Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Polyakrylamidgeler for Invadopodia og Trækkraft Analyser på kræftceller

Published: January 4, 2015 doi: 10.3791/52343
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Mekanisk stivhed i tumormikromiljøet spiller en afgørende rolle som drivkraft malign adfærd ved at øge invadopodia aktivitet og actomyosin kontraktilitet. Brug polyacrylamidgeler (cloud) kan invadopodia og trækkraft assays anvendes til at undersøge de invasive og kontraktile egenskaber cancerceller i respons til matrix stivhed.

Abstract

Stive tumorvæv har været stærkt impliceret i regulering af cancer cellemigration og invasion. Invasiv migration gennem tværbundne væv lettes af actin-rige fremspring kaldet invadopodia der proteolytisk nedbryder den ekstracellulære matrix (ECM). Invadopodia aktivitet har vist sig at være afhængig af ECM stivhed og cancercelle kontraktile kræfter tyder på, at stivhed signaler kan regulere disse subcellulære strukturer gennem actomyosin kontraktilitet. Invasive og kontraktile egenskaber kræftceller kan korreleres in vitro ved hjælp invadopodia og trækkraft assays baseret på polyacrylamidgeler (PaaS) af forskellige stivheder. Invasive og kontraktile egenskaber kræftceller kan korreleres in vitro ved hjælp invadopodia og trækkraft assays baseret på polyacrylamidgeler (PaaS) af forskellige stivheder. Mens nogle forskelle mellem de to analyser findes, protokollen præsenteres her er en metode til at skabe PAA'er thpå kan bruges i begge analyser og er let at tilpasse til brugerens specifikke biologiske og tekniske behov.

Introduction

Stivheden af tumor-associerede ECM er blevet identificeret som en væsentlig faktor i at køre malign adfærd ved at øge actomyosin kontraktilitet 1-3. Selv om denne virkning primært er blevet demonstreret med brystcancerceller, er matrix stivhed vist sig at ændre invasive egenskaber af celler afledt fra en række af cancertyper 4-8 tyder på, at tumor stivhed kan spille en rolle i andre typer af cancere. For at trænge tværbundne væv under invasive migration, kræftceller udnytter actin-rige klæbende fremspring kaldet invadopodia der lokaliserer proteinaser til fokalt forringe ECM 9. Invadopodia betragtes kendetegnende for invasive celler og har været impliceret i tumorcelleinvasion og metastase 10,11. Tidligere arbejde har vist, at matrix stivhed kan regulere invadopodia numre og tilhørende ECM nedbrydning 4,12 gennem myosin II-aktivitet og mekanosensitive proteiner 12. I betragtning af denkorrelation mellem tumor tæthed og cancer aggressivitet 13,14, tyder disse resultater på en mekanisme, ved hvilken cancerceller kan reagere på stive tumorvæv at drive invasion og metastase gennem actomyosin kontraktilitet.

In vitro ECM stivhed og in vivo væv densitet er blevet vist at regulere invasive opførsel af cancerceller 1,15-17. Mens actomyosin kontraktilitet synes at være vigtige i denne proces aktuelle undersøgelser konflikt, hvorvidt metastatisk kapacitet er korreleret til øget eller nedsat kontraktile kræfter 6,18-20. Endvidere er det fortsat uvist, om disse kræfter direkte mediere invadopodia aktivitet 21. Vi fandt for nylig, at kræftcellen kontraktile styrker var afhængige af matrix stivhed og var prædiktiv for ECM nedbrydning ved invadopodia 5. Disse resultater tyder på, at cellulære kræfter kan spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft ved at mediere invadopodia activitet som reaktion på de mekaniske egenskaber af tumormikromiljøet.

