Abstract
Die Ermittlung der Wirkungsweise von bioaktiven Chemikalien ist von Interesse für ein breites Spektrum von akademischen, pharmazeutischen und industriellen Wissenschaftlern. Saccharomyces cerevisiae oder Bäckerhefe, ist ein Modell, Eukaryoten, für die eine vollständige Sammlung von ~ 6000 Gen-Deletionsmutanten und hypomorphen essentielles Gen Mutanten sind im Handel erhältlich. Diese Sammlung von Mutanten verwendet werden, um systematisch erkennen chemisch-Gen-Interaktionen, dh Gene notwendig, eine chemische tolerieren. Diese Information wiederum berichtet über die wahrscheinliche Wirkungsweise der Verbindung. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die schnelle Identifizierung von chemischen genetischen Wechselwirkungen in Bäckerhefe. Wir zeigen, das Verfahren unter Verwendung des Chemotherapeutikum 5-Fluorouracil (5-FU), die eine wohldefinierte Wirkmechanismus besitzt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Kern TRAMP RNA-Exosom und DNA-Reparaturenzyme sind für die Proliferation in Gegenwart von 5-FU, die im Einklang mit früheren m ist erforderlichicroarray basierten Barcode-Chemie genetische Ansätze und das Wissen, dass 5-FU beeinträchtigt sowohl RNA als auch DNA-Stoffwechsel. Die erforderlichen Validierungsprotokolle dieser Hochdurchsatz werden ebenfalls beschrieben.
Introduction
Die genetischen Tools und Ressourcen im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae haben großen funktionellen Genomik Studien, die gemeinsam ein neues Licht auf, wie Gene funktionieren, wie Netzwerke, um die Anforderungen von biologischen Systemen erfüllen zu können. Der Grundstein dieser Tools war die gemeinsame Erstellung eines vollständigen Satzes von nicht wesentlichen Gendeletionen aller offenen Leserahmen in Hefe 1,2. Eine auffallende Beobachtung war, dass nur ~ 20% der Hefe-Gene sind für die Lebensfähigkeit erforderlich, wenn als Haploiden unter Standardlaborbedingungen gezüchtet. Dies unterstreicht die Fähigkeit einer Zelle, durch die Nutzung alternativer biologischen Bahnen gegen genomische Perturbationen puffern. Genetische Mutanten, die individuell lebensfähig sind, aber tödlich in Verbindung, Signal angeschlossenen oder konvergent parallel biologische Pfade und bilden genetische Interaktionsnetzwerke, die biologische Funktion zu beschreiben. Mit der Entwicklung der bedingten temperature empfindlichen und hypomorphen Allele von essentiellen Genen die Technik nicht auf die Untersuchung von nicht-essentiellen Genen 3,4 beschränkt. Dieses Konzept wurde in einer genomischen Maßstab angewendet produziert eine unvoreingenommene genetische Interaktion Karte darstellen, wie Gene in ähnlichen zellulären Prozessen beteiligt Cluster zusammen 5.
Chemische Störungen der genetischen Netzwerke Mimik Gendeletionen (Abbildung 1) 6. Abfragen von wachstumshemmenden Verbindungen gegen eine hochdichte Anordnung von Deletionsstämme Überempfindlichkeit identifiziert eine chemisch-genetischen Interaktionsprofil, also eine Liste von Genen, die erforderlich ist, um die chemische Beanspruchung verträgt. Wie genetische Interaktionen, Großbildschirme von chemischen Bibliotheken haben gezeigt, dass mit einem ähnlichen Wirkmechanismus Cluster zusammen 7 Verbindungen. Daher wird durch die Gründung der chemisch-genetische Wechselwirkungsprofil von einer Verbindung der Wirkmechanismus kann durch einen Vergleich mit lar entnehmen,ge-Skala synthetischen genetischen und chemischen genetische Interaktion Datensätze von 8,9.
Groß chemisch-genetischen Screens, wo Dutzende von Verbindungen werden verhört wurden von Barcode Konkurrenztests durchgeführt. Bei diesem Ansatz wird die gepoolte Sammlung von Deletionsmutanten ist en masse über mehrere Generationen in einem kleinen Volumen an Medium, das eine chemische gezüchtet. Da jeder Deletionsmutante beherbergt eine einzigartige genetische Barcode wird die Lebensfähigkeit / Wachstum einzelner Mutanten innerhalb des Pools von Deletionsstämme von Microarray-oder Hochdurchsatz-Sequenzierung 10 verfolgt.
