Summary
Rigidità meccanica nel microambiente tumorale gioca un ruolo cruciale nel guidare il comportamento maligno aumentando l'attività Invadopodi e actomiosina contrattilità. Utilizzando gel di poliacrilammide (PaaS), Invadopodi e forza di trazione test possono essere utilizzati per studiare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali in risposta alla matrice rigidità.
Abstract
Tessuti tumorali rigidi sono stati fortemente implicati nella regolazione della migrazione delle cellule del cancro e l'invasione. Migrazione invasiva attraverso i tessuti reticolati è facilitato da sporgenze ricchi di actina chiamati Invadopodi che proteoliticamente degradano la matrice extracellulare (ECM). Attività Invadopodi ha dimostrato di essere dipendente da rigidità ECM e il cancro delle cellule contrattili forze che suggeriscono che i segnali di rigidità possono regolare queste strutture subcellulari attraverso actomiosina contrattilità. Proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali possono essere correlati in vitro utilizzando Invadopodi e forza di trazione test basati su gel di poliacrilammide (PaaS) di diversa rigidità. Proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali possono essere correlati in vitro utilizzando Invadopodi e forza di trazione test basati su gel di poliacrilammide (PaaS) di diversa rigidità. Mentre esistono delle differenze tra i due test, il protocollo qui presentata fornisce un metodo per la creazione di PAA thin può essere utilizzato in entrambi i test e sono facilmente adattabili alle esigenze biologiche e tecniche specifiche dell'utente.
Introduction
La rigidità del ECM associati al tumore è stato identificato come un fattore significativo nel determinare comportamenti maligni aumentando actomiosina contrattilità 1-3. Anche se questo effetto è stato dimostrato soprattutto con le cellule del cancro al seno, la rigidità matrice è stato trovato per modificare le proprietà invasive di cellule derivate da una varietà di tumori 4-8 che suggeriscono che la rigidità del tumore può svolgere un ruolo in altri tipi di tumori. Per penetrare i tessuti reticolati durante la migrazione invasivo, le cellule tumorali utilizzano sporgenze adesive ricche di actina conosciuti come Invadopodi che localizzare proteasi a degradare focally ECM 9. Invadopodi sono considerati un segno distintivo di cellule invasive e sono stati implicati in invasione delle cellule tumorali e metastasi 10,11. Il lavoro precedente ha mostrato che la rigidità matrice può regolare numeri Invadopodi e associati ECM degrado 4,12 attraverso l'attività miosina II e proteine meccanosensibili 12. Dato checorrelazione tra la densità del tumore e cancro aggressività 13,14, questi risultati suggeriscono un meccanismo attraverso il quale le cellule tumorali possono rispondere ai tessuti tumorali rigidi guidare invasione e metastasi attraverso actomiosina contrattilità.
In vitro rigidità ECM e nella densità del tessuto vivo hanno dimostrato di regolare il comportamento invasivo delle cellule tumorali 1,15-17. Mentre actomiosina contrattilità sembra essere importante in questo processo, gli studi in corso il conflitto come se la capacità metastatica è correlata ad un aumento o diminuzione forze contrattili 6,18-20. Inoltre, resta noto se queste forze mediare direttamente l'attività Invadopodi 21. Abbiamo recentemente scoperto che le forze contrattili cellula tumorale dipendevano rigidità matrice ed erano predittivi di ECM degrado da Invadopodi 5. Questi risultati suggeriscono che le forze cellulari possono svolgere un ruolo importante nella progressione del cancro mediando Invadopodi actività in risposta alle proprietà meccaniche del microambiente tumorale.
Al fine di correlare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali 5, abbiamo modificato un protocollo per la creazione di ZAP con differenti rigidità precedentemente utilizzati per studiare l'attività Invadopodi rigidità-dipendente 4,12,22. Con reticolazione chimica fibronectina plasma umano durante ZAP, questi idrogel modificati possono essere utilizzate come base per entrambi Invadopodi e forza di trazione saggi per assicurare che le cellule sperimentato le stesse rigidità in entrambi gli esperimenti 5. Nei saggi Invadopodi, la fibronectina fornisce un dominio di legame naturale per la gelatina di collegare la ECM sovrapposto alla ZAP per rilevare degradazione della matrice. Nei saggi di forza di trazione, la fibronectina fornisce un ligando per adesione cellulare diretta per rilevare spostamenti microsfere utilizzate per calcolare le forze di trazione cellulari. Questo metodo comporta quello che abbiamo chiamato morbido, duro,e CPA rigidi che sono legati ai piatti fondo di vetro e hanno moduli elastici, E, di 1.023, 7.307, e 22.692 Pa 5 che abbracciano la gamma di proprietà meccaniche segnalate per i tessuti normali e tumorali 23.
