljøendringer er sjeldne 12,13. Selv om disse mikroskopiske funksjonene er kjent 14, har de sjelden blitt brukt på et mikroskopisk nivå til dendroecological forskning. Videre nøyaktig timing av disse vekstreaksjoner i naturlig dyrket trær, avgjørende for eksakte dating formål, har sjelden blitt dokumentert nylig 15.
Når det gjelder virkningene av den globale oppvarmingen 16, til forbedring av eksisterende og utvikling av nye teknikker registrere og kvantifisere tidligere og pågående miljøprosesser er nødvendig, spesielt når det gjelder klimapåvirkning forskning 11.Ved å utvide tradisjonelle tre anatomisk forskning til en økologisk basert trevirke anatomi 17, kan dendro forskerne analysere nye parametere og utvikle nye metoder for å forstå de kortsiktige og langsiktige effekter av spesifikke miljøfaktorer på anatomi av treaktige planter 18. Detaljert kunnskap om variasjoner i ulike celleparametere innenfor de enkelte ringene knyttet til spesifikke drivere (f.eks mekaniske krefter, klimavariasjoner) er den grunnleggende forutsetning for å forstå variasjonen i treet ring formasjon. Sammenlignet med vanlige ring bredde målinger, identifisere tre anatomiske varianter krever mer komplekse og omfattende forberedelse teknikker som krever mye arbeid og tid. Detaljerte prosedyrer for prøven skjæring, farging, og innstøping er fordeleren og er alltid avhengig av Målet med studien 19.
For makroskopisk analyse av ringbredde i bartrær eller strukturer for antall, størrelse eller distribution av skip i hardtre, overflaten av en prøve vanlig polert med fint slipepapir eller spesielle slipemaskiner 20. En ulempe med denne prosedyren er at fyllingen av de individuelle cellene med støv som hindrer ytterligere halvautomatisk mikroskopisk analyse 21. De beste resultatene for makroskopisk prøveopparbeidelse oppnås når prøveflate er kuttet ved hjelp av et barberblad eller en annen skarp kniv.
Mens for små prøver, barberblader er et perfekt verktøy; større prøver som kjerner krever skjæring av plane flater over hele omfanget av kjerner. I motsetning til sliping, blir cellene ikke er fylt med støv, noe som muliggjør ytterligere forberedelse for den etterfølgende bildeanalyse. Videre er den åpne cellelumen, de skal kutte cellevegger, og den plane overflate av hele prøven muliggjøre anvendelsen av høyfrekvent densitometri 22 til hele omfanget av kjernen. For bildeanalyser, overflaten av prøvene (cellevegger) kan farges ved hjelp av mørk blekk og de åpne celle lumen kan senere bli fylt med hvitt kritt for å øke kontrasten mellom celleveggen og lumen området 19,23. Dette ganske enkel teknikk gjør en grunnleggende makroskopisk vurdering av større cellestrukturer for fartøy størrelse målinger.
Disse teknikkene for skjæring av plane flater er tilstrekkelig for makroskopiske analyser. For en detaljert tre anatomiske (dvs. mikroskopisk) analyse, er overført lysmikroskopi den vanligste metoden anvendt i dendro vitenskaper. Xylem celler differensierer gjennom komplekse prosesser som omfatter celletype bestemmelse, celledeling, celledifferensiering, og programmert celledød 24. Siden timing og hastigheten som disse prosessene oppstår bestemme celle anatomiske egenskaper, kan miljøforhold som påvirker disse prosessene generere anatomiske avvik i ringstrukturen. Som en viktig forutsetning for disse analyseres, mikro seksjoner må være forberedt med en mikrotom 19. Når du forbereder prøver for seksjonering, er synligheten av tracheid eller fiberretningen avgjørende. Bruken av hånddrevet skyve mikrotomer er det anbefalt å kutte mikro seksjoner, fordi denne teknikk muliggjør høy kvalitet seksjoner som er nødvendig for bildeanalyse 19. Avhengig av den spesifikke ønske om en viss studie, blir mikro seksjoner skåret vinkelrett eller parallelt med den langsgående utstrekning av cellene. Disse delene er så fotografert under et mikroskop og celle dimensjoner målt ved hjelp av spesialisert bilde analyserer programvare.
Inntil nylig var muligheten til å forberede mikro seksjoner begrenset til små utvalgsstørrelser bare (ca. 1 cm x 1 cm). Dette er akseptabelt å analysere enkelthendelser som forstyrrelser i spesifikke år, men denne teknikken ikke tillater lengre tidsserie analyse er nødvendig for miljø rekonstruksjoner. Dette arbeidet kan bare innsed gjennom utvikling av nye, effektive og økonomiske forberedelse prosedyrer og analytiske teknikker. I de senere årene har medlemmene av tre-ring lab på Swiss Federal Institute WSL i Sveits startet intensivt arbeid på dette emnet. Som et resultat, har nye enheter og analyse teknikker blitt utviklet for å støtte tanken om å integrere tre anatomiske trekk til et bredt spekter av miljøforskningstemaer.