For at korrelere invasive og kontraktile egenskaber kræftceller 5, vi ændret en protokol til at skabe PAA'er med forskellige stivheder, der tidligere blev brugt til at undersøge stivhed-afhængig invadopodia aktivitet 4,12,22. Ved kemisk tværbinding human plasma fibronectin hele PAA'er kan disse modificerede hydrogeler anvendes som grundlag for både invadopodia og trækkraft assays for at sikre, at celler oplevet de samme stivheder i begge forsøg 5. I invadopodia assays fibronectin giver en naturlig bindingsdomæne for gelatine at knytte overlejret ECM til PAA'er at detektere matrixnedbrydning. I trækkraften assays fibronectin tilvejebringer en ligand for direkte cellulær adhæsion til påvisning mikrosfære forskydninger anvendes til at beregne cellulære trækkræfter. Denne metode resulterer i det, vi har kaldt bløde, hårde,og stive PAA'er, der er bundet til glasbund retter og har elastik moduli, E, på 1.023, 7.307 og 22.692 Pa 5, som spænder over forskellige mekaniske egenskaber rapporteret for normale og ondartede væv 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af dækglas for PAA'er

  1. Clean 12 mm dækglas med lave lint klude.
  2. Flame de 12 mm dækglas og 14 mm dækglas i mikrobrønden af ​​hver 35 mm glasbund fad ved at føre dem gennem en bunsenbrænder flamme med en pincet.
  3. Behandl mikrobrøndene med 200 pi 0,1 N NaOH i 5 minutter ved stuetemperatur.
  4. Aspirer og lufttørre mikrobrøndene i 30 min.
  5. Behandl mikrobrøndene med 50-100 pi 3-aminopropyltrimethoxysilan i 10 minutter ved stuetemperatur i stinkskab. Dette kemikalie reagerer med plast; derfor bruge glas pipetter og ikke fylde mikrobrøndene helt at undgå kontakt med fadet plast.
  6. Vask microwells med ultrarent vand i ca. 10 min indtil 3-aminopropyltrimethoxysilan bliver klar.
  7. Skyl microwells med ultrarent vand to gange ved hjælp af en sprøjteflaske.
  8. Vask mikrobrøndene med 2 ml ultrarent vand omt stuetemperatur på en rocker indstillet til en medium hastighed (~ 1 Hz) i 10 min.
  9. Aspirer og lufttørre mikrobrøndene i 30 min.
  10. Behandl mikrobrøndene med 2 ml 0,5% glutaraldehydopløsning ved stuetemperatur på en rocker indstillet til middel hastighed (~ 1 Hz) i 30 minutter.
  11. Vask mikrobrøndene med 2 ml ultrarent vand ved stuetemperatur på en rocker indstillet til medium hastighed (~ 1 Hz) i 10 minutter. Gentag to gange mere for i alt 30 min.
  12. Tørre mikrobrønde på en stejl vinkel (60 ° eller mere) i 30 minutter.
    Bemærk: Dishes kan opbevares i 2 måneder i en ekssikkator.

2. Fremstilling af PAA'er for Invadopodia assays

  1. For en 1 ml opløsning af den bløde PAA (8% acrylamid og 0,05% BIS), kombinere 200 pi 40% acrylamid, 25 pi 2% BIS, og 574 pi ultrarent vand (tabel 1).
  2. For en 1 ml opløsning af den hårde PAA (8% acrylamid og 0,35% BIS), kombinere 200 pi 40% acrylamid, 175 & #181 l af 2% BIS, og 409 pi ultrarent vand (tabel 1).
  3. For en 1 ml opløsning af den stive PAA (12% acrylamid og 0,60% BIS), kombinere 300 pi 40% acrylamid, 300 pi 2% BIS, og 169 pi ultrarent vand (tabel 1).
  4. Afgasses løsninger for 15 min. Tilføj 200, 215, og 230 pi af 1 mg / ml human plasma fibronectin i ultrarent vand til de bløde, hårde og stive PAA løsninger hhv. For alle opløsninger tilsættes 1 pi 10 mg / ml acrylsyre N-hydroxysuccinimid (NHS) ester, 5 pi af en 100 mg / ml ammoniumpersulfat, og 2 pi N, N, N ', N'-tetramethylethylendiamin (TEMED Tabel 1). Bland med forsigtig pipettering og undgå at skabe bobler i løsninger.