Ableitung Fitness durch Überwachung Koloniegröße von physikalisch Array-Mutanten auf festem Agar, der eine bioaktive Verbindung gewachsen ist auch eine wirksame Methode, um chemisch-genetischer Interaktionen 11,12 identifizieren. Dieser Ansatz bietet eine kostengünstige Alternative für den Wettbewerb basierten Screening und zur Bestimmung von kleinen Bibliotheken von Chemikalien geeignet.Hier skizziert ist eine einfache Methode zur Erzeugung einer Liste von chemisch-genetischer Interaktionen in S. cerevisiae, die nicht auf der Molekularbiologie Manipulationen oder Infrastruktur angewiesen ist. Es erfordert nur eine Hefe Löschen Sammlung, einen Roboter oder manuell Pinning Gerät und frei verfügbaren Bildanalyse-Software.
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Protocol
HINWEIS: Der allgemeine Arbeitsablauf dieses Verfahrens ist in Figur 2 skizziert.
1. Bestimmung der wachstumshemmende Dosis
- Herstellung von Hefe-Nacht-Kultur
HINWEIS: Der Hefeextrakt-Pepton-Dextrose Wachstumsmedium (YEPD) im Sinne dieses Protokolls ist ein Standardrezept 13.- Streak aus BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) Zellen auf einer YEPD-Agar-Platte und Inkubation für 48 Stunden bei 30 ° C oder bis sichtbare Kolonien zu bilden.
- Übernachtkulturen herzustellen durch Inokulieren von 5 ml YEPD flüssigen Medium in einem sterilen Kulturgefäß mit einer Einzelkolonie. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C mit kontinuierlicher Rotation oder Schütteln. Die Kultur wird in der Regel erreichen die Sättigung von der Morgen (~ 2 × 10 8 Zellen / ml).
- Solide Agarmedien Zubereitung mit unterschiedlichen chemischen Dosen
- Bereiten Sie einige Vorräte andie Chemikalie bei 100x gewünschte Endkonzentration in einem geeigneten Lösemittel getestet werden.
HINWEIS: Wirksame Konzentrationen werden von der chemischen abhängen und muss empirisch ermittelt werden. Es ist daher ratsam, zunächst zu testen eine breite Endkonzentrationsbereich, dh von niedrigen uM bis hoch mM. - Für jede Konzentration der zu testenden Chemikalie, Aliquot 3 ml geschmolzenem YEPD-Agar mit einem mehrere sterile Kulturröhrchen. Platz in 55 ° C Wasserbad auf erstarrt halten.
- Für jede Konzentration der zu testenden Chemikalie werden 30 ul der 100-fach Verbindung in geschmolzenem Medium, Wirbel 2-3 sec mischen und Pipette 1 ml in jedes Paar von doppelten Vertiefungen einer Platte mit 12 Vertiefungen. Achten Sie darauf, ein Fahrzeug sind nur Kontrolle. Lassen Platten über Nacht bei Raumtemperatur einstellen. Werfen Sie keine zusätzliche Medien.
- Bereiten Sie einige Vorräte andie Chemikalie bei 100x gewünschte Endkonzentration in einem geeigneten Lösemittel getestet werden.
- Verteilt Plattierzellen
- Impfen Sie 10 ml YEPD flüssige Medien mit 2 ul einer gesättigten Hefekultur, über Nacht, wie in Schritt 1 aufgewachsen.1.2.
- Platte 25 ul verdünnt Hefekultur pro Well, gleichmäßig mit sterilen Glasperlen oder Stange und damit die Platte unter einer Flamme trocknen. Inkubieren Platte bei 30 ° C für 48 Stunden.
- Bewerten des Wachstums von Hefe (sowohl Anzahl und Größe der Kolonien) auf den Platten. Wählen einer subletalen Konzentration der Verbindung, die nicht das Wachstum hemmt, um mehr als 10% bis 15%, um den Bildschirm durchzuführen.
2. Systematische Chemical Genetische Bildschirm
- Wartung von Lösch-Mutante-Array (DMA) und Vorbereitung der Quelle-Platte
- Für eine detaillierte Beschreibung über den Aufbau Deletionsmutante Arrays aus Glycerin Aktien finden Sie in Baryshnikova et al. 14 verwiesen. Sobald Deletionsmutanten in einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte angeordnet wurde, kann der DMA für einige Monate bei 4 ° C gelagert werden. Replizieren auf YEPD-Agar, enthaltend 200 ug / ml G418 wie nötig, um Kolonien zu wachsen in jede verhindernandere.
HINWEIS: Mehrere serielle Replikationen sollte vermieden werden, um den Verlust von langsamem Wachstum zu verhindern und das Auftreten von Suppressormutanten minimieren. Dies ist besonders relevant, wenn die Aufrechterhaltung der Sammlungen als Haploiden. - Führen Sie alle Replikat-Plating Schritte mit einer mikrobiellen Anordnen Robotersystem. Alternativ manipulieren angeordnet Kolonien mit manuellen Pinning-Tools.