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Protocol
1. Preparazione di vetrini di vetro per PAA
- Pulire 12 millimetri coprioggetto con panni bassi lint.
- Flame i coprioggetti 12 mm e il coprioggetto 14 millimetri nel micropozzetto di ogni piatto di vetro fondo 35 millimetri facendoli passare attraverso una fiamma becco Bunsen con una pinzetta.
- Trattare i pozzetti con 200 ml di 0,1 N NaOH per 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirare e asciugare i pozzetti per 30 min.
- Trattare i pozzetti con 50-100 ml di 3-amminopropiltrimetossisilano per 10 minuti a temperatura ambiente nella cappa. Questo prodotto chimico reagisce con plastica; quindi, utilizzare pipette di vetro e non riempire completamente i pozzetti per evitare il contatto con la plastica piatto.
- Lavare i pozzetti con acqua ultrapura per circa 10 minuti fino a quando il 3 amminopropiltrimetossisilano diventa chiaro.
- Sciacquare i pozzetti con acqua ultrapura due volte con una bottiglia a spruzzo.
- Lavare i pozzetti con 2 ml di acqua ultrapura unt temperatura ambiente su un bilanciere fissato a una velocità media (~ 1 Hz) per 10 min.
- Aspirare e asciugare i pozzetti per 30 min.
- Trattare i pozzetti con 2 ml di soluzione di glutaraldeide allo 0,5% a temperatura ambiente su un bilanciere fissato a una velocità media (~ 1 Hz) per 30 min.
- Lavare i micropozzetti con 2 ml di acqua ultrapura a temperatura ambiente su un bilanciere funzionante a velocità media (~ 1 Hz) per 10 min. Ripetere altre due volte per un totale di 30 min.
- Pozzetti a secco con un angolo ripido (60 ° o superiore) per 30 minuti.
Nota: I piatti possono essere conservati per 2 mesi in un essiccatore.
2. Preparazione del PAA per Invadopodi saggi
- Per una soluzione del PAA molle (8% acrilammide e 0,05% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 25 ml di 2% BIS, e 574 ml di acqua ultrapura (Tabella 1).
- Per una soluzione del PAA disco (8% acrilammide e 0,35% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 175 e #181; l del 2% BIS, e 409 ml di acqua ultrapura (Tabella 1).
- Per una soluzione del PAA rigida (12% acrilammide e 0,60% BRI) 1 ml, 300 ml di combinare 40% acrilammide, 300 ml di 2% BIS, e 169 ml di acqua ultrapura (Tabella 1).
- Degassare le soluzioni per 15 min. Aggiungere 200, 215, e 230 ml di 1 mg / ml di fibronectina plasma umano in acqua ultrapura alle molli, duri, rigidi e soluzioni di PAA, rispettivamente. Per tutte le soluzioni, aggiungere 1 ml di 10 mg / ml di acido acrilico N-idrossisuccinimmide (NHS) estere, 5 microlitri di 100 mg / ml, persolfato di ammonio e 2 ml di N, N, N ', N'-tetrametiletilendiammina (TEMED Tabella 1). Mescolare con dolce pipettaggio e evitare di creare bolle in soluzioni.
PAA (1 ml) | 40% AA (Ml) | 2% (Ml) | Ultrapure Acqua (Ml) | 1 mg / ml FN (Ml) | 10 mg / ml NHS Ester (Ml) | 100 mg / ml APS (Ml) | TEMED (Ml) | Elastico Modulo (Pa) |
| Morbido | 200 | 25 | 574 | 200 | 1 | 5 | 2 | 1023 |
| Duro | 200 | 175 | 409 | 215 | 1 | 5 | 2 | 7307 |
| Rigido | 300 | 300 | 169 | 230 | 1 | 5 | 2 | 22692 |
Tabella 1: Ingrediente voluMES e conseguente moduli elastici per ZAP morbide, dure e rigide utilizzati nei test Invadopodi. AA = acrilamide, FN = fibronectina, APS = persolfato di ammonio.
