Abstract
Bestemmelse af virkningsmekanismen af bioaktive stoffer er af interesse for en bred vifte af akademiske, farmaceutiske og industrielle forskere. Saccharomyces cerevisiae, eller spirende gær, er en model eukaryot, for hvilken en komplet samling af ~ 6.000 gendeletion mutanter og hypomorphic essentielt gen mutanter er kommercielt tilgængelige. Disse samlinger af mutanter kan anvendes til systematisk at påvise kemisk-gen-interaktioner, dvs. gener er nødvendige for at tolerere et kemikalie. Denne information igen, rapporterer om den sandsynlige virkningsmåde af forbindelsen. Her beskriver vi en protokol til hurtig identifikation af kemisk-genetiske interaktioner i spirende gær. Vi viser fremgangsmåden ved anvendelse af kemoterapeutiske middel 5-fluoruracil (5-FU), som har en veldefineret virkningsmekanisme. Vores resultater viser, at den nukleare TRAMP RNA er behov exosom og DNA reparation enzymer for proliferation i nærvær af 5-FU, hvilket er konsistent med tidligere microarray baserede stregkoder kemiske genetiske tilgange og viden om, at 5-FU negativ indflydelse både RNA og DNA metabolisme. De nødvendige validering protokoller fra disse high-throughput skærme er også beskrevet.
Introduction
De genetiske værktøjer og ressourcer til rådighed i modelorganismen Saccharomyces cerevisiae har aktiveret omfattende genomik undersøgelser, som tilsammen giver ny indsigt i, hvordan generne fungerer som netværk for at opfylde kravene i biologiske systemer. Hjørnestenen i disse værktøjer var den kollaborative oprettelsen af et komplet sæt af ikke-væsentlige gendeletioner af alle åbne læserammer i gær 1,2. Et slående observation var, at kun ~ 20% af gær-gener er nødvendige for levedygtighed, når de dyrkes som haploider under standard laboratoriebetingelser. Dette understreger evne en celle til buffer mod genomiske forstyrrelser gennem anvendelse af alternative biologiske veje. Genetiske mutanter, der er levedygtige individuelt, men dødelig i kombination, signalerer tilsluttet eller konvergente parallelle biologiske veje og danne genetiske interaktionsnetværk der beskriver biologiske funktion. Med udviklingen af betingede temperature følsomme og hypomorphic alleler af essentielle gener teknologien er ikke begrænset til studiet af ikke-væsentlige gener 3,4. Dette koncept er blevet anvendt på et genomisk skala producerer en fordomsfri genetisk samspil kort viser, hvordan gener involveret i lignende cellulære processer klynge sammen 5.
Kemiske perturbationer af genetiske netværk efterligner gendeletioner (figur 1) 6. Forespørger vækstinhiberende forbindelser mod en high-density array af deletionsstammer for overfølsomhed identificerer en kemisk-genetisk samspil profil, dvs. en liste over gener, er forpligtet til at tolerere kemisk stress. Ligesom genetiske interaktioner, har store skærme af kemiske biblioteker vist, at forbindelser med en lignende virkningsmekanisme klynge sammen 7. Derfor ved at etablere den kemisk-genetiske interaktion profil af en forbindelse virkningsmekanismen kan udledes ved at sammenligne den med larGE-skala syntetisk genetiske og kemiske genetiske interaktion datasæt 8,9.
Store kemiske-genetiske skærme, hvor snesevis af forbindelser er afhørt, er blevet udført af stregkode konkurrence- assays. I denne tilgang, er de fælles samling af deletionsstammer dyrket massevis i flere generationer i en lille mængde af medier, der indeholder et kemikalie. Da hver deletionsmutanten huser en unik genetisk stregkode, er levedygtigheden / vækst af individuelle mutanter inden puljen af deletionsstammer spores af microarray eller high-throughput sekventering 10.
Formode fitness ved at overvåge koloni størrelse på fysisk grupperede mutanter dyrket på fast agar indeholdende en bioaktiv forbindelse er også en effektiv metode til at identificere kemiske-genetiske interaktioner 11,12. Denne fremgangsmåde giver en omkostningseffektiv alternativ til konkurrence-baserede screening og er velegnet til at analysere små biblioteker af kemikalier.Her skitserede er en simpel metode til at producere en liste over kemiske-genetiske interaktioner i S. cerevisiae, der ikke er afhængig af molekylærbiologiske manipulationer eller infrastruktur. Det kræver kun en gær sletning samling, en robot eller manuel pinning apparat, og frit tilgængelig billedanalyse software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Den generelle arbejdsgang med denne procedure er beskrevet i figur 2.
1. Bestemmelse af væksthæmmende Dose
- Fremstilling af gær overnatskultur
BEMÆRK: gær-ekstrakt-pepton-dextrose vækstmedier (YEPD), der anvendes i denne protokol er en standard opskrift 13.- Træk ud BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) celler på en YEPD agarplade og inkuberes i 48 timer ved 30 ° C eller indtil synlige kolonier dannes.
- Forbered overnatskulturer ved inokulering 5 ml YEPD flydende medier i en steril kultur fartøj med en enkelt koloni. Inkuber natten over ved 30 ° C med kontinuerlig rotation eller rystning. Kulturen vil typisk nå mætning ved morgen (~ 2 x 10 8 celler / ml).
- Fast præparat agarmedier indeholdende varierende kemiske doser
- Forbered flere lagre afkemikaliet skal testes på 100x ønskede slutkoncentration i et passende opløsningsmiddel.
BEMÆRK: Effektive koncentrationer vil afhænge af de kemiske, og skal bestemmes empirisk. Det er derfor tilrådeligt at begynde med at teste en bred endelig koncentrationsområde, altså fra lav pM til høj mM. - For hver koncentration af kemikalie, der skal testes, portion 3 ml smeltet YEPD agar til en flere steril kultur rør. Anbring i 55 ° C vandbad for at holde fra at størkne.
- For hver koncentration af kemikalie, der skal testes tilsættes 30 pi af 100x forbindelsen til smeltet medier, vortex 2-3 sek at blande og pipette 1 ml i hvert par af dublerede brønde i en 12-brønds plade. Vær sikker på at inkludere et køretøj kun kontrol. Tillad plader for at indstille natten over ved stuetemperatur. Kassér eventuelle ekstra medie.
- Forbered flere lagre afkemikaliet skal testes på 100x ønskede slutkoncentration i et passende opløsningsmiddel.
- Spread plating celler
- Podes 10 ml YEPD flydende medier med 2 pi af en mættet gærkultur, dyrket natten over som i trin 1.1.2.
- Plate 25 pi fortyndet gærkultur per brønd, jævnt fordelt ved hjælp af sterile glasperler eller stang, og lad pladen tørre under en flamme. Inkuber plade ved 30 ° C i 48 timer.
- Evaluer væksten af gær (både samlet antal og størrelse af kolonier) på pladerne. Vælg en sub-letal koncentration af forbindelse, der ikke inhiberer vækst med mere end 10% -15% for at udføre skærmen.
2. Systematisk Chemical Genetisk Screen
- Vedligeholdelse af deletion-mutant-array (DMA) og udarbejdelse af Source Plate
- For en detaljeret beskrivelse af, konstruere deletionsmutant arrays fra glycerol lagre henvises til Baryshnikova et al. 14. Når deletionsmutanter er blevet opstillet ved en densitet på 384 kolonier per plade, kan DMA opbevares i flere måneder ved 4 ° C. Gentagne på YEPD-agar indeholdende 200 ug / ml G418 som nødvendigt for at forhindre kolonier at vokse i hveranden.
Bemærk: Flere serielle gentagelser bør undgås for at forhindre tab af langsomtvoksende stammer og minimere forekomsten af suppressor mutanter. Dette er især relevant, hvis opretholdelse samlingerne som haploider. - Udfør alle replika-plating trin ved hjælp af en mikrobiel arraying robotsystem. Alternativt, manipulere klædt kolonier ved hjælp af manuelle pinningcentre værktøj.
BEMÆRK: gær deletion samling er tilgængelig som haploider og diploider fra flere kommercielle kilder og er typisk leveres som glycerolstamopløsninger i 96-brønds plader.
- For en detaljeret beskrivelse af, konstruere deletionsmutant arrays fra glycerol lagre henvises til Baryshnikova et al. 14. Når deletionsmutanter er blevet opstillet ved en densitet på 384 kolonier per plade, kan DMA opbevares i flere måneder ved 4 ° C. Gentagne på YEPD-agar indeholdende 200 ug / ml G418 som nødvendigt for at forhindre kolonier at vokse i hveranden.
- Kondenserende deletionsmutanten matrix
- Forbered 250 ml YEPD agarmedier indeholdende 200 ug / ml G418. Den effektive koncentration af G418 kan variere, og hvert parti skal testes empirisk.
- Fremstilles fem YEPD agarplader ved at hælde 50 ml YEPD-agar indeholdende 200 ug / ml G418 pr plade. Gøre dette én dag før kondensering arrayet og lade pladerne til afkøling ved stuetemperaturratur natten over på en flad jævn overflade.
BEMÆRK: Fire plader vil være behov for indsamling på 1.536-stammen tæthed, er den femte plade hældes som en ekstra. - Fjern de 16 petriskåle indeholdende mutant deletion samling med en tæthed på 384 kolonier per plade, og gøre det muligt at komme til stuetemperatur (~ 1 time).
- Tør kondens, der har dannet på låget af hver plade ved hjælp af en delikat opgave tørre. I modsat fald kan resultere i vanddråber deponeres på array'et og krydskontaminering af opstillede mutanter.
- Ved hjælp af en mikrobiel matrix pinning robot, kondensere DMA fra en densitet på 384 kolonier per plade (16 petriskåle) til 1.536 kolonier per plade (4 petriskåle). Udfør denne, således at 1. koloni fra plade 1 ben til række 1 kolonne 1 i kondenserede array, til den 1. koloni af plade 2 række 1 kolonne 2, den 1. koloni af pladen 3 til række 2 og kolonne 1, og den 1. koloni af pladen 4 til række 2kolonne 2.
- Inkubér konsoliderede matrix ved 30 ° C natten over.
- Undersøg array at sikre en ensartet overførsel af kolonier fra kilde plader. Der vil være flere blanke positioner, med vilje indarbejdet i array, der tjener som en guide til at sikre DMA er kondenseret korrekt (figur 4A).
BEMÆRK: Disse vil være kilde plader til replikaudpladning på medier, der indeholder testforbindelsen. En enkelt kilde plade kan bruges til flere pinnings. Også mange robotter vil have en modgående funktion, som sikrer tilsvarende tal for gær bliver overført hver gang.
- Replika plade deletionsmutant matrix
- Forbered 700 ml kontrol (køretøj alene) og 700 ml eksperimentel medier (kemisk-holdige). Det er nok til at udføre analysen i tre eksemplarer (12 plader pr betingelse, plus to ekstra).
- Hæld 50 ml YEPD agar indeholdende teststof eller kontrol pr plade. Lad pladerne to afkøle ved stuetemperatur natten over på en flad jævn overflade.
- Brug af robotten til replika plade inokuleres DMA på tre sæt plader indeholdende kemikalier på den eksperimentelt bestemte koncentration, samt tre sæt plader indeholdende vehikelkontrollen. Pladerne inkuberes ved stuetemperatur i 24-48 timer.
3. Imaging Plader og Data Analysis
- Fjern pladerne fra inkubatoren og give dem mulighed for at komme til stuetemperatur (~ 1 time) før billeddannelse. Dette vil forhindre kondensdannelse mens billeddannelse pladerne.
- Billede plader på 24 og 48 timer ved at fjerne låget og placere forsiden nedad på en flad seng scanner. Tag billeder med en opløsning på mindst 300 dpi. Alternativt kan du bruge et digitalt kamera til at tage billeder. Hvis det gøres, placeres pladerne står op på en mørk baggrund og fjerne lågene til billedet.
BEMÆRK: Filformatet og positionering af pladerne vil afhænge af kvantificering program anvendes. Udfør kvantificering og sammenligning af array-koloni størrelser ved hjælp af en af flere open source programmer, herunder balony 15, SGAtools 16, og ScreenMill 17.
4. Validering af skærmen
BEMÆRK: På dette tidspunkt flere gær deletioner mutanter vil score så overfølsomme over for den kemiske af interesse. Disse kemiske-genetiske interaktioner skal næste valideres på to måder. Først identiteten af følsomme stammer bør bekræftes ved PCR. For det andet skal kemisk følsomhed uafhængigt scoret. Nedenfor redegøres er en kort protokol til udførelse spotting analyser at validere stamme overfølsomhed, en teknik almindelig i gær biologi.
- Træk ud ønskede (allergisk) mutanter fra gær deletion samling på YEPD-agar indeholdende 200 ug / ml G418. Inkuber ved 30 ° C, indtil kolonier dannes. Kontroller genotypen af stammen ved diagnostisk PCR med primere ifølgeproducentens protokol.
- Podes 5 ml YEPD væske til hver stamme og inkuberes natten over ved 30 ° C med rotation eller rystning.
- Mål OD 600 og fortyndes stamme til OD600 = 1 i sterilt dH 2 O. Det er nu de normaliserede gærkulturer.
- Dispenseres 100 pi normaliseret vildtype-gær (BY4741) kultur til brønd A1 i en 96-brønds plade. Dispenser 100 pi yderligere op til syv stammer til brønde B1-H1.
- Brug en multikanalpipette til at dispensere 90 pi sterilt dH 2 O til brønde A2-H2 gennem A6-H6. Endelig udarbejde en række 1:10 fortyndinger af normaliserede gærkulturer. Start med serielt pipettering 10 pi kolonne 1 til kolonne 2 med en multikanalpipette og fortsætte på tværs af 96-brønds pladen, indtil seks fortyndinger fremstilles (dvs. 10 0 til 10. -5).
- Overfør 2-5 pi af fortyndet gærkulturer i et gitter ved hjælp af en multikanalpipette på YEPD faste medier indeholdende kemiske og køretøj kontrol. Pladerne inkuberes ved den passende temperatur i 24-48 timer.
- Undersøg plader og sammenligne følsomheden af udvalgte mutanter til kemisk (i forhold til BY4741 kontrol). Billede plader på 24 og 48 timer som i trin 3.2.
BEMÆRK: Mens identifikationen af flere overfølsomme stammer med tilhørende gen ontologier eller funktioner giver tillid til gyldigheden af skærmen, transformation af en overfølsom sletning stamme med et plasmid indeholdende et vildtype kopi af genet er forpligtet til formelt at fastslå, at et gen sletning af interesse (og ikke skjulte andet sted mutationer) forårsager narkotika følsomhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en validering af denne fremgangsmåde udførte vi en repræsentativ kemisk genetisk skærminteraktion af det kemoterapeutiske middel 5-fluoruracil (5-FU) efter det ovenfor beskrevne protokol. 5-FU er kendt for at forstyrre thymidylatsyntase samt DNA og RNA metabolisme 18. De kemiske genetiske interaktioner af 5-FU er godt undersøgt og er blevet undersøgt af gær stregkode microarray teknikker, der anvender både heterozygote og homozygote sletning samlinger 8,19. Her viser vi, at lignende resultater kan opnås ved sammenlignende kvantificering af mutant koloni størrelse.
Det skal bemærkes, at skærmen udføres udnytter ikke-essentielle haploid gendeletion samling. Denne type skærm kan også udføres under anvendelse diploide stammer, temperaturfølsomme mutanter og hypomorphic alleler, således at optagelse af essentielle gen mutanter. En fordel at udnytte det haploide sletning samling øges lægemiddel Sensitivity af target veje på grund af den fuldstændige mangel på genproduktet. Er dog to væsentlige ulemper, essentielt gen overfølsomhed ikke kan forespørges, og det haploide kollektionen er tilbøjelig til spontane suppressor mutationer, der er udvalgt til over flere opformeringer. Dette kan føre til en forringelse af samlingen. Således er der en iboende afvejning mellem integritet og bredden af grupperingen og følsomhed over for lægemiddelvirkning. Dette skal tages i betragtning, og den mest hensigtsmæssige mutant samling vælges på grundlag af den ønskede anvendelse.
For det første at den relevante sub-dødelige koncentration af 5-FU anvendes i skærmen blev bestemt til at være 10 pM ved at dyrke BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) celler på stigende koncentration af 5-FU og visuelt evaluere gær koloni vækst ( Figur 3A). Alternativt kan lignende resultater opnås ved dyrkning Iast i mikrotiterplader i flydende kultur og hyppig overvågning af kulturer optisk densitet under anvendelse af en mikropladelæser (figur 3B), som skitseret af tidligere grupper 10,20.
Brug af Singer ROTOR blev gæren DMA gentaget på 1.536 kolonier per plade densitet på medium indeholdende 10 uM 5-FU eller et dimethylsulfoxid (DMSO) kontrol (figur 4A). Disse plader blev inkuberet i 24 timer ved stuetemperatur og afbildes på en flad bed scanner. Colony størrelse måling for hver mutant på begge eksperimentelle og kontrol pladerne blev udført under anvendelse balony billedanalyse motor 15. Balony software beregner størrelsen forholdet kolonier på den eksperimentelle opstilling i forhold til kontrol. Brugeren er i stand til at indstille et forhold tærskelværdi og hvis skærmen er udført i mindst tredobbelte en p-værdi vil blive tildelt hver mutant. I vores repræsentative screen mutanter, som viste et forhold på ≤0.8 blev overvejeed at være hits. Resultaterne af kolonien kvantificering kan præsenteres grafisk ved at plotte størrelsesforholdet for hver koloni på y-aksen og gendeletion bestilt af matrix position (figur 4B) eller forhold (figur 4C) på x-aksen.
Syntetisk syge / kan dødbringende mutanter identificeret i skærmen grupperes ud fra funktionsbeskrivelser ved at udføre gen ontologi (GO) analyse. Der er flere offentligt tilgængelige værktøjer til GO analyse af lister over S. cerevisiae gener; herunder Funspec 21, DAVID Bioinformatik Database 22,23, og Saccharomyces Genome Database (SGD) Go Term Finder 24. Gendeletioner der havde et forhold på mindre end eller lig med 0,8 i skærmbilledet 5-FU blev anvendt som input liste for Funspec. Funspec accepterer en liste over systematisk eller fælles gærgen navne og udsender referater af gen-ontologier, funktionelle klassifikationer, lokalisering, protein komplekser samt othendes nyttige klassificeringer, som er beriget på denne liste. Det repræsentative skærm udført viste en berigelse af ontologier for RNA metabolisme, herunder tRNA vakler, uridin modifikation og RNA overvågning maskiner, og respons på DNA-skader (tabel 1). Disse resultater er enig med tidligere undersøgelser, der har vist 5-FU behandling resulterer i ophobning af polyadenylerede ikke-kodende RNA, som behandles af den nukleare TRF / Rrp6 / Luft / Mtr4 polyadenylerings (TRAMP) exosome 25. Således disse resultater er i overensstemmelse med tidligere kemiske genetiske skærmbilleder og den kendte mekanisme af 5-FU bioaktivitet 8,19.
Som med alle high-throughput funktionelle genomiske metoder er det nødvendigt at validere resultaterne. For at validere kemiske genetiske interaktioner gærmutanter skal først PCR-valideret med primere, der annealer inden for målsætningen genets promotor og KANMX forstyrrelser kassette. Udvælgelse af stammer til gyldigtion er noget vilkårlige, men prioritering mutanter, der viser en stærk fænotype og gruppe funktionelt giver et godt udgangspunkt. Dernæst er overfølsomhed over for et kemikalie bekræftet ved hjælp spotting assays, en fælles tilgang til måling af egnethed gærmutanter. Til dette formål er seriefortyndinger af gærstammer spottet i et gitter på medier indeholdende passende kemiske dosis såvel som en kontrol. Som et eksempel, bekræfter vi kemiske genetiske vekselvirkning af 5-FU med AIR1 og trf5 mutanter af TRAMP-komplekset (figur 5). Disse gener koder for komponenter af TRAMP exosom. Vi bemærker, at rrp6 stamme, der mangler kernen 3'-5'-exonukleaseaktivitet af TRAMP, gik tabt i vores laboratorium high-density DMA kollektion. Ved opnåelse af en frisk rrp6 mutant bekræfter vi, at rrp6 og 5-FU også vise en kemisk genetisk interaktion, at fastslå, at TRAMP aktivitet er forpligtet til at tolerere 5-FU. Dette illustrererat integriteten af stor deletion samlinger kan blive kompromitteret over tid, hvilket gør korrekt DMA vedligeholdelse og stamme validering kritisk.
Vores skærmen også identificeret mutanter i flere DNA reparation enzymer (herunder RAD50, rad52 og MRE11) som 5-FU følsomme. Scoring af koloni angivne størrelse relative egnethed af disse mutanter på 10 uM 5-FU som 0,7, 0,65 og 0,42 sammenlignet med vildtype. Baseret på vores genfremsatte spotting assays (figur 5), er en undervurdering sandsynligvis disse værdier på grund af den begrænsede dynamikområde fitness måling ved kolonistørrelse scoring. Dette understreger en anden grund til selvstændigt bekræfte interaktioner ved seriel spotting: størrelsen af nogle kemiske genetiske interaktioner kan undervurderes i dataanalyse primære. Vores resultater viser, at en vækst baseret kemisk genetisk skærm udført med ~ 4.800-stammen haploide sletning indsamling, i tre eksemplarer, giver tilstrækkelig resol ution trygt isolere specifikke kemiske genetiske interaktioner.
Figur 1:. Skematisk fremstilling af kemiske Genetiske Interaktioner Gene deletioner, der resulterer i overfølsomhed over for kemiske perturbation muliggøre identifikation af biologiske processer er omfattet af et kemikalie. (A) Konvergent veje kan forstyrres af enten gendeletion (geneA) eller kemisk (geneB). Individuelt kan disse cellulære fornærmelser tolereres på grund af den iboende redundans i biologiske veje. Men i kombination cellelevedygtighed er kompromitteret resulterer i enten en syntetisk syg eller dødelig fænotype. (B) Sletning af gener (geneC) kritiske til at mildne kemisk induceret stress også forårsage overfølsomhed og angiver biologiske veje afbrudt ved kemisk behandling. jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2: Workflow for Kemisk Genetisk Screen (A) Bestemmelse af sub-hæmmende dosis:. Forældrekontrol gærstammer dyrkes til stationær fase, fortyndet 1: 5000, og spredning belagt på faste YEPD medier indeholdende stigende kemisk dosis. Den højeste koncentration der ikke er større end 10-15% vækstinhibering er valgt til screening mod DMA. (B) Systematisk Kemisk Genetisk skærm: Ved hjælp af en high-throughput-array pinning robot S. cerevisiae DMA er replika udpladet på medier indeholdende den passende koncentration af teststoffet. Pladerne inkuberes ved stuetemperatur i 24-48 timer, afbildes, og den relative koloni størrelse bestemmes.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3 :. Bestemmelse af Sub-inhiberende koncentration. (A) Vækst af BY4741 celler på faste medier, der indeholder 5-fluouracil. Mættet BY4741 kultur fortyndet 1: 5.000 og udpladet på stigende koncentrationer af 5-fluorouracil. (B) Vækstkurve af BY4741 celler i flydende medier indeholdende 5-fluoruracil. ~ 4 × 10 4-celler blev deponeret i tre eksemplarer i stigende koncentrationer af 5-FU og OD blev målt hver 10 min i 22 timer.
Figur 4: Kemisk Genetisk Screen 5-Fluorouracil. (A) S. cerevisiae deletionsmutant matrix replikeres på YEPD-agar indeholdende 10 uM 5-FU (til højre) og DMSO kontrol (venstre). (B) Resultater af kemiske Genetisk Screen: Relativ vækst af mutanter på 10 uM 5-FU i forhold til DMSO-kontrol bestilt af matrix position. (C) relative vækst af mutanter på 10 uM 5-FU i forhold til DMSO-kontrol bestilt af koloni størrelsesforhold. Et forhold tærskel på ≤0.8 er angivet på begge grafer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5: Validering af kemiske genetisk samspil. Serielle fortyndinger af flere isolerede mutantstammer dyrket på DMSO kontrol (A), 10 uM 5-FU (
| GO Kategori | P-værdi | Generne identificeret (hits) | # hits | Samlet # af gener i GO Kategori |
| tRNA wobble uridin modifikation [GO: 0002098] | 2,24 × 10 -6 | SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 TUM1 ELP3 | 7 | 24 |
| transskription, DNA-afhængige [GO: 0006351] | 1,69 × 10 -5 | PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 gcr2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 | 32 | 540 |
| oversættelse [GO: 0006412] | 4,28 × 10 -5 | RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7 RPS19B RPS19A RPS7A | 22 | 318 |
| tRNA wobble position uridin thiolering [GO: 0002143] | 1,88 × 10 -4 | NCS6 URM1 TUM1 | 3 | 5 |
| regulering af transskription, DNA-afhængig [GO: 0006355] | 4,98 × 10 -4 | PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 SWI3 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 gcr2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 | 27 | 507 |
| protein urmylation [GO: 0032447] | 6.33 × 10 -4 | NCS6 URM1 URE2 | 3 | 7 |
| mRNA eksport fra kernen som respons på varmestress [GO: 0031990] | 2,04 × 10 -3 | RPB4 NUP120 NUP133 | 3 | 10 |
| nuklear polyadenylering-afhængig CUT kataboliske proces [GO: 0071039] | 2,04 × 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 10 |
| tryptophan metaboliske proces [GO: 0006568] | 2.15 × 10 -3 | TRP5 TRP3 | 2 | 3 |
| tidlig endosom til Golgi transport [GO: 0034498] | 2,75 × 10 -3 | ENT5 TCA17 RCY1 | 3 | 11 |
| ribosomale lille underenhed biogenese [GO: 0042274] | 3,63 × 10 -3 | SAC3 LTV1 RPS19B RPS19A | 4 | 24 |
| kromatin modifikation [GO: 0016568] | 3,64 × 10 -3 | LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ASH1 SGF11ELP3 | 9 | 114 |
| ATP metaboliske proces [GO: 0046034] | 4,23 × 10 -3 | VMA2 VMA1 | 2 | 4 |
| vakuolær proton-transport V-typen ATPase kompleks samling [GO: 0070072] | 4,23 × 10 -3 | VMA21 VPH2 | 2 | 4 |
| kromosom lokalisering [GO: 0050000] | 4,23 × 10 -3 | NUP120 NUP133 | 2 | 4 |
| mRNA transport [GO: 0051028] | 4,59 × 10 -3 | DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 | 6 | 58 |
| vakuolær forsuring [GO: 0007035] | 4,89 × 10 -3 | VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 | 4 | 26 |
| rRNA eksport fra kernen [GO: 0006407] | 5.63 × 10 <sup> -3 | NUP120 NUP133 RPS19B RPS19A | 4 | 27 |
| endocytose [GO: 0006897] | 6,57 × 10 -3 | SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 VPS1 end3 | 7 | 82 |
| overvågning nukleare mRNA af mRNA 3'-ende behandling [GO: 0071031] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 MPP6 | 2 | 5 |
| ncRNA polyadenylering [GO: 0043629] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| nuklear polyadenylering-afhængig snoRNA kataboliske proces [GO: 0071036] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| nuklear polyadenylering-afhængig snRNA kataboliske proces [GO: 0071037] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| tryptophan biosyntetiske proces [GO: 0000162] | 6,92 × 10 -3 | TRP5 TRP3 | 2 | 5 |
| protein indsættelse i ER membranen [GO: 0045048] | 6,92 × 10 -3 | GET1 GET4 | 2 | 5 |
| mRNA stabilisering [GO: 0048255] | 6,92 × 10 -3 | ATP25 IGO1 | 2 | 5 |
| respons på DNA beskadigelse stimulus [GO: 0006974] | 7,05 × 10 -3 | MUS81 RAD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 DEF1 MMS22 RAD52 MRE11 RAD50 RMI1 | 12 | 197 |
| GO Kategori | P-værdi | Generne identificeret (hits) | i "> # hitsSamlet # af gener i GO Kategori | |
| nuklear polyadenylering-afhængig rRNA kataboliske proces [GO: 0071035] | 8.46 × 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 16 |
Tabel 1: Gene ontologi (GO) Karakterisering af 5-fluoruracil mutanter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her skitserede er en tilgang til at generere kemisk-genetiske interaktion profiler. Fremgangsmåden er enkel: ved at sammenligne koloni størrelser af hver stamme i omfattende gendeletion samlinger i nærvær og fravær af et kemikalie, alle gener, der er nødvendige til at tolerere en kemisk skade identificeret. Annotation berigelse analyse af den resulterende liste over følsomme stammer kan derefter anvendes til at give indsigt i en kemisk virkemåde. Selv denne protokol er blevet optimeret til knopskydende gær, kan det også være indrettet til brug med andre grupperede mikrobielle sletning samlinger, såsom E. coli Keio samling, som er blevet anvendt med succes til at probe flere hundrede cellulære perturbationer 26,27.
Kemisk-genetisk profilering i gær og andre organismer er veletableret. De fleste af disse undersøgelser har påberåbt sig konkurrencemæssige analyser, kvantificere pooled deletionsmutanter gennem microarray analyse eller high-throughput sequder lever af unikke genetiske stregkoder. Denne fremgangsmåde har vist sig at være en succes i at producere robuste kemisk-genetiske profiler af store kemiske biblioteker. Den her beskrevne metode giver et nyttigt alternativ til kemisk-genetisk analyse af et mindre antal testforbindelser. Assayet tilvejebringer en enkel udlæsning, der er mindre omkostningerne uoverkommelige end høj-throughput sekventering eller microarray analyse og ikke lider sekvens bias. Mens protokollen som skitseret kræver en robot instrument til koloni manipulation, er sådanne systemer bliver mere overkommelig og skiftevis protokollen kan modificeres til brug med manuelle pinningcentre værktøjer, eksempler, som er optaget på listen over materialer.
Det er vigtigt at være opmærksom på begrænsningerne i denne fremgangsmåde og kemisk genetiske profiler i almindelighed. For det første skal forbindelsen have en virkning på levedygtighed i knopskydende gær, eller den særlige organisme, der anvendes. Mens mange grundlæggende biologiske processerog funktioner er velbevarede blandt eukaryoter, organisme specifikke kemiske genetiske interaktioner kan variere meget, og det samme optagelse af kemikalier i celler. Det skal også bemærkes, at flere deletionsstammer har vist sig at være følsomme over for multiple lægemiddelbehandlinger 8. Disse omfatter gener involveret i drug efflux, vakuolær funktion, og membranintegritet. Det er vigtigt at tage hensyn til multiresistens, når de foretager konklusioner med hensyn til direkte og indirekte virkemåder.
Den her beskrevne skærm blev udført ved hjælp af den haploide sletning indsamling, en fælles tilgang til kemisk-genetisk analyse i gær. Der er nu flere samlinger af gærmutanter rådighed for yderligere støtte i bestemmelsen af en kemisk forbindelse virkningsmekanisme. Dette omfatter ikke kun det komplette homozygot og heterozygote diploide sletning kollektioner, men også betingede temperaturfølsomme essentielle gen mutanter, det Decréased Overflod af mRNA Perturbation (DAMP) gær mutant bibliotek og en syntetisk histon H3 og H4 mutant indsamling, som kan anvendes til at undersøge epigenetiske baserede molekylære behandlinger 3,4,28, I betragtning af den utrolige dybde af de værktøjer til rådighed, den lette metoden, og den begrænsede infrastruktur kræves, denne tilgang giver et tilgængeligt format for at få adgang rig funktionel information med hensyn til den mekanisme af en kemisk forbindelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forskningen i CJN laboratoriet er støttet af driftstilskud fra NSERC, den canadiske Cancer Society Research Institute (CCSRI), og den canadiske Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12-well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5 ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10 cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1,000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1,000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
References
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
- Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
- Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
- Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
- Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
- Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
- Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
- Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
- Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
- Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
- Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
- Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
- Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
- Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).
