Introduction
Många funktioner i hjärnans funktion är för närvarande omöjligt att replikera i ett artificiellt system. Hjärnans förmåga att snabbt bearbeta komplexa sensorisk information och för att generera, som svar är exakta motorkommandon i sig redan utöver den nuvarande toppmodern. Men dess förmåga att anpassa sig till olika förhållanden genom att lära av tidigare erfarenheter gör det så mycket bättre än styrsystem människan utvecklas. Hittills försöker replikera eller utnyttja denna plasticitet har träffat lite framgång, och förståelsen av det inre arbetet i hjärnan har gäckat grepp om forskare. En av de viktigaste frågorna samtidigt undersöka sambandet mellan hjärnan och beteende är oförmågan att korrekt åt alla variablerna i systemet: Helst skulle en optimal experimentuppställning tillåter samtidig inspelning och stimulans till ett stort antal nervceller, långsiktig stabilitet , övervakning av synapser positioner och vikter och kontrollerbar bi-directional interaktion med miljön. Svårigheten att spåra alla dessa variabler samtidigt ledde till studiet av hjärnan-beteendet relation på två mycket olika skalor: antingen med beter djur, utan exakt kontroll över experimentella betingelser 1-7 eller med små, isolerade delar, såsom delar av neuronal vävnad, utan helhetssyn på systemet 8. I det senare fallet, medan ingen utarbetat experimentuppställning tillåter fullständig övervakning av alla parametrar som är involverade i arbetet i och med en enkel neurala nätverk, är en bra kompromiss som tillhandahålls av dissocierade nervceller odlas över Micro-Elektrod Arrays (MEA) 9. Dessa enheter, född i slutet av 70-talet 10, har flera fördelar jämfört med traditionella elektrofysiologiska tekniker: för det första, möjligheten att spela in och stimulera ett neuralt nätverk på många olika platser på en gång (vanligtvis 60 elektroder). Dessutom är nästan icke-invasiv kopplingen av MEA med celler, Vilket möjliggör observation av samma nätverk under långa tidsperioder, upp till flera månader 11. De fysiologiska effekterna av elektrisk stimulering på dissocierade kulturer har studerats utför tack vare dessa enheter, avslöjar att många fastigheter observerats vid högre skalor (såsom exempelvis plasticitet och enkelt minne processer 12-14) är konserverade trots förlusten av arkitekturen. Under kulturtillväxt, dessa nät börjar visa spontan aktivitet vid ca 7 dagar in vitro (DIV) 15,16. Nätverksaktivitet tenderar att förändras radikalt med ytterligare tillväxt; först som enstaka spikar samlar in skurar (mot slutet av den andra veckan) 17, senare som den ändras till en mycket komplext mönster av synkroniserad, icke-periodisk nätverk skurar 18, som representerar den mogna tillståndet i ett nätverk. Det har föreslagits 19 att denna synkrona beteende, något liknande den som observerats i in vivo rekordningar på sovande djur, orsakas av brist på sinnesintryck.
En annan strategi försökt att få en bättre förståelse för informationskodning har tagits genom att utföra slutna kretslopp experiment, där olika typer av signaler användes för att styra stimulering av neuronala nätverket självt 11,20-23. I dessa experiment har ett externt medel med förmåga att interaktion med miljön använts för att generera sensorisk information matas till det neurala nätet, vilket i sin tur produceras motorkommandon för en effektor mekanism. Detta tillät observationer av hur dynamiska och adaptiva egenskaper av neurala system utvecklats som svar på inducerade förändringar i miljön.
En installations att utföra "förkroppsligade neurofysiologi" experiment utvecklades, där en hjulförsedd sensorplattform (en fysisk robot eller dess virtuell modell) rör sig omkring i en arena och dess hastighetsprofiler bestäms av aktiviteten hos en neuronalsystemet (dvs, en population av rått nervceller odlas över en MEA). Roboten kännetecknas av de hastighetsprofiler av dess två självständigt styrda hjul och av de strömavläsningar av avståndsgivarna. Den exakta innebörden av avståndssensorer är inte relevant; de kan vara aktiva eller passiva optiska sensorer eller ultraljudssensorer. Uppenbarligen inte denna fråga inte tillämpas i fråga om virtuella robotar, där sensorer kan utformas med någon önskad funktion.