Protocol
1. Prøvetaking Teknikker
- Kjernetaking
- For prøvetaking trestammer, trekke ut minst to kjerner ved hjelp av en tilvekst corer fra hver stamme til å analysere sin vekstutvikling. Varier stilling for prøvetaking på forskningsoppgaven, for eksempel, for vanlige klima rekonstruksjoner ta kjerner parallelt med skråningen. Når du arbeider med tropiske arter, ta minst tre eller flere kjerner.
- Bruk en skjerpet inkrement kjerneprøvetaker (5, 10 eller 12 mm i diameter) og plassere kjerneprøvetaker vinkelrett på den voksende aksen av stammen.
MERK: Hvis du vil ha en kontrollert og stabil posisjon av corer, bruk en pusher for å unngå bevegelser av andre enn sin rotasjon corer når du borer den inn i treet. Bore inn i stammen hele veien inn i og gjennom margen. Til kjernen svært tett tre (dvs. tropiske arter), bruke spesielle rekonfigureres motorsag organer med en adapter av tilvekst kjerner som tillater å kjerne selv tett skog som Diospyrus ebenum (Ebony). </ Li> - Bruk en kjøkkenvifte og fjerne den resulterende kjerne fra treet. Slå ut corer og fjerne det fra stammen.
- Legg til en bestemt ID til den uttrukne kjerne med en myk blyant ved å skrive på et bånd, som deretter plasseres direkte på kjernen. Gjenta prosedyren på den motsatte side av stammen.
- Lagre de to prøver av treet i plast eller papir-rør eller spesielle bokser for å hindre skader.
MERK: Papir sugerør er gunstig spesielt i tropiske miljøer fordi de hindrer kjernene fra støping. - Til slutt, montere kjernene (fiber retning oppreist) på tre bærebjelker. Bruk kaldt vann motstandsdyktig trelim og la dem tørke.
MERK: Du må aldri montere kjerner på Trestender hvis målet med studien omfatter videre kjemisk, isotop eller tetthet analyse. For disse formålene, fikse kjernene i åpne kabelkanaler eller en enkelt faced bølgepapp.
- Mikrokjernetaking
- Bruk en spesiell punching enheteller nål med en åpning på 2 mm. Avhengig av barktykkelse bruke en meisel for å fjerne en nødvendig del av barken.
- Plassere enheten vinkelrett på den voksende aksen på spindelen som beskrevet ovenfor, og bruke en hammer til å trenge inn i margen av stammen til ca. 2 cm i dybde.
- Slå nålen til å brekke den resulterende micro kjerne inne i verktøyet og fjerne den fra stammen. Oppbevar mikrokjerner i mikrosentrifugerør ampuller og merke dem.
- Disc prøvetaking
- I spesielle tilfeller (og spesielt i tropene), f eks ved prøvetaking stubber og falne trær eller når det er mulig, ta plater (tverrsnitt vinkelrett på den voksende aksen) med en motorsag. Bare nummer på platene og lagre dem til videre analyse.
MERK: Denne prosedyren prøvetaking er mest brukt for alle tørr-døde, historiske, arkeologiske og sub-fossilt materiale samt meget tett treslag som ikke tillater bruk av tilvekst corers.
2. Prøvepreparering
- Sliping disker
- Plassere platene på en slipemaskin og slipe overflaten ved hjelp av en sekvens av stadig fine korn, som starter med sandpapir av 80-grit, etterfulgt av 120, 220, 300-grit. En endelig polering med 400-korning er tilstrekkelig for de fleste bartrær. For hardtre og spesielt tropiske arter, bruk slipekorn opp til 1200 for å skille de vekst-ring grenser.
- Cutting plane flater på kjerner
- Fest tilvekst kjerner i kjernen innehaver av en nyutviklet kjerne mikrotom slik at å kutte plane flater på kjerner i løpet av hele sin utstrekning.
MERK: Rett orientering av kjernen inne i holderen for å ha fiberretningen av prøve oppreist, som er i rett vinkel i forhold til kniven på mikrotomen. - Løft kjernen til den litt berører bladet. Trekk bladet, som er festet på kulelager veiledning over omfanget av kjernen til cut ved en første del av toppen.