PAA
(1 ml) 		40%
AA
(Pi) 		2%
(Pi) 		Ultrarent
Vand
(Pi) 		1 mg / ml
FN
(Pi) 		10 mg / ml
NHS Ester
(Pi) 		100 mg / ml
APS
(Pi)
TEMED
(Pi) 		Elastik
Modulus
(Pa)
Blød 200 25 574 200 1 5 2 1023
Hård 200 175 409 215 1 5 2 7307
Stiv 300 300 169 230 1 5 2 22.692

Tabel 1: Ingrediens VOLUmes og deraf elasticitetsmoduler til bløde, hårde og stive PAA'er anvendes i invadopodia assays. AA = acrylamid, FN = fibronektin, APS = ammoniumpersulfat.

  1. Pipette 8,48 pi af PAA-opløsningen på midten af ​​hver mikrobrønd.
    Bemærk: Denne volumen teoretisk giver en PAA 75 um i tykkelse.
  2. Sænk forsigtigt Flammet side af 12 mm dækglas på dråben i mikrobrønd med en pincet.
  3. Lad klemt PAA løsning til at polymerisere i 15-30 min. Kontroller polymerisation ved at kontrollere sidesten løsning.
  4. Tilsæt 2 ml 1x PBS til hver skål og fjern de 12 mm dækglas med en pincet.
    Bemærk: 10x PBS fremstillet i laboratoriet, og som består af 0,011 M KH 2 PO 4, 1,54 M NaCl, og 0,056 M Na 2 HPO 4.
  5. Vask mikrobrøndene med 2 ml 1X PBS ved stuetemperatur i 5 min. Gentag to gange mere for i alt 15 min.

3. Perstatning af PAA'er for Trækkraft assays

  1. For en 1 ml opløsning af den bløde PAA (8% acrylamid og 0,05% BIS), kombinere 200 pi 40% acrylamid, 25 pi 2% BIS, og 566 pi ultrarent vand (tabel 2).
  2. For en 1 ml opløsning af den hårde PAA (8% acrylamid og 0,35% BIS), kombinere 200 pi 40% acrylamid, 175 pi 2% BIS, og 401 pi ultrarent vand (tabel 2).
  3. For en 1 ml opløsning af den stive PAA (12% acrylamid og 0,60% BIS), kombinere 300 pi 40% acrylamid, 300 pi 2% BIS, og 161 pi ultrarent vand (tabel 2).
  4. Afgasses løsninger for 15 min. Tilføj 200, 215, og 230 pi af 1 mg / ml human plasma fibronectin til de bløde, hårde og stive PAA løsninger hhv. Lydbehandles 8 pi 200 nm røde fluorescerende mikrosfærer (excitation / emission af 580/605 nm) i 30 sek. For hver løsning, tilsættes 8 pi 200 nm rød fluorescerende mikrokugler,1 pi 10 mg / ml acrylsyre NHS ester, 5 pi af en 100 mg / ml ammoniumpersulfat og 2 pi TEMED (tabel 2). Bland med forsigtig pipettering og undgå at skabe bobler i løsninger.

PAA
(1 ml) 		40%
AA
(Pi) 		2%
BIS
(Pi) 		Ultrarent
Vand
(Pi) 		1 mg / ml
FN
(Pi)
Micro-kugler
(Pi) 		10 mg / ml
NHS Ester
(Pi) 		100 mg / ml
APS
(Pi)
TEMED
(Pi) 		Elastik
Modulus
(Pa)
Blød 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
Hård 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
Stiv 300 300 161 230 8 1 5 2 22.692

Tabel 2:. Volumen ingrediens og deraf elasticitetsmoduler til bløde, hårde og stive PAA'er anvendes i trækkraften assays AA = acrylamid, FN = fibronektin, APS = ammoniumpersulfat.

  1. Pipette 8,48 pi af PAA-opløsningen på midten af ​​hver mikrobrønd.
    Bemærk: Denne volumen teoretisk giver en PAA 75 um i tykkelse.
  2. Sænk forsigtigt Flammet side af the 12 mm dækglas på dråben i mikrobrønd med en pincet.
  3. Lad klemt PAA løsning til at polymerisere i 15-30 min. Kontroller polymerisation ved at kontrollere overskydende opløsning.
  4. Tilsæt 2 ml 1x PBS til hver skål og fjern de 12 mm dækglas med en pincet.
  5. Vask mikrobrøndene med 2 ml 1X PBS ved stuetemperatur i 5 min. Gentag to gange mere for i alt 15 min.