- Pipettare 8,48 ml di soluzione di PAA al centro di ciascun pozzetto.
Nota: Questo volume produce teoricamente PAA di 75 micron di spessore. - Abbassare delicatamente il lato fiammato del vetrino 12 mm appoggiata al droplet del micropozzetto con una pinzetta.
- Lasciare che la soluzione PAA sandwich per polimerizzare per 15-30 min. Verificare polimerizzazione controllando la soluzione rimanente.
- Aggiungere 2 ml di PBS 1x per ogni piatto e rimuovere i 12 millimetri coprioggetto con una pinzetta.
Nota: 10x PBS viene effettuata in laboratorio e composto da 0,011 M KH 2 PO 4, 1,54 M di NaCl, e 0,056 M Na 2 HPO 4. - Lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS a temperatura ambiente per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min.
3. Priparazione del PAA per forza trazione saggi
- Per una soluzione del PAA molle (8% acrilammide e 0,05% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 25 ml di 2% BIS, e 566 ml di acqua ultrapura (Tabella 2).
- Per una soluzione del PAA disco (8% acrilammide e 0,35% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 175 ml di 2% BIS, e 401 ml di acqua ultrapura (Tabella 2).
- Per una soluzione del PAA rigida (12% acrilammide e 0,60% BRI) 1 ml, 300 ml di combinare 40% acrilammide, 300 ml di 2% BIS, e 161 ml di acqua ultrapura (Tabella 2).
- Degassare le soluzioni per 15 min. Aggiungere 200, 215, e 230 ml di 1 mg / ml di fibronectina plasma umano ai morbidi, duri, rigidi e soluzioni di PAA, rispettivamente. Sonicare 8 ml di 200 nm microsfere rosse fluorescenti (eccitazione / emissione di 580/605 nm) per 30 sec. Per ogni soluzione, aggiungere 8 ml di 200 microsfere fluorescenti rossi nm,1 ml di 10 mg / ml di acido acrilico estere NHS, 5 microlitri di 100 mg / persolfato di ammonio ml e 2 microlitri di TEMED (Tabella 2). Mescolare con dolce pipettaggio e evitare di creare bolle in soluzioni.
PAA (1 ml) | 40% AA (Ml) | 2% BIS (Ml) | Ultrapure Acqua (Ml) | 1 mg / ml FN (Ml) | Microsfere (Ml) | 10 mg / ml NHS Ester (Ml) | 100 mg / ml APS (Ml) | TEMED (Ml) | Elastico Modulo (Pa) |
| Morbido | 200 | 25 | 566 | 200 | 8 | 1 | 5 | 2 | 1023 |
| Duro | 200 | 175 | 401 | 215 | 8 | 1 | 5 | 2 | 7307 |
| Rigido | 300 | 300 | 161 | 230 | 8 | 1 | 5 | 2 | 22692 |
Tabella 2:. Volumi ingrediente e conseguente moduli elastici per ZAP morbide, dure e rigide utilizzati nei test di forza di trazione AA = acrilamide, FN = fibronectina, APS = persolfato di ammonio.
- Pipettare 8,48 ml di soluzione di PAA al centro di ciascun pozzetto.
Nota: Questo volume produce teoricamente PAA di 75 micron di spessore. - Abbassare delicatamente il lato fiammata di the 12 millimetri coprioggetto al droplet del micropozzetto con una pinzetta.
- Lasciare che la soluzione PAA sandwich per polimerizzare per 15-30 min. Verificare polimerizzazione controllando soluzione rimanente.
- Aggiungere 2 ml di PBS 1x per ogni piatto e rimuovere i 12 millimetri coprioggetto con una pinzetta.
- Lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS a temperatura ambiente per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min.
4. Preparazione di ECM per Invadopodi saggi
- Riscaldare la soluzione di gelatina (1% gelatina e 1% di saccarosio) a 37 ° C.
- Trattare le PAA con 150 microlitri della soluzione di gelatina per 1 min poi accuratamente aspirato dal fondo dei pozzetti quando si tiene i piatti fondo di vetro con un angolo di 45 °.
- Essiccare il sottile strato residuo di gelatina sulle PAA ai pozzetti con un angolo ripido (60 ° o maggiore) per ottimizzare l'essiccazione per 60 min.
- Trattare i pozzetti con 2 ml di una soluzione di glutaraldeide allo 0,5% in refrigerate iCe per 15 minuti seguita da temperatura ambiente per 30 min.
- Lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min.
- Trattare i pozzetti con 2 ml di una soluzione di boroidruro di sodio per 1 min. Battere delicatamente piatti sul banco per rimuovere le bolle che si formano sulla superficie della gelatina.
- Aspirare e lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min.
- Diluire una soluzione fibronectina plasma umano marcato con FITC a 50 pg / ml con PBS 1x e centrifugare a 175.000 xg a 4 ° C per 15 min. O acquistare in commercio fibronectina etichettati o etichettarlo come segue:
- Disciogliere 5 mg di fibronectina in 10 ml di tampone borato (170 mM di sodio tetraidrato metaborato e 40 mM NaCl) e posto in tubi di dialisi.
- Etichetta la fibronectina posizionando il tubo in 200 ml di tampone borato contenente 6 mg di FITC disciolto a temperatura ambiente su un agitatore magneticoimpostare al minimo per 1,5 ore al buio.
- Dializzare con 500 ml di PBS 1x su un agitatore magnetico impostato al minimo per 3 giorni in una stanza buia fredda (4 ° C) con due volumi cambia un giorno.
- Concentrazione fibronectina Calcolare FITC-marcato sulla base della densità ottica di aliquote diluito (1: 200) a 280 nm e 493 nm come [OD 280 - (0,36 x OD 493)] / 1,4 volte il fattore di diluizione di 200 volte 2 (che rappresenta per il glicerolo concentrare la fibronectina nel passaggio successivo) conseguente unità mg / ml.
- Dializzare notte in una soluzione di glicerolo al 50% su un agitatore magnetico impostato al minimo durante la notte in una camera fredda buio a 4 ° C.)
- Trattare i pozzetti con 150 microlitri della soluzione di fibronectina FITC-marcato a temperatura ambiente per 60 minuti al buio.
- Aspirare accuratamente la soluzione fibronectina coniugati con fluoresceina dal fondo dei pozzetti quando si tiene i piatti fondo di vetro aun angolo di 45 ° e quindi riempire il vetro piatti inferiori con soluzione di etanolo al 70% a temperatura ambiente per 10 min in una cappa di coltura cellulare scuro per la sterilizzazione. Anche riempire vetro fondo coperchi piatto o pulire con panni imbevuti lint bassi nel 70% di etanolo.
- Lavare i piatti fondo di vetro da riempire con 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte con 2 ml di PBS 1x per un totale di 15 min.
5. Preparazione e Imaging di Invadopodi Assays
- Aggiungere 25.000 cellule tumorali in 2 ml di terreno Invadopodi (1: 1 DMEM e RPMI 1640 con 5% di siero a basso contenuto proteico, siero bovino fetale al 10%, e 20 ng / ml di fresco aggiunto del fattore di crescita epidermico) ai piatti fondo di vetro e incubare una notte.
- Aspirare e trattare i pozzetti con 2 ml di una soluzione di paraformaldeide 3,7% a temperatura ambiente al buio per 20 minuti per fissare le cellule.
- Dopo due lavaggi rapidi con 2 ml di 1x PBS, trattare i pozzetti con 2 ml di Triton X-100 soluzione 0,1% a camera temperatura al buio per 5 min a permeabilize cellule.
- Dopo un lavaggio rapido con 2 ml di 1x PBS, trattare i pozzetti con 3% di albumina sierica bovina soluzione bloccante a temperatura ambiente al buio per 60 minuti per bloccare le cellule.
- Incubare le micropozzetti con 150 ml di anticorpo anti-topo cortactin (1: 750) in soluzione a temperatura ambiente al buio blocco per 60 min.
- Lavare pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min.
- Incubare i pozzetti con 150 ml di capra anti-topo 633 anticorpi (1: 500) e 546 falloidina (1: 750) in soluzione a temperatura ambiente al buio blocco per 60 min.
- Lavare pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min.
- Aggiungere sei gocce di mezzo di montaggio per riempire ogni micropozzetto e coprire con 22 x 22 lamelle.
- Immagine cortactin e actina per identificare Invadopodi con eccitazione e di emissione filtri di 632/647 nm e556/570 nm, rispettivamente, con un obiettivo ad immersione in olio ad alta NA, 40X su un ampio campo di microscopio invertito. Analogamente, immagine fibronectina identificare degrado ECM utilizzando un filtro di eccitazione ed emissione di 492/518 nm.
