Summary
Rigidez mecânica no microambiente tumoral desempenha um papel crucial na condução de comportamento maligno, aumentando a atividade invadopodia e actomiosina contratilidade. Usando géis de poliacrilamida (PaaS), invadopodia e força de tração ensaios podem ser utilizados para estudar as propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas em resposta a matriz rigidez.
Abstract
Tecidos tumorais rígidas têm sido fortemente implicado na regulação da migração e invasão de células de cancro. Migração invasivo através de tecidos de ligação cruzada é facilitada por saliências ricos em actina chamados invadopodia proteoliticamente que degradam a matriz extracelular (ECM). Atividade Invadopodia demonstrou ser dependente de rigidez ECM e contráteis da célula cancerosa forças sugerindo que sinais de rigidez pode regular estas estruturas subcelulares através actomiosina contratilidade. Propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas podem ser correlacionados in vitro utilizando invadopodia e força de tração ensaios baseados em géis de poliacrilamida (PaaS) de diferentes factores de rigidez. Propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas podem ser correlacionados in vitro utilizando invadopodia e força de tração ensaios baseados em géis de poliacrilamida (PaaS) de diferentes factores de rigidez. Enquanto existem algumas variações entre os dois ensaios, o protocolo aqui apresentado fornece um método para a criação de PAA thno pode ser usado em ambos os ensaios e são facilmente adaptáveis às necessidades biológicas e técnicas específicas do usuário.
Introduction
A rigidez da ECM associado a tumor tem sido identificada como um factor significativo na condução comportamento maligno, aumentando a contractilidade actomiosina 1-3. Embora este efeito principalmente tem sido demonstrado com células de cancro da mama, a rigidez da matriz foi encontrado para alterar as propriedades invasivas das células derivadas de uma variedade de cancros o que sugere que 4-8 rigidez tumoral podem desempenhar um papel em outros tipos de cancros. Para penetrar tecidos reticulados durante a migração invasiva, as células cancerosas utilizam saliências adesivas ricas em actina conhecidos como invadopodia que localizar proteinases para degradar focally o ECM 9. Invadopodia são consideradas uma característica de células invasivas e têm sido implicados na invasão de células de tumores e metástases 10,11. Os trabalhos anteriores mostraram que a rigidez da matriz pode regular números invadopodia e associado ECM degradação 4,12 através da atividade da miosina II e proteínas mechanosensitive 12. Considerando acorrelação entre a densidade e a agressividade do tumor do cancro 13,14, estes resultados sugerem um mecanismo pelo qual as células cancerígenas podem responder aos tecidos rígidos de tumor para dirigir a invasão e metástases através de actomiosina contractilidade.
Em rigidez MEC in vitro e em densidade do tecido vivo têm sido mostrados para regular o comportamento invasivo das células cancerosas 1,15-17. Enquanto actomiosina contractilidade parece ser importante neste processo, estudos actual conflito a respeito de se a capacidade metastática está correlacionada com o aumento ou a diminuição da força contráctil 6,18-20. Além disso, não se sabe se essas forças mediar diretamente a atividade invadopodia 21. Recentemente, descobriu que forças contráteis da célula cancerosa eram dependentes de rigidez da matriz e foram preditivos de degradação ECM por invadopodia 5. Estes resultados sugerem que as forças celulares podem desempenhar um papel importante na progressão do cancro pela mediação invadopodia acdade em resposta às propriedades mecânicas do microambiente do tumor.