I experimenten som beskrivs häri, är roboten används alltid den virtuella genomförande, med sex avståndssensorer som pekar på 30 °, 60 ° och 90 ° från roboten rubrik i båda riktningarna. Aktiviteten av de tre vänstra och högra sensorerna genomsnitt och aktiviteten av den biologiska kulturen drivs av den information som samlas in av sådana "supersensorer" (som bara kommer att hänvisas till som "vänster" och "höger" sensorer i resten av detta arbete). Protocol beskrivits kan faktiskt appliceras på den fysiska roboten med ganska mindre justeringar. Den information som samlas in av roboten (antingen fysiska eller virtuella) kodas i en serie av stimuli som används för att manipulera aktiviteten hos den biologiska neurala nätverk, som är fysiskt åtskilda av roboten. De stimuli själva är alla identiska och därför inte koda någon information. Vad som är relevant är deras frekvens: stimulering höjningar när roboten närmar sig ett hinder, med olika leveransställen kodning sensorisk information från vänster och höger ögon "av roboten. Det neurala nätverket kommer att presentera olika svar på den inkommande tåg av stimuli: uppgiften att avkodningsalgoritmen är att översätta den resultenätverksaktivitet i kommandon som används för att styra hjulen på roboten. Givet en "perfekt" nätverksbeteende (dvs, med tillförlitlig och helt separerade svar på stimuli från olika elektroder), skulle detta Result i robot körning i sin arena utan att träffa några hinder. De flesta nätverk närvarande ett beteende olika mycket från idea, därför en enkel inlärningsprotokoll införs: när den aktiveras, tetanic stimulering (korta perioder av högfrekvent stimulering, 20 Hz stimulering för 2 sek, inspirerad av protokollen i 24,25) efter en kollision med ett hinder levereras. Om tetanic stimulering resulterar i en lokal förstärkning av nätverksanslutning, kommer detta att resultera i en progressiv ökning av navigeringsfunktionerna i roboten.
HyBrainWare2, en förbättrad version av den anpassade programvara publiceras i 26, är kärnan arkitekturen utvecklas för att hantera styrning av de olika anordningarna i systemet (stimulatorn, datainsamling, bearbetning och visualisering, robot kommunikation eller simulering). Denna programvara har utvecklats på vårt labb och är fritt tillgänglig på förfrågan. Denna programvara ger gränssnittet meddatainsamlingskortet: när användaren startar datainsamling från GUI, styr programmet förvärvs styrelsen att starta provtagning och A / D-omvandling av data som kommer från inspelningselektroder. Dessa data kan sedan spelas in, visas till skärm eller analyseras i realtid för att upptäcka spikar, enligt vad som angivits av användaren (se Tillvägagångssätt avsnitt för detaljer). Vidare i mjukvaran, definitionen av kodning (översättning av sensorisk information till en elektrisk stimulering) och avkodning (översättning av inspelad aktivitet i motorkommandon för roboten) algoritmer måste specificeras. I synnerhet är vår inställning ganska lättanvänd jämfört med liknande system som utformats i det förflutna 27, eftersom nästan alla variabler kan nås av användaren rätt innan själva experimentet, medan all inspelad information sparas automatiskt i ett format som är kompatibelt med ett neuralt dataanalys verktygslåda 28.
Följande procedur avsnitt beskriver en inlärningsexperiment på dissocierade rått hippocampus kulturer: all odling och experimentella parametrar finns för just denna förberedelser och kan behöva ändras om en annan biologisk substrat ska användas. Likaså tar det beskrivna experimentet fördel av den som sluten slinga arkitektur för att undersöka inlärningseffekten av tetanisk stimulering, men arkitekturen i sig är tillräckligt flexibelt för att användas i studien av olika funktioner i dissocierade neurala nätverk. Större varianter av den föreslagna experimentet förklaras ytterligare i diskussionsavsnittet.
Protocol
1. Beredning av Neuronala Kultur över en MEA
- Plate neuronala kulturer på MEA chips, som beskrivs 29. Beskrivningen av ett liknande förfarande tillhandahålls också 9 och i diskussionsavsnittet.
- Vrid MEA värmesystem på 5-10 min före start av inspelningen för att minimera den termiska påkänningen som upplevs av cellerna: set målet för temperaturregulatorn temperaturen till 37 ° C och slå på värmeplattan under MEA själv (tillhandahålls i de flesta kommersiella MEA ring) och, om möjligt, en uppvärmd lock för att kraftigt minska avdunstningen.
- Sterilisera gaspermeabla lock före varje användning i en autoklav med fuktig värme (30 min, 130 ° C). För att undvika avdunstning och förhindra förändringar i osmolaritet, hålla kulturerna täckta med lock under inspelning.
- Placera neuronala kultur i förstärkaren 30 min innan faktiskt börjar inspelningen.
OBS: Enkelt flytta kulturerna från incubator till förstärkaren kommer att avsevärt störa spontan aktivitet för ungefär en halvtimme. Under denna tid kommer odlingsmedium temperaturen stabiliseras. - Om en carbair krets finns tillgänglig, börja cirkulation av carbair (en blandning av 5% CO2 och 95% O2 + N2) för experiment längre än ett par timmar: kulturer kommer att kräva det i syfte att bibehålla både syre och pH-nivåer stabil.
2. Val av inspelningsparametrarna för MEA Förvärv
- Välj programvara filterbandbredd för att upptäcka spikar (dvs Multi-Unit Aktivitet - MUA) 30: i RawDataDisplay formuläret markera "300 Hz-3 kHz" kryssrutan.
- Starta förvärvet av data: Tryck på "Start" knappen i RawDataDisplay formuläret.
- Ställ Threshold Gain för spik detektering i RawDataDisplay till 7.