6. Preparazione e Imaging di forza trazione Assays
- Aggiungere 15.000 cellule tumorali in 2 ml di terreno Invadopodi ai piatti fondo di vetro e incubare durante la notte.
- Aspirare media nei piatti fondo di vetro e sostituire con 2 ml di mezzo L-15, con le stesse integratori (siero ipoproteica 5%, siero bovino fetale al 10%, e 20 ng / ml di fresco aggiunto del fattore di crescita epidermico), pre -warmed a 37 ° C.
- Incubare i piatti inferiori vetro in una camera ambientale su un microscopio invertito pre-equilibrati a 37 ° C con umidità elevata per 1 ora.
- Prendere quattro serie di immagini con un elevato NA, 40X obiettivo su un microscopio a grande campo invertito, con una fase automatizzata per marcare posizioni cellulari:
- Celle di immagine su dip dei PAA con contrasto di fase (immagine "fase").
- Microsfere fluorescenti immagine utilizzando filtri di eccitazione ed emissione di 560/645 nm concentrandosi leggermente sotto le celle fino al primo strato di microsfere nella parte superiore del PAA è a fuoco (immagine "sottolineato").
- In aggiunta, si concentrano al fondo del PAA (utilizzando le microsfere come marcatori) e prendere una immagine (un'immagine "bottom"). Nota: Lo scopo di questa immagine è di registrare la z-posizione per ottenere lo spessore effettivo PAA in ciascuna posizione per i calcoli forza di trazione come descritto in Risultati rappresentativi.
- Dopo queste immagini sono state acquisite a più posizioni, mescolare delicatamente in 220 ml di soluzione al 10% Triton-X per rimuovere le cellule. Microsfere fotografia in cima ZAP in ciascuna posizione come precedentemente descritto (immagine "nullo").
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Representative Results
Nel saggio Invadopodi, Invadopodi sono in genere identificato da colocalizzazione di marcatori come actina e cortactin a strutture puntiformi all'interno del corpo cellulare (Figura 1). Sia attivamente degradante e non degradanti Invadopodi può essere contato e si differenziano per se queste strutture sono colocalized con aree nere prive segnale fluorescente nella fibronectina coniugati con fluoresceina (Figura 1). Invadopodi vengono contati manualmente, e la degradazione ECM per cellula è determinata dal thresholding manualmente queste aree nere entro contorni delle cellule.
Nel saggio forza di trazione, quattro immagini vengono acquisite in ciascuna localizzazione cellulare segnato da posizione fase (figura 2). Primo, "fase" e "sottolineato" immagini sono prese di tutte le cellule di interesse. Un'immagine "fondo" del PAA è anche preso in ciascuna posizione per calcolare lo spessore idrogel. Dopo aver rimosso tegli cellule, un'immagine "null" è presa in ogni posizione tappa segnata. Deformazioni della CPA sono calcolati sulla base della variazione nelle posizioni di microsfere tra immagini "nulli" "sottolineato" e. Questi spostamenti e le proprietà meccaniche del CPA (E e il rapporto di Poisson assunto come 0,5) vengono poi utilizzati per calcolare le forze di trazione (Figura 2). Esistono diversi metodi diversi di calcolo forze di trazione di 24 basati su alcuni formulazione della soluzione Boussinesq per un infinito metà spazio elastico 25. Mentre i dettagli di queste analisi sono oltre la portata di questo testo, abbiamo la licenza software LIBTRC da Micah Dembo presso la Boston University, che utilizza un metodo descritto in precedenza per calcolare le forze di trazione 26. Questo particolare metodo di calcolo compensa spessori finiti nei suoi calcoli, che richiede lo spessore del PAA in ogni posizione, che viene calcolato in base al difference nel z-posizione dei "stressati" e immagini "di fondo". Molti gruppi di ricerca hanno pacchetti di computer simili a disposizione o scegliere di scrivere i propri programmi. Inoltre, esistono altri metodi per calcolare le forze di trazione basati su differenti approcci matematici 24.