HINWEIS: Die Hefe Löschen Kollektion ist so Haploiden und Diploide von mehreren kommerziellen Quellen erhältlich und wird in der Regel als Glyzerin in 96-Well-Platten geliefert.
- Für eine detaillierte Beschreibung über den Aufbau Deletionsmutante Arrays aus Glycerin Aktien finden Sie in Baryshnikova et al. 14 verwiesen. Sobald Deletionsmutanten in einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte angeordnet wurde, kann der DMA für einige Monate bei 4 ° C gelagert werden. Replizieren auf YEPD-Agar, enthaltend 200 ug / ml G418 wie nötig, um Kolonien zu wachsen in jede verhindernandere.
- Kondensieren der Deletionsmutante Array
- Bereiten 250 ml YEPD-Agarmedium, enthaltend 200 ug / ml G418. Die effektive Konzentration von G418 können variieren und jede Menge sollte empirisch überprüft werden.
- Bereiten fünf YEPD Agarplatten durch Gießen von 50 ml YEPD-Agar, enthaltend 200 ug / ml G418 pro Platte. Tun Sie dies einen Tag vor Kondensation des Array und damit die Platten bei Raumtemperatur abkühlenratur über Nacht auf eine ebene Unterlage.
HINWEIS: Vier Platten werden für die Sammlung bei 1536-Dehnungs Dichte erforderlich ist, wird die fünfte Platte als extra gegossen. - Entfernen Sie die 16 Petrischalen, die das mutierte Löschen Sammlung bei einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (ca. 1 Stunde) zu kommen.
- Wischen Sie Kondensation, die mit eine heikle Aufgabe wischen auf dem Deckel jeder Platte gebildet hat. Bei Nichtbeachtung kann es zu Wassertröpfchen führen, dass auf dem Array und Kreuzkontamination von angeordneten Mutanten hinterlegt.
- Mit einem mikrobiellen Array Pinning Roboter, kondensieren die DMA von einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte (16 Petrischalen), um 1536 Kolonien pro Platte (4 Petrischalen). Führen Sie diese, so dass der 1. Kolonie von Platte 1 Stifte 1 Spalte 1 der verkürzten Reihe rudern, um die 1. Kolonie Platte 2 Zeile 1 Spalte 2, der 1. Kolonie Platte 3 zu Zeile 2 und Spalte 1, und der 1. Kolonie Platte 4 zu Zeile 2Spalte 2.
- Inkubieren Sie die Konzern-Array bei 30 ° C über Nacht.
- Untersuchen Sie das Array, um eine einheitliche Übertragung von Kolonien von der Quelle Platten zu gewährleisten. Es werden mehrere leere Positionen, absichtlich in das Array aufgenommen, die als Richtschnur dienen, um sicherzustellen, das DMA korrekt (4A) kondensiert sein.
HINWEIS: Diese greift auf die Quellplatten für Replikaplattierung auf Medien, die die Testverbindung sein. Eine Hand Platte kann für mehrere Pinnings verwendet werden. Auch viele Roboter Gegenläufig-Funktion, die eine ähnliche Anzahl von Hefe werden jedes Mal übertragen gewährleisten müssen.
- Replica Platte Deletionsmutante Array
- Bereiten 700 ml der Kontrolle (nur Vehikel) und 700 ml Versuchsmedien (chemische haltigen). Das ist genug, zur Durchführung des Assays in dreifacher Ausfertigung (12 Platten pro Zustand, plus zwei Extrakosten).
- Gießen Sie 50 ml YEPD-Agar, der Prüfsubstanz oder Steuer pro Platte. Lassen Sie die Platten to bei Raumtemperatur über Nacht abkühlen lassen auf eine ebene Unterlage.
- Verwendung des Roboters zu Replikaplatte inokulieren die DMA auf drei Sätze von Platten, die Chemikalien an der experimentell bestimmten Konzentration, sowie drei Sätze von Platten, die die Vehikelkontrolle. Platten bei Raumtemperatur inkubieren 24-48 h.
3. Speicherfolien und Datenanalyse
- Platten Entfernen von Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (ca. 1 Stunde) vor der Bilderzeugung kommen. Dadurch wird die Bildung von Kondenswasser während Abbildung der Platten zu verhindern.
- Bildplatten 24 und 48 Stunden nach Entfernen des Deckels und Platzierung der Vorderseite nach unten auf einem Flachbettscanner. Machen Sie Bilder mit einer Auflösung von mindestens 300 dpi. Alternativ können Sie eine Digitalkamera zur Erfassung von Bildern. Wenn dabei konfrontiert Ort Platten auf einem dunklen Hintergrund, und entfernen Sie den Deckel zu Bild.
HINWEIS: Das Dateiformat und Positionierung der Platten wird auf der Quantifizierung Programm abhängen. Führen Quantifizierung und den Vergleich der Array Koloniegrößen mit einem der vielen Open-Source-Programme, einschließlich Balony 15. SGAtools 16 und ScreenMill 17.