OBS: Beroende på den önskade specificiteten / selektivitet avvägning och den antagna upptäckajon algoritm, kan denna tröskel ställas in mellan 6 och 10 gånger den beräknade standardavvikelse. - Ställ Tröskel Minne till 2 sek och tryck på "Lock" knappen när ingen tillsatta aktiviteten syns i displayen (båda kommandon är i RawDataDisplay form). Markera "Uppskatta SD från median 'för att beräkna buller standardavvikelse från medianen av det absoluta värdet av den observerade signalen 31,32, om det är svårt att ge ännu korta tidsfönster utan tillsatta aktivitet. Ta bort bocken från detta alternativ när du trycker på "Lock" knappen, som den underliggande algoritmen är beräkningsintensiv och kan orsaka datorn att släpa.
- Slå på spik upptäckt rutin ("Spike Detection" kryssrutan i RawDataDisplay form). Om spik upptäckt redan körs (dvs, är kryssrutan redan märkt), kassera spikar upptäckts fram till detta ögonblick genom att klicka på "Reset" -knappen i Dataregistrering formuläret.
3. Val av MEA Elektroder att Stimulera Neuronala Kultur och reaktion Karta Beräkning
- Record spontan aktivitet neuronala celler odlas över MEA 30 min: spara data till fil genom att klicka på "Record" -knappen, i "Spikes" låda av DataRecording formen, efter önskad tid har förflutit (30 min, i det här fallet).
- Identifiera de 10 mest aktiva kanaler (dvs 10 kanaler med högsta spik räknas), välj sedan de kanaler i någon av MEA layouter (antingen i Coding, avkodning eller anslutning Kart former) genom att dra muspekaren över de önskade områdena. När kanalerna är valda, högerklicka någonstans på MEA layout och välj "Lägg till vänster sensorisk område" i popupmenyn: dessa elektroder kommer att användas för att leverera elektrisk stimulering i steg 3.5.
- Kontrollera att stimulatorn och MEA förstärkare är korrekt ansluten: alla konfigurationer require två trådar per önskad stimulering kanal, medan en extra koaxialkabel kommer att krävas för att bära synkroni signalen (se handböckerna för de särskilda områden instrumenten för anslutningsdiagram). Fortsätt sedan att slå på stimulatorn på.
- Definiera stimulans parametrar i anslutning Kart formuläret. Samtliga stimuli levereras till kulturen är bifasisk kvadrat spänningsvågor. Ställ halv längd till 300 ^ sek och amplitud till 1,5 V pp 33.
OBS: Stimuli tillräckligt stor för att på ett tillförlitligt sätt framkalla neurala svar kommer mycket troligt kompromiss inspelningen av aktivitet från samma platser. I resten av papperet, bör elektroder som används för stimulering leverans inte väljas för inspelning all relevant information. - Record svar på stimulering: Tryck på Start-knappen i ConnectionMap formuläret. En serie av 30 stimuli, med ett intervall på 5 sek är, i sin tur, automatiskt levereras från var och en av de utvalda elektroderna, medan svaren är rekorded från de återstående 59 elektroder.
- Beräkna en anslutning karta (dvs sannolikheten att observera ett svar från en elektrod i en tidslucka efter leverans av stimulans från en annan elektrod) för varje stimulerande kanal genom någon matte programvara eller SpyCode, ett program som utvecklats i det förflutna (och fritt tillgänglig på begäran) för att utföra beräkningar på neurala uppgifter 28.
- Från anslutnings kartorna väljer bästa elektroder: kasta alla stimulerande elektroder som inte väcker reaktioner (dvs. tidsfönstret efter stimulering, bränning priser är inte signifikant högre än under spontan bränning).
- Välj bland de återstående elektrod, paret med minsta overleap i svaren. Specifikt för varje stimulerande elektrod, beräkna den genomsnittliga spik räknas i varje inspelnings elektrod, sedan beräkna skillnaden mellan motsvarande elektroder för alla stimulerande elektroder par. Välj par för which summan av absolutvärdena av svarsskillnader över alla inspelningskanaler är störst.
- Välj ett av dessa elektroder att koda sensorisk information från den vänstra sidan av roboten och den andra för att koda avläsningar från rätsidan: För att göra detta, dra muspekaren över en elektrod, högerklicka på MEA layouten och välj sedan "Lägg till vänster sensorisk området" (eller "Lägg till höger sensorisk området").
4. Gränssnitt för Neuronala Kultur med robot: Val av kodning och avkodning Schemes
- Ställ "Coding Skriv 'i Coding formuläret till Linear.
- Definiera lägsta och högsta stimuleringstalen i Coding formuläret. Använd standard intervallet 0,5-2 Hz.
- Ställ "Jitter" parameter i Coding formuläret till 0.
- Ställ avkodningsalgoritmen parametrar i avkodning Form (vikt och extinktionskoefficient) till 1, för en måttligt aktiv kultur (~ 1 spik / sek per kanaliEL). Definiera en ny parameter par om bränning priser starkt och ständigt avvika från detta värde. Se diskussionen för exakt funktion avkodningsparametrar.
- Ställ avkodningsalgoritmen brast parametrar i avkodning Form. Ställ vikten till 0 (efterklangstid är då irrelevant), om inte skillnaden mellan spikar och skurar är föremål för studien.
