Introduction
Mange av funksjonene i hjernens funksjon er for tiden umulig å gjenskape i et kunstig system. Hjernens evne til raskt å behandle komplekse sensorisk informasjon og til å generere, som svar, er presise motoriske kommandoer av seg selv allerede utover dagens state-of-the-art. Men dens evne til å tilpasse seg ulike forhold ved å lære av tidligere erfaringer gjør det så enormt mye bedre menneske utviklet kontrollsystemer. Så langt, forsøker å gjenskape eller utnytte dette plastisitet har møtt liten suksess, og forståelsen av den interne driften av hjernen har unngikk forståelse av forskere. Ett av de viktigste spørsmålene mens han etterforsker forholdet mellom hjerne og atferd er manglende evne til å skikkelig få tilgang til alle variablene i systemet: ideelt sett ville en optimal eksperimentelt oppsett tillate samtidig opptak og stimulering til et stort antall nerveceller, langsiktig stabilitet , overvåking av synapser stillinger og vekter, og kontrollerbar bi-directional samspill med miljøet. Vanskeligheten i å spore alle disse variablene samtidig førte til studiet av hjerne-atferd forhold ved to svært forskjellige skalaer: enten med oppfører dyr, uten god kontroll over forsøksbetingelsene 1-7 eller med små, isolerte deler, for eksempel deler av nervevev, med ingen samlet oversikt over systemet 8. I sistnevnte tilfelle, mens ingen utviklet eksperimentelle oppsettet lar den komplette overvåking av alle parametrene som er involvert i arbeidet i enda en enkel nevrale nettverk, er en god avveining levert av dissosiert nevroner vokst i løpet Micro-elektrode Arrays (måle) 9. Disse enhetene, født på slutten av 70-tallet 10, har flere fordeler i forhold til tradisjonelle elektrofysiologiske teknikker: for det første, muligheten for opptak og stimulere et nettverk på mange forskjellige steder på en gang (vanligvis 60 elektroder). Videre er nesten ikke-invasiv koblingen av MEAs med cellene, Tillater observasjon av det samme nettverket for lange perioder, opp til flere måneder 11. De fysiologiske virkninger av elektrisk stimulering for dissosierte kulturer er blitt grundig studert, takket være disse anordninger, avslører at mange egenskaper sett ved høyere vekter (slik som, for eksempel, plastisitet og enkel minne prosesser 12-14) er konservert til tross for tap av arkitektur. Under kultur vekst, disse nettverkene begynne å vise spontan aktivitet på ca 7 dager in vitro (DIV) 15,16. Nettverksaktivitet tendens til å endre seg radikalt med ytterligere vekst; først som enkle pigger samles i blokker (mot slutten av den andre uken) 17, som senere går over til et meget komplekst mønster av synkronisert, ikke-nettverks periodisk bryter 18, som representerer moden tilstand av et nettverk. Det har blitt foreslått 19 at dette synkron oppførsel, noe som ligner den som ble observert i in vivo registreringninger om sovende dyr, er forårsaket av mangel på sanseinntrykk.
En annen tilnærming har forsøkt å få en bedre forståelse av informasjon som koder er blitt tatt ved å utføre lukket-sløyfe eksperimenter, der forskjellige typer av signaler ble brukt til å styre stimulering av neuronal nettverket selv 11,20-23. I disse eksperimentene, har en ytre middel i stand til interaksjon med omgivelsene blitt brukt til å generere sensorisk informasjon tilføres til det neurale nettverk, som i sin tur fremmotorkommandoer for en effektor mekanisme. Dette tillot observasjoner av hvordan dynamiske og tilpasningsdyktige egenskaper av nervesystemer utviklet som svar på induserte endringer i miljøet.
Et oppsett for å utføre 'nedfelt nevrofysiologi' eksperimenter ble utviklet, der et hjul sensorplattform (en fysisk robot eller sin virtuelle modell) beveger seg rundt på en arena og dens hastighetsprofiler bestemmes av aktiviteten til en neuronalsystem (dvs. en befolkning på rotte nevroner dyrket over en MEA). Roboten er kjennetegnet ved de hastighetsprofilene for de to uavhengig styrte hjul, og ved den aktuelle avlesninger av avstandsfølere. Det nøyaktige innholdet i avstandssensorer ikke er relevant; de kan være aktive eller passive optiske sensorer eller ultralydsensorer. Åpenbart har dette problemet ikke gjelder i tilfelle av virtuelle roboter, hvor sensorer kan være utformet med hvilken som helst ønsket egenskap.