4. Validierung von Screen
HINWEIS: In dieser Phase wird mehrere Hefe-Mutanten Deletionen als überempfindlich auf die Chemikalie punkten. Diese chemisch-genetischer Interaktionen muss nächste auf zwei Arten überprüft werden. Zunächst wird die Identität der empfindliche Stämme sollten durch PCR bestätigt werden. Zweitens müssen die Chemikalien-Sensitivität unabhängig gewertet. Folgenden Abschnitten wird eine kurze Protokoll zur Durchführung von Tests, um Spotting Dehnungsempfindlichkeit, eine Technik, die in Hefe Biologie gemeinsam zu überprüfen.
- Streak out gewünschte (allergisch) Mutanten aus der Deletion Sammlung Hefe auf YEPD-Agar, enthaltend 200 ug / ml G418. Inkubiere bei 30 ° C bis Kolonien bilden. Stellen Sie sicher, das Erbgut des Stammes durch diagnostische PCR mit Primern nachProtokoll des Herstellers.
- Impfen Sie 5 ml der YEPD Flüssigkeit für jeden Stamm beimpft und über Nacht bei 30 ° C mit einer Rotation oder Schütteln.
- Messen OD 600 und verdünnt jede Belastung in sterile dH 2 O OD 600 = 1 Diese werden nun die normierten Hefekulturen.
- Dispense 100 ul der normalisierten Wildtyp-Hefe (BY4741) Kultur und A1 einer 96-Well-Platte. Dispense 100 ul von bis zu sieben zusätzliche Belastungen in die Vertiefungen B1-H1.
- Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette auf 90 ul sterilem dH 2 O in die Vertiefungen A2-H2 bis A6-H6 verzichten. Schließlich bereiten eine Reihe von 1:10 Verdünnungen normalisierte Hefekulturen. Starten Sie durch serielles Pipettieren von 10 ul der Spalte 1 Spalte 2 mit einer Mehrkanalpipette, und weiter über die Platte mit 96 Vertiefungen bis sechs Verdünnungen hergestellt werden (dh 10 0 bis 10 -5).
- Übertragen Sie 2-5 ul der verdünnten Hefekulturen in einem Raster mit einer MehrkanalPipette auf YEPD festen Medien, die chemischen und Fahrzeugsteuerung. Platten bei der geeigneten Temperatur für 24-48 Std.
- Untersuchen Platten und vergleichen Sie die Empfindlichkeit des ausgewählten Mutanten gegen chemische (bezogen auf BY4741-Steuerung). Bildplatten bei 24 und 48 h, wie in Schritt 3.2.
HINWEIS: Während der Identifizierung mehrerer überempfindlich Stämme mit verwandten Gen Ontologien oder Funktionen verleiht Vertrauen auf die Gültigkeit des Bildschirms, Umwandlung eines überempfindlichen Deletionsstamm mit einem Plasmid, das eine Wildtyp-Kopie des Gens wird benötigt, um förmlich festgestellt werden, dass ein Gen, Löschen von Interesse (und nicht versteckt zweiten Standort Mutationen) verursacht Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten.
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Representative Results
Als Validierung dieses Ansatzes Wir führten eine repräsentative chemische genetische Wechselwirkung Bildschirm des Chemotherapeutikum 5-Fluorouracil (5-FU) gemäß dem oben beschriebenen Protokoll. 5-FU ist bekannt, die Thymidylat-Synthase sowie die DNA und RNA-Metabolismus 18 stören. Die chemischen genetischen Wechselwirkungen von 5-FU sind gut untersucht und wurden von Hefe Barcode-Mikroarray-Techniken unter Verwendung von sowohl heterozygote und homozygote Deletion Sammlungen 8,19 untersucht. Hier zeigen wir, dass ähnliche Ergebnisse durch vergleichende Quantifizierung der Mutantenkoloniegröße erhalten werden.
Es sollte beachtet werden, dass der Bildschirm ausgeführt nutzt die nicht wesentliche haploiden Gendeletion Sammlung werden. Diese Art von Bildschirm kann auch unter Verwendung von diploiden Stämmen, temperaturempfindlichen Mutanten und Allele hypomorphen, wodurch die Aufnahme von essentiellen Gen-Mutanten werden. Ein Vorteil bei der Nutzung des haploiden Löschen Kollektion Medikament sensitiv erhöhtkeit von Zielbahnen, da die vollständige Abwesenheit des Genprodukts. Es sind jedoch zwei wesentliche Nachteile, die essentielle Gen Empfindlichkeitsreaktion nicht abgefragt werden, und die haploide Sammlung ist anfällig für spontane Suppressormutationen, die über mehrere Ausbreitungen ausgewählt sind. Dies kann zu einer Verschlechterung der Sammel führen. Somit gibt es eine inhärente Kompromiß zwischen Integrität und Breite der Anordnung und Empfindlichkeit gegenüber Arzneimittelwirkung. Dies muss berücksichtigt werden, und der am besten geeigneten Mutanten Sammlung ausgewählt basierend auf der gewünschten Anwendung.