4. Fremstilling af ECM for Invadopodia assays

  1. Varm gelatineopløsning (1% gelatine og 1% saccharose) til 37 ° C.
  2. Behandl PAA'er med 150 pi af gelatineopløsning i 1 min og derefter forsigtigt suges fra bunden af ​​mikrobrøndene, når man holder de nederste retter glas ved en 45 ° vinkel.
  3. Tør det resterende tynde lag af gelatine på PAA'er i mikrobrøndene på en stejl vinkel (60 ° eller mere) for at optimere tørring i 60 minutter.
  4. Behandl microwells med 2 ml af en afkølet 0,5% glutaraldehyd løsning på ice i 15 minutter, efterfulgt af stuetemperatur i 30 minutter.
  5. Vask microwells med 2 ml af en 1x PBS i 5 min. Gentag to gange mere for i alt 15 min.
  6. Behandl mikrobrøndene med 2 ml af en natriumborhydridopløsning for 1 min. Bank forsigtigt på retter på bænken til at fjerne bobler, der danner på overfladen af ​​gelatine.
  7. Aspirer og vask mikrobrøndene med 2 ml af en 1x PBS i 5 min. Gentag to gange mere for i alt 15 min.
  8. Et FITC-mærket humant plasma fibronectin opløsning til 50 ug / ml med 1x PBS og centrifugeres fortyndes ved 175.000 xg ved 4 ° C i 15 min. Enten købe kommercielt tilgængelige mærket fibronectin eller mærke det på følgende måde:
    1. Opløs 5 mg fibronectin i 10 ml boratpuffer (170 mM natriummetaborat tetrahydrat og 40 mM NaCl) og sted i dialyserør.
    2. Mærk fibronectin ved at placere slangen i 200 ml boratpuffer indeholdende 6 mg opløst FITC ved stuetemperatur på en magnetisk omrørersat til den laveste indstilling i 1,5 timer i mørke.
    3. Dialyse med 500 ml af en 1x PBS på en magnetomrører indstillet til den laveste indstilling i 3 dage i et mørkt kølerum (4 ° C) med to volumen ændrer en dag.
    4. Beregn FITC-mærket fibronectin koncentration baseret på den optiske densitet af fortyndede prøver (1: 200) ved 280 nm og 493 nm som [OD 280 - (0,36 x OD 493)] / 1.4 gange fortyndingsfaktoren 200 gange 2 (der tegner for glycerol koncentrere fibronectin i det næste trin), hvilket resulterer i mg / ml enheder.
    5. Dialyse natten over i en 50% glycerol-opløsning på en magnetomrører indstillet til den laveste indstilling natten over i et mørkt kølerum ved 4 ° C.)
  9. Behandl mikrobrøndene med 150 pi af FITC-mærket fibronectin opløsning ved stuetemperatur i 60 minutter i mørke.
  10. Aspirere forsigtigt FITC-mærket fibronectin løsning fra bunden af ​​mikrobrøndene når man holder de nederste retter glas veden vinkel på 45 ° og derefter fylde glasbund retter med 70% ethanol-opløsning ved stuetemperatur i 10 minutter i en mørk cellekultur hætte til sterilisering. Fylde Også glasbund fad låg eller tørre af med lave lint klude dyppet i 70% ethanol.
  11. Vask glasbund retter ved at fylde dem med 1x PBS i 5 min. Gentag to gange med 2 ml 1X PBS for i alt 15 min.