I forsøkene som her er beskrevet, er roboten brukes alltid den virtuelle gjennomføring, med seks avstandssensorer som peker på 30 °, 60 ° og 90 ° fra robotens posisjon i begge retninger. Aktiviteten av de tre venstre og høyre sensorene blir midlet og aktiviteten av den biologiske kultur er drevet av informasjonen som samles inn ved hjelp av slike "Super-sensorenes (som bare vil bli referert til som" venstre "og" høyre "sensorer i resten av dette arbeidet). Protocol beskrevet kan faktisk anvendes på den fysiske robot med relativt små justeringer. Den informasjon som samles av robot (enten fysisk eller virtuelt) kodes i en rekke stimuli som brukes til å manipulere aktivitet av biologisk neuralt nettverk, som er fysisk adskilt av roboten. Stimuli selv er alle identiske og dermed ikke kode noe informasjon. Hva er relevant er deres frekvens: stimulering renteøkninger når roboten nærmer en hindring, med forskjellige leveringssteder koding sensorisk informasjon fra venstre og høyre øyne "av roboten. Det nevrale nettverket vil presentere forskjellige responser til den innkommende tog av stimuleringer: oppgaven med dekodealgoritmen er å omsette det resulterende nettverket aktivitet inn kommandoer som brukes for å styre hjulene på roboten. Gitt en "perfekt" nettverk atferd (dvs. med pålitelig og helt atskilt svar på stimuli fra ulike elektroder), ville dette Result i roboten kjører i sin arena uten å treffe noen hindring. De fleste nettverk stede en atferd svært forskjellige fra ideality, derfor en enkel læring protokollen er innført: når aktivert, tetanic stimulering (korte perioder med høy frekvens stimulering, 20 Hz stimulering i 2 sek, inspirert av protokoller som er beskrevet i 24,25) etter en kollisjon med en hindring er levert. Hvis tetanic stimulering resulterer i en lokal styrking av nettverkstilkobling, vil dette resultere i en progressiv økning i navigasjons egenskapene til roboten.
HyBrainWare2, en forbedret versjon av tilpasset programvare utgitt i 26, er kjernearkitektur som er utviklet for å håndtere kontroll av de ulike enhetene i systemet (stimulator, datainnsamling, prosessering og visualisering, robot kommunikasjon eller simulering). Denne programvaren er utviklet ved vår lab og er fritt tilgjengelig på forespørsel. Denne programvaren inneholder grensesnittet meddatainnsamling bord: en gang brukeren starter datainnsamling fra GUI, styrer programvare oppkjøpet styret å starte prøvetaking og A / D-konvertering av data som kommer fra opptaks elektroder. Denne informasjonen kan deretter bli registrert, vises til skjerm eller analyseres i sanntid for å oppdage pigger, i henhold til de alternativene som er definert av brukeren (se Prosedyre seksjon for detaljer). Videre i programvaren, definisjonen av koding (oversettelse av sensorisk informasjon til en elektrisk stimulering) og dekoding (oversettelse av registrert aktivitet i motoriske kommandoer for roboten) algoritmer må spesifiseres. Spesielt er vårt oppsett relativt brukervennlig sammenlignet med lignende systemer designet i det siste 27, siden nesten alle variabler kan nås av brukeren rett før du starter selve eksperimentet, mens all den registrerte informasjonen blir automatisk lagret i et format som er kompatibelt med en neural dataanalyse verktøykasse 28.
Følgende prosedyre delen beskriver en lærings eksperiment på dissosiert rotte hippocampus kulturer: all dyrking og eksperimentelle parametre er gitt for denne spesielle forberedelser og kanskje må endres hvis en annen biologisk substrat skal brukes. Likeledes tar den beskrevne eksperiment fordel av lukket-sløyfe-arkitektur for å undersøke effekten av læring tetanic stimulering, men arkitekturen i seg selv er fleksibel nok til å bli brukt i studiet av ulike funksjoner i dissosiert nevrale nettverk. Hovedvarianter av foreslått forsøk er nærmere forklart i diskusjonen delen.
Protocol
1. Utarbeidelse av Neuronal kultur over en MEA
- Plate nevrale kulturer på MEA chips, som beskrevet 29. Beskrivelsen av en tilsvarende fremgangsmåte er også tilveiebrakt 9 og i den diskusjon delen.
- Snu MEA varmesystem på 5-10 min før du starter opptaket for å minimere varme stress opplevd av cellene: innstilt temperatur mål av temperaturkontrolleren til 37 ° C og slå på varmeplate under MEA selv (forutsatt i de fleste kommersielle MEA-systemer) og, hvis tilgjengelig, et oppvarmet dekning for å redusere fordampning.
- Sterilgassgjennomtrengelige hetter før bruk i en autoklav med fuktig-varme (30 min, 130 ° C). For å unngå fordampning og hindre endringer i osmolaritet, holde kulturer dekket med caps under opptak.
- Plasser neuronal kultur i forsterkeren 30 min før faktisk begynner opptaket.
MERK: Bare flytte kulturer fra incubator til forsterkeren i betydelig grad vil forstyrre spontan aktivitet i ca en halv time. I løpet av denne tiden, vil kultur middels temperatur stabilisere seg. - Hvis en carbair krets er tilgjengelig, starter sirkulasjon av carbair (en blanding av 5% CO 2 og 95% O 2 + N 2) for eksperimenter lengre enn et par timer: kulturer vil kreve det for å opprettholde både oksygen og pH-verdier stabilt.
2. Valg av opptaksparametere for MEA Acquisition
- Velg programvare filter båndbredde for å oppdage spikes (dvs. Multi-Unit Aktivitet - MUA) 30: i RawDataDisplay skjema markere '300 Hz-3 kHz "boksen.
- Starte kjøp av data: trykk på "Start" -knappen i RawDataDisplay skjemaet.
- Sett Threshold Gain for pigg deteksjon i RawDataDisplay til 7.