Figura 1: Il dosaggio Invadopodi può essere utilizzato per identificare Invadopodi e degrado ECM associato immagini Esempio grande campo di fluorescenza Invadopodi in una cella SCC-61 (testa e collo carcinoma a cellule squamose) su un disco PAA con 1% di gelatina e FITC. fibronectina etichettati. Invadopodi sono in genere identificato da colocalizzazione di due marcatori, come actina e cortactin (rosso e blu l'immagine di sovrapposizione in, rispettivamente). Invadopodi può essere quantificata come sia attivamente degradanti (colocalized con aree nere mancanzaing segnale FITC come indicato da frecce gialle) e non degradanti (indicata con frecce bianche). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il dosaggio forza di trazione può essere utilizzata per determinare forze di trazione cellulari generate dal citoscheletro actina tracciando spostamento di microsfere incorporate nei PAA Esempio largo campo di fase e fluorescenza immagini di una cella SCC-61 su un disco PAA (. "fase"), e le microsfere direttamente sotto le cellule sulla superficie superiore del PAA ("sottolineato"). L'immagine di fondo del PAA può anche essere preso per calcolare successivamente suo spessore locale ("bottom"). Dopo che la cella è rimossa, un'immagine viene nuovamente presa della microsferas alla superficie superiore del PAA ("nullo"). Posizioni microsfere tra la "stressati" e le immagini "nulli" possono essere monitorati per produrre un "campo di spostamento." Spostamenti microsfere e PAA proprietà meccaniche possono essere utilizzate per calcolare un "campo vettoriale trazione". Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Vi presentiamo un metodo per la fabbricazione di PAA che possono essere utilizzati come base per Invadopodi e forza di trazione saggi di correlare i comportamenti cellulari invasive e contrattili. Mentre CPA sono stati a lungo utilizzati per osservare gli effetti sulle cellule rigidità e calcolare le forze di trazione 18,24,27, questo protocollo è il primo a sviluppare test paralleli basati su CPA con le stesse rigidità di correlare i comportamenti cellulari invasive e contrattili in risposta alla matrice proprietà meccaniche. Correttamente l'attivazione dei vetrini dei piatti fondo di vetro assicura che i CPA si legano a loro e non venire fuori. Mentre noi ed altri hanno invocato reattivi come sulfo-SANPAH e acido acrilico NHS estere di impegnare la gelatina alla superficie della ZAP in passato 4,12,28, abbiamo trovato che questi metodi non producono strati superficiali affidabile uniformi di fibronectina . Pertanto, fibronectina è stato incorporato e reticolato in tutto il PAA utilizzando acido acrilico NHS ester interpretatoda altri gruppi 29,30. Tuttavia, concentrazioni crescenti di fibronectina stato necessario per produrre la stessa densità ligando alle superfici morbide, dure, e rigide PAA 5. Inoltre, l'incorporazione di fibronectina (ma non le microsfere) riduce le proprietà meccaniche dei ZAP molli, duri, e rigide da 1.071, 9.299, e 28.283 Pa 4 a 1.023, 7.307 e 22.692 Pa 5, rispettivamente. Tuttavia, questi valori di moduli elastici ridotti ancora comprendevano la gamma di tessuti normali e tumorali 23. Moduli di stoccaggio del PAA possono essere facilmente misurata con reometria e convertiti in moduli elastici 1,4.
Mentre il protocollo è semplice, l'abbassamento e la rimozione dei 12 millimetri coprioggetto sono i passaggi più difficili e richiedono pratica. La sfida più grande quando si abbassa un coprioggetto è quello di garantire che la soluzione PAA si diffonde in modo uniforme, senza bolle o schizzi. Rimozione di un coprioggetto richiedeuna mano ferma per non danneggiare il coprioggetto 12 mm, il fondo di vetro 14 millimetri coprioggetto, o il PAA. Abbiamo provato rivestimenti idrofobi sul coprioggetto 12 millimetri per favorire l'eliminazione, ma ha scoperto che i CPA sono lasciati con modelli nelle loro superfici. L'uso di punta fine e sottile, pinzette paddle-stile per l'abbassamento e la rimozione da 12 mm coprioggetto, rispettivamente, è altamente raccomandato. Inoltre, la quantità di luce utilizzata per l'immagine delle celle deve essere minimizzato poiché alcuni tipi di cellule sono sensibili alla luce concentrata sul microscopio. Inoltre, L-15 è stato utilizzato per i test di forza di trazione dalla nostra camera ambientale sul nostro microscopio non è attrezzato per CO 2. Mentre gli stessi integratori sono stati utilizzati in media per le Invadopodi e forza di trazione saggi nel tentativo di mantenere condizioni stesso, DMEM e RPMI 1640 possono essere usati al posto di L-15 se CO 2 livelli possono essere controllati.