- Skyv tilbake kniven bak kjernen, løfter prøveholderen med kjernen ca 10 mikrometer og gjenta skjære prosedyre. Gjøre dette inntil omtrent en tredjedel av kjernens diameter skjæres ned som resulterer i en kontinuerlig plan flate.
- Fest tilvekst kjerner i kjernen innehaver av en nyutviklet kjerne mikrotom slik at å kutte plane flater på kjerner i løpet av hele sin utstrekning.
- Forbereder mikro seksjoner ved å legge maisstivelse løsning.
- For detaljert bildeanalyse av den anatomiske strukturen, fikse kjerner eller andre prøver skilt ut fra plater i holderen av en mikrotom. Plasser mikrotom blad, guidet av et kulelager veiledning av en nyutviklet slede mikrotom på den øvre kanten av prøven og trekke over det.
- Skyv tilbake bladet til å løfte opp prøven ved 20 til 30 mikrometer og dra bladet over prøven på nytt. Gjenta denne fremgangsmåten til en kontinuerlig overflate på toppen av prøven er opprettet.
- Dekke den resulterende overflate med en maisstivelse oppløsning (10 g maisstivelse og 8 ml vann og 7 g av 100% glycerol) med en vanlig børste.
MERK: stivelseskornene fylle opp de åpne cellene i prøven for å stabilisere strukturen for den etterfølgende kutting av de tynne seksjoner. - Løft prøven med 15 um, plassere en pensel på overflaten av prøven og trekke bladet langsomt mot prøven begynner å skjære av en tynn seksjon (under børsten). Mens kutte, glir den resulterende avsnittet om bladet guidet av børsten.
- Når hele delen er kuttet, fjern mikroseksjonen fra bladet med en børste og vann (for å redusere friksjon) og plasser delen på et glass lysbilde for ytterligere forberedelse. For å hindre dem i å tørke, dekke dem med en liten mengde glyserol (33% = en del av 100% glyserol og to deler vann).
3. Microslide Forberedelse
- For følgende forberedelse av permanente lysbilder, først vaske glyserol bort fra mikro-delen med en pipette og vann.
- Dekk til vått seDette skjer med et par dråper safranin (1 g safranin pulver + 100 ml vann) og Astrablue (0,5 g Astra blå pulver + 2 ml 100% eddiksyre + 100 ml vann) for å skille mellom lignified og ikke-lignified konstruksjoner, men også for å forbedre kontrasten for den etterfølgende bildeanalyse.
- La den delen hvile i 5 min omfattes av fargestoff og deretter vaske det bort med en pipette og vann igjen.
- Så snart overdreven fargestoffet er fjernet, dehydrere delen med pipetter ved å vaske dem med en sekvens av 75% fortynnet, 96% og til slutt 100% etanol.
- Pipetter til skylle prøvene på objektglass i stedet for å plassere prøvene i et bad for å redusere behandlingstiden til omkring to til tre minutter for hele dehydratiseringsprosessen.
MERK: Dehydrering med etanol hindrer skjøre prøver fra å bryte. - Deretter skyll den delen med 100% xylol.
MERK: Xylen er kreftfremkallende og ventilasjon er obligatorisk i laboratoriet når du bruker den. Andreprodukter eksisterer erstatte xylol, men hvis det er hensikten å lagre prøvene over lengre tidsperioder (år, tiår) for en potensiell reanalyse, er Canada balsam (trinn 3.5.2) den eneste innstøpningsmediet som holder seg klart uten å endre farge over tid. Dessverre må Kanada balsam som skal brukes i kombinasjon med xylol. - Så lenge xylol er melkeaktig (hvitaktig), gjenta dehydrering prosess som det ikke er tilstrekkelig dehydrert.
- Så snart xylol forblir klar, dekke delen med et fall på 100% Canada Balsam og dekke det med et dekkglass av minst størrelsen av delen.
NB: Vær oppmerksom på å fjerne luftbobler ved å trykke forsiktig på dekselet glass ned. - Plasser den resulterende micro lysbilde mellom to strimler av varmebestandig plast og legg den på en metallplate. Plassere en vekt (for eksempel en magnet) på toppen av lysbildet å trykke den ned for å holde den delen flat under følgende tørkeprosessen.
- Plasser lysbildene i en ovn ved60 ° C i ca. 12 timer. Etter 12 timer, ta lysbildene ut av ovnen og legg dem på en hylle for å la dem avkjøles til romtemperatur (20 ° C). Når kjølig, fjerne vekt og plaststripen og rydde raset ved hjelp av barberblader for å fjerne overskudd Canada balsam.
4. Visualisering celleinnhold
- Forbered Nawashin løsning 25.