5. Forberedelse og Imaging af Invadopodia assays

  1. Tilføj 25.000 cancerceller i 2 ml invadopodia medium (1: 1 DMEM og RPMI 1640 med 5% lav-protein serum, 10% føtalt bovint serum, og 20 ng / ml frisk tilsat epidermal vækstfaktor) til de nederste retter glas og inkuber natten over.
  2. Aspirer og behandle microwells med 2 ml af en 3,7% paraformaldehyd opløsning ved stuetemperatur i mørke i 20 min for at fastsætte cellerne.
  3. Efter to hurtige vaske med 2 ml 1X PBS, behandle mikrobrøndene med 2 ml af en 0,1% Triton X-100 opløsning ved stuetemperatur tempeperatur i mørke i 5 minutter for at permeabilisere cellerne.
  4. Efter en hurtig vask med 2 ml 1X PBS, behandle microwells med 3% bovint serumalbumin blokerende opløsning ved stuetemperatur i mørke i 60 minutter for at blokere cellerne.
  5. Inkubér mikrobrøndene med 150 pi muse-anti-cortactin antistof (1: 750) i blokerende opløsning ved stuetemperatur i mørke i 60 min.
  6. Vask mikrobrønde med 2 ml 1X PBS for 5 min. Gentag to gange mere for i alt 15 min.
  7. Inkuber mikrobrøndene med 150 pi gede-anti-mus 633-antistof (1: 500) og 546 phalloidin (1: 750) i blokerende opløsning ved stuetemperatur i mørke i 60 min.
  8. Vask mikrobrønde med 2 ml 1X PBS for 5 min. Gentag to gange mere for i alt 15 min.
  9. Tilføj seks dråber montering medium til at fylde hver mikrobrond og dæk med 22 x 22 dækglas.
  10. Billede cortactin og actin at identificere invadopodia hjælp excitation og emissionsfiltre af 632/647 nm og556/570 nm, ved hjælp af en høj NA, 40X olieimmersion linse på en bred felt omvendt mikroskop. Tilsvarende billedet fibronectin identificere ECM-nedbrydning under anvendelse af en excitation og emission filter 492/518 nm.

6. Forberedelse og Imaging af Trækkraft assays

  1. Tilføj 15.000 cancerceller i 2 ml invadopodia medium til de nederste retter glas og inkuberes natten over.
  2. Aspirer medium i nederste retter glas og erstatte med 2 ml L-15-medium, med de samme kosttilskud (5% lavt proteinindhold serum, 10% føtalt bovint serum og 20 ng / ml frisk tilsat epidermal vækstfaktor), præ -warmed til 37 ° C.
  3. Inkubér glasbund retter i et miljøkammer på et omvendt mikroskop præ-ækvilibreret til 37 ° C med høj fugtighed i 1 time.
  4. Tag fire sæt billeder ved hjælp af en høj NA, 40X linse på en bred felt omvendt mikroskop med en automatiseret stadium at markere cellulære positioner:
    1. Billede celler på atp af PAA'er hjælp af fasekontrast ("fase" billede).
    2. Billede fluorescerende mikrokugler ved hjælp af excitation og emissionsfiltre af 560/645 nm ved at fokusere lidt under cellerne, indtil det første lag af mikrosfærer på toppen af ​​PAA'er kommer i fokus ("understregede" billede).
    3. Desuden fokuserer på bunden af ​​PAA'er (ved hjælp af mikrosfærer som markører) og tage et billede ("bunden" billede). Bemærk: Formålet med dette billede er at registrere z-position til at få den faktiske PAA tykkelse ved hver position for trækkraft beregninger som beskrevet i Repræsentative resultater.
    4. Efter disse billeder er erhvervet på flere positioner, forsigtigt blandes i 220 pi 10% Triton-X løsning til at fjerne celler. Billede mikrosfærer på toppen af ​​PAA'er ved hver position som tidligere beskrevet ("nul" billede).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I invadopodia assay invadopodia typisk identificeres ved co-lokalisering af markører som actin og cortactin på punktformig strukturer i cellen (Figur 1). Både aktivt nedværdigende og ikke-nedbrydende invadopodia kan tælles og er differentieret ved, om disse strukturer colocalized med sorte områder mangler fluorescerende signal i FITC-mærket fibronectin (figur 1). Invadopodia manuelt talt og ECM nedbrydning per celle bestemmes ved manuelt tærsklingsrutine disse sorte områder i konturerne af cellerne.