OBS: Värdena som föreslås i steg 4.4 kommer att producera jämna robotrörelser och hastigheter som är kompatibla med robotreaktionstider för måttligt aktiva råtta primära kulturer. Sprängnings parametrar har exakt samma funktion som de som beskrivits i steg 4.4, men den utlösande händelsen är detekteringen av en skur i stället för en spik: den faktiska hastigheten av varje hjul är helt enkelt summan av bidragen från detekterade spikar och skurar.
5. Design av Navigation Arena för Robot
- I Virtual Arena formuläret designer, välja mellan avgränsas (gränserna för arenan är synliga för roboten och jagmpassable) eller gränslös (om roboten utgångar från ena sidan av arenan, det kommer omedelbart återinträda från motsatta) arenan och ställa arenastorlek i pixlar.
- Använd inte avgränsas arenor mindre än 100 x 100 pixlar, i syfte att möjliggöra betydande rörelse. Använd inte hinder med en radie mindre än 5 pixlar som de helt enkelt kan falla mellan siktlinjer av roboten.
- Tänk på att mycket stora arenastorlekar kan orsaka datorns prestanda att brytas ned: om en stor arena krävs, testa programvara prestanda med den önskade arenan innan svår upprepade experiment.
- Ställ robot startposition antingen manuellt (klicka på "Manual Selection" knappen i Virtual Arena Designer formuläret, sedan önskad plats) eller genom att ange koordinaterna för roboten vid experimentet starta i "Robot Utgångsläge åkrar.
- Lägg valfritt antal oframkomliga hinder inom arenan. Antingen placera dem mansivt i arenan efter att ha klickat på "Lägg Hinder manuellt" -knappen eller ställ antal och storlek intervall.
- Klicka på "Generera Arena 'knappen för att generera arenan med de valda funktionerna. Inga förändringar kommer att ske förrän knappen trycks.
- Spara utformade arenan och ladda relativa filen, före användning i ett experiment, med kommandoknapparna i nedre delen av Virtual Arena formuläret Designer.
6. Val av MEA Elektroder till Record neuronal aktivitet från Kultur
- Välj som tillfälliga registreringselektrod de på vilka olika svar, i steg 3.8, har observerats: elektroder som visade större svar efter stimulering från "vänster" (eller "rätt") elektrod kommer att utgöra den "vänster" (eller "rätt") registreringselektrod. Använd inte elektroder som inte visat signifikanta svar till antingen stimulerande elektrod för att styra roboten. From MEA layout popupmenyn, välj "Lägg till vänster motorområdet" (eller "Lägg till höger motorområdet") för att definiera inspelningselektroder.
- Välj funktioner för att spela in i Experiment chef formuläret. I detta skede, spikar och stimuleringstidsstämplar är den enda relevanta informationen.
- Utför en 10 min provkörning: starta roboten drivs genom att klicka på Start-knappen Experiment i Experiment chef formuläret, klicka på den igen efter 10 minuter har gått.
OBS: När alla parametrar har ställts in (kodning och avkodning, robot arena, stimulerande och inspelning elektroder, funktioner för att spela in), kommer ett filnamn urval be om inspelade filer namn och destination, då roboten kommer att börja röra sig i sin arena, efter de fastställda reglerna. Alla de valda funktionerna sparas automatiskt i realtid. - Upprepa steg 3,6 och 6,1 på data som förvärvats i steg 6.3, i syfte att välja inspelningselektroder från data som samlats in under en verklig robot körning (se Discussion för den logiska grunden för detta tillvägagångssätt i två steg).
7. Utföra en Neuro-robot Experiment
- Välj i Experiment Chef bildar de uppgifter som ska registreras: markera Spike, Robot och Stimuli Datakryssrutorna.
- Starta en pre-lärande robot kör: klicka på "Starta Experiment" -knappen i Experiment chef formuläret. Välj nya filnamn för datafiler vid uppmaning. När 30 minuter har gått, klicka på "Starta Experiment" knappen igen för att stoppa roboten kör.
- Slå på lärande protokollet (markera "Deliver tetanic Stimulering Efter Hit" kryssrutan i Experiment chef form) och utför träningsrobotkörning, av samma längd som pre-träningsfasen (dvs, 30 min). Kom ihåg att mata in olika filnamn när du uppmanas att undvika att skriva över data från steg 7.2.
- Stäng av lärande protokollet igen (avmarkera "Deliver tetanic Stimulering Efter Hit 'kryssrutan) Och utför efter lärande robotkörning. Än en gång, kom ihåg att ändra filnamn för att förhindra överskrivning.
8. Andra Response Karta Beräkning
- Upprepa steg 3,1-3,6. Använd data från dessa inspelningar för att testa om några ändringar har inducerats antingen i de spontana eller framkallade aktivitetsmönster med inlärnings protokollet.