Zunächst wird die entsprechende subletalen Konzentration von 5-FU in dem Bildschirm verwendet werden war entschlossen, 10 & mgr; M von wachsenden BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) Zellen auf zunehmende Konzentration von 5-FU und visuellen Bewertung Hefekolonie Wachstum ( 3A). Alternativ können ähnliche Ergebnisse durch den Anbau von ihr erhaltenast in Mikrotiterplatten in Flüssigkultur und häufige Überwachung der Kulturen optische Dichte mit einem Mikroplattenleser (3B), in der vorhergehenden Gruppen 10,20 skizziert.
Mit dem Sänger ROTOR wurde die Hefe DMA bei 1536 Kolonien pro Platte Dichte auf Medien mit 10 uM 5-FU oder Dimethylsulfoxid (DMSO) Kontrolle (4A) repliziert. Diese Platten wurden 24 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und auf einem Flachbettscanner abgebildet. Koloniegröße Messung für jede Mutante zu beiden experimentellen und Kontrollplatten wurde unter Verwendung der Bildanalyse Balony Maschine 15. Die Balony Software berechnet das Größenverhältnis der Kolonien auf dem Versuchsanordnung relativ zu steuern. Der Anwender ist in der Lage, ein Verhältnis Schwelle und wenn der Bildschirm in ausgeführt mindestens verdreifachen ein p-Wert wird für jede Mutante zugeordnet werden. In unserer repräsentativen Bildschirm Mutanten, die ein Verhältnis von ≤0.8 zeigten, wurden betrachtened, um Zugriffe zu sein. Die Ergebnisse der Kolonie Quantifizierung kann grafisch durch Auftragen des Größenverhältnisses für jede Kolonie auf der y-Achse und der Gen-Deletion von Feldposition (4B) oder des Verhältnisses (4C) auf der x-Achse geordnet dargestellt werden.
Synthetische krank / tödliche Mutanten auf dem Bildschirm identifiziert werden können, basierend auf Funktionsbeschreibungen, indem Gene Ontology (GO) Analyse zusammengefasst werden. Es gibt mehrere öffentlich zugängliche Werkzeuge für GO Analyse der Listen von S. cerevisiae-Gene; einschließlich Funspec 21. DAVID Bioinformatik Database 22,23 und der Saccharomyces Genome Database (SGD) Go Zeit Finder 24. Deletionen, die ein Verhältnis von weniger als oder gleich 0,8 in der 5-FU-Bildschirm hatten, wurden als Eingabeliste für Funspec verwendet. Funspec akzeptiert eine Liste von systematischen oder gemeinsame Hefegen Namen und gibt Zusammenfassungen Gen Ontologien, Funktionsbereichen, Lokalisierung, Proteinkomplexen sowie otsie nützlich Klassifikationen, die in dieser Liste angereichert sind. Der Vertreter Bildschirm durchgeführt zeigten eine Anreicherung von Ontologien für die RNA-Metabolismus, einschließlich tRNA wackelt, Uridin Änderung und RNA Überwachung Maschinen, und als Antwort auf DNA-Schädigung (Tabelle 1). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Studien, die 5-FU-Behandlung führt zu einer Akkumulation von nicht-kodierenden RNAs polyadenyliert, die von der Kern Trf / Rrp6 / Luft / MTR4 Polyadenylierung (TRAMP) Exosom 25 verarbeitet werden, gezeigt haben. So sind diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit früheren chemischen genetischen Screens und dem bekannten Mechanismus der 5-FU-Bioaktivität 8,19.
Wie bei allen Hochdurchsatz-funktionelle Genomanalysen ist es notwendig, um die Ergebnisse zu überprüfen. Um zu überprüfen, chemisch-genetischen Wechselwirkungen Hefemutanten zuerst werden mit Primern, die in der Ziel Gen-Promotor und kanMX Disruptionskassette PCR validiert. Selektion von Stämmen für gültigeation ist etwas willkürlich, aber die Priorisierung Mutanten, die einen starken Phänotyp zeigen und Gruppe funktional bietet einen guten Ausgangspunkt. Anschließend wird Überempfindlichkeit gegenüber einem chemischen mit Spotting-Assays, ein gemeinsames Konzept zur Messung Fitness Hefemutanten bestätigt. Zu diesem Zweck werden Verdünnungsreihen von Hefestämmen in einem Raster auf einem Medium, das die geeignete chemische Dosis sowie eine Steuer gesichtet. Als Beispiel bestätigen wir die chemische genetische Interaktion von 5-FU mit air1 und trf5 Mutanten der TRAMP-Komplex (Abbildung 5). Diese Gene kodieren für Komponenten des TRAMP Kern Exosom. Wir stellen fest, dass die rrp6 Belastung, ohne den Kern 3'-5'-Exonukleaseaktivität TRAMP, wurde im DMA-Sammlung unserem Labor mit hoher Dichte verloren. Am Erhalt einer frischen rrp6 Mutante bestätigen wir, dass rrp6 und 5-FU eine chemische genetische Interaktion zeigen auch, dass zur Errichtung TRAMP Aktivität ist erforderlich, um 5-FU zu tolerieren. Dies veranschaulichtdass die Integrität der große Deletion Sammlungen beeinträchtigt mit der Zeit zu, so dass die richtige DMA Wartung und Dehnungsvalidierungs kritisch.