- Fremstille en løsning (A) med 5 g kromsyre, 50 ml 96% eddiksyre og 320 ml avionisert vann. Tilbered en annen oppløsning (B) med 200 ml formalin med 175 ml avionisert vann.
- Blande oppløsning A og oppløsning B i et 1: 1 forhold for å opprette Nawashin løsning.
- For å visualisere celleinnholdet, fiksere prøven med Nawashin løsningen i 10 minutter for å stoppe alle nedbrytningsprosesser innenfor cellen.
MERK: fiksering bevarer cellekjerner som åpner for en estimering av celle levetid (celle levetid = atomkjerner til stede / kjerner fraværende, tilstedeværelse or fravær av kjernen angir om cellen er levende eller død). - Etter fiksering, vaske delene med vann for å fullt ut fjerne Nawashin løsning før farging dem med safranin-Astra blå og før tillegg beising dem med picric-anilin blå (en del mettet vannløselig Anilin blå + 4 deler 10% pikrinsyre) .
- Forsiktig oppvarming av prøven til 80 ° C (i alle fall under kokepunktet) for å akselerere fargeprosessen. For dehydrering og innebygging av prøvene følge protokollen trinn 03.04 til 03.08.
5. Klar digitale bilder av anatomiske trekk
- Lage digitale bilder av kjerne overflater for fartøy analyse.
- Skjær kjerneoverflaten flyet ved hjelp av kjerne mikrotom og beis den resulterende overflaten svart ved å bruke et filt markør.
- Så snart fargestoffet tørkes, gni overflaten av kjernen med hvitt kritt. Trykk på kritt i cellene ved ganske enkelt å gni krittet overoverflaten ved hjelp av en finger. Fjern også overskuddet kritt av denne prosedyren.
MERK: Som et resultat av celleveggene er svarte og lumen deler av fartøyene er hvite. Denne kontrasten er en forutsetning for en automatisert bildeanalyse. - Plasser forberedt kjerne under en kikkert mikroskop utstyrt med et digitalt kamera. Ta en sekvens av svakt overlappende (ca. 10%) bilder som starter på den ene side av kjernen inntil hele overflaten er fanget. Sy enkeltbilder for å skape et komplett bilde av kjerneoverflaten.
- Lage digitale bilder fra mikro lysbilder
- Plasser de rensede mikro lysbilder under et mikroskop og ta overlappende bilder fra hele seksjonen.
- Definere en bestemt forstørrelse avhengig av strukturene som skal analyseres, som strekker seg mellom 40X og 1,000X forstørrelse.
- Sy enkle bilder for å lage en komplett bilde av seksjonen. For å unngå mulige skjevheter i sømmene prosessen, bruk "; Plan "-type objektiv med mikroskopet.
6. Kvantifisering anatomiske trekk
- For å oppdage celler og ring grenser ved hjelp av bildeanalyseverktøyet ROXAS18 eller lignende programvare, laste et komplett bilde av en mikro-delen og den tilhørende romlig kalibrering for å få kvantitative resultater i metriske enheter. Beregne den romlige kalibrering ved å måle antall piksler mellom skalaer av en mikrometer scenebilder tatt på samme forstørrelse og dele den oppnådde verdien av skalaen avstand i metriske enheter (f.eks 1000 mikrometer).
- Velg fra listen som (gitt i programvaren) en passende konfigurasjon før du starter den automatisk en del av analysen.
MERK: En konfigurasjon er en tidligere optimalisert sett av programinnstillinger som for eksempel tar hensyn til farging farge av prøven, og størrelsen og formen utvalg av cellene som skal påvises. Skreddersydde konfigurasjoner dermedtillate å produsere optimale gjenkjenningsresultater for ulike arter og bildekvaliteter.- Velge flere alternativer som for eksempel bruk av regionene i bildet som skal inkluderes eller ekskluderes å unngå, for eksempel tomme bilde marginer eller sprekker i utvalget, hvis det er nødvendig.
- Starte analysen ved å trykke på knappen ANALYSE. Hvis valgt, definere regioner i bildet som skal inkluderes eller ekskluderes hjelp av polygon, rektangel eller sirkel verktøyet. Følgende automatisk analyse benytter fleksible algoritmer for å korrigere noen bilde mangler (f.eks dårlig kontrast) og forbedre kontrasten basert på kvaliteten av bildet.
- I spesielle tilfeller (og spesielt i tropene), f eks ved prøvetaking stubber og falne trær eller når det er mulig, ta plater (tverrsnitt vinkelrett på den voksende aksen) med en motorsag. Bare nummer på platene og lagre dem til videre analyse.