Representative Results
Den utvecklade experimentella ram tillät testning av huruvida ett utbyte av information mellan en kultur av nervceller och det virtuella förverkligandet av en fysisk robot är möjlig 34. Figur 1 visar flera prover av erhållna vägar rest med en virtuell robot i 20 min experiment i olika förhållanden : från vänster till höger en ordentlig sluten slinga experiment ett "tomt MEA" robotexperiment (inga celler är pläterade på MEA för denna kontrollexperiment) och en öppen slinga robotexperiment (stimulering hastigheten är konstant i stället för kodning sensorinformation) är representerade. De representativa spår bekräftar att en dubbelriktad växelverkan mellan de neuronala och artificiella element som är nödvändigt för att uppnå goda prestanda för navigering av roboten. Ändå roboten upplever flera hits mot hindren.
I figur 2, navigationsprestanda av roboten, expressed som pixlar reste mellan efterföljande hits, visas i olika förhållanden. De två första kolumnerna visar fördelningen av avstånden rest i kontrollexperiment som nämns ovan ("tomma MEA" och öppen slinga konfigurationer), medan den tredje och fjärde kolumnerna visar prestandan utan och med respektive leverans av tetanisk stimulering efter varje slå mot ett hinder. Införandet av tetanic stimulering (Jfr ordningen, punkt 7.2) förbättrar avsevärt den sträcka mellan två på varandra följande träffar, vilket förbättrar prestanda för navigering av roboten 35.
I figur 3, är navigeringsprestanda av en robot med olika avkodningsförhållanden presenteras. För detta ändamål har en annan arena konfiguration antagits. Detta bidrog till att kvantifiera framgångsrik navigering av roboten inom arenan 36: såsom beskrivs i steg 4.1 i förfarandet, är robotenpresenterade en serie korta spår. Framgången är helt enkelt förhållandet mellan antalet framgångsrikt korsade spår över antalet presenterade spår. I synnerhet, under experimenten en realtidsidentifiering av brast och isolerade spikar utfördes. Avkodnings paradigm skiljer sig från varandra på grund av de relativa vikter av skurar och isolerade spikar (Jfr ordningen punkterna 3,5-3,6 och diskussion).
Figur 1: En neuronala nätverk och en robot har en dubbelriktad informationsutbyte Denna figur visar tre representativa vägar rest med roboten under 20 minuter av experimentet.. Speciellt ljusgröna områden är gratis för roboten att röra sig i, medan mörkgröna pixlar representerar oframkomliga hinder att roboten kan uppfatta genom sina avståndssensorer. I varje försök, startar roboten in den övre vänstra delen av arenan och reser till sin slutliga ståndpunkt, avbildad som en stor rosa prick. De mindre svarta prickarna representerar träffar mot ett hinder, medan den färgkodade banan ger en indikation på tidsutvecklingen för robotrörelse. Färgen fältet till höger uttrycker tid som förflutit från början av experimentet i minuter. (A) Path följt under ett slutet kretslopp experiment. (B) Path följt under ett "tomt" MEA experiment (inga celler odlas på MEA yta). (C) Path följt under en öppen slinga experiment (stimulering hastigheten är konstant under hela experimentet). Klicka här för att se en större version av bilden.
Figur 2: Prestanda resultat påverkas av sluten-loop och tetanic stimulering. Denna graf rapporterar distributioner av avstånden som omfattas av roboten mellan efterföljande hits i olika förhållanden. I synnerhet de två första distributioner representerar kontrollexperiment ("Empty" för inspelningar utan nervceller pläterade på MEA, "Open loop" (OL) för experiment med ett "blint" robot). De två sista kolumnerna representerar "Closed loop" skick utan (CL) och med (CL + TS) inlärningsprotokoll förs genom tetanisk Stimulation (TS), som levereras till kulturen efter hits mot ett hinder. I varje ruta representerar den horisontella mittsegmentet medianen av fördelningen, tom ruta medelvärdet, sträcker den centrala baren till den första och tredje kvartilen och morrhår sträcker sig till 5: e och 95: e percentilen. Extremvärden representeras som diamanter. Statistik har utförts med användning av Kruskall-Wallis envägsanalys av varianspå leden: parvisa jämförelsen Student-Newman-Keuls avslöjar att alla medianvärden skiljer sig avsevärt med p <0,05.
Figur 3: Avkodning påverkar robot prestanda Grafen ovan visar sannolikheten för en given avkodningsalgoritm, för roboten att navigera framgångsrikt genom ett kort spår i en begränsad tid.. Identifiering av skurar och isolerade spikar utförs i realtid under experimentet själv. I det första fallet ("Spikes") alla upptäckta spikar presentera samma relativa vikt, för det andra och tredje distributioner en vikt på 0 var fastställts för respektive, isolerade spikar och spikar som tillhör en explosion. De två sista kolumnerna representerar de resultat som uppnåtts i det fall där alla spikar redovisas, men med en annan relativa vikt beroende på deras position.Särskilt i den fjärde kolumnen isolerade spikar gavs högre relativ vikt än brast händelser, medan viktningen är inverterad för avkodning i förhållande till den femte kolumnen uppgifter. I varje kurva, den centrala linjen representerar medianen av fördelningen, tom ruta medelvärdet, medan den centrala baren sträcker sig till den första och tredje kvartilen och morrhår sträcker sig till 5: e och 95: e percentilen. Statistik har utförts med användning av Kruskall-Wallis envägsanalys av varians på leden. Den parvisa jämförelsen (Student-Newman-Keuls metod) avslöjar att signifikanta skillnader (p <0,05) kan observeras mellan kolumnerna 1 och 4, 2 och 4, 2 och 5, 2 och 3.