MERK: Avhengig av ønsket spesifisitet / selektivitet kompromisset og på den vedtatte oppdageion-algoritmen, kan denne terskelen settes til mellom 6 og 10 ganger det beregnede standardavvik. - Satt Threshold Minne til 2 sek og trykk på "Lås" -knappen når ingen spiking aktivitet er synlig på skjermen (begge kommandoene er i RawDataDisplay form). Mark 'Estimer SD fra median' for å beregne støystandardavvik fra medianen av den absolutte verdi av det observerte signalet 31,32, dersom det er vanskelig å tilveiebringe enda kortere tidsvinduer uten spiking aktivitet. Fjern haken fra dette alternativet når du trykker på "Lås" -knappen, som underliggende algoritmen er krevende og kan føre til at PC-en til å henge etter.
- Slå på pigg deteksjon rutine ('Spike Detection "boksen i RawDataDisplay form). Hvis pigg deteksjon allerede kjører (det vil si at avkrysnings allerede merket), forkaste pigger oppdaget opp til dette øyeblikket ved å klikke på "Reset" -knappen i Dataregistrering skjema.
3. Valg av MEA Elektroder å stimulere nevrale Kultur og Response Kart Computation
- Record spontan aktivitet av nerveceller dyrket over MEA for 30 min: lagre data til fil ved å klikke på opptaksknappen, i "Spikes 'boksen i DataRecording form, etter ønsket mengde tid har gått (30 min, i dette tilfellet).
- Identifisere de 10 mest aktive kanaler (dvs. 10 kanaler med høyest pigg teller), og deretter velge de kanalene i noen av MEA oppsett (enten i koding, dekoding eller Connection Kart former) ved å dra musepekeren over de ønskede områdene. Når er valgt kanalene, høyreklikk hvor som helst på MEA layout og velg "Legg til venstre sensoriske område" i hurtigmenyen: disse elektrodene vil bli brukt til å levere elektrisk stimulering i trinn 3.5.
- Kontroller at stimulator og MEA forsterker er riktig tilkoblet: alle konfigurasjoner require to ledninger per ønsket stimulering kanal, mens en ekstra koaksialkabel vil være nødvendig for å bære synkronisering signal (henvises til håndbøkene for de nærmere instrumenter for koblingsskjemaer). Fortsett deretter å slå stimulatoren på.
- Definere stimulans parametere i Connection Kart skjemaet. Alle stimulering levert til kultur er bifasisk firkantet spenningsbølger. Satt halv varighet til 300 usek og amplitude til 1,5 V pp 33.
MERK: Stimuli stor nok til å pålitelig fremkalle nevrale responser vil meget sannsynlig kompromiss innspillingen av aktivitet fra de samme stedene. I resten av papiret, bør elektroder som brukes for stimulering levering ikke velges for opptak all relevant informasjon. - Posten respons på stimulering: Trykk på Start-knappen i ConnectionMap skjemaet. En serie på 30 stimuli, med et intervall på 5 sekunder er, i sin tur, automatisk leveres fra hver av de utvalgte elektroder, mens responser er plateed fra de gjenværende 59 elektroder.
- Beregne en forbindelse kart (dvs. sannsynligheten for å observere et svar fra en elektrode i en tidsluke etter levering av stimulans fra en annen elektrode) for hver stimulerende kanal gjennom noen matte programvare eller SpyCode, et program utviklet i det siste (og fritt tilgjengelig på forespørsel) til å utføre beregninger på nevrale data 28.
- Fra tilkoblings kart, velger beste elektroder: forkaste alle stimulerende elektroder som ikke vekker reaksjoner (dvs. i tidsvinduet etter stimulering, skyte priser er ikke signifikant høyere enn under spontan avfyring).
- Velg blant de resterende elektroder, paret med minst overleap i svarene. Spesielt for hver stimulerende elektrode, beregne den gjennomsnittlige pigg telling i hvert opptak elektrode, og deretter å beregne forskjellen mellom tilsvarende elektroder for alle stimulerende elektroder parene. Velg paret for hh summen av absolutte verdier av responsforskjeller i løpet av alle opptakskanaler er høyest.
- Velg ett av disse elektrodene å kode sanseinformasjon fra venstre side av roboten og den andre til å kode opplesninger fra høyre side: For å gjøre dette, dra musepekeren over en elektrode, høyreklikker du på MEA layout velg deretter "Legg til venstre sensoriske område" (eller "Legg til høyre sensoriske område ').
4. Grensesnitt den Neuronal Culture med robot: Valg av Koding og dekoding Ordninger
- Sett 'Coding Type' i Coding skjemaet til Linear.
- Definere minimum og maksimum stimulering priser i Coding skjemaet. Bruke standard utvalg av 0,5-2 Hz.
- Sett "Jitter 'parameter i kodeskjemaet til 0.
- Still dekoding algoritmen parametrene i dekoding Form (vekt og ekstinksjonskoeffisient) til 1, for en moderat aktiv kultur (~ en pigg / sek per flael). Definere en ny parameter pair hvis skuddhastigheter sterkt og stadig avvike fra denne verdien. Se diskusjonen for den nøyaktige funksjonen til dekoding parametere.