Representative Results
Alle dendroecological analyser er avhengig av nøyaktige prøver, uansett om plater, stenger, eller mikrokjerner er tatt. For dette, må enhetene være i perfekt form (nøyaktig skjerpet) for å unngå mikrosprekker innenfor tre prøven. Ved fremstilling av overflater på tilvekst kjerner, er bruken av en kjerne mikrotom. Muligheten til å ha åpne celler, som kan bli ytterligere behandlet for å øke kontrasten for bildeanalyse og fartøy størrelse målinger (figur 1), er et første viktig skritt i retning av tilpasning av anatomiske strukturer i tidsserieanalyser. Noen ganger tettheten til en hard prøve forhindrer bruk av en mikrotom. I så fall en skikkelig polering og påfølgende fjerning av overdreven sagflis fra fartøyene med en kompressor eller vakuum er det beste alternativet.
For mer detaljerte analyser av mindre cellestrukturer som vårveden og sommerved tracheids i bartrær, er høykvalitets mikro seksjoner trengs. Her potential artefakter som sekundære celleveggene blir strippet av primærveggen må unngås (figur 2). Dersom disse gjenstander forekommer i de digitale bilder, er ikke lenger mulig en automatisert analyse av celledimensjonene. Gjenstander da må korrigeres manuelt, noe som er tidkrevende og i de fleste tilfeller fører til feilmålinger av celle dimensjoner. Den enkle anvendelse av et ikke-newtonsk fluid, dvs. en maisstivelsesløsning, til toppen av prøven understøtter stabiliteten av konstruksjonen og samtidig redusere forekomsten av gjenstander til et minimum (fig 2) 26. Denne anvendelse av maisstivelse, egnet for alle tre prøver, inkludert tropiske arter, gjør anvendelsen av fremgangsmåten innebygging til prøvene før skjæring overflødig.
Mikro seksjoner muliggjør en sikrere bestemmelse av årringer. Dette er særlig tilfelle for bartrær vokser på sine naturlige grenser, dvs. </ Em>, ved tregrensa i høye alpine områder. Ekstremt trange ringer er hyppige og vanskelig å oppdage makroskopisk (figur 3). I ekstreme tilfeller, at ringene består av en eller to rader av vårved celler og en rekke av flate sommerved celler, som mangler (i motsetning til vanlige sommerved celler) fortykkede celleveggene. For dette er de bedre eller til og med bare synlig når du bruker mikro seksjoner. Videre kan variasjoner tetthet differensieres fra ring grensene tydeligere, noe som forenkler påvisning av årringer spesielt i Middelhavet og tropene (figur 3).
Ved analyse av bildene ved en forstørrelse på 40 ganger eller høyere, enkeltceller er synlige, og tykkelsen av deres cellevegger er også detekterbare. Semi-automatisk analyse programvare gjør det mulig for måling av spesifikke parametre langs definerte stier følgende retning av deres timelige og romlig utvikling (figur 4). Med dette, chanGES av enkelt parametre som cellelumen eller celleveggtykkelse kan bestemmes over hele omfanget av en årlig ring (figur 4). Dette kan gjøres for alle ringer synlige i bildet, og dette støtter behovet for en lengre tidsserie analyse fullt.
Bilde analyser kan også brukes til å bestemme utviklingsfaser årringer i vegetasjonen periode (figur 5). Når du analyserer bildet av en seksjon farget med safranin og Astra-blå med polarisert lys, selv de forskjellige stadier av lignification, som begynner i de ytterste hjørnene av celleveggene før full lignification av den sekundære celleveggen, blir synlige. Dette er fordi de lignified (modne) cellevegger skinne opp i polarisert lys (Figur 5). Detaljert informasjon kan relateres til miljødata dokumentert for de respektive vegetasjon periode for å finne ut for eksempel en mer detaljert klima-vekst forhold onship.