Unsere Bildschirm auch Mutanten in verschiedenen DNA-Reparaturenzyme (einschließlich Rad50, RAD52 und Mre11) als 5-FU empfindlich ausgewiesen. Scoring der Koloniegröße angegeben die relative Eignung dieser Mutanten auf 10 uM 5-FU als 0,7, 0,65 und 0,42 im Vergleich zum Wildtyp. Basierend auf unseren Bestätigungsspotting-Assays (Abbildung 5) sind diese Werte eine Unterschätzung wahrscheinlich wegen der begrenzten Dynamikbereich von Fitnessmessung durch Koloniegröße Scoring. Dies zeigt eine zweite Grund, unabhängig Wechselwirkungen durch serielle Spotting bestätigen: die Größenordnung einiger chemischer genetischen Wechselwirkungen können in der Primärdatenanalyse zu unterschätzen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass ein Wachstum Chemie genetische Bildschirm mit ~ 4800-Dehnungs haploiden Löschen Blutentnahme durchgeführt, in dreifacher Ausfertigung, eine ausreichende Resol ution, selbstbewusst zu isolieren bestimmte chemische genetischen Interaktionen.
Fig. 1: Schematische Darstellung des Chemical Genetic Wechselwirkungen Gendeletionen in Empfindlichkeit gegenüber chemischen Störung führen ermöglichen die Identifizierung biologischer Prozesse durch eine chemische abgezielt. (A) Convergent Wege kann entweder durch Gen-Deletion (Genea) oder chemisch (geneB) gestört werden. Individuell kann diese zellulären Beleidigungen aufgrund der inhärenten Redundanz in biologischen Wegen toleriert. Jedoch in Kombination Zellviabilität was entweder synthetisch kranken oder letalen Phänotyp beeinträchtigt. (B) Deletion von Genen (geneC) entscheidend zur Minderung chemisch induzierten Stress auch zu Überempfindlichkeit und zeigen biologische Pfade durch chemische Behandlung gestört. jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2: Workflow für Chemische Genetische Bildschirm (A) Bestimmung der Unter Hemmdosis:. Kinder Hefestämme zur stationären Phase gezüchtet, 1: 5.000, und die Ausbreitung auf festem YEPD Medien mit zunehmenden chemischen Dosis überzogen. Die höchste Konzentration, die nicht größer als 10-15% ige Wachstumshemmung ist zur Abschirmung gegen die DMA ausgewählt. (B) Systematische Chemical Genetische Screen: Mit einer Hochdurchsatz-Array Pinning Roboter die S. cerevisiae DMA ist Replik auf Medien, die die geeignete Konzentration der Prüfsubstanz überzogen. Die Platten werden bei Raumtemperatur für 24-48 Stunden inkubiert, abgebildet wird, und die relativen Koloniegröße bestimmt.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3 :. Bestimmung der Unter Hemmkonzentration. (A) Das Wachstum der BY4741 Zellen auf festem Medium, das 5-Fluorouracil. Gesättigte BY4741 Kultur verdünnt 1: 5.000 und steigenden Konzentrationen von 5-Fluorouracil plattiert. (B) Wachstumskurve BY4741 Zellen in flüssigen Medien, die 5-flurouracil. ~ 4 × 10 4 Zellen wurden in dreifacher Ausfertigung in steigenden Konzentrationen von 5-FU und ODs wurden alle 10 Minuten für 22 Stunden gemessen, abgeschieden.