- Still dekoding algoritmen briste parametre i dekoding Form. Sett vekten til 0 (desintegrasjonstid er da uten betydning), med mindre forskjell mellom toppene og støt er gjenstand for undersøkelse.
MERK: Verdiene er foreslått i trinn 4.4 vil produsere jevne robot bevegelser og hastigheter som er kompatible med robot reaksjon ganger for moderat aktive rotte primærkulturer. Serien parametre har nøyaktig samme funksjon som de som er beskrevet i trinn 4.4, men den utløsende hendelse er deteksjon av en skur i stedet for en pigg: den faktiske hastigheten på hvert hjul er rett og slett summen av bidragene fra detekterte toppene og støt.
5. Design av Navigation Arena for Robot
- I Virtual Arena Designer form, velge mellom avgrenset (grensene av arenaen er synlige for roboten og jegmpassable) eller grenseløs (hvis roboten utganger fra den ene siden av arenaen, det vil umiddelbart gå inn fra motsatt en) arena og sett arena størrelse i piksler.
- Ikke bruk begrensede arenaer mindre enn 100 x 100 piksler, for å tillate store bevegelser. Ikke bruk hindringer med en radius mindre enn fem piksler som de kan rett og slett faller mellom linjene av synet av roboten.
- Husk at svært store arena størrelser kan føre til datamaskinens ytelse å degradere: hvis en stor arena er nødvendig, teste programvare ytelse med ønsket arena før du starter vanskelige å gjenta eksperimenter.
- Satt robot startposisjon enten manuelt (klikk på 'Manuell Selection "-knappen i Virtual Arena Designer form, deretter ønsket plassering) eller ved å angi koordinatene til roboten på eksperimentet starter i" Robot startposisjon' felt.
- Legge til så mange ufremkommelige hindringer innenfor arenaen. Enten plassere dem manni manuell i arenaen etter å ha klikket på "Legg Obstacle manuelt" -knappen eller sett nummer og størrelse.
- Klikk på "Generer Arena 'knappen for å generere arenaen med de valgte funksjonene. Ingen endringer vil skje før denne knappen trykkes.
- Lagre utformet arena og laste den relative fil, før bruk i et eksperiment, med kommandoknappene i den nedre delen av Virtual Arena Designer skjema.
6. Valg av MEA Elektroder til Record nerveaktiviten fra Kultur
- Velg som midlertidige opptak elektroder de på hvilke forskjellige reaksjoner, i trinn 3.8, har blitt observert: elektroder som viste større svar etter stimulering fra "venstre" (eller "rett") elektrode vil utgjøre den "venstre" (eller "rett") innspillings elektroder. Ikke bruk elektroder som ikke viser signifikante responser til enten stimulerende elektrode å styre roboten. From MEA layout pop-up menyen, velg "Legg til venstre motor område" (eller "Legg til høyre motor område ') for å definere opptaks elektroder.
- Velg funksjoner for å spille inn i Experiment Manager-skjemaet. På dette stadiet, pigger og stimulering tidsstempler er den eneste relevante informasjonen.
- Utfør en 10 min prøvekjøring: start roboten kjøre ved å klikke Start Experiment knappen i Experiment Manager-skjemaet, klikk på den igjen etter 10 minutter er gått.
MERK: Når alle parameterne er satt (koding og dekoding, robot arena, stimulerende og opptak elektroder, har til posten), vil et filnavn utvalg be om innspilte filer navn og et mål, da roboten vil begynne å bevege seg i sin arena, følge de definerte regler. Alle funksjoner som er valgt, lagres automatisk i sanntid. - Gjenta trinn 3.6 og 6.1 på data innhentet i trinn 6.3, for å velge opptaks elektroder fra data samlet inn i løpet av en faktisk robot kjøre (se Discussion for begrunnelsen av denne to-trinns tilnærming).
7. Utføre en Neuro-robot Experiment
- Velg i Experiment sjef danne dataene som skal registreres: markere Spike, Robot og Stimuli databoksene.
- Lansere en pre-læring robot kjøre: Klikk på «Start Experiment" -knappen i Experiment Manager-skjemaet. Velge nye filnavn for datafiler når du blir bedt. Når 30 minutter har gått, kan du klikke på «Start Experiment" -knappen igjen for å stoppe roboten løpe.
- Slå på læring protokollen (merk den "Deliver tetanic Stimulering Etter Hit 'boksen i Experiment sjef form) og utføre treningen robot kjøre, av samme lengde som den pre-treningsfasen (dvs. 30 min). Husk å legge inn forskjellig filnavn når du blir bedt om å unngå å overskrive data fra trinn 7.2.
- Slå av læring protokollen igjen (fjerne merket for den "Deliver tetanic Stimulering Etter Hit 'boksen) Og utføre post-læring robot løp. Igjen, må du huske å endre filnavn for å hindre overskriving.
8. Second Response Kart Computation
- Gjenta trinn 3,1-3,6. Bruke data fra disse opptakene for å teste om eventuelle endringer har blitt indusert enten i spontane eller fremkalt aktivitetsmønstre ved læring protokollen.