Figur 1. Eksempler på et mikro-delen og en forberedt plan overflate av en eik inkludert ringbredde og fartøystørrelse målinger Venstre:. Ytterste delen av en eik tilvekst kjerne. Den 5 mm diameter kjerne ble kuttet ved hjelp av en kjerne mikrotom. Overflaten ble deretter farget svart ved hjelp av en filt markør og cellene ble fylt med hvitt kritt etter flekken var tørr. Høyre: grafen angir ringbredde og fartøyets størrelse målinger utført på overflaten av kjernen er vist til venstre. Det er ingen mikro seksjoner var nødvendig for å gjøre disse målingene på grunn av den klare overflate opprettet av kjernen mikrotom (modifisert etter 21). Bunn: Micro-delen avskåret en tilvekst kjerne, farget, dehydrert og fast i Canada balsam. Tykkelse: 20 um, lengde: 25 cm. g "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bilder av mikro seksjoner kutte uten stabilisering kontra en del kutt ved hjelp av maisstivelse løsning Venstre:. Micro seksjonen viser kutte gjenstander i vårved tracheids av et bartre. Prøven ble kuttet uten å bygge, og som et resultat heller tynne sekundære vegger av vårved celler ble avspaltet primærveggen (blå piler). Høyre: Micro-delen uten noen gjenstander i vårved tracheids av et bartre. Denne delen (samme prøve som vist til venstre) ble kuttet etter påføring av maismel løsning med en børste på toppen av prøveoverflaten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3. Eksempler på knapt påvisbare årlige ring grenser Venstre: Micro seksjon av et inkrement kjerne (her: Larix decidua) som viser en ring grense (sort pil) angitt ved en enkelt rad av utflatede sommerved celler uten noen fortykning av celleveggene. Denne ringen vil ikke være synlige makroskopisk. Høyre: Intra-årlige tetthet svingninger (hvit pil) er vanlig i Middelhavet arter (micro seksjon: Steineik). Den gradvise endringen av cellestrukturen mot sommerved og tilbake til vårveden struktur (hvit pil) åpner for å skille tetthet svingninger fra reelle ring grenser (svart pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Illustrasjon av lumen området og veggtykkelsesmålinger innenfor en årlig ring av et bartre Top:. Cut-out bilde viser et eksempel på resultater fra Roxas analyse i et tre-ring av Pinus sylvestris (furu). Ring grenser er vist i gult og skisserer av tracheid lumina i cyan. For ett radial fil (blå tracheid lumina) de målte celle veggtykkelser er representert med røde sirkler. Svart skala bar = 100 mikrometer. Bunn:. De intra-årlige endringer i tracheid lumen område og tracheid celleveggtykkelse for hele årlige ring Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. EKSEMPEe av en forme årlig ring. Bildet er tatt under et lysmikroskop med polarisert lys fra en safranin og Astra-blå farget mikro-seksjon hentet fra en mikro-core samples på den 7 juli 2007 fra en Europalerk vokser i Lötschental på 1300 m over havet. På denne mikro-delen av cambial celler, cellene i utvidelsesfasen, cellene i den fortykkede fase og de modne cellene er gjenkjennelig. Tangentiell bredden på bildet dekker ~ 1 mm av Margen tverrsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Utfordringene for en vellykket og bærekraftig integrering av tre anatomi inn dendroecological forskning er, bortsett fra manifold analytiske problemer, hovedsakelig på grunn av tekniske aspekter. Disse utfordringene varierer fra prinsippet prøvetaking tilnærminger til å skape høy kvalitet mikro seksjoner og deres påfølgende analyse 19.
Ved første øyekast, er sampling av kjerner eller plater en enkel fremgangsmåte som har vært kjent i mange år. Det er mange ting som kan gjøres galt og en liten unøyaktighet i prøvetaking kan resultere i alvorlige problemer under de påfølgende forberedelse og analysefasene. Små unøyaktigheter som for eksempel kjerneboring som er ikke akkurat vinkelrett stammeaksen eller bruke et ufullkomment skjerpet corer er ikke et problem hvis målet med studien er begrenset til å ringe-breddemålinger. Når imidlertid sikte på mikroskopisk analyse av prøvene, kan en feilaktig samplingsretningen føre optiske forvrengninger avcellevegger, mens bruken av butte corers resultater i mikrosprekker i kjernen. Som et resultat, når man prøver å skjære mikro seksjoner av disse kjerner, de tynne seksjoner bare falle fra hverandre, og et effektivt preparat ikke lenger er garantert. Det samme gjelder for mikrokjernetaking. En butt tupp vil resultere i høye trykk når puncher er hamret inn i stammeveden. Følgelig cambial lag vil bli komprimert. De cambial celler (figur 5) blir følgelig presset og kan ikke bli analysert.
Disc prøvetaking er faktisk den beste strategien når analysere vekstvariasjoner å relatere dem til miljøendringer. Dessverre er det rett og slett umulig å ta plater fra alle trær som skal tas prøver for videre analyser. Ikke desto mindre, spesielt i tilfelle av tropisk dendrochronology, blir en viss mengde stilk disker nødvendig i kombinasjon med tilvekst kjerner. Diskene brukes som en base for å definere ring grenser og for å støtte grenselinjenkaper definert basert på analyse av tilvekst kjerner 12,27,28.