Para correlacionar propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas, 5, modificamos um protocolo para a criação de PAAs com diferentes rigidez que anteriormente foi usado para investigar a atividade invadopodia dependente da rigidez 4,12,22. Por reticulação química fibronectina do plasma humano ao longo do PAA, estes hidrogéis modificadas podem ser utilizadas como a base para ambas invadopodia e ensaios de força de tracção para assegurar que as células experimentado as mesmas em ambas as experiências rigidez 5. Nos ensaios invadopodia, a fibronectina fornece um domínio de ligação natural para gelatina para ligar o ECM sobreposta para o SAP para detectar a degradação da matriz. Nos ensaios de força de tração, a fibronectina fornece um ligando para adesão celular direto para detectar deslocamentos de microesferas utilizadas para calcular as forças de tração celulares. Este método resulta em o que temos chamado macio, duro,e PAAs rígidas que são obrigados a pratos com fundo de vidro e têm módulos elásticos, E, de 1023, 7307 e 22692 Pa 5, que abrange a gama de propriedades mecânicas reportados para os tecidos normais e cancerosos 23.
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Protocol
1. Preparação de lamelas de vidro para PAAs
- Limpos 12 lamelas mm com toalhetes baixos fiapos.
- Chama as lamelas 12 milímetros e 14 milímetros a lamela na microplaca de cada 35 milímetros prato de vidro de fundo, passando-os através de uma chama do queimador de Bunsen, usando uma pinça.
- Tratar os micropoços com 200 uL de NaOH 0,1 N durante 5 min à temperatura ambiente.
- Aspirar e secar os micropoços para 30 min.
- Tratar os micropoços com 50-100 ul de 3-aminopropiltrimetoxisilano, durante 10 min à temperatura ambiente, na hotte. Este produto químico reage com plástico; portanto, use pipetas de vidro e não preencher os micropoços completamente para evitar contato com o plástico prato.
- Lave os micropoços com água ultrapura para cerca de 10 min até que o 3-aminopropiltrimetoxisilano se torna claro.
- Lave os micropoços com água ultrapura duas vezes utilizando uma garrafa squeeze.
- Lave os micropoços com 2 ml de água ultrapura umtemperatura ambiente t em um balancim fixado a uma velocidade média (~ 1 Hz), durante 10 min.
- Aspirar e secar os micropoços para 30 min.
- Tratar os micropoços com 2 ml de solução de glutaraldeído a 0,5% à temperatura ambiente num agitador rotativo ajustado a uma velocidade média (~ 1 Hz), durante 30 min.
- Lave os micropoços com 2 ml de água ultrapura à temperatura ambiente num agitador rotativo à velocidade média (~ 1 Hz), durante 10 min. Repita duas vezes mais para um total de 30 min.
- Micropoços seco a um ângulo inclinado (60º ou superior) por 30 min.
Nota: Os pratos pode ser armazenada durante 2 meses num exsicador.
2. Preparação de PAAs para Invadopodia Ensaios
- Para uma solução de PAA suave (8% de acrilamida e 0,05% BIS) 1 ml, combinar 200 ul de 40% de acrilamida, 25 ul de 2% BIS, e 574 ul de água ultrapura (Tabela 1).
- Para uma solução de PAA disco (8% de acrilamida e 0,35% BIS) 1 ml, combinar 200 ul de 40% de acrilamida, 175 & #181; l de 2% BIS, e 409 ul de água ultrapura (Tabela 1).
- Para uma solução de PAA rígida (12% de acrilamida e 0,60% BIS) 1 ml, combinar 300 ul de 40% de acrilamida, 300 ul de 2% BIS, e 169 ul de água ultrapura (Tabela 1).
- Desgaseificar as soluções durante 15 min. Adicionar 200, 215, e 230 uL de 1 mg / ml de fibronectina de plasma humano em água ultrapura com as soluções de APA macios, duros, rígidos e, respectivamente. Para todas as soluções, adicionar 1 ml de 10 mg / ml de ácido acrílico N-hidroxissuccinimida (NHS), éster de 5 uL de um / ml de persulfato de amónio, 100 mg e 2 ul de N, N, N ', N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED ; Tabela 1). Misture com pipetagem suave e evitar a criação de bolhas em soluções.
PAA (1 ml) | 40% AA (L) | 2% (L) | Ultrapura Água (L) | 1 mg / ml FN (L) | 10 mg / ml NHS Éster (L) | 100 mg / mL APS (L) | TEMED (L) | Elástico Módulo (Pa) |
| Macio | 200 | 25 | 574 | 200 | 1 | 5 | 2 | 1023 |
| Duro | 200 | 175 | 409 | 215 | 1 | 5 | 2 | 7307 |
| Rígido | 300 | 300 | 169 | 230 | 1 | 5 | 2 | 22692 |
Tabela 1: Ingrediente volumes e resultando módulos elásticos para PAAs macios, duros e rígidos utilizados nos ensaios invadopodia. AA = acrilamida, FN = fibronectina, APS = persulfato de amónio.
- Pipetar 8,48 mL da solução de PAA sobre o centro de cada micropoço.
Nota: Este volume teoricamente produz um PAA de 75 um de espessura. - Com cuidado, abaixe o lado inflamado da lamela 12 milímetros para a gota na microplaca, usando uma pinça.
- Permitir que a solução de PAA ensanduichada polimerizar durante 15-30 min. Verifique polimerização, verificando a solução restante.
- Adicionar 2 ml de 1x PBS a cada prato e remover as lamelas de 12 milímetros, com uma pinça.
Nota: 10x PBS é feita em laboratório e composto de 0,011 M de KH 2 PO 4, 1,54 M de NaCl, e 0,056 M de Na 2 HPO 4. - Lave os micropoços com 2 ml de 1x PBS à temperatura ambiente durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min.
3. Preparação de PAAs para TRACCÇÃO Ensaios
- Para uma solução de PAA suave (8% de acrilamida e 0,05% BIS) 1 ml, combinar 200 ul de 40% de acrilamida, 25 ul de 2% BIS, e 566 ul de água ultrapura (Tabela 2).
- Para uma solução de PAA disco (8% de acrilamida e 0,35% BIS) 1 ml, combinar 200 ul de 40% de acrilamida, 175 ul de 2% BIS, e 401 ul de água ultrapura (Tabela 2).
- Para uma solução de PAA rígida (12% de acrilamida e 0,60% BIS) 1 ml, combinar 300 ul de 40% de acrilamida, 300 ul de 2% BIS, e 161 ul de água ultrapura (Tabela 2).
- Desgaseificar as soluções durante 15 min. Adicionar 200, 215, e 230 uL de 1 mg / ml de fibronectina do plasma humano para as soluções de APA macios, duros, rígidos e, respectivamente. Sonicate 8 l de 200 nm microesferas vermelhas fluorescentes (excitação / emissão de 580/605 nm) para 30 seg. Para cada solução, adicionar 8 l de 200 microesferas fluorescentes vermelhas nm,1 uL de 10 mg / ml de ácido acrílico, éster NHS 5 ul de um / ml de persulfato de amónio a 100 mg, e 2 ul de TEMED (Tabela 2). Misture com pipetagem suave e evitar a criação de bolhas em soluções.
PAA (1 ml) | 40% AA (L) | 2% BIS (L) | Ultrapura Água (L) | 1 mg / ml FN (L) | As micro-esferas (L) | 10 mg / ml NHS Éster (L) | 100 mg / mL APS (L) | TEMED (L) | Elástico Módulo (Pa) |
| Macio | 200 | 25 | 566 | 200 | 8 | 1 | 5 | 2 | 1023 |
| Duro | 200 | 175 | 401 | 215 | 8 | 1 | 5 | 2 | 7307 |
| Rígido | 300 | 300 | 161 | 230 | 8 | 1 | 5 | 2 | 22692 |
Tabela 2:. Ingrediente volumes e resultando módulos elásticos para PAA macios, duros, rígidos e utilizados nos ensaios de força de tracção AA = acrilamida, FN = fibronectina, APS = persulfato de amónio.
- Pipetar 8,48 mL da solução de PAA sobre o centro de cada micropoço.
Nota: Este volume teoricamente produz um PAA de 75 um de espessura. - Com cuidado, abaixe o lado inflamado de the 12 milímetros lamela sobre a gota na microplaca, usando uma pinça.
- Permitir que a solução de PAA ensanduichada polimerizar durante 15-30 min. Verifique polimerização, verificando solução restante.
- Adicionar 2 ml de 1x PBS a cada prato e remover as lamelas de 12 milímetros, com uma pinça.
- Lave os micropoços com 2 ml de 1x PBS à temperatura ambiente durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min.
4. Preparação de ECM para Invadopodia Ensaios
- Aquece-se a solução de gelatina (gelatina a 1% e 1% de sacarose) a 37 ° C.
- Tratar o SAP com 150 ul da solução de gelatina, durante 1 min, em seguida, cuidadosamente aspirado a partir do fundo dos micropoços ao segurar os pratos de vidro de fundo num ângulo de 45 °.
- Seca-se a camada fina remanescente de gelatina sobre o SAP nos micropoços em um ângulo agudo (60 ° ou maior) para optimizar a secagem durante 60 minutos.
- Tratar os micropoços com 2 ml de uma solução de glutaraldeído a 0,5% refrigerado em ice durante 15 minutos, seguido por temperatura ambiente durante 30 min.
- Lave os micropoços com 2 ml de uma 1x PBS durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min.
- Tratar os micropoços com 2 ml de uma solução de boro-hidreto de sódio durante 1 min. Bater levemente pratos na bancada para remover as bolhas que se formam sobre a superfície da gelatina.
- Aspirar e lavar os micropoços com 2 ml de uma 1x PBS durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min.
- Dilui-se uma solução de fibronectina de plasma humano marcada com FITC a 50 ug / ml com um 1x PBS e centrifugar a 175.000 x g a 4 ° C durante 15 min. Ou comprar comercialmente disponível fibronectina rotulados ou rotulá-la da seguinte forma:
- Dissolve-se 5 mg de fibronectina em 10 ml de tampão borato (170 mM de tetra-hidrato de metaborato de sódio e 40 mM de NaCl) e o lugar em tubagem de diálise.
- Rotular a fibronectina, colocando o tubo em 200 ml de tampão de borato contendo 6 mg de FITC dissolvido à temperatura ambiente num agitador magnéticodefinido na configuração mais baixa para 1,5 horas no escuro.
- Dialisar com 500 ml de uma 1x PBS num agitador magnético definido no nível mais baixo durante 3 dias num quarto escuro frio (4 ° C) com dois volumes muda de um dia.
- Calcular a concentração de fibronectina marcada com FITC com base na densidade óptica de aliquotas diluídas (1: 200) a 280 nm e 493 nm como [OD 280 - (0,36 x DO 493)] / 1,4 vezes o factor de diluição de 2 vezes 200 (que corresponde para a concentração de glicerol a fibronectina no passo seguinte), resultando em unidades de mg / ml.
- Dialisar durante a noite numa solução de glicerol a 50% num agitador magnético definido no nível mais baixo durante a noite numa câmara fria a 4 ° C).
- Tratar os micropoços com 150 ul de solução de fibronectina marcada com FITC à temperatura ambiente durante 60 min no escuro.
- Aspirar cuidadosamente a solução de fibronectina marcada com FITC a partir do fundo dos micropoços ao segurar os pratos de vidro de fundo emum ângulo de 45 ° e, em seguida, encher os pratos de vidro de fundo com solução de etanol a 70% à temperatura ambiente durante 10 min, a uma capa de cultura de células para a esterilização escuro. Preencha também tampas de vidro prato fundo ou limpar com lenços lint baixa embebido em álcool 70%.
- Lavar pratos com fundo de vidro, preenchendo-os com 1x PBS por 5 min. Repita duas vezes mais com 2 ml de PBS 1x para um total de 15 min.
5. Preparação e imagem das Invadopodia Ensaios
- Adicionar 25.000 células cancerosas em 2 ml de meio invadopodia (1: 1 de DMEM e meio RPMI 1640 com 5% de soro de baixo teor em proteína, 10% de soro fetal de bovino, e 20 ng / ml de factor de crescimento epidérmico adicionada de fresco) para os pratos de vidro de fundo e incubar durante a noite.
- Aspirar e tratar os micropoços com 2 ml de uma solução de paraformaldeído a 3,7% à temperatura ambiente no escuro durante 20 minutos para fixar as células.
- Após duas lavagens rápidas com 2 ml de PBS 1x, tratar os micropoços com 2 ml de Triton X-100 a 0,1% na solução tempe quartoratura no escuro durante 5 min para permeabilizar as células.
- Depois de uma lavagem rápida com 2 mL de PBS 1x, tratar os micropoços com 3% de albumina de soro bovino solução à temperatura ambiente de bloqueio no escuro durante 60 min para bloquear as células.
- Incubar os micropoços com 150 ul de anticorpo de ratinho anti-cortactina (1: 750) em solução à temperatura ambiente no escuro durante 60 minutos de bloqueio.
- Lave os micropoços com 2 ml de 1x PBS durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min.
- Incubar os micropoços com 150 ul de anticorpo de cabra anti-rato de anticorpo 633 (1: 500) e 546 faloidina (1: 750) em solução à temperatura ambiente no escuro durante 60 minutos de bloqueio.
- Lave os micropoços com 2 ml de 1x PBS durante 5 min. Repita duas vezes mais para um total de 15 min.
- Adicione seis gotas de meio de montagem para preencher cada micro e cubra com 22 x 22 lamelas.
- Cortactina Imagem e actina para identificar invadopodia usando filtros de excitação e emissão de 632/647 nm e556/570 nm, respectivamente, utilizando uma lente de imersão em óleo de elevada NA, 40X sobre uma ampla microscópio de campo invertido. Da mesma forma, a fibronectina imagem para identificar a degradação de ECM utilizando um filtro de excitação e de emissão de 492/518 nm.
6. Preparação e imagem das TRACCÇÃO Ensaios
- Adicionar 15.000 células cancerosas em 2 ml de meio invadopodia para os pratos de vidro de fundo e incubar durante a noite.
- Aspirar o meio em pratos de vidro de fundo e substituir com 2 ml de meio L-15, com os mesmos suplementos (5% de soro de baixo teor em proteína, 10% de soro fetal de bovino, e 20 ng / ml de factor de crescimento epidérmico) adicionado de fresco, pré -warmed a 37 ° C.
- Incubar as placas de fundo de vidro em uma câmara ambiental em um microscópio invertido pré-equilibrado a 37 ° C, com humidade elevada durante 1 h.
- Tome quatro conjuntos de imagens usando uma NA alta, 40X lente em um microscópio de campo amplo invertido com um estágio automatizado para marcar posições celulares:
- Células de imagens sobre ap dos PAAs usando contraste de fase (imagem de "fase").
- Imagem microesferas fluorescentes de excitação e emissão filtros de 560/645 nm, concentrando-se ligeiramente sob as células até a primeira camada de microesferas no topo dos AAP entra em foco ("estressado" imagem).
- Além disso, o foco para o fundo do PAA (usando as microesferas como marcadores) e tomar uma imagem (imagem de "fundo"). Nota: A finalidade desta imagem é para registrar a posição z para obter a espessura PAA real em cada posição para cálculos de força de tração, conforme descrito em Resultados representativos.
- Depois dessas imagens foram adquiridas em múltiplas posições, misturar suavemente em 220 ul de solução a 10% de Triton-X para remover as células. Microesferas de imagem no topo do SAP em cada posição conforme anteriormente descrito (imagem "nula").
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Representative Results
No ensaio invadopodia, invadopodia são tipicamente identificadas por uma co-localização de marcadores como actina e cortactina em estruturas puntiformes dentro do corpo celular (Figura 1). Ambos degradar de forma activa e não-degradante invadopodia pode ser contado e são diferenciados por se estas estruturas são co-localizada com as áreas pretas falta de sinal fluorescente no fibronectina marcada com FITC (Figura 1). Invadopodia são contadas manualmente, e a degradação de ECM por célula é determinada por thresholding estas áreas pretas manualmente dentro contornos das células.
No ensaio de força de tracção, quatro imagens são capturados em cada localização celular marcada pela posição de fase (Figura 2). Em primeiro lugar, "fase" e "salientou" imagens são tiradas de todas as células de interesse. A imagem "bottom" do PAA é também tida em cada posição, a fim de calcular a espessura hidrogel. Após a remoção tele células, uma imagem de "null" é tomada em cada posição etapa marcada. Deformações no SAP são calculados com base na mudança de posições de microesferas entre o "sublinhou" e as imagens "nulo". Estes deslocamentos e as propriedades mecânicas do PAA (E e do coeficiente de Poisson assumido como 0,5) são então utilizados para calcular as forças de tracção (Figura 2). Existem vários métodos diferentes para calcular as forças de tracção 24 com base em alguma formulação da solução de Boussinesq para um espaço infinito meia elástica 25. Embora os detalhes destas análises estão fora do escopo deste texto, temos licenciado software LIBTRC de Micah Dembo na Universidade de Boston, que utiliza um método descrito anteriormente para o cálculo de forças de tração 26. Este método computacional especial compensa espessuras finitas em seus cálculos que exige a espessura da SAP em cada posição, que é calculado com base no diferença na z-posição dos "estressados" imagens e "bottom". Muitos grupos de pesquisa têm pacotes de computador semelhantes disponíveis ou optar por escrever seus próprios programas. Além disso, existem outros métodos para calcular as forças de tracção a partir de diferentes abordagens matemáticas 24.
Figura 1: O ensaio invadopodia pode ser utilizado para identificar e invadopodia degradação de ECM associada Exemplo imagens de campo amplo de fluorescência de invadopodia numa célula SCC-61 (cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas) no disco um PAA com 1% de gelatina e FITC. fibronectina marcada. Invadopodia são normalmente identificados por co-localização de dois marcadores, tais como actina e cortactina (vermelho e azul na imagem sobreposta, respectivamente). Invadopodia pode ser quantificada como tanto ativamente degradantes (colocalized com áreas pretas faltaing sinal FITC como indicado por setas amarelas) e não-degradantes (indicado por setas brancas). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O ensaio de força de tracção pode ser usado para determinar as forças de tracção celulares gerados por o citoesqueleto de actina, acompanhando o deslocamento de microesferas embebidas nas de campo amplo de fase e de fluorescência imagens PAA exemplo de uma célula SCC-61 sobre um disco de PAA (. "fase"), e as microesferas directamente sob a células na superfície superior do PAA ("salientou"). Uma imagem do fundo do PAA também pode ser levado para calcular mais tarde a sua espessura local ("fundo"). Depois a célula é removida, uma imagem é mais uma vez feita de microesferas na superfície de topo do PAA ("nulo"). Microesferas posições entre o "sublinhou" e as imagens "nulo" pode ser rastreado para produzir um "campo de deslocamento." Deslocamentos microesferas e PAA propriedades mecânicas podem então ser usados para calcular um "campo de vetores de tração." Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apresenta-se um método para a fabricação de PAA que podem ser usados como a base para invadopodia força de tracção e ensaios para correlacionar comportamentos celulares invasivos e contrácteis. Enquanto PAAs têm sido muito utilizados para analisar os efeitos da rigidez nas células e calcular forças de tração 18,24,27, este protocolo é o primeiro a desenvolver ensaios paralelos baseados em PAAs com os mesmos factores de rigidez para correlacionar comportamentos celulares invasivos e contráteis em resposta a matriz propriedades mecânicas. Devidamente ativando as lamelas dos pratos com fundo de vidro garante que o SAP irá ligar-se a eles e não sair. Enquanto nós e outros já invocado reagentes, tais como sulfo-SANPAH e ácido acrílico éster NHS para se ligarem à superfície de gelatina de o SAP no passado 4,12,28, verificou-se que esses métodos não produzir camadas superficiais uniformes fiáveis da fibronectina . Portanto, a fibronectina foi embebida e reticulado ao longo do PAA usando ácido acrílico éster NHS como realizadapor outros grupos 29,30. No entanto, concentrações crescentes de f ibronectina foram necessárias para se obter a mesma densidade de ligante nas superfícies das moles, duras e rígidas PAA 5. Além disso, a incorporação de fibronectina (mas não as microesferas) reduziu as propriedades mecânicas dos PAA macios, duros, rígidos e de 1.071, 9.299, e 28.283 Pa 4 a 1.023, 7.307, e 22.692 Pa 5, respectivamente. No entanto, estes valores reduzidos módulos elásticos ainda englobava a gama de tecidos normais e cancerosos 23. Módulos de armazenamento da SAP pode ser facilmente medida por reometria e convertido em módulos elásticos 1,4.
Enquanto o protocolo é para a frente, abaixando e removendo os 12 milímetros lamelas são os passos mais difíceis e exigem prática. O maior desafio ao baixar uma lamela é garantir que a solução PAA se espalha uniformemente, sem quaisquer bolhas ou espirrar. A remoção de uma lamela requeruma mão firme, a fim de não danificar a lamela 12 mm, o fundo de vidro 14 milímetros lamela, ou o PAA. Temos tentado revestimentos hidrofóbicos na lamela 12 milímetros para ajudar na remoção, mas descobriu que o SAP são deixados com padrões em suas superfícies. O uso de ponta fina e finas, pinças de estilo pá para baixar e removendo os 12 milímetros lamelas, respectivamente, é altamente recomendável. Além disso, a quantidade de luz utilizado para a imagem das células deve ser minimizada uma vez que alguns tipos de células são sensíveis à luz concentrada sobre o microscópio. Além disso, meio L-15 foi utilizado para os ensaios de força de tracção uma vez que a câmara ambiental no nosso microscópio não está equipado para o CO 2. Enquanto os mesmos suplementos foram usados meios para os invadopodia e da força de tracção ensaios numa tentativa de manter as condições da mesma, DMEM e meio RPMI 1640 pode ser utilizado em vez de L-15, se os níveis de CO2 pode ser controlada.
Enquanto o volume da solução de PAA foi escolhida teoricamente a ygéis ield com uma espessura de 75 um, a sua espessura variar tipicamente entre 30-60 mm. No entanto, esse intervalo é bem acima do valor pelo qual as células podem sentir a rigidez subjacente das lamelas dos pratos com fundo de vidro 31. Além disso, a espessura da camada de ECM utilizados para detectar a degradação (gelatina e fibronectina marcada com FITC revestida sobre a AAP) foi previamente relatada como cerca de 1 um de espessura 12; portanto, essa fina camada de não proteger as células contra a rigidez do AAP. No entanto, detritos sólidos, rachaduras e outras deformidades ou o SAP e / ou camada de ECM pode afetar celulares propriedades invasivas e contráteis individuais. Estes problemas podem ser causados por impuros lamelas 12 milímetros que introduzem os detritos para os hidrogéis, secagem excessiva dos géis e / ou gelatina, e aspiração incompleto de boro-hidreto de sódio, que pode deixar bolhas que deformam a camada de ECM. Portanto, é preciso ter cuidado ao selecionar cells para imagiologia para garantir que eles não sejam indevidamente influenciado por irregularidades locais nas superfícies das amostras.
Concentrações relativamente elevadas de fibronectina tanto na SAP (misturados em 200-230 ng / ml) e a camada de ECM (sobreposto ao gelatina a 50 ug / ml) foram usados; no entanto, as concentrações reais em cada superfície não foram medidos directamente. Enquanto cada superfície parece estar saturado com fibronectina, não está claro se as células experimentar as mesmas densidades ligando exatas entre os dois ensaios. Para os ensaios de força de tracção, a 200 nm microesferas a uma diluição de 1: 125 provaram ideal para imagiologia. No entanto, é muito comum encontrar outros grupos utilizando microesferas de diferentes diâmetros ou diluições. Neste sistema, as microesferas menores exibido movimento Browniano dentro do SAP, enquanto que microesferas maiores causado fissuras e deformidades. Estas observações são muito provavelmente devido às propriedades físicas do PAA (isto
No geral, muitos desses fatores experimentais pode ser ajustada com base nas necessidades do usuário, como PAAs com diferentes propriedades mecânicas, as células cancerosas com diferentes propriedades invasivas e contráteis, e sistemas de microscopia com outros recursos de imagem. A proporção de acrilamida: BIS pode ser variada para produzir PAA com módulos elásticos semelhante ou diferente e 27 reticulação. A sensibilidade dos ensaios de força de tracção pode ser ajustado para dar conta diferentes níveis de força celular, alterando a rigidez e / ou microesferas dilutde iões. Fluoróforos diferentes, também pode ser escolhido para imunofluorescência e marcação com base em fibronectina especificações microscópio. Enquanto FITC faz lixívia, é bastante brilhante degradação tomada ECM facilmente identificável. No entanto, imagens de fluorescência de invadopodia e pequenas microesferas normalmente requer objetivos NA elevados para resolução ideal. Além disso, ambos os ensaios podem ser realizados em lamelas de vidro em placas de poços. No entanto, com fundo de vidro pratos são muito mais fáceis de preparar e usar todo o processo experimental. No futuro, combinando estes ensaios em um permitiria a visualização direta de ambos degradação ECM e geração de força celular. No entanto, vários desafios técnicos surgiria incluindo imagens ao vivo de células para invadopodia e microbead deslocamentos, o aumento da exposição à luz celular, branqueamento da fibronectina com FITC, e se as forças de tracção são completamente transduzida através da camada de ECM marcado por fluorescência e de ligação cruzada para as superfícies PAA .
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Disclosures
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número K25CA143412 (Parekh). Gostaríamos de reconhecer que o apoio adicional foi fornecido pelo Departamento de Otorrinolaringologia. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health.
Acknowledgments
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Acrylic acid NHS ester | Sigma-Aldrich | A8060 | prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | can also use rhodamine |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | prepare fresh 10% solution in 1x PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | use 6 drops to fill microwells |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Bovine serum albumin | RPI | A30075 | make 3% for blocking solution in 1x PBS and store in 4 °C |
| Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| dialysis tubing | Sigma-Aldrich | D9777 | pre-equilibrate in borate buffer for 15 - 30 min |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | use to make invadopodia medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | use to make acrylic acid NHS ester solution |
| Epidermal growth factor | Life Technologies | PHG0311 | use to make invadopodia medium |
| Ethanol | PHARMCO-AAPER | E200 | dilute with ultrapure water to 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | use to make invadopodia medium |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | protect from light |
| Gelatin | Polysciences | 00639 | typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| Glass bottom dishes (35 mm coverslips) | MatTek | P35G-0-14-C | coverslips are uncoated |
| Glutaraldehyde (25%) | Polysciences | 01909 | dilute with 1x PBS to 0.5% |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody | Life Technologies | A21050 | |
| Human plasma fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | use to make 10x PBS stock |
| Mouse anti-cortactin 4F11 antibody | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | use to make 10x PBS stock |
| NaCl | RPI | S23020 | use to make 10x PBS stock and borate buffer |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | dilute with ultrapure water to 0.1 N |
| Nu-Serum (low-protein serum) | BD Biosciences | 355500 | use to make invadopodia medium |
| Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | typically make 10% stock in 1x PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl) |
| PBS (sterile) | Cellgro | 21-040-CV | use for cell culture |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | use to make invadopodia medium |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1x PBS |
| Sodium metaborate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | S0251 | use to make borate buffer |
| Sucrose | RPI | S24060 | typically make 10 ml of 1% sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 °C (preheat PBS to dissolve gelatin easily) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | make 10% stock in 1x PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1x PBS for staining |
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