I trækkraft assay fire billeder fanget på hvert cellulære lokalisering præget af trin position (figur 2). Først "fase" og "understregede" billeder er taget af alle cellerne af interesse. En "bottom" billede af PAA er også taget ved hver position for at beregne hydrogel tykkelse. Efter fjernelse than celler, er en "null" billede taget ved hver markerede trin position. Deformationer i PAA'er beregnes ud fra ændringen i mikrosfæreformuleringer positioner mellem "understregede" og "nul" billeder. Disse forskydninger og de ​​mekaniske egenskaber af PAA'er (E og Poissons forhold forudsættes som 0,5) anvendes derefter til at beregne trækkræfter (figur 2). Der findes flere forskellige metoder til beregning af trækkræfter 24 baseret på nogle formulering af Boussinesq løsning til et uendeligt elastisk halv plads 25. Mens detaljerne i disse analyser er uden for rammerne af denne tekst har vi licenseret LIBTRC software fra Micah Dembo ved Boston University, der bruger en tidligere beskrevet metode til beregning trækkræfter 26. Denne særlige beregningsmetode kompenserer for finite tykkelser i sine beregninger, som kræver, at tykkelsen af ​​PAA'er ved hver position, der er beregnet ud fra den difference i z-positionen af ​​de "stressede" og "bunden" billeder. Mange forskergrupper har lignende computer pakke til rådighed, eller vælger at skrive deres egne programmer. Desuden findes der andre metoder til beregning af trækkraft kræfter baseret på forskellige matematiske tilgange 24.

Figur 1
Figur 1: invadopodia assay kan anvendes til at identificere invadopodia og tilhørende ECM nedbrydning Eksempel bredt felt fluorescensbilleder af invadopodia i en SCC-61 (hoved og hals pladecellecarcinom) celle på en hård PAA med 1% gelatine og FITC-. mærket fibronectin. Invadopodia typisk identificeres ved colokalisering af to markører, såsom actin og cortactin (rød og blå i overlejringsbilledet, henholdsvis). Invadopodia kan kvantificeres som både aktivt nedværdigende (colocalized med sorte områder manglering FITC signal som angivet med gule pile) og ikke-nedbrydende (angivet med hvide pile). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2: trækkraft assay kan anvendes til at bestemme cellulære trækkræfter genereret af actincytoskelettet ved at spore forskydning af indlejrede mikrokugler i PAA'er Eksempel bredt synsfelt fase og fluorescens billeder af en SCC-61 celler på en hård PAA (. "fase"), og mikrosfærerne direkte under cellen på oversiden af ​​PAA ("understregede"). Kan også tages et billede af bunden af ​​PAA til senere beregne den lokale tykkelse ("bunden"). Efter cellen er fjernet, er et billede igen taget af mikrosfærens ved oversiden af ​​PAA ("nul"). Mikrosfærepellets positioner mellem de "stressede" og "null" billeder kan spores til at give en "feltet forskydning". Mikrosfærepellets forskydninger og PAA mekaniske egenskaber kan derefter bruges til at beregne en "trækkraft felt vektor." Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi præsenterer en fremgangsmåde til fremstilling PAA'er, der kan anvendes som grundlag for invadopodia og trækkraft assays at korrelere invasive og kontraktile cellulære adfærd. Mens PAA'er længe har været brugt til at se på stivhed effekter på celler og beregne trækkræfter 18,24,27, denne protokol er den første til at udvikle parallelle assays baseret på PAA'er med samme stivheder at korrelere invasive og kontraktile cellulære adfærd som reaktion på matrix mekaniske egenskaber. Korrekt aktivering af dækglas af de nederste retter glas sikrer, at PAA'er vil binde til dem og ikke komme ud. Mens vi og andre har påberåbt reagenser, såsom sulfo-SANPAH og acrylsyre NHS-ester til at binde gelatine til overfladen af PAA'er tidligere 4,12,28, fandt vi, at disse metoder ikke producerer pålideligt ensartede overfladelag af fibronectin . Derfor fibronectin var indlejret og tværbindes hele PAA'er hjælp acrylsyre NHS ester som udføresaf andre grupper 29,30. Imidlertid blev stigende koncentrationer af fibronectin er nødvendige for at give samme ligand densitet ved overfladerne af bløde, hårde og stive PAA'er 5. Derudover inkorporering af fibronectin (men ikke mikrokuglerne) reducerede de mekaniske egenskaber af de bløde, hårde og stive PAA'er fra 1.071, 9.299 og 28.283 Pa 4 til 1.023, 7.307 og 22.692 Pa 5 hhv. Disse reducerede elastiske moduli værdier stadig omfattede række normale og ondartede væv 23. Opbevaring moduli af PAA'er kan let måles ved rheometri og omdannes til elasticitetsmoduler 1,4.