Fordeler og ulemper med sliping versus skjæring blir hyppig diskutert 1,11,21. Som det er nevnt ovenfor, er den beste fremgangsmåten avhenger alltid av problemstilling og parametrene som skal analyseres (makroskopisk eller mikroskopisk). Hvis isotopiske eller kjemiske analyser er projisert i et ytterligere arbeidstrinn, er det av største viktighet at det slipende støv dannet ved sliping som kan fylles inn i cellen lumina over hele prøven, blir nøye fjernet ved støvsuging eller trykkluft.
Cutting mikro seksjoner er for alle mikroskopiske analyser den mest hensiktsmessige måten å forberede prøver for videre analyser. Først av alt, er den delen avskåret prøven, som deretter kan holdes uten kontaminering for potensielle videre analyser. Second disse delene tillate for høye målinger av encellede parametere oppløsning. Videre unngår den tidkrevende innstøpingTeknikken ved hjelp av en maismel-løsning 26 for å stabilisere celler som er en stor fordel i mikro snitting.
En ulempe med mikro seksjonering er fortsatt begrenset utvalgsstørrelse som resulterer i lange forberedelser ganger. For sanntid serie analyser gå tilbake i tid over århundrer eller årtusener, er det behov for å videreutvikle eksisterende skjære enheter 17,19, men også bildebehandling og analyse 18. Et første skritt i denne retningen er utviklingen av kjerne mikrotom 21, opprinnelig produsert for å kutte plane flater på kjerner (figur 1). Tidligere tester viste at evnen til å skjære mikro seksjoner av hele kjerner ved hjelp av denne enhet (figur 1).
Høykvalitets mikro seksjoner gi grunnleggende prinsipp for en effektiv bildeanalyse. Tar bildene under et mikroskop er en vanlig prosedyre 19, men deres effektiv analyse er fortsatt en oppgave som måskal videreutvikles 17. Alle eksisterende bildeanalysesystemer er semi-automatisk, det vil si, de trenger å være mer eller mindre intenst kontrollert av tekniker. I mange tilfeller bildene må rettes eller til nye bilder må gjøres for å forbedre kontrasten for en bedre registrering av strukturene av programvare uten å endre celleveggtykkelse innenfor bildet.
Spesialiserte verktøy for bildeanalyse som Roxas 18, WinCell eller spesifikke skript for ImageJ 29 er i stand til å gi grunnleggende anatomiske data som celle nummer, celle dimensjon, celleveggtykkelse og celle posisjon innenfor den årlige ring. Mange flere anatomiske beregninger som er relevante i en dendroecological sammenheng kan beregnes fra disse grunnleggende målinger som størrelse av de største rør, størrelsesfordeling av rørledninger, størrelse på vårveden eller den første raden av rørledninger, (optisk) tre tetthet, intra-årlig profiler av kanal størrelse og celleveggentykkelse, og gruppering mønstre av rørledninger (enslig, multipler, etc.).
Ved hjelp av programvaren Roxas 18, blir konturene av rør lumina (dvs. vann gjennomføre celle) og årlige ring grenser automatisk gjenkjent og visuelt representert som overlegg over originalbildet. Algoritmer for rørledninger er basert på farge, størrelse og form informasjon, algoritmer for ring grenser til den lokale konteksten av hver kanal. En verktøykasse tillater oss å manuelt forbedre disse resultatene ved direkte redigering av overlay-funksjonene, dvs. slette, legge til og endre ring grenser og rør skisserer. Etter redigering, den endelige data utgang, inkludert celleveggtykkelse (bartrær), blir automatisk generert og lagret i et regneark. Fullt automatiserte systemer er for øyeblikket ikke tilgjengelig, ikke engang for bartrær som viser en relativt enkel struktur, men dette er et mål for fremtidig utvikling. Dette vil sterkt støtte full integrasjon av tre anatomiske parametre i tidsserieanalyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Increment corer | http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en |
||
| Core-Microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Laboratory microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Trephor micro corer | http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp | ||
| Nawashin solution | Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid | ||
| Picric-Anilin blue | One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol | ||
| Safranin | Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 | ||
| Astra-blue | Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 | ||
| Ethanol | Linear Formula CH3CH2OH | ||
| Xylol (Xylene) | Linear Formula C6H4(CH3)2 | ||
| Canada Balsam | Embedding solution for microscopy | ||
| Roxas Software | http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN | ||
| ImageJ Software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| WinCell | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Schweingruber, F. H. Tree Rings and Environment: Dendroecology. , Haupt. Bern. (1996).
- Sheppard, P. R. Dendroclimatology: extracting climate from trees. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 1, 343-352 (2010).
- Wagenführ, R. Anatomie des Holzes: Strukturanalytik - Identifizierung - Nomenklatur - Mikrotechnologie. , DRW-Verlag Weinbrenner. (1999).
- Tennessen, D., Blanchette, R. A., Windes, T. C. Differentiating Aspen and Cottonwood in Prehistoric Wood from Chacoan Great House Ruins. Journal of Archaeological Science. 29, 521-527 (2002).
- Rowell, R. M. Handbook of Wood Chemistry and Wood Composites. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2005).
- Kaennel, M., Schweingruber, F. H. Multilingual Glossary of Dendrochronology. Terms and definitions in English, German, French, Spanish, Italian, Portuguese and Russian. , Haupt. Berne. (1995).
- Esper, J., Frank, D. C., Luterbacher, J., et al. A changing world: challenges for landscape research. On selected issues and challenges in dendroclimatology. Kienast, F. , Springer. Dordrecht. 113-132 (2007).
- Esper, J., Frank, D. C., Wilson, R. J. S., Büntgen, U., Treydte, K. Uniform growth trends among central Asian low and high elevation juniper tree sites. Trees. 21 (2), 141-150 (2007).
- Frank, D. C., Nievergelt, D., Esper, J. Summer temperature variations in the European Alps, AD 755-2004. Journal of Climate. 19 (2), 5606-5623 (2006).
- Treydte, K., et al. Millennium-long precipitation record from tree-ring oxygen isotopes in northern Pakistan. Nature. 440, 1179-1182 (2006).
- Heinrich, I. Dendrogeomorphology. The Encyclopedia of Quaternary Science. Elias, S. A. 2, Amsterdam, Elsevier. 91-103 (2013).
- Verheyden, A., De Ridder, F., Schmitz, N., Beeckman, H., Koedam, N. High-resolution time series of vessel density in Kenyan mangrove trees reveal a link with climate). New Phytologist. 167, 425-435 (2005).
- Abrantes, J., Campelo, F., García-González, I., Nabais, C. Environmental control of vessel traits in Quercus ilex under Mediterranean climate: relating xylem anatomy to function. Trees. 27, 655-662 (2013).
- Fengel, D., Wegener, G. W. ood Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions. , Kessel Verlag, Remagen. (2003).
- Heinrich, I., Gärtner, H., Monbaron, M. Tension wood formed in Fagus sylvatica and Alnus glutinosa after simulated mass movement events. IAWA-Journal. 28 (1), 39-48 (2007).
- Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom and New York, NY. (2013).
- Lucchinetti, S., Schweingruber, F. H. New perspectives for wood anatomical analysis in Dendrosciences: The GSL1-microtome). Dendrochronologia. 32 (1), 47-51 (2014).
- Arx, G., Carrer, M. ROXAS - a new tool to build centuries-long tracheid-lumen chronologies in conifers. Dendrochronologia. 32 (3), 290-293 (2014).
- Schweingruber, F. H. Microscopic Preparation Techniques for Plant Stem Analysis. , Verlag Dr Kessel, Remagen. (2013).
- Hoadley, R. B. Identifying wood: Accurate results with simple tools. , The Taunton Press. Newtown, CT. (1990).
- Nievergelt, D. The core-microtome. A new tool for surface preparation on cores and time series analysis of varying cell parameters. Dendrochronologia. 28 (2), 85-92 (2010).
- Von Schnakenburg, P., Bräuning, A., Helle, G. Detecting annual growth rhythms from high-frequency densitometry and carbon isotopes in tropical mountain rain forest trees in southern Ecuador. Tree Rings in Archaeology, Climatology and Ecology. Elferts, D., Brumelis, G., Gärtner, H., Helle, G., Schleser, G. 6, GFZ Potsdam. Potsdam. 96-99 (2008).
- Garcia Gonzalez, I., Fonti, P. Ensuring a representative sample of earlywood vessels for dendroecological studies: an example from two ring-porous species. Trees. 22 (2), 237-244 (2008).
- Fonti, P., et al. Studying global change through plastic responses of xylem anatomy in tree rings. New Phytologist. 185 (1), 42-53 (2010).
- Purvis, M. J., Collier, D. C., Walls, D. Laboratory techniques in Botany. , Butterworth, London. (1966).
- Schneider, L., Gärtner, H. The advantage of using non-Newtonian fluids to prepare micro sections. Dendrochronologia. 31 (3), 175-178 (2013).
- De Ridder, M., Vanden Bulcke, J., Van Ackera, J., Beeckman, H. Tree-ring analysis of an African long-lived pioneer species as a tool for sustainable forest management. Forest Ecology and Management. 304, 417-426 (2013).
- De Ridder, M., et al. A tree-ring based comparison of Terminalia superba climate–growth relationships in West and Central. Trees. 27 (5), 1225-1238 (2013).
- Redband, W. S. ImageJ. , U.S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij (1997).