Representative Results
Den utviklede forsøks rammen tillates testing av hvorvidt en utveksling av informasjon mellom en kultur av nevroner og den virtuelle realisering av en fysisk robot er mulig 34 Fig. 1 viser flere eksempler på oppnådde banene som en virtuell robot i 20 min eksperimenter på forskjellige tilstander : fra venstre mot høyre en skikkelig lukket-sløyfe eksperiment, en "tom MEA" robot-eksperiment (ingen celler blir sådd ut på MEA for dette kontrollforsøk) og en åpen sløyfe robot eksperimentet (stimuleringsfrekvens er konstant i stedet for koding sensorinformasjon) er representert. De representative spor bekrefte at en toveis interaksjon mellom neuronal og kunstige elementer som er nødvendig for å oppnå gode navigasjons forestillinger av roboten. Likevel opplever roboten flere treff mot hindringer.
I figur 2, navigasjons ytelsen av roboten, expressed som piksler reist mellom påfølgende treff, er vist i forskjellige forhold. De to første kolonnene viser fordelingen av avstander i kontrollforsøk som er nevnt ovenfor ('tom MEA' og åpen-sløyfe-konfigurasjoner), mens den tredje og fjerde kolonne viser resultatene uten og med henholdsvis levering av tetanic stimulering etter hvert truffet mot en hindring. Innføringen av tetanic stimulering (jfr prosedyre, punkt 7.2) forbedrer betydelig distanse mellom to påfølgende treff, og dermed forbedre navigasjons forestillinger av roboten 35.
I figur 3 vises navigasjons ytelsen av en robot med forskjellige dekodingsforhold presentert. For å oppnå dette, har en annen arena konfigurasjon vedtatt. Dette har bidratt til å kvantifisere den vellykkede navigering av roboten innenfor arenaen, 36: som beskrevet i trinn 4.1 i prosedyren, er robotenpresentert en rekke korte spor. Den suksessraten er ganske enkelt forholdet mellom antall vellykket kryssende spor enn antall spor som er presentert. Spesielt under forsøkene en sanntids identifikasjon av sprekker og isolerte toppene ble utført. Dekodingen paradigmer skiller seg fra hverandre på grunn av de relative vekter av skurer og isolerte spisser (jfr prosedyre, poeng 3,5 til 3,6 og diskusjon).
Figur 1: En neuronal nettverk og en robot har en toveis utveksling av informasjon Denne figuren viser tre representative banene som roboten i løpet av 20 minutter av forsøket.. Spesielt lys grønne områder er gratis for roboten til å bevege seg i, mens mørke grønne piksler representerer ufremkommelige hindringer som roboten kan oppfatte gjennom sine avstandssensorer. I hver studie starter roboten jegn øvre venstre delen av arenaen og reiser til sin endelige posisjon, avbildet som en stor rosa prikk. De mindre sorte prikker representerer treff mot et hinder, mens fargekodet banen gir en indikasjon på tidsutviklingen av robot bevegelse. Fargen feltet på høyre side uttrykker tid har gått fra begynnelsen av forsøket på få minutter. (A) Bane fulgt under et lukket eksperiment. (B) Sti fulgt under en "tom" MEA eksperiment (ingen celler dyrkes på MEA overflate). (C) Sti fulgt under en åpen-sløyfe eksperiment (stimulering rate er konstant gjennom hele forsøket). Klikk her for å se en større versjon av figuren.
Figur 2: Resultater er påvirket av stengt-loop og tetanic stimulering. Denne grafen viser fordelingen av avstander som omfattes av roboten mellom påfølgende treff i ulike forhold. Spesielt de to første distribusjoner representerer kontrollforsøk ("tom" for opptak uten nevroner belagt på MEA, "Åpen sløyfe '(OL) for eksperiment med en" blind "robot). De to siste kolonnene representerer "Closed loop" tilstand uten (CL) og med (CL + TS) læringsprotokoll implementert gjennom tetanic Stimulation (TS), blir levert til kulturen etter treff mot en hindring. I hver boks, representerer sentrale horisontalt segment medianen i fordelingen, den tomme firkanten middelverdien, strekker den sentrale baren til den første og tredje kvartil og kinnskjegg utvide til 5 th og 95 th persentiler. Slengere er representert som diamanter. Statistikk har blitt utført ved hjelp av Kruskall-Wallis enveis variansanalysepå rekkene: Student-Newman-Keuls parvise sammenligningen avslører at alle medianverdier er vesentlig forskjellige med p <0,05.
Figur 3: Decoding påvirker robot ytelse Grafen ovenfor representerer sannsynligheten for en gitt dekoding algoritme, av roboten til å navigere vellykket gjennom et kort spor i en begrenset tidsperiode.. Identifisering av skurer og isolerte spisser er utført i sann tid under forsøket selv. I det første tilfellet ("pigger") alle detekterte toppene presentere den samme flatevekten for det andre og tredje fordelinger en vekt på 0 ble satt til henholdsvis isolerte pigger og pigger som tilhører en burst. De to siste kolonnene representerer de resultater som ble oppnådd i det tilfelle hvor alle piggene er rede for, men med en annen relativ vekt i henhold til deres posisjon.Spesielt i den fjerde kolonnen isolert toppene ble gitt høyere relativ vekt enn seriearrangementer, mens vektingen er invertert for dekoding relative femte kolonne data til. I hver graf, representerer den sentrale linjen medianen i fordelingen, den tomme firkanten middelverdien, mens den sentrale baren strekker seg til den første og tredje kvartil og kinnskjegg utvide til 5 th og 95 th persentiler. Statistikk har blitt utført ved hjelp av Kruskall-Wallis enveis variansanalyse på rekkene. Den parvise sammenligning (Student-Newman-Keuls fremgangsmåte,) viser at signifikante forskjeller (p <0,05) kan observeres mellom kolonnene 1 og 4, 2 og 4, 2 og 5, 2 og 3.