Når protokollen er ligetil, sænke og fjerne de 12 mm dækglas er de mest vanskelige skridt og kræver praksis. Den største udfordring ved sænkning et dækglas er at sikre, at PAA løsning breder sig jævnt uden bobler eller sprøjt. Fjernelse af en dækglas kræveren rolig hånd for ikke at beskadige 12 mm dækglas, glas bunden 14 mm dækglas eller PAA. Vi har forsøgt hydrofobe belægninger på 12 mm dækglas for at lette fjernelsen, men fandt, at PAA'er står tilbage med mønstre i deres overflader. Brugen af ​​fine spids og tynde, padle-stil pincet til at sænke og fjerne de 12 mm dækglas henholdsvis anbefales. Desuden er mængden af ​​lys, der anvendes til afbildning af cellerne skal minimeres, da nogle celletyper er følsomme over for koncentreret lys på mikroskopet. Også blev L-15 medium, der anvendes til trækkraften assays siden vores miljømæssige kammer på vores mikroskop ikke er udstyret til CO 2. Mens de samme kosttilskud blev anvendt i medierne for invadopodia og trækkraft assays i et forsøg på at holde betingelserne de samme, kan DMEM og RPMI 1640 anvendes i stedet for L-15, hvis CO 2 niveauer kan kontrolleres.

Mens mængden af ​​PAA-opløsningen blev valgt til teoretisk yield geler med en tykkelse på 75 um, deres tykkelser varierer typisk mellem 30-60 um. Men dette interval er et godt stykke over den værdi, som celler kan fornemme den underliggende stivhed af dækglas af glas bunden retter 31. Desuden er tykkelsen af ECM lag anvendes til at detektere forringelse (gelatine og FITC-mærket fibronectin overlejret til PAA'er) er tidligere blevet rapporteret som ca. 1 um i tykkelse 12; Derfor er dette tynde lag ikke beskytte cellerne fra den manglende fleksibilitet i den PAA'er. Fast affald, revner og andre deformiteter i enten PAA'er og / eller ECM lag, kan dog påvirke individuelle cellulære invasive og kontraktile egenskaber. Disse problemer kan være forårsaget af urene 12 mm dækglas, der introducerer snavs i hydrogelerne, overdreven tørring af gelerne og / eller gelatine og ufuldstændig aspiration af natriumborhydrid som kan efterlade bobler, der deformerer ECM lag. Derfor skal der udvises forsigtighed ved valg af ceLLS til billeddannelse til at sikre, at de ikke unødigt påvirket af lokale uregelmæssigheder i overfladerne af prøverne.

Relativt høje koncentrationer af fibronectin i både PAA'er (blandet ved 200-230 pg / ml), og ECM lag (overlagt på gelatine ved 50 ug / ml) er blevet anvendt; Men de faktiske koncentrationer på begge overfladen ikke har været direkte målt. Mens hver overflade synes at være mættet med fibronectin, er det uklart, om celler opleve de samme nøjagtige ligand tætheder mellem de to assays. For trækkraft assays, 200 nm mikrosfærer ved en fortynding på 1: har 125 bevist optimale for billeddannelse. Men det er ganske almindeligt at finde andre grupper ved hjælp af mikrokugler med forskellige diametre eller fortyndinger. I dette system mindre mikrosfærer vises Brownsk bevægelse i PAA'er, mens større mikrokugler forårsagede revner og deformiteter. Disse observationer er mest sandsynligt på grund af de fysiske egenskaber af PAA'er (dvs.