Discussion
I detta papper en neurorobot arkitektur baserad på en neural styrenhet (dvs, ett nätverk av nervceller som kommer från cortex eller hippocampus av embryonala råttor), dubbelriktat ansluten till en virtuell robot, presenteras. Roboten, som har sensorer och hjul, tvingas att röra sig i ett statiskt arena med hinder och dess uppgift består i att undvika kollisioner.
Den första och kanske mest kritiska aspekten av det beskrivna förfarandet är framställningen av kulturerna själva, eftersom felfrekvensen tenderar att vara betydande även i de bästa av de tekniska villkoren. En detaljerad beskrivning av odling tekniker är dock utanför ramen för detta arbete. Som en allmän riktlinje bör inspelningar inträffa när nätverket eldhastighet når en stabil nivå, vanligtvis efter 3 veckor in vitro. En grov uppskattning av friska kulturer är förekomsten av spontan elektrofysiologiska aktivitet i flera inspelnings kanaliels (minst 20 kanaler över 60 tillgängliga). Sådana kulturer kännetecknas av en hög grad av neuronal inbördes förbindelserna. Under sådana förhållanden, oftast neural aktivitet blir starkt synkroniserad och ibland visar den epileptiforma händelser, med intensiv tillsatta följt av minuter långa tysta perioder 37. Båda dessa funktioner utgör ett problem: driven synkronisering kommer att göra det omöjligt att skilja på reaktioner på stimuli från olika elektroder, medan kulturer uppvisar epileptiform aktivitet kommer att svara på den första stimulus presenteras med en lång utbrott av aktivitet, följt av en tyst period, oavsett någon efterföljande stimuli levereras. Båda dessa frågor kan starkt förbättras genom anställning av mönstrade kulturer 35, i vilken det neurala befolkningen är uppdelad i två eller flera svagt sammankopplade undergrupper.
En annan fråga är att neurala svar starkt beroende utdelning av inkommande StimulI 38,39. I en sluten slinga experimentet, är det levererade stimulering en funktion av sensoravläsningar, vilka i sin tur är en följd av robotens rörelse och därmed av de neurala svaren själva. Detta innebär att det inte finns något enkelt sätt att fastställa på förhand vad svaren kommer att observeras under själva försöket. Som ett resultat, måste valet av input-output elektroder lita på varandra följande approximationer. I det beskrivna protokollet, ett två-stegsförfarande (nämligen stegen 5,5 och 6,4) är implementerad för att försöka bestämma en anslutning karta. I det första steget, är en vanlig sekvens av stimuli levereras och svar på sådana stimuli används för att härleda en första anslutning karta och en tillfällig uppsättning inspelningskanaler. Denna konfiguration används sedan för att utföra provkörning beskrivs i steg 6.4 och väljer inspelningskanaler som kommer att övervakas under själva försöket.
I avsnittet Resultat, ett representativt navigerings result och omedelbara förbättringar som orsakats av införandet av ett lärande paradigm presenteras. Under hela protokollbeskrivningen, finns flera andra möjliga experimentella varianter nämns. Till exempel, för att de två stora kodningssystem som genomförts i HyBrainWare2 (linjära och stokastiska) där utvecklade utreda exakt vilken roll tidsingångs variabilitet på neurala kod 38. I det linjära fallet, är ögonblicklig stimulering hastighet en funktion av användardefinierade parametrar och robot sensorer inspelningar. I den stokastiska fallet har varje gång exempelvis en viss sannolikhet för att bli vald att leverera en stimulans. Sådan sannolikhet automatiskt beräknas av HyBrainWare2 så att de förväntade stimulerings priser matchar det förra fallet. Möjligheten att lägga jitter till linjär kodning ger en mjuk övergång mellan de två fallen som beskrivs ovan. På samma sätt, kan utforska olika kombinationer av parametrar i avkodningssektionen hjälpa belysa precise roll för sprängning i in vitro neuronnät. Hastigheten på varje hjul av roboten ökar proportionellt mot vikten parametern varje gång en händelse detekteras i motsvarande utgång området, medan utsläckningskoefficient anger hur mycket tid, i sekunder, en av de bidrag som krävs för att förlora 50% av sitt värde . Förfallet är en enkel exponentiell. Dessa varianter har redan beaktats i den nuvarande utformningen av HyBrainWare2, men många fler forskningsmöjligheter är öppna om ytterligare ändringar i programvara eller experimentuppställning kan införas.