Abbildung 4: Chemische Genetische Bildschirm von 5-Fluorouracil. (A) S. cerevisiae Deletionsmutante Array auf YEPD-Agar mit 10 & mgr; M 5-FU (rechts) und DMSO Kontrolle (links) repliziert. (B) Ergebnisse der chemischen Genetische Screen: Relative Wachstum der Mutanten auf 10 uM 5-FU im Vergleich zu DMSO-Kontrolle durch Feldposition bestellt. (C) Relative Wachstum der Mutanten auf 10 uM 5-FU im Vergleich zu DMSO-Kontrolle durch Koloniegrößenverhältnis bestellt. Ein Verhältnis Schwelle von ≤0.8 auf beiden Diagramme angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5: Validierung Chemische Genetische Interaktionen. Serielle Verdünnungen von mehreren isolierten Mutantenstämme auf DMSO-Steuerung (A) gezüchtet, 10 & mgr; M 5-FU (
| GO Kategorie | P-Wert | Gene identifiziert (Treffer) | # Hits | Gesamtanzahl von Genen in GO Kategorie |
| tRNA Taumel Uridin Modifikation [GO: 0002098] | 2,24 x 10 -6 | SIT4 NCS6 Urm1 KTI12 IKI3 TUM1 ELP3 | 7 | 24 |
| Transkription, DNA-abhängige [GO: 0006351] | 1,69 × 10 -5 | PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 Aft1 RAI1 STB5 SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 Leo1 SSN3 SGF11 ELP3 | 32 | 540 |
| Übersetzung [GO: 0006412] | 4,28 × 10 -5 | RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7 RPS19B RPS19A RPS7A | 22 | 318 |
| tRNA Wobble-Position Uridin Thiolierung [GO: 0002143] | 1,88 × 10 -4 | NCS6 Urm1 TUM1 | 3 | 5 |
| Regulation der Transkription, DNA-abhängige [GO: 0006355] | 4,98 × 10 -4 | PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 Aft1 RAI1 STB5 SDS3 SWI3 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 Leo1 SSN3 SGF11 ELP3 | 27 | 507 |
| Protein urmylation [GO: 0032447] | 6,33 × 10 -4 | NCS6 Urm1 URE2 | 3 | 7 |
| mRNA Export von Kern als Reaktion Stress zu erwärmen [GO: 0031990] | 2,04 × 10 -3 | RPB4 NUP120 NUP133 | 3 | 10 |
| Kern Polyadenylierung abhängige CUT Abbauprozess [GO: 0071039] | 2,04 × 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 10 |
| Tryptophanstoffwechsels [GO: 0006568] | 2,15 × 10 -3 | TRP5 TRP3 | 2 | 3 |
| früh, um Golgi Transport Endosomen [GO: 0034498] | 2,75 × 10 -3 | ENT5 TCA17 RCY1 | 3 | 11 |
| Ribosomen-Biogenese kleinen Untereinheit [GO: 0042274] | 3,63 × 10 -3 | SAC3 LTV1 RPS19B RPS19A | 4 | 24 |
| Chromatinmodifizierung [GO: 0016568] | 3,64 × 10 -3 | LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ASH1 SGF11ELP3 | 9 | 114 |
| ATP Stoffwechsel [GO: 0046034] | 4,23 × 10 -3 | VMA2 VMA1 | 2 | 4 |
| vakuolären Protonen-Transport V-ATPase komplexen Montage [GO: 0070072] | 4,23 × 10 -3 | VMA21 VPH2 | 2 | 4 |
| Chromosomenlokalisierung [GO: 0050000] | 4,23 × 10 -3 | NUP120 NUP133 | 2 | 4 |
| mRNA-Transport [GO: 0051028] | 4,59 × 10 -3 | DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 | 6 | 58 |
| vakuolären Versauerung [GO: 0007035] | 4,89 × 10 -3 | VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 | 4 | 26 |
| rRNA-Export aus Kern [GO: 0006407] | 5,63 x 10 <sup> -3 | NUP120 NUP133 RPS19B RPS19A | 4 | 27 |
| Endozytose [GO: 0006897] | 6,57 × 10 -3 | SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 VPS1 END3 | 7 | 82 |
| Kern mRNA Überwachung von mRNA 3'-End-Verarbeitung [GO: 0.071.031] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 MPP6 | 2 | 5 |
| ncRNA Polyadenylierung [GO: 0043629] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| Kern Polyadenylierung abhängige snoRNA Abbauprozess [GO: 0071036] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| Kern Polyadenylierung abhängige snRNA Abbauprozess [GO: 0071037] | 6,92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| Tryptophan Biosyntheseprozess [GO: 0000162] | 6,92 × 10 -3 | TRP5 TRP3 | 2 | 5 |
| Protein Einsetzen in ER-Membran [GO: 0045048] | 6,92 × 10 -3 | GET1 GET4 | 2 | 5 |
| mRNA Stabilisierung [GO: 0048255] | 6,92 × 10 -3 | ATP25 IGO1 | 2 | 5 |
| Antwort auf DNA-Schädigung Stimulus [GO: 0006974] | 7,05 × 10 -3 | Mus81 RAD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 DEF1 MMS22 RAD52 MRE11 RAD50 RMI1 | 12 | 197 |
| GO Kategorie | P-Wert | Gene identifiziert (Treffer) | in "> # HitsGesamtanzahl von Genen in GO Kategorie | |
| Kern Polyadenylierung abhängige rRNA Abbauprozess [GO: 0071035] | 8,46 × 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 16 |
Tabelle 1: Gene Ontology (GO) Charakterisierung von 5-Fluorouracil Sensitive Mutanten.
