Abstract
Determinare la modalità di azione delle sostanze chimiche bioattive è di interesse per una vasta gamma di accademici, farmaceutico, e gli scienziati industriali. Saccharomyces cerevisiae, o lievito in erba, è un modello eucariote che una collezione completa di ~ 6.000 mutanti di delezione genica e hypomorphic gene essenziale mutanti sono disponibili in commercio. Queste collezioni di mutanti possono essere utilizzati per rilevare sistematicamente interazioni chimico-gene, cioè geni necessari a tollerare una sostanza chimica. Queste informazioni, a sua volta, riporta sulla modalità probabile di azione del composto. Qui si descrive un protocollo per la rapida identificazione di interazioni chimiche-genetico in erba lievito. Noi dimostriamo il metodo utilizzando l'agente chemioterapico 5-fluorouracile (5-FU), che ha un meccanismo ben definito di azione. I nostri risultati mostrano che il vagabondo nucleare rna exosome e riparazione del DNA enzimi sono necessari per la proliferazione in presenza di 5-FU, che è coerente con le precedenti microarray approcci basati su codice a barre chimico genetiche e le conoscenze che il 5-FU influisce negativamente sia il metabolismo RNA e DNA. Sono descritti anche i protocolli di validazione richieste di questi schermi ad alto rendimento.
Introduction
Gli strumenti e le risorse disponibili nel organismo modello Saccharomyces cerevisiae genetici hanno permesso grandi studi di genomica funzionale che forniscono insieme nuovi indizi su come i geni funzionano come reti per soddisfare i requisiti dei sistemi biologici. La pietra angolare di questi strumenti è stata la creazione collaborativa di un set completo di delezioni geniche non essenziali di tutte le fasi di lettura aperte nel lievito 1,2. Un'osservazione sorprendente è che solo il ~ 20% dei geni di lievito sono necessari per la vitalità quando cresciuto come aploidi in condizioni standard di laboratorio. Ciò evidenzia la capacità di una cellula per tamponare contro perturbazioni genomiche attraverso l'utilizzo di percorsi biologici alternativi. Mutanti genetici che sono vitali singolarmente, ma letali in combinazione, segnalano percorsi biologici paralleli collegati o convergenti e formano reti di interazione genetica che descrivono la funzione biologica. Con lo sviluppo di te condizionalealleli mperature-sensibili e hypomorphic di geni essenziali della tecnologia non è stato limitato allo studio di geni non essenziali 3,4. Questo concetto è stato applicato su scala genomica produce un imparziale mappa interazione genetica che illustra come i geni coinvolti in processi cellulari simili raggruppano 5.
Perturbazioni chimiche di reti genetiche delezioni geniche mimici (Figura 1) 6. Interrogazione composti inibitori della crescita contro una matrice ad alta densità di ceppi di eliminazione per ipersensibilità identifica un profilo di interazione chimico-genetico, cioè una lista di geni che è richiesto di tollerare lo stress chimico. Come interazioni genetiche, schermi di grandi dimensioni di librerie chimiche hanno dimostrato che i composti con una modalità d'azione simile grappolo insieme 7. Pertanto, stabilendo il profilo interazione chimica-genetica di un composto della modalità di azione può dedurre confrontandola con larinterazione genetica e chimica sintetica ge scala genetica Dataset 8,9.
Schermi chimico-genetico su larga scala, in cui vengono interrogati decine di composti, sono stati eseguiti da saggi concorrenza barcode. In questo approccio, la raccolta aggregata dei ceppi di delezione è coltivato in massa per diverse generazioni in un piccolo volume di supporti contenenti una sostanza chimica. Dal momento che ogni mutante eliminazione nasconde un codice a barre genetico unico, la redditività / crescita dei singoli mutanti nel pool di ceppi cancellazione