Samlet set kan mange af disse eksperimentelle faktorer justeres på basis af brugerens krav såsom PAA'er med forskellige mekaniske egenskaber, cancerceller med varierende invasive og kontraktile egenskaber og mikroskopi systemer med andre billeddannelse kapaciteter. Forholdet mellem acrylamid: BIS kan varieres for at frembringe PAA'er med lignende eller forskellige elasticitetsmoduler og tværbinding 27. Følsomheden af ​​trækkraften assays kan justeres til grund for forskellige cellulære styrkeniveau ved at ændre stivhed og / eller mikrokugler dilution. Kan også vælges forskellige fluorophorer for immunofluorescens og fibronectin mærkning baseret på mikroskop specifikationer. Mens FITC gør blegemiddel, det er helt lyse making ECM nedbrydning let kan identificeres. Men fluorescensafbildning af invadopodia og små mikrosfærer kræver typisk høj NA mål for optimal opløsning. Desuden kan begge assays udføres på dækglas i brønde. Men glas bund retter er meget lettere at forberede og bruge hele den eksperimentelle proces. I fremtiden vil kombinere disse analyser i en mulighed for direkte visualisering af både ECM nedbrydning og cellulære kraft generation. Ville imidlertid flere tekniske udfordringer opstår, herunder levende celler billeddannelse til invadopodia og mikroperle forskydninger, forøget cellulær eksponering for lys, blegning af FITC fibronectin, og om trækkræfter er fuldstændig transduceres via fluorescensmærket og tværbundet ECM lag til PAA overflader .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute for National Institutes of Health under Award Number K25CA143412 (Parekh). Vi vil gerne anerkende, at yderligere støtte blev leveret af Institut for Hals-og ørelæge. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.

Acknowledgments

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Aminopropyltrimethoxysilane Sigma-Aldrich 281778
Acrylamide (40%) Bio-Rad 161-0140
Acrylic acid NHS ester Sigma-Aldrich A8060 prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidin Life Technologies A22283 can also use rhodamine
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700 prepare fresh 10% solution in 1x PBS
Aqua Poly/Mount Polysciences 18606 use 6 drops to fill microwells
BIS (2%) Bio-Rad 161-0142
Bovine serum albumin RPI A30075 make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C
Coverslips (12 mm) Fisher Scientific 12-545-80
dialysis tubing Sigma-Aldrich D9777 pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min
DMEM Cellgro 10-013-CV use to make invadopodia medium
DMSO Sigma-Aldrich D8418 use to make acrylic acid NHS ester solution
Epidermal growth factor Life Technologies PHG0311 use to make invadopodia medium
Ethanol PHARMCO-AAPER E200 dilute with ultrapure water to 70%
FBS Thermo Scientific SH30070.03 use to make invadopodia medium
FITC Sigma-Aldrich F7250 protect from light
Gelatin Polysciences 00639 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
Glass bottom dishes (35 mm coverslips) MatTek P35G-0-14-C coverslips are uncoated
Glutaraldehyde (25%) Polysciences 01909 dilute with 1x PBS to 0.5%
Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody Life Technologies A21050
Human plasma fibronectin Life Technologies 33016-015 add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles
KH2PO4 EMD Millipore PX-1565-1 use to make 10x PBS stock
Mouse anti-cortactin 4F11 antibody EMD Millipore 05-180
Na2HPO4 EMD Millipore SX-0720-1 use to make 10x PBS stock
NaCl RPI S23020 use to make 10x PBS stock and borate buffer
NaOH (1 N) Sigma-Aldrich S2770 dilute with ultrapure water to 0.1 N
Nu-Serum (low-protein serum) BD Biosciences 355500 use to make invadopodia medium
Paraformaldehyde Acros 416785000 typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)
PBS (sterile) Cellgro 21-040-CV use for cell culture
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV use to make invadopodia medium
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS
Sodium metaborate tetrahydrate Sigma-Aldrich S0251 use to make borate buffer
Sucrose RPI S24060 typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)
TEMED Bio-Rad 161-0800
Triton X-100 Alfa Aesar A16046 make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  2. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
  3. Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
  4. Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
  5. Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
  6. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572 (2012).
  7. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
  8. Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
  9. Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
  10. Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
  11. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  12. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  13. Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
  14. Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
  15. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
  16. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
  17. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  18. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
  19. Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
  20. Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015 (2011).
  21. Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
  22. Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).
  23. Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
  24. Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
  25. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
  26. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
  27. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  28. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
  29. Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
  30. Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
  31. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).

Tags

Medicine invadopodia trækkraft nedbrydning kontraktilitet stivhed polyacrylamid
Polyakrylamidgeler for Invadopodia og Trækkraft Analyser på kræftceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jerrell, R. J., Parekh, A.… More

Jerrell, R. J., Parekh, A. Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells. J. Vis. Exp. (95), e52343, doi:10.3791/52343 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter