Abstract
Bakteriell yta motilitet, såsom svärmning, vanligen undersöks i laboratorium med plattanalyser som kräver specifika koncentrationer av agar och ibland inkludera specifika näringsämnen i tillväxtmediet. Beredningen av sådana explicita media och tillväxtytan villkor tjänar att ge de gynnsamma förhållanden som tillåter inte bara bakterietillväxt men samordnad motilitet av bakterier över dessa ytor inom tunna vätskefilmer. Reproducerbarhet svärm platta och andra ytan motilitet plattanalyser kan vara en stor utmaning. Speciellt för mer "tempererade swarmers" som uppvisar motilitet endast inom agar intervall av 0,4% -0,8% (vikt / vol), smärre förändringar i protokoll eller laboratoriemiljö kan kraftigt påverka svärm analysresultat. "Vätbarhet", eller vatteninnehåll på mellan flytande och fast-luftgränssnitt av dessa plattanalyser, är ofta en viktig variabel som skall kontrolleras. En ytterligare utmaning i bedömningen svärmning är hur man kvantifiera observed skillnader mellan två (eller flera) experiment. Här har vi detalj en mångsidig två-fas-protokollet för att förbereda och bild svärm analyser. Vi inkluderar riktlinjer för att kringgå de utmaningar som vanligen förknippas med svärm analys media förberedelse och kvantifiering av data från dessa analyser. Vi visar specifikt vår metod med hjälp av bakterier som uttrycker fluorescerande eller självlysande genetiska reportrar som grönt fluorescerande protein (GFP), luciferas (lux operon) eller cellulära fläckar för att möjliggöra tidsförlopp optisk avbildning. Vi visar vidare förmågan hos vår metod för att spåra konkurrerande svärm arter i samma experiment.
Introduction
Många bakterier flyttar på ytor med hjälp av olika medel för själv framdrivning. Vissa motilitet fenotyper kan forskat i laboratoriet med hjälp plattanalyser som påverkas av den flytande miljön i samband med den halvfasta plattanalyskompositionen. En delmängd av användbar yta motilitet plattanalyser vidare innebära en gasfas-typiskt rumsluften. Följaktligen resultatet av någon särskild yta motilitet analys, kräver noggrann kontroll av gränssnittet i tre faser: den lokala miljö fast yta, flytande miljö och gas miljö egenskaper.
Den vanligast studerade motilitet läge i ett sådant tre-fas-analys är känd som svärmar. Myllrande motilitet är samordnad grupp rörelse bakterieceller som drivs av sin flag genom tunna vätskefilmer på ytor 1. Det är oftast studeras i laboratorier som använder halvfasta plattanalyser som innehåller 0,4% -0,8% (vikt / vol) agar 1. En matris avmänskliga patogener utnyttja denna rörlighet beteende för att utforska och kolonisera den mänskliga värden. Till exempel använder Proteus mirabilis myllrande motilitet att flytta upp i urinröret, når och kolonisera urinblåsan och njurarna 2. Myllrande motilitet anses allmänt som en föregångare steg för att biofilmbildning, den främsta orsaken till patogenes i många humana patogener 3.
Den myllrande fenotyp är mycket varierande bland bakteriearter; experimentell framgång och reproducerbarhet förlitar starkt på faktorer som näringssammansättning, agar typ och sammansättning, sterilisering protokoll (t.ex. autoklave), halvfasta medier härdning, och omgivande fukt (t.ex. säsongsmässiga förändringar), bland annat 3-5. Variationen i ytan motilitet svar betonar de utmaningar som uppstått i dessa studier och de betydande inflytande media och miljö kan utöva. För vissa swarming arter, såsom Pseudomonas, svärm MOTbilitet kan uppstå på en mängd olika medie kompositioner, även om den observerade fenotypen och medföljande svärm expansionstakt kommer att variera kraftigt 3. Tillsammans har dessa faktorer kan göra ytan motilitet studier extremt utmanande. Säsongs variabilitet inom ett labb kan påverka dessa trefas analyser: analyser kan fungera bättre i den fuktiga luften i sommar och värre i den torra luften i vintern. Här presenterar vi de allmänna riktlinjer för att kringgå några av de mest anmärkningsvärda utmaningarna när du utför yta motilitet plattstudier.
För vissa ytliga motilitet studier, är av stort intresse för utvecklingen av specifika fenotyper. De flesta, men inte alla, publicerade studier för att undersöka svärmning av P. aeruginosa visar bildandet av rankor eller fraktaler strålar ut från en ympning centrum 3-9. Skillnader mellan P. aeruginosa stammar har dokumenterats 5,8, men mycket av närvaron eller frånvaron av rankor kan hänföras till den specific medium och protokoll som används för dessa svärm motilitet plattanalyser. Här tar vi information om hur man kan främja klänge bildande svärmar för P. aeruginosa. Eftersom P. aeruginosa är bara en av många myllrande bakterier, inkluderar vi även information om vår metod för att undersöka svärmning av Bacillus subtilis och glida av Myxococcus Xanthus. Liksom P. aeruginosa, aktuell forskning om B. subtilis och M. Xanthus spänner en rad ämnen som forskarna arbetar med att urskilja aspekter av sporulering, motilitet, stress, och övergångsbeteende 1,10. Det finns ett behov av att kvantifiera de mönster och dynamik i specifikt beteende (er) för dessa celler i swarming grupper.
Surface motilitet datainsamling, kan analys och tolkning vara besvärliga och kvalitativ. Vi har utvecklat ett protokoll för detaljerade makro- analys av bakteriella svärmar som ger förutom svärma zon morfologi och size (t.ex. diameter), kvantitativ dynamisk information om svärm expansionstakt och bakteriell eller bioprodukt densitetsfördelning 7. Dessutom kan denna metod utnyttja tillgängliga fluorescerande proteiner, luminiscens, och färgämnen för att få en heltäckande bild av bakteriella interaktioner 8, samt för att spåra syntesen av bioprodukter (t.ex. P. aeruginosa ramnolipid 7,8) inom en svärm.
Protocol
1. Swarm Assay Media Förberedelse och Ympning 4,5,7,8,11
- Beredning av media
OBS: Det medium komposition som beskrivs nedan är tillämplig på P. aeruginosa klänge bildningsstudier. Se Materialspecifikationer på tabell 1 för P. aeruginosa, B. subtilis, och M. Xanthus ytan motilitet analyser.- Blanda 200 ml av FAB-minus (NH 4) 2 SO 4 svärm medel (Material tabell) 0,9 g Noble-agar, och 0,2 g kasaminosyror (tabell 1) genom omröring med en magnetisk omrörarstav. Använd små volymer (100-300 ml) för att förbättra överensstämmelsen mellan experiment.
- Autoklavera 200 ml agar / medium blandningen med användning av en exponeringstid av 22 minuter, temperaturexponering av 121,1 ° C och en snabb ventil alternativ. De autoklav inställningar gör att korrekt sterilisering och agar smältning, men förhindrar agar karamellise.
OBS: Noble agar är benägen att kolasering; bakteriell motilitet ändras på karamelliserad agar. - Omedelbart efter det att steriliseringscykeln har slutfört, stäng locket medieflaska för att förhindra förlust av vatten genom avdunstning. Observera dock att strama tak kan orsaka en "vakuumförslutning" -liknande effekt på flaskan.
- Kyl media till 50 ° C under omrörning vid rumstemperatur (RT) och tillsätt 2 ml steril 1,2 M glukos. Alternativt, placera media i en 60 ° C inkubator eller vattenbad tills den ska användas (upp till 15 timmar senare), och följ anvisningarna. För att förhindra bildning av bubblor i media, blanda noggrant med användning av magnetisk omrörarstav; bubblor på ytan av agar förhindrar även svärmar.
OBS: För andra analyser, lägg i detta steg värmekänsliga komponenter som inte kan autoklaveras såsom ytterligare näringsämnen eller färgämnen, som behövs (t.ex., tillsättning av 8 pl Invitrogen Syto 63 färgämne per 100 ml smält agar till bilden M. Xanthus som visas i Representative Resultat, nedan). Tillsättning av vissa färgämnen kan påverka baslinjen myllrande beteende, vilket bör kontrolleras mot en icke-dye kontroll. - I ett laboratorium huva, alikvot 7,5 ml sterilt medium per 60 mm polystyren diameter petriskål och hålla plattorna i ett enda lager (ej staplas). För större myllrande ytan, portion 25 ml av media per 100 mm diameter petriskål. Det är viktigt att fylla skålarna på en jämn horisontell yta. Använd en prick nivå för att kontrollera om ytan är planat.
OBS: För P. aeruginosa-analyser, med hjälp av en specifika medievolymen per platta kommer att förbättra konsekvens och reproducerbarhet. För B. subtilis och M. Xanthus analyser, hand hälla ger resultat som är jämförbara med specifika volym portioner.
- Plate härdning
- För små plattor (60 mm), låt den smälta agarmediet att bota (båda satt till halvfast och torr överflödig vätska) i huven avtäckt (dvs utan lock) i 30 min. Störreplattor (100 mm) kräver en längre härdningstid (se diskussion).
OBS: Alternativt kan vissa analyser kräver plattor att härda på bänken topp över natten (20-24 h) täcks (dvs lock på) i ett enda skikt (Tabell 1). Myllrande är känslig för både överskott och otillräcklig fukt. Fuktigheten, luftflöde och temperatur för en viss lab kan nödvändig variation till tallrik härdning att främja optimal svärmning av er bakterie. - Inokulera plattorna omedelbart efter torkperioden är över. Förvara inte plattorna för vidare användning.
- Utför "bläcket sprids test" genom observation en testplatta med 10 pl blandning av 0,50% (vol / vol) Higgins Vattentät Svart Indien bläck och bakterieinokulat 11. Om bläcket / inokulat blandning sprider lätt (dvs behåller inte droppform) på ytan av media, kommer media att behöva ytterligare tid för att torka.
OBS: För arter som är särskilt känsliga för fukt (<em> t.ex. P. aeruginosa), göra en snabb "bläck sprids test" 11 för att avgöra om plattorna är torra nog.
- Utför "bläcket sprids test" genom observation en testplatta med 10 pl blandning av 0,50% (vol / vol) Higgins Vattentät Svart Indien bläck och bakterieinokulat 11. Om bläcket / inokulat blandning sprider lätt (dvs behåller inte droppform) på ytan av media, kommer media att behöva ytterligare tid för att torka.
- För små plattor (60 mm), låt den smälta agarmediet att bota (båda satt till halvfast och torr överflödig vätska) i huven avtäckt (dvs utan lock) i 30 min. Störreplattor (100 mm) kräver en längre härdningstid (se diskussion).
- Swarm Assay Inokulering
- Ympa 6 ml buljong odlingsmedia (se tabell 1 för detaljer) med en isolerad koloni från ett nytt (<5 dagar gammal om de lämnas i rumstemperatur) lysogeni Broth (LB) plattkultur. Inkubera buljongkulturer natten (≤18 hr) vid 30 ° C eller 37 ° C med horisontell skakning (240 rpm).
- Inokulera svärm plattor genom observation med 1-5 pl natten buljong kultur, eller genom "peta" agar med en steril tandpetare eller tråd ympning nål.
OBS: Vi föredrar den senare metoden, eftersom det minskar sannolikheten för stänk ympen och förhindrar att lägga ytterligare fukt till svärmen yta.
- Swarm Assay Inkubation
- För allmän analys, inkubera svärm analysplattor vid 30 °C eller 37 ° C (eller till och med 42 ° C i B. subtilis; Tabell 1) -detta är bakterie specifik. Vänd plattorna under inkubation så att fukt kondenserar på locket, inte agar.
OBS: Temperaturen kan påverka fenotyp samt kinetik. För P. aeruginosa svärmar, inkubation vid 37 ° C leder till snabbare tillväxt och svärm expansionen än inkubation vid 30 ° C; dock morfologi dessa svärmar skiljer sig ofta med denna förändring i temperatur. - För tidsförlopp imaging, inkubera svärm plattor vid lämplig temperatur före överföra till avbildningsstationen (se tabell 1 för detaljer).
OBS: Denna pre-imaging inkubation tillåter svärmar för att starta sin utveckling och etablera innan de flyttas till en ny miljö, som kan eller inte kan vara optimalt för myllrande motilitet.
- För allmän analys, inkubera svärm analysplattor vid 30 °C eller 37 ° C (eller till och med 42 ° C i B. subtilis; Tabell 1) -detta är bakterie specifik. Vänd plattorna under inkubation så att fukt kondenserar på locket, inte agar.
2. Makroskopisk avbildning av Surface Motility Analyser 7,8
<ol>3. databehandling och tolkning 7,8
- Bildbehandling
- Använd MI programvara för batch exportera bilder som 16-bitars TIFF-filer: Arkiv> Exportera eller Exportera flera> Välj fil (er) för att exportera och exportera plats.
- Använd ImageJ för att öppna en enda bild eller importera en time-lapse-serien:
- Öppna en enda bild: Arkiv> Öppna
- Import tidsförlopp bildsekvens: Arkiv> Importera Sequence och välj "Sortera namn numeriskt".
- För större tidsförlopp filer, välj "Använd virtuell stack" i "Importera Sequence" fönstret för att stapla de exporterade bilderna i lämpliga kategorier (dvs, GFP, RFP, etc.).
- Om det behövs ändrar bilder från 16-bitars filer till 8-bitars filer: Bild> typ> 8-bitars
OBS: Vissa ImageJ verktyg kräver 8-bitarsbilder. - Bestäm om intensiteten signalen för en bild eller tidsförlopp sekvens måste inverteras. Placera markören på en ljuspunkt i bilden (t.ex. fluorescerande tillväxt) och notera signalstyrkan "värde" från ImageJ verktygsfältet. Sedan placera markören i en mörk plats utanför grovplåtsområdet och notera signalstyrkan. Om signalintensiteten för den mörka punkten är större än intensiteten för den ljusa fläcken, måste bildsignalintensiteten skall inverteras (följ delstegen 1-2 nedan).
- Vänd intensitetssignalerna: Redigera> Invertera
- Vänd uppslagstabell: Bild> uppslagstabeller> Invertera LUT
- Subtrahera bakgrunden: Process> Subtrahera bakgrund, och använda en "rullande boll radie" med en pixelradie som är ena halvan av en bild dimension (t.ex. 1.000 pixlar för en 2000 x 2000 pixel bild).
- Artificiellt färg en bild eller tidsförlopp sekvens: Bild> uppslagstabeller, och välj lämplig färg från alternativlistan.
- För filmer med två eller flera kanaler, slå ihop och balansera färgerna innan du sparar som en film (bildbehandling, steg 8). Att slå samman bilder tillsammans, öppet alla bildstaplar i ImageJ, välj sedan Bild> Färga> Merge Kanaler, och tilldela varje stapel till en färgkanal.
- Spara tid-lapse-sekvens som AVI eller QuickTime-film: Arkiv> Spara som och välj önskat format och specifikationer.
- Dataanalys
- Förvärva Bakteriell Surface tillväxtområde för att kvantifiera expansionstakt
- Öppna bild (er) i ImageJ
- För att beräkna diametern på plattan i pixlar, dra en linje över centrum av en analysplatta med "Straight" verktyget från och mäta dess längd: Analysera> Mät
- Den måttenhet i ImageJ är piXel. Skaffa en omvandlingsfaktor genom att dividera den diametern på analysplattan (t.ex., 60 för en 60 mm platta) av pixellängden som erhölls i det föregående steget.
- Ändra måttenhet från pixel till mm: Bild> Egenskaper
- Ändra "Enhet Length" till "mm" och "Pixel Width", "Pixel Längd" och "Voxel Djup" till omräkningsfaktor som beräknats i föregående steg. Välj "Global" rutan för att upprätthålla denna omräkningsfaktor på flera bilder.
OBS: Om ImageJ stängs och öppnas igen, eller synfältet av en bild ändras (dvs, är en bild inzoomad mer än en annan), måste omvandlingsfaktorn räknas om. Alternativt utföra alla analyser i pixlar och sedan omvandlas till mm.
- Ändra "Enhet Length" till "mm" och "Pixel Width", "Pixel Längd" och "Voxel Djup" till omräkningsfaktor som beräknats i föregående steg. Välj "Global" rutan för att upprätthålla denna omräkningsfaktor på flera bilder.
- För varje bildruta, spåra och mäta svärm området med hjälp av "Freehand Selections" verktyg i verktygsfältet för att spåra outline av svärmen och mät området med hjälp av: Analysera> Mät. Detta kommer att generera en mätning logga som kan sparas för vidare analys i Microsoft Excel eller liknande program: Arkiv> Spara som
- Förvärva Bakteriell Surface Growth Intensitet att kvantifiera Surface Growth Rate
- När bakgrunden subtraheras (bildbehandling, steg 5), använd den sista bildrutan i sekvensen för att bestämma den maximala området svärm (Data Analysis, steg 1).
- Använd "Oval" markeringsverktyg i verktygsfältet för att rita en ruta runt bakterieytan tillväxt.
- Ställ medelintensiteten mätning av pixlar i rutan använder: Analysera> Set Mätningar och välj "Mean gråvärdet".
- För att få intensitet signalmätningar för varje bildruta i tidsförlopp sekvens, medan på den första bilden i sekvensen går till: Analysera> Mät. Detta kommer att generera en mätning logga som kan sparas för vidare analys i Mihelst med Microsoft Excel eller liknande program: Arkiv> Spara som
- Alternativ till föregående avsnitt (Data Analysis, steg 2). Använd ImageJ Makron plugin för att installera och köra ett Makron tillväxtytan intensitetsmätning script.
- Setup en automatiserad mätning skript att analysera flera ramar samtidigt: Plugin> Nytt> Makro och klistra in förutsatt manus (nedan) i rutan och spara som en ImageJ Makron textfil: Arkiv> Spara och spara till ImageJ programmappen under " makron ".
numberOfFrames = N
for (i = 0; i <numberOfFrames; i ++) {
kör ("Measure");
kör ("Nästa skiva [>] ');
}
OBS: Här variabeln "N" är för ett odefinierat antal ramar. - Redigera "numberOfFrames" i Makron plugin för varje försök att återspegla antalet bildrutor i bildsekvensen innan du kör skriptet. Användning: Plugin> Makron>Redigera och skriv in det korrekta antalet bildrutor i sekvensen och spara (Arkiv> Spara).