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Discussion
Hier skizziert ist ein Ansatz zur Erzeugung von chemisch-genetischer Interaktionsprofile. Das Verfahren ist einfach: durch Vergleich Koloniegrößen von jedem Stamm in umfassenden Gendeletion Sammlungen in Gegenwart und in Abwesenheit einer chemischen, alle Gene benötigt wird, um eine chemische Insult tolerieren identifiziert. Annotation Bereicherung Analyse des resultierenden Liste sensibler Stämme können dann verwendet werden, um einen Einblick in eine Chemikalien Wirkungs bieten. Während dieses Protokolls für Bäckerhefe optimiert wurde, kann sie auch zur Verwendung mit anderen Arrayed mikrobiellen Deletion Sammlungen, wie der E. angepasst werden coli Keio-Kollektion, die erfolgreich eingesetzt wird, um Hunderte von zellulären Störungen 26,27 sondieren.
Chemisch-genetischer Profile in Hefe und anderen Organismen ist gut etabliert. Die meisten dieser Studien wurden auf den Wettbewerb Tests, die durch Microarray-Analyse oder Hochdurchsatz-sequ gebündelt Deletionsmutanten quantifizieren verlassenrenzen der einzigartigen genetischen Barcodes. Dieser Ansatz hat sich in der Herstellung von robusten chemisch-genetische Profile von großen chemischen Bibliotheken bewährt. Die hier beschriebene Methode bietet eine nützliche Alternative für die chemisch-genetische Analyse einer kleineren Anzahl von Testverbindungen. Der Test bietet eine einfache Anzeige, die weniger kostspielig als Hochdurchsatz-Sequenzierung oder Microarray-Analyse ist und nicht aus der Sequenz Bias leiden. Während das Protokoll genannten Aufgaben erfordert ein Robotic-Instrument zur Kolonie Manipulation werden solche Systeme immer erschwinglicher und alternativ könnte das Protokoll für die Verwendung mit Hand Pinning-Tools, von denen Beispiele in der Liste der Stoffe aufgenommen wurden eingestellt werden.
Es ist wichtig, sich über die Grenzen dieses Ansatzes und chemische genetischer Profile im Allgemeinen. Erstens muss die Verbindung eine Wirkung auf die Lebensfähigkeit in knospender Hefe zu haben, oder die spezifischen Organismus ausgenutzt. Während viele grundlegende biologische Prozesseund Funktionen sind gut konserviert zwischen Eukaryoten Organismus spezifischen chemischen genetischen Wechselwirkungen kann breit variieren, ebenso wie der Aufnahme von Chemikalien in die Zellen. Es sollte auch beachtet werden, dass mehrere Deletionsmutanten wurden gefunden empfindlich multiple Arzneimittelbehandlungen 8 angesehen werden. Diese umfassen Gene in Efflux, vakuolären Funktion und Membranintegrität involviert. Es ist wichtig zu berücksichtigen, Mehrfachresistenzen, wenn Sie Rückschlüsse auf die direkte und indirekte Wirkmechanismen zu nehmen.
Die hier beschriebene Bildschirm wurde mit dem haploiden Löschen Sammlung, ein gemeinsames Konzept für die chemisch-genetische Analyse in Hefe. Es gibt nun mehrere Sammlungen von Hefe-Mutanten zur Verfügung, weitere Hilfe bei der Bestimmung von Wirkungsweise einer chemischen Verbindung. Dazu gehören nicht nur die komplette homozygoten und heterozygoten diploiden Löschen Sammlungen, aber auch bedingt temperaturempfindlichen essentielles Gen-Mutanten, die Decreased Fülle von mRNA Störungs (feuchten) Hefemutante Bibliothek und eine Kunst Histon H3 und H4 Mutante Sammlung, die verwendet werden könnten, um epigenetische basierte molekulare Therapien 3,4,28 untersuchen, Angesichts der unglaublichen Tiefe der Werkzeuge zur Verfügung, die eine einfache die Methodik und die begrenzte Infrastruktur erforderlich ist, bietet dieser Ansatz einen zugänglichen Format zu reichen funktionelle Informationen in Bezug auf den Mechanismus einer chemischen Verbindung zugreifen.
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Acknowledgments
Die Forschung im Labor CJN durch Betriebskostenzuschüsse von NSERC, der Canadian Cancer Society Research Institute (CCSRI) und der Canadian Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12-well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5 ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10 cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1,000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1,000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
References
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