En ganska betydande begränsning av protokollet här beskrivna är kravet på den utvecklade anpassade program, HyBrainWare2 (fritt tillgänglig på begäran till alla intresserade användare). Denna programvara har utformats för ett antal enheter (stimulator, förvärv ombord, MEA förstärkare) av en viss modell och tillverkare. Även om det faktiskt är möjligt att anpassa den för att arbeta på different uppställningar, kommer omvandlingen ta lite programmering skicklighet. Likaså de ingående alternativen täcker endast en begränsad uppsättning av alla de experimentella frågor som kunde undersökas genom en sådan inställning. Till exempel är det spik detektionsalgoritmen implementeras i den presenterade arkitektur (exakt tid spik upptäckt 40) helt definieras av flera hårdkodade parametrar som behöver ändras om föremål för registrering är väldigt annorlunda från dissocierade neurala nätverk (t.ex. hjärtceller eller skivor). Slutligen inlärnings protokollet består av leverans av en kort, högfrekvent (2 sek på 20 Hz stimulering, är varje stimulus puls samma som de som används för att koda sensorisk information) stimulering efter varje hinder träff. Om roboten stöter emot ett hinder med sin högra sida, är det tetanic stimulans levereras till elektroden som vanligtvis koder för höger sidoinformation och detsamma gäller för vänster sida träffar. Detta protokoll är hårdkodad och kan inte be ändras av användaren utan att ändra spännande program.
Medan installationen presenteras här är inte första förkroppsligade system för hybrid, slutna kretslopp experiment 20,23,27,41,42, var de som utformade tidigare fokuserat på en enda avhandling som stöds av data från ett begränsat antal analoga preparat . Å andra sidan har den beskrivna installations använts för ett stort antal experiment (mer än 100 kulturer har registrerats sedan 2012) med preparat som skiljer för modularitet och ursprung, medan experimenten själva adresserade olika frågor (t.ex. effekterna av tetanisk stimulans och relevans för sprängning, som presenteras i resultatet). Inom en snar framtid, är nya experimentella sessioner planeras att verifiera de bestående effekterna av både tetanic och kretslopps stimulering och förhållandet mellan stimulans regelbundenhet och observerade svar. En annan fråga som skall behandlas är länken mellan spontan och observerad aktivitet, medidén om att lägga en ny avkodningsalgoritm som tar hänsyn till historien om tidigare aktivitet och stimulering 43.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Ph.D. elev Marta Bisio för odling och underhålla neuronala nätverk över Mikroelektrod arrayer och Dr Marina Nanni och Dr Claudia Chiabrera från NBT-IIT för tekniskt bistånd för dissekering och dissociation förfaranden. Den forskning som leder till dessa resultat har erhållit finansiering från EU: s sjunde ramprogram (IKT-FET FP7 / 2007-2013, FET Young Explorers system) under bidragsavtal n ° 284.772 BRAIN BOW ( www.brainbowproject.eu ). Författarna vill också tacka Silvia Chiappalone för hennes hjälp i att producera de bilder som används i inledningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulus Generator 4002 | Multi Channel Systems | ||
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| NI 6255 Acquisition Card | National Instruments | ||
| Microsoft Visual Studio 2008 | Microsoft | ||
| 2078P Multichannel System-National Instruments adapter board | Developed at University of Genova (Italy) | ||
| Matlab 2010 | Mathworks | ||
| HyBrainWare2 | HyBrainWare2: Contact Information |
References
- Fetz, E. E. Volitional control of neural activity: implications for brain–computer interfaces. The Journal of Physiology. 579 (3), 571-579 (2007).
- Carmena, J. M., et al. Learning to control a brain–machine interface for reaching and grasping by primates. PLoS Biology. 1 (2), e42 (2003).
- Azin, M., Guggenmos, D. J., Barbay, S., Nudo, R. J., Mohseni, P. A miniaturized system for spike-triggered intracortical microstimulation in an ambulatory rat. Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 58 (9), 2589-2597 (2011).
- Angotzi, G. N., Boi, F., Zordan, S., Bonfanti, A., Vato, A. A programmable closed-loop recording and stimulating wireless system for behaving small laboratory animals. Scientific Reports. 4, (2014).
- Maher, M., Pine, J., Wright, J., Tai, Y. -C. The neurochip: a new multielectrode device for stimulating and recording from cultured neurons. Journal of Neuroscience. 87 (1), 45-56 (1999).
- Olsson, R. H., Buhl, D. L., Sirota, A. M., Buzsaki, G., Wise, K. D. Band-tunable and multiplexed integrated circuits for simultaneous recording and stimulation with microelectrode arrays. Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 52 (7), 1303-1311 (2005).
- Zanos, S., Richardson, A. G., Shupe, L., Miles, F. P., Fetz, E. E. The Neurochip-2: an autonomous head-fixed computer for recording and stimulating in freely behaving monkeys. Neural Systems and Rehabilitation Engineering. IEEE Transactions on. 19 (4), 427-435 (2011).
- Reger, B. D., Fleming, K. M., Sanguineti, V., Alford, S., Mussa-Ivaldi, F. A. Connecting brains to robots: an artificial body for studying the computational properties of neural tissues. Artificial Life. 6 (4), 307-324 (2000).
- Hales, C. M., Roston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 2056 (2010).
- Gross, G., Rieske, E., Kreutzberg, G., Meyer, A. A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro. Neurosci Lett. 6 (2), 101-105 (1977).