- Följ delstegen 1-3 i dataanalys-Steg 2, och medan den första bildrutan i sekvensen köra makron plugin: Plugin> Makron> Kör. Detta kommer att generera en mätning logga som kan sparas för vidare analys i Microsoft Excel eller liknande program: Arkiv> Spara som
- Setup en automatiserad mätning skript att analysera flera ramar samtidigt: Plugin> Nytt> Makro och klistra in förutsatt manus (nedan) i rutan och spara som en ImageJ Makron textfil: Arkiv> Spara och spara till ImageJ programmappen under " makron ".
- Förvärva Bakteriell Surface tillväxtområde för att kvantifiera expansionstakt
Representative Results
Variation i platt preparatet kan avsevärt påverka myllrande motilitet. Härdn eller torktid efter hälla smält agarmedium påverkar den tunna vätskefilm som finns på ytan motilitet analyser och bakterie motilitet över tiden. Förändringar i näringssammansättning påverkar också svärma för flera bakterier. Figur 1A visar en kortsiktig effekt torktid vid spridning av Indien Bläck och spridning av en initial inokulat av Bacillus subtilis 11. Figur 1B visar effekten av torktid och figur 1C visar effekterna av ammoniumsulfat [(NH4) 2 SO 4] vid efterföljande tendril utveckling genom svärm P. aeruginosa 5.
Mätbara uppgifter kan erhållas från endpoint bilder av ytan motilitet använder flera avbildningsstrategier. Figur 2 visar representativa tillväxtytan resultat för
Utbyggnad av datainsamling än bara kontroll och avbildning av slutpunktsresultat möjliggör studier av dynamiska beteende (er) för ytan växande bakterier. Figur 3 7 visar ett exempel på P. aeruginosa svärma (avbildas för GFP uttryckande celler) och dess tillhörande ramnolipid produktion (avbildas med Nile Red lipid fläck) -den kvantifiering av data från dessa bilder visas också att visa expansionstakten P. aeruginosa myllrande. Video 1 visar en time-lapse för B. subtilis myllrande avbildas med luminiscens av en lux uttryckande stam. Video 2 8 visar en time-lapse för P. aeruginosa Salmonella enterica serovar Typhimurium (röd-uttryck lux) i en konkurrensutsatt svärm analys.
Figur 1: Exempel på faktorer i ytan motilitet analys förberedelser som påverkar analysresultatet Effekt av (A) agar torktid på agarytan fukt och sprider av inokulat för B.. subtilis (Ref 8), (B) agar torktid på P. aeruginosa swarming (omtryckt från Ref 5 med tillstånd), och (C) närvaro eller frånvaro av ammoniumsulfat på P. aeruginosa myllrande och klänge bildning.
Figur 2: Alternative strategier för tillväxt bildyta och motilitet av bakterier med en Bruker bildbehandling. Sida vid sida bild av en kamera (till vänster) och Bruker bild (höger) visar (A) P. aeruginosa uttrycker GFP-avbildas med grön fluorescens inställningar (B) B. subtilis uttrycker lux mareld reporter-avbildas med Luminiscens inställningar, och (C) M. Xanthus färgade med SYTO 64-avbildas med inställningar Röd Fluorescence II. Se tabell 2 för inställning detaljer.
Figur 3:. Kvalitativ och kvantitativ analys av en yta motilitet analys (A) Time-lapse analys av distributionscelltäthet, ramnolipid produktion (Nile Red lipid fläcken avbildas med Röda FluorescensI inställningarna; skalstreck = 15 mm), och (B) kvantifiering av den av expansionshastigheten från fördelningscelldensitet bilder av ett P. aeruginosa svärm. (Utdrag ur Ref 6 med tillstånd.)
Video 1. Time-lapse avbildning av ett B. subtilis svärm. B. subtilis uttrycker lux och registreras med hjälp av Luminiscens inställningarna. Se tabell 2 för inställning detaljer.
Video 2. Interspecies tävling visualiseras genom time-lapse avbildning. Svärmar av P. aeruginosa (grön, uttrycker GFP och registreras med hjälp av grön fluorescens inställningar) och S. enterica serovar Typhimurium (röd; Expressjunger lux och registreras med hjälp av Luminiscens inställningar). Se tabell 2 för inställning detaljer. (Reprint med tillstånd från Ref 7.)