Discussion
I denne artikkelen en nevro-robotarkitektur basert på et nevralt kontrolleren (dvs. et nettverk av nerveceller som kommer fra cortex eller hippocampus av embryoniske rotter), begge veier koblet til en virtuell robot, er presentert. Roboten, som har sensorer og hjul, er tvunget til å bevege seg i en statisk arena med hindringer og dens oppgave består av å unngå kollisjoner.
Den første og muligens mest kritiske aspekt ved den beskrevne fremgangsmåten er fremstillingen av kulturene seg selv, da den feilraten vil ha en tendens til å være betydelig, selv i de beste tekniske forhold. En detaljert beskrivelse av dyrking teknikker er imidlertid utenfor omfanget av den foreliggende arbeid. Som en generell rettesnor, skal opptak oppstå når nettverket skuddtakt når et stabilt nivå, vanligvis etter 3 uker in vitro. En grov indikasjon på sunne kulturer er tilstedeværelsen av spontan elektrofysiologisk aktivitet i flere opptak flaels (minst 20 kanaler over 60 tilgjengelig). Slike kulturer er preget av en høy grad av nevronale inter-tilkobling. Under slike forhold, nevrale aktiviteten vanligvis blir sterkt synkronisert og, til tider, viser den epileptiske hendelser, med intens spiking fulgt av minutter lange stille perioder 37. Begge disse funksjonene presentere et problem: dreven synkronisering vil gjøre det umulig å skille respons på stimuli fra forskjellige elektroder, mens kulturer som oppviser epileptiform aktivitet vil reagere på den første stimulus presentert med et langt utbrudd av aktivitet, etterfulgt av en stille periode, uansett noen påfølgende stimuli levert. Begge disse problemene kan være sterkt bedres ved ansettelse av mønstrede kulturer 35, der det nevrale befolkningen er delt i to eller flere svakt sammenknyttede undergrupper.
En annen sak er at nevrale responser sterkt avhengig av fordelingen av innkommende Stimuljeg 38,39. I et lukket eksperimentet, er det leverte stimulering en funksjon av sensoravlesninger, som i sin tur er en konsekvens av robotens bevegelse og dermed av de nevrale responser selv. Dette innebærer at det ikke er noen lett måte å etablere forhånd hva responser vil bli observert under selve forsøket. Som et resultat, må valget av kryssløps elektroder er avhengige av suksessive approksimasjoner. I den beskrevne protokoll, en to-trinns prosess (nemlig trinn 5.5 og 6.4) er implementert for å prøve å finne en sammenheng kart. I det første trinn blir en fast rekkefølge av stimuler levert og svar på slike stimuli blir brukt til å utlede en første forbindelse kart og et midlertidig sett med opptakskanaler. Denne konfigurasjonen blir så brukt til å utføre prøvekjøring beskrevet i trinn 6.4 og velge opptakskanaler som vil bli overvåket under selve forsøket.
I delen resultater, en representant navigasjons result og de umiddelbare forbedringer forårsaket av innføringen av en lærings paradigme blir presentert. Gjennom hele beskrivelsen protokollen, er flere andre mulige varianter eksperimentelle nevnt. For eksempel til de to store koding systemer implementert i HyBrainWare2 (lineære og stokastiske) hvor utviklet undersøke eksakte rolle timelig innspill variasjon på det nevrale kode 38. I den lineære tilfellet er momentant stimulering hastighet en funksjon av brukerdefinerte parametere og robot sensorer innspillinger. I den stokastiske tilfellet har hver gang eksempelvis en gitt sannsynlighet for å bli valgt for å levere et stimulus. Slik sannsynlighet blir automatisk beregnet av HyBrainWare2 slik at de forventede stimulerings prisene matche den tidligere saken. Muligheten for å legge til jitter lineær koding gir en jevn overgang mellom de to tilfeller som er beskrevet ovenfor. På samme måte kan utforske ulike kombinasjoner av parametere i dekoding seksjon hjelpe belyse PreciSE rolle sprengning i in vitro nevrale nettverk. Hastigheten på hvert hjul av roboten øker proporsjonalt med vekten parameter hver gang en hendelse er detektert i det tilsvarende utgangsområdet, mens ekstinksjonskoeffisienten indikerer hvor mye tid, i sekunder, en av de bidrag som trengs for å miste 50% av sin verdi . Forfallet er en enkel eksponentiell. Disse variantene har allerede blitt tatt hensyn til i den nåværende utformingen av HyBrainWare2, men mange flere forskningsmuligheter er åpne om kan innføres ytterligere endringer i programvaren eller eksperimentelle oppsettet.