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1), 17-24 (2001).
- le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons. PLoS One. 5 (1), e8871 (2010).
- Marom, S., Shahaf, G. Development learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy. Quarterly reviews of biophysics. 35 (1), 63-87 (2002).
- Shahaf, G., Marom, S. Learning in networks of cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 21 (22), 8782-8788 (2001).
- Pelt, J., Vajda, I., Wolters, P. S., Corner, M. A., Ramakers, G. J. Dynamics and plasticity in developing neuronal networks in vitro. Progress in Brain Research. 147, 171-188 (2005).
- Chiappalone, M., Bove, M., Vato, A., Tedesco, M., Martinoia, S. Dissociated cortical networks show spontaneously correlated activity patterns during in vitro development. Brain Research. 1093 (1), 41-53 (2006).
- Tateno, T., Jimbo, Y., Robinson, H. Spatio-temporal cholinergic modulation in cultured networks of rat cortical neurons: spontaneous activity. Neuroscience. 134 (2), 425-437 (2005).
- Masquelier, T., Deco, G. Network bursting dynamics in excitatory cortical neuron cultures results from the combination of different adaptive mechanism. PLoS One. 8 (10), e75824 (2013).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation. The Journal of Neuroscience. 25 (3), 680-688 (2005).
- Martinoia, S., et al. Towards an embodied in vitro electrophysiology: the NeuroBIT project. Neurocomputing. 58-60, 1065-1072 (2004).
- Mussa-Ivaldi, F. A., et al. New perspectives on the dialogue between brains and machines. Frontiers in Neuroscience. 4 (1), 44 (2010).
- Warwick, K., et al. Controlling a Mobile Robot with a Biological Brain. Defence Science Journal. 60 (1), (2010).
- Kudoh, S. N., et al. Vitroid–the robot system with an interface between a living neuronal network and outer world. International Journal of Mechatronics and Manufacturing Systems. 4 (2), 135-149 (2011).
- Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons. Biophysical Journal. 76 (2), 670-678 (1999).
- Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. Network plasticity in cortical assemblies. European Journal of Neuroscience. 28 (1), 221-237 (2008).
- Mulas, M., Massobrio, P., Martinoia, S., Chiappalone, M. A simulated neuro-robotic environment for bi-directional closed-loop experiments. Paladyn. 1 (3), 179-186 (2010).
- Novellino, A., et al. Connecting neurons to a mobile robot: an in vitro bidirectional neural interface. Computational Intelligence and Neuroscience. 2007 (12725), 1-13 (2007).
- Bologna, L. L., et al. Investigating neuronal activity by SPYCODE multichannel data analyzer. Neural Networks. 23 (6), 685-697 (2010).
- Frega, M., et al. Cortical cultures coupled to micro-electrode arrays: a novel approach to perform in vitro excitotoxicity testing. Neurotoxicology and Teratology. 34 (1), 116-127 (2012).
- Quian Quiroga, R., Panzeri, S. Extracting information from neuronal populations: information theory and decoding approaches. Nature Reviews Neuroscience. 10 (3), 173-185 (2009).
- Donoho, D. L., Johnstone, J. M. Ideal spatial adaptation by wavelet shrinkage. Biometrika. 81 (3), 425-455 (1994).
- Martinez, J., Pedreira, C., Ison, M. J., Quian Quiroga, R. Realistic simulation of extracellular recordings. Journal of neuroscience methods. 184 (2), 285-293 (2009).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. Effective parameters for stimulation of dissociated cultures using multi-electrode arrays. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 27-37 (2004).
- Tessadori, J., Mulas, M., Martinoia, S., Chiappalone, M. Biomedical Robotics and Biomechatronics (BioRob), 2012 4th IEEE RAS & EMBS International Conference on. , 332-337 (2012).
- Tessadori, J., Bisio, M., Martinoia, S., Chiappalone, M. Modular neuronal assemblies embodied in a closed-loop environment: toward future integration of brains and machines. Frontiers in Neural Circuits. 6, (2012).
- Neural Engineering (NER). Tessadori, J., et al. 2013 6th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 899-902 (2013).
- Colombi, I., Mahajani, S., Frega, M., Gasparini, L., Chiappalone, M. Effects of antiepileptic drugs on hippocampal neurons coupled to micro-electrode arrays. Frontiers in Neuroengineering. 6, 10 (2013).
- Gal, A., Marom, S. Entrainment of the intrinsic dynamics of single isolated neurons by natural-like input. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7912-7918 (2013).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of neuroscience methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- DeMarse, T. B., Wagenaar, D. A., Blau, A. W., Potter, S. M. The neurally controlled animat: biological brains acting with simulated bodies. Autonomous Robots. 11 (3), 305-310 (1023).
- Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task. Journal of Neural Engineering. 5 (3), 310-323 (2008).
- Truccolo, W., Hochberg, L. R., Donoghue, J. P. Collective dynamics in huma and monkey sensorimotor cortex: predicting single neuron spikes. Nature Neuroscience. 13 (1), 105-111 (2010).