Mentre il volume di soluzione di PAA è stato scelto per teoricamente yield gel con uno spessore di 75 micron, i loro spessori variano tipicamente fra 30-60 micron. Tuttavia, questa gamma è ben al di sopra del valore al quale le cellule in grado di percepire la rigidità sottostante dei vetrini dei piatti inferiori vetro 31. Inoltre, lo spessore dello strato ECM utilizzato per rilevare il degrado (gelatina e fibronectina marcata con FITC sovrapposto ad ZAP) è stato precedentemente segnalato come circa 1 micron di spessore 12; Pertanto, questo sottile strato non protegge le cellule dai rigidità della CPA. Tuttavia, detriti solidi, crepe, e altre deformità in entrambi ZAP e / o strato ECM possono influenzare i singoli cellulari proprietà invasive e contrattili. Questi problemi possono essere causati da immondi 12 millimetri coprioggetto che introducono i detriti nelle idrogeli, eccessiva asciugatura del gel e / o la gelatina, e aspirazione incompleta di boroidruro di sodio che può lasciare bolle che deformano lo strato ECM. Pertanto, è necessario prestare attenzione nella scelta cells di imaging per garantire che essi non siano indebitamente influenzati da irregolarità locali nelle superfici dei campioni.
Concentrazioni relativamente elevate di fibronectina sia ZAP (mescolato a 200-230 mcg / ml) e lo strato ECM (sovrapposto gelatina a 50 ug / ml) sono stati utilizzati; tuttavia, le concentrazioni effettive su entrambi superficie non sono stati misurati direttamente. Mentre ogni superficie sembra essere saturo di fibronectina, non è chiaro se le cellule sperimentano la stessa densità di ligando esatta tra i due dosaggi. Per la forza di trazione saggi, 200 microsfere nm a una diluizione di 1: 125 si sono dimostrate ottimali per l'imaging. Tuttavia, è abbastanza comune trovare altri gruppi con microsfere di diametri o diluizioni differenti. In questo sistema, microsfere piccole visualizzati moto browniano all'interno ZAP, mentre microsfere grandi causato crepe e deformazioni. Queste osservazioni sono molto probabilmente a causa delle proprietà fisiche del PAA (ie
Nel complesso, molti di questi fattori sperimentali possono essere regolati in base alle esigenze degli utenti, come CPA con diverse proprietà meccaniche, le cellule tumorali con diverse caratteristiche invasive e contrattili, e sistemi di microscopia con altre capacità di imaging. Il rapporto di acrilammide: BIS può essere variata per produrre PAA con moduli elastici simili o differenti e reticolazione 27. La sensibilità dei saggi forza di trazione può essere regolata per conto dei diversi livelli di forza cellulare cambiando la rigidità e / o microsfere dilution. Diversi fluorofori possono essere scelti per l'etichettatura immunofluorescenza e fibronectina sulla base delle specifiche del microscopio. Mentre FITC fa candeggina, è abbastanza luminoso degrado making ECM facilmente identificabili. Tuttavia, imaging di fluorescenza di Invadopodi e piccole microsfere in genere richiede obiettivi alti NA per la risoluzione ottimale. Inoltre, entrambi i saggi possono essere eseguiti su vetrini a pozzetti. Tuttavia, piatti di vetro in basso sono molto più facili da preparare e utilizzare tutto il processo sperimentale. In futuro, la combinazione di questi test in un unico consentirebbe di visualizzazione diretta sia di degrado ECM e la generazione di forza cellulare. Tuttavia, sorgerebbero diversi problemi tecnici, tra cui l'imaging cellulare dal vivo per Invadopodi e microperla spostamenti, una maggiore esposizione alla luce cellulari, sbiancare la fibronectina FITC, e se le forze di trazione sono completamente trasdotti attraverso lo strato ECM fluorescente e cross-linked alle superfici PAA .
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Disclosures
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Cancer Institute dei National Institutes of Health in premio Numero K25CA143412 (Parekh). Vorremmo riconoscere che un ulteriore sostegno è stato fornito dal Dipartimento di Otorinolaringoiatria. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Acknowledgments
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1x PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use 6 drops to fill microwells |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C |
| Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
| Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
| Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
| Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
| Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1x PBS to 0.5% |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
| Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10x PBS stock |
| Mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10x PBS stock |
| NaCl | RPI | S23020 | use to make 10x PBS stock and borate buffer |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
| Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
| Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
| PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS |
| Sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
| Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining |
References
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