En ganske betydelig begrensning av protokollen her beskrevet er kravet til den utviklet tilpasset programvare, HyBrainWare2 (fritt tilgjengelig ved forespørsel til alle interesserte brukere). Denne programvaren er utviklet for et sett av enheter (stimulator, anskaffelse brett, MEA forsterker) av en bestemt modell og produsent. Mens det er faktisk mulig å tilpasse det til å fungere på different oppsett, vil konverteringen ta litt programmering dyktighet. Tilsvarende de inkluderte alternativene dekker kun et begrenset sett av alle de eksperimentelle spørsmål som kan bli undersøkt gjennom et slikt oppsett. For eksempel er pigg algoritme implementert i den presenterte arkitektur (presis tid pigg deteksjon 40) fullstendig definert av flere hardkodet parametere som må endres hvis motivet for registrering er svært forskjellig fra dissosiert nevrale nettverk (f.eks hjerteceller eller skiver). Endelig består lærings protokollen for levering av en kort, høy frekvens (2 sek på 20 Hz stimulering, er hver stimulus puls det samme som de som brukes til å kode sensorisk informasjon) stimulering etter hvert hinder hit. Hvis roboten treffer et hinder med sin høyre side, er det tetanic stimulering levert til elektroden som vanligvis koder for høyre side informasjon og det samme gjelder for venstre side treff. Denne protokollen er hardkodet og kan ikke be endres av brukeren uten å endre spennende programvare.
Mens oppsettet presenteres her er ikke den første nedfelt system for hybrid, lukket-sløyfe eksperimenter 20,23,27,41,42, ble de utformet i det siste fokusert på en enkelt avhandling støttes av data fra et begrenset antall analoge forberedelser . På den annen side har den beskrevne oppsettet vært brukt i et stort antall forsøk (mer enn 100 kulturer har vært registrert siden 2012) med forberedelsene ulik for modularitet og opprinnelse, mens forsøkene selv adressert ulike problemstillinger (f.eks virkningen av tetanic stimulering og relevans for sprengning, som presenteres i resultatene). I nær fremtid, er nye eksperimentelle økter forutsett å verifisere de varige effekter av både tetanic og lukket stimulering og forholdet mellom stimulering regularitet og observerte responser. En annen sak som skal behandles er linken mellom spontane og observerte aktiviteten, medideen om å legge en ny dekoding algoritme som tar hensyn til historien om tidligere aktivitet og stimulering 43.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takk Ph.D. student Marta Bisio for dyrking og vedlikehold av nevrale nettverk enn Micro-elektrode Arrays og Dr. Marina Nanni og Dr. Claudia Chiabrera fra NBT-IIT for teknisk assistanse for disseksjon og dissosiasjon prosedyrer. Forskningen fører til disse resultatene har mottatt støtte fra EUs syvende rammeprogram (IKT-FET FP7 / 2007-2013, FET Young Explorers ordning) under tilskuddsavtalen n ° 284772 BRAIN BOW ( www.brainbowproject.eu ). Forfatterne vil også gjerne takke Silvia Chiappalone for hennes hjelp i å produsere grafikk som brukes i innledningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulus Generator 4002 | Multi Channel Systems | ||
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| NI 6255 Acquisition Card | National Instruments | ||
| Microsoft Visual Studio 2008 | Microsoft | ||
| 2078P Multichannel System-National Instruments adapter board | Developed at University of Genova (Italy) | ||
| Matlab 2010 | Mathworks | ||
| HyBrainWare2 | HyBrainWare2: Contact Information |
References
- Fetz, E. E. Volitional control of neural activity: implications for brain–computer interfaces. The Journal of Physiology. 579 (3), 571-579 (2007).
- Carmena, J. M., et al. Learning to control a brain–machine interface for reaching and grasping by primates. PLoS Biology. 1 (2), e42 (2003).
- Azin, M., Guggenmos, D. J., Barbay, S., Nudo, R. J., Mohseni, P. A miniaturized system for spike-triggered intracortical microstimulation in an ambulatory rat. Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 58 (9), 2589-2597 (2011).
- Angotzi, G. N., Boi, F., Zordan, S., Bonfanti, A., Vato, A. A programmable closed-loop recording and stimulating wireless system for behaving small laboratory animals. Scientific Reports. 4, (2014).
- Maher, M., Pine, J., Wright, J., Tai, Y. -C. The neurochip: a new multielectrode device for stimulating and recording from cultured neurons. Journal of Neuroscience. 87 (1), 45-56 (1999).
- Olsson, R. H., Buhl, D. L., Sirota, A. M., Buzsaki, G., Wise, K. D. Band-tunable and multiplexed integrated circuits for simultaneous recording and stimulation with microelectrode arrays. Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 52 (7), 1303-1311 (2005).
- Zanos, S., Richardson, A. G., Shupe, L., Miles, F. P., Fetz, E. E. The Neurochip-2: an autonomous head-fixed computer for recording and stimulating in freely behaving monkeys. Neural Systems and Rehabilitation Engineering. IEEE Transactions on. 19 (4), 427-435 (2011).
- Reger, B. D., Fleming, K. M., Sanguineti, V., Alford, S., Mussa-Ivaldi, F. A. Connecting brains to robots: an artificial body for studying the computational properties of neural tissues. Artificial Life. 6 (4), 307-324 (2000).