| P. aeruginosa | P. aeruginosa tendril bildningsstudier | B. subtilis | M. Xanthus | |
| Overnight buljong odlingsmedia | FAB plus 30 mM glukos | FAB plus 30 mM glukos | LB | CTT |
| Overnight buljongkultur inkubationstemperatur | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 30 h vid 30 ° C |
| Swarm media | FAB | FAB minus (NH4) 2 SO4 | 2% (vikt / volym) LB | CTT |
| Swarm medier: ytterligare komponenter | 12 mM glukos a | 10% (vikt / vol) CAA, 12 mM glukos en | n / a | SYTO® 64 a |
| Agar typ | Agar, Noble | Agar, Noble | Granulerat agar | Agar, Noble Affymetrix |
| Agar koncentration (vikt / vol) | 0,45% | 0,45% | 0,60% | 1,50% |
| Swarm plattstorlek | 60 mm | 60 mm | 100 mm | 150 mm |
| Media volym per platta | 7,5 ml | 7,5 ml | Hand Hällde | Hand Hällde |
| Inställning Swarm media / torkningsmetod | Hood; plattor avtäckt | Hood; plattor avtäckt | Benchtop; Plattorna täcks | Benchtop; Plattorna täcks |
| Inställning Swarm media / torktid | 30 min | 30 min | Över natten (20 -24 h) | Över natten (20 -24 h) |
| Swarm analys inkubationstemperatur | 30 eller 37 ° C | 30 ° C | 37 ° C | 30 ° C |
| Inkubation för tids lapse avbildning | 30 ° C under åtminstone 4 h | 30 ° C under åtminstone 4 h | 37 ° C under 2 h | RT i 12 h |
| Time-lapse capture längd | 24 tim | 24 tim | 10 tim | 66 tim |
| Time-lapse inställning | 1 frame / 10 min | 1 frame / 10 min | 1 bild / 6 min | 1 frame / 10 min |
| en Tillagt efter autoklavering. | ||||
Tabell 1:. Specifikationer för Surface Motility analys Förberedelse Inkluderar ytamotilitet analys förberedelse specifikationer för P. aeruginosa, B. subtilis, och M. xanthus.
| Signal | Grön fluorescens | Röd fluorescens I | Röd fluorescens II | Luminiscens |
| Protein eller färgämne | Grönt fluorescerande protein (GFP) | mCherry protein eller Nilrött ramnolipid fläck | SYTO® 64 | Luciferas från lux-operonet |
| Excitationsvåglängd (nm) | 480 ± 10 | 540 ± 10 | 590 ± 10 | Av |
| Utsläpps våglängd (nm) | 535 ± 17,5 | 600 ± 17,5 | 670 ± 17,5 | Utan filter |
| Exponeringstid (sek) | 30 | 60 | 60 | 240 |
| f- stopp | 4,0 | 4,0 | 2,5 | 1,1 |
| FOV (mm) | 190 | 190 | 140 | 120 |
| Fokalplanet (mm) | 27,5 | 27,5 | 12,2 | 4 |
| Binning (pixlar) | Inget | 2 x 2 | Inget | 8 x 8 |
Tabell 2: Imaging Specifikation Bruker imaging stations specifikationer för röd och grön fluorescens, och luminiscens avbildning av bakterieytan tillväxt..
Discussion
Att uppnå reproducerbar myllrande i ett laboratorium kan vara en utmaning, eftersom svärm analyser är mycket känsliga för miljöfaktorer såsom fukt och tillgängliga näringsämnen. Den mest kritiska aspekten av en yta motilitet platta analysen är fukt på agarytan. Före ympning måste svärm media vara torr nog för att förhindra bakterieceller från att simma över ytan flytande, men inte så torr som att hämma myllrande motilitet 5. Inkubation bör ske på ett tillräckligt fuktig miljö: för lite fukt kan resultera i analys uttorkning under inkubation, medan för mycket fukt kan leda till konstgjorda eller arte yta sprids. Om inte en fuktkontrollerad inkubator finns till hands, kan inkubator och laboratoriefuktigheten varierar kraftigt. Följaktligen kan en extra vattenbehållare, en luftfuktare eller en avfuktare inom inkubatorn krävas för att förhindra över torkning eller ansamling av fukt samtidigt som relative fuktighet nära 80%. Att upprätthålla detta ideal luftfuktighet kan visa sig utmanande om säsongsmässiga förändringar luftfuktighet är betydande. Om så är fallet, kommer svärmen analysprotokoll kräva vissa justeringar för att ta hänsyn till säsongsmässiga förändringar i luftfuktighet. Vi har funnit att modifiera svärm medie torktid är det enklaste sättet att justera för säsongsmässiga förändringar luftfuktighet. Konstant övervakning luftfuktighet, både inom och utanför inkubatorn, rekommenderas. Vidare rekommenderas att forskarna kalibrera och validera sina instrument, företagskuvöser, skalor, etc. som mindre fel i temperatur, volym eller mängder av media komponenter kan påverka reproducerbarhet av dessa analyser.
Det bör också noteras att typen och storleken på plattan som används i analysen kan påverka platt fukt, och sålunda svärmar. Lufttäta plattor inte ventilera bort fukt, vilket uppmuntrande simning motilitet. Däremot open-faced plattor tillåter för mycket fukt att fly. En petriskålger en idealisk miljö för att det ventilerar bort tillräckligt fukt för att förhindra vätska bygga upp, men behåller tillräckligt med fukt för att förhindra att medierna från att torka ut. Denna metod detaljer en yta motilitet analysprotokoll som möjliggör hög bildkvalitet. För att hålla agar klart för rätter avbildning 60 mm diameter är fyllda med 7,5 ml agarmedia. Om detaljerad avbildning inte krävs, kan volymerna upp till 20 ml också ge reproducerbara resultat.
Medan myllrande motilitet kan uppnås på ett brett spektrum av agar koncentrationer, det optimala intervallet agar krävs för svärmning beror på arten. Sammantaget hämmar högre agar koncentrationer myllrande motilitet, och följaktligen den tid som krävs för att producera en bild-ready svärm ökar. P. aeruginosa myllrar allmänhet på agar koncentrationer 0,4-0,7% 1, men vi tycker att optimal svärmning sker i ett mycket smalare utbud (0,4-0,5%). Andra, såsom B. subtilis och S. enterisken svärm på 0,6% agar, och Vibrio parahaemolyticus på 1,5% agar 10. Den erforderliga agarkoncentration bestäms också av den typ och märke av agar. Högre renhet agar, som Noble agar, starkt öka svärma i P. aeruginosa och föredras framför granulerad agar 13,14. Dessa renade versioner av agar är också mer benägna att karamellise under autoklavsterilisering cykeln; beroende på instrumentet, en förkortad / modifierat steriliseringssekvens (för att eventuellt ändra avgascykeln för att förhindra långvarig värmeexponering) kan vara skyldigt att upprätta svärm media med Noble agar.
Media sammansättning spelar också en roll i den observerade svärmen fenotypen 3. P. aeruginosa myllrande motilitet studier utförs vanligen använder minimala näringsmedier. Vi föredrar FAB medel 4,8 (Material tabell), men andra medier, såsom M9, LB, eller små variationer på dessa vanliga medier,har använts med framgång 9,15,16. Tendril bildning uppnås bäst på FAB minimalt medium kompletterat med glukos som kolkälla och kasaminosyror (CAA), men utan en ytterligare kvävekälla (dvs., (NH4) 2 SO4) 6,13. Om tendril bildning eller morfologi är inte huvudfokus i studien, då FAB minimalmedium (Material tabell, Tabell 1) saknar CAA rekommenderas så att effekterna av specifika kolkällor och / eller ytterligare näringsämnen kan studeras i detalj. Andra arter, såsom B. subtilis (presenteras här), är mångsidiga swarmers, kan svärma på LB och granulerad agar. Dessa arter svärm lätt, kräver endast ~ 10 tim för att utveckla ett komplett svärm. Denna snabba myllrande takt gör efter utvecklingen av svärmen potentiellt svårt men våra protokoll gör sådan spårning mycket möjligt. Förmågan att utföra svärm tidsförlopp avbildning ger en substantial lätthet i svärm datainsamling, särskilt från sådana ivrig swarmers.
Vi introducerar en robust, heltäckande, två-fas-protokoll och riktlinjer som syftar till att förbättra genomförandet och reproducerbarhet av bakteriell yta motilitet forskning och har främst betonat aspekter viktigt att undersöka flagellära medierad svärmning. Denna svärm analysprotokoll detaljer viktiga aspekter av medie sammansättning och hantering av ytan motilitet plattor för att ge större konsekvens och reproducerbarhet inom och mellan forskargrupper. Detta kommer att förbättra grunden för jämförelsen mellan olika forskningsstudier. Dessutom ger den presenterade tillvägagångssättet och protokoll medel för att göra forskningen om svärmning och ytan motilitet mindre känsliga för miljövariationer genom att forskare medvetna om att sådana faktorer påverkar deras arbete och ge möjliga lösningar (t.ex. hur små förändringar i agar påverkar svärma 4,5 ). Vidare protokollet lämnas tillkvantifiera makroskopiska aspekter av svärmning, ger en möjlighet att mäta många attribut av bakterieytan tillväxt som tidigare omöjliga att uppskatta.
Vi har inte undersökt alla ytvatten rörliga bakterier i utvecklingen av detta protokoll. Som sådan, är det förväntat att protokoll modifieringar kommer att krävas för arter som inte presenteras här. Effektiviteten av detta protokoll begränsas av de inneboende gränserna för utrustning och material som används. Till exempel, temperaturrelaterade studier är inte möjlig ännu med Bruker avbildningsstationen, eftersom temperaturreglering är inte en funktion av utrustningen. Dessutom kan användningen av färgämnen (såsom Nilrött att färga rhamnolipids) har kinetiska och koncentrationsbegränsningar 8. Denna teknik bygger starkt på bearbetning och analys av digitala bilder; förbättrad automatisering av dataanalys (t.ex. med hjälp av ytterligare Makron script funktion i ImageJ) skulle minska den tid som behövs för analysoch utöka nyttan av uppgifterna. Slutligen, på grund av robusthet bildprotokoll, bör framtida tillämpningar syfta utöka denna teknik för att undersöka mindre enhetliga tillväxtytor som är mer relevanta för ytor koloniserades av miljö- och patogena bakterier.
Disclosures
Publicerings avgifter för denna artikel delvis sponsrad av Bruker Corporation.
Acknowledgments
Delvis stöd för detta arbete lämnades av National Institute of Health (R01GM100470 och 1R01GM095959-01A1, till MA och JDS) och en Core Facility bidrag från Indiana Kliniska och translations Sciences Institute (finansierat delvis av NIH bidrag # UL1 TR000006; till JDS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagentsa | |||
| FAB Minimal Media: | Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O. | ||
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | 2 g. Not used in P. aeruginosa tendril formation studies. |
| Na2HPO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 9 g |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | 3 g |
| NaCl | BDH | BDH8014 | 3 g |
| MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) | Fisher Scientific | M33 | 1 ml |
| CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) | Fisher Scientific | C79 | 1 ml |
| Trace metal solution (see below) | n/a | n/a | 1 ml |
| Trace Metal Solution: | Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil. | ||
| CaSO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | 255548 | 200 mg |
| MnSO4 x H2O | Sigma-Aldrich | M7634 | 20 mg |
| CuSO4 x 5H2O | Fisher Scientific | C493 | 20 mg |
| ZnSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | 20 mg |
| CoSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | C6768 | 10 mg |
| NaMoO4 x 2H2O | Sigma | S6646 | 10 mg |
| H3BO3 | Fisher Scientific | A74 | 5 mg |
| FeSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | 200 mg |
| CTT Media: | Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O. | ||
| Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) | Amresco | 0234 | 1 ml. Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
| K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) | Sigma-Aldrich | P3786 | 0.1 ml. Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
| MgSO4 solution | Fisher Scientific | M65 | 0.8 ml. Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore). |
| Casitone | BD Diagnostics | 225930 | 1 g |
| Additional Reagents: | |||
| LB Broth, Lennox | BD Diagnostics | 240230 | 2% (wt/vol) |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media. Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving. |
| Casamino acids (CAA) | Amresco | J851 | 0.10% (wt/vol). Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving. |
| Agar, Noble | Sigma-Aldrich | A5431 | 0.45% (wt/vol). Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
| Agar, Noble | Affymetrix | 10907 | 1.50% (wt/vol). Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
| Agar, Granulated | Fisher Scientific | BP1423 | 0.60% (wt/vol) |
| Higgins Waterproof Black India Ink | Higgins | HIG44201 | 0.50% (vol/vol). Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture. |
| SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11346 | Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 μl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving). |
| Relevant Materials and Equipment | |||
| Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia. x H) | VWR | 25384-326 | |
| Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia. x H) | VWR | 25384-342 | |
| Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia. x H) | VWR | 25384-092 | |
| In-Vivo Xtream | Bruker | Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html | |
| Bruker MI software | Bruker | http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf | |
| ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information. | |||
References
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews: Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Burall, L. S., et al. et al.Proteus mirabilis. genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: Identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infection and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa. biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PLoS One. 6 (6), e20888 (2011).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa. swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M., O'Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Du, H., et al. High density waves of the bacterium Pseudomonas aeruginosa. in propagating swarms result in efficient colonization of surfaces. Biophysical Journal. 103 (3), 601-609 (2012).
- Morris, J. D., et al. Imaging and analysis of Pseudomonas aeruginosa. swarming and rhamnolipid production. Appl Environ Microbiol. 77 (23), 8310-8317 (2011).
- Tremblay, J., Richardson, A. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa. swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. J Bacteriol. 195 (5), 909-918 (2013).
- Patrick, J. E., Kearns, D. B. Laboratory strains of Bacillus subtilis .do not exhibit swarming motility. Journal of Bacteriology. 191 (22), 7129-7133 (2009).
- Molecular Imaging. , Bruker Corporation. Available from: http://www.bruker.com/service/support-upgrades/software-downloads/molecular-imaging.html (2014).
- Harshey, R. M., Matsuyama, T. Dimorphic transition in Escherichia coli. and Salmonella typhimurium.: surface-induced differentiation into hyperflagellate swarmer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 91 (18), 8631-8635 (1994).
- Rashid, M. H., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate is needed for swimming, swarming, and twitching motilities of Pseudomonas aeruginosa. Proc Nat Acad Sci U.S.A.. 97 (9), 4885-4890 (2000).
- Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa. PA14. Journal of Bacteriology. 189 (9), 3603-3612 (2007).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic-di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa.: the pilY1. gene and its impact on surface-associated behaviors. J Bacteriol. 192 (12), 2950-2964 (2010).