- Hales, C. M., Roston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 2056 (2010).
- Gross, G., Rieske, E., Kreutzberg, G., Meyer, A. A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro. Neurosci Lett. 6 (2), 101-105 (1977).
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1), 17-24 (2001).
- le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons. PLoS One. 5 (1), e8871 (2010).
- Marom, S., Shahaf, G. Development learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy. Quarterly reviews of biophysics. 35 (1), 63-87 (2002).
- Shahaf, G., Marom, S. Learning in networks of cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 21 (22), 8782-8788 (2001).
- Pelt, J., Vajda, I., Wolters, P. S., Corner, M. A., Ramakers, G. J. Dynamics and plasticity in developing neuronal networks in vitro. Progress in Brain Research. 147, 171-188 (2005).
- Chiappalone, M., Bove, M., Vato, A., Tedesco, M., Martinoia, S. Dissociated cortical networks show spontaneously correlated activity patterns during in vitro development. Brain Research. 1093 (1), 41-53 (2006).
- Tateno, T., Jimbo, Y., Robinson, H. Spatio-temporal cholinergic modulation in cultured networks of rat cortical neurons: spontaneous activity. Neuroscience. 134 (2), 425-437 (2005).
- Masquelier, T., Deco, G. Network bursting dynamics in excitatory cortical neuron cultures results from the combination of different adaptive mechanism. PLoS One. 8 (10), e75824 (2013).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation. The Journal of Neuroscience. 25 (3), 680-688 (2005).
- Martinoia, S., et al. Towards an embodied in vitro electrophysiology: the NeuroBIT project. Neurocomputing. 58-60, 1065-1072 (2004).
- Mussa-Ivaldi, F. A., et al. New perspectives on the dialogue between brains and machines. Frontiers in Neuroscience. 4 (1), 44 (2010).
- Warwick, K., et al. Controlling a Mobile Robot with a Biological Brain. Defence Science Journal. 60 (1), (2010).
- Kudoh, S. N., et al. Vitroid–the robot system with an interface between a living neuronal network and outer world. International Journal of Mechatronics and Manufacturing Systems. 4 (2), 135-149 (2011).
- Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons. Biophysical Journal. 76 (2), 670-678 (1999).
- Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. Network plasticity in cortical assemblies. European Journal of Neuroscience. 28 (1), 221-237 (2008).
- Mulas, M., Massobrio, P., Martinoia, S., Chiappalone, M. A simulated neuro-robotic environment for bi-directional closed-loop experiments. Paladyn. 1 (3), 179-186 (2010).
- Novellino, A., et al. Connecting neurons to a mobile robot: an in vitro bidirectional neural interface. Computational Intelligence and Neuroscience. 2007 (12725), 1-13 (2007).
- Bologna, L. L., et al. Investigating neuronal activity by SPYCODE multichannel data analyzer. Neural Networks. 23 (6), 685-697 (2010).
- Frega, M., et al. Cortical cultures coupled to micro-electrode arrays: a novel approach to perform in vitro excitotoxicity testing. Neurotoxicology and Teratology. 34 (1), 116-127 (2012).
- Quian Quiroga, R., Panzeri, S. Extracting information from neuronal populations: information theory and decoding approaches. Nature Reviews Neuroscience. 10 (3), 173-185 (2009).
- Donoho, D. L., Johnstone, J. M. Ideal spatial adaptation by wavelet shrinkage. Biometrika. 81 (3), 425-455 (1994).
- Martinez, J., Pedreira, C., Ison, M. J., Quian Quiroga, R. Realistic simulation of extracellular recordings. Journal of neuroscience methods. 184 (2), 285-293 (2009).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. Effective parameters for stimulation of dissociated cultures using multi-electrode arrays. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 27-37 (2004).
- Tessadori, J., Mulas, M., Martinoia, S., Chiappalone, M. Biomedical Robotics and Biomechatronics (BioRob), 2012 4th IEEE RAS & EMBS International Conference on. , 332-337 (2012).
- Tessadori, J., Bisio, M., Martinoia, S., Chiappalone, M. Modular neuronal assemblies embodied in a closed-loop environment: toward future integration of brains and machines. Frontiers in Neural Circuits. 6, (2012).
- Neural Engineering (NER). Tessadori, J., et al. 2013 6th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 899-902 (2013).
- Colombi, I., Mahajani, S., Frega, M., Gasparini, L., Chiappalone, M. Effects of antiepileptic drugs on hippocampal neurons coupled to micro-electrode arrays. Frontiers in Neuroengineering. 6, 10 (2013).
- Gal, A., Marom, S. Entrainment of the intrinsic dynamics of single isolated neurons by natural-like input. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7912-7918 (2013).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of neuroscience methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- DeMarse, T. B., Wagenaar, D. A., Blau, A. W., Potter, S. M. The neurally controlled animat: biological brains acting with simulated bodies. Autonomous Robots. 11 (3), 305-310 (1023).
- Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task. Journal of Neural Engineering. 5 (3), 310-323 (2008).
- Truccolo, W., Hochberg, L. R., Donoghue, J. P. Collective dynamics in huma and monkey sensorimotor cortex: predicting single neuron spikes. Nature Neuroscience. 13 (1), 105-111 (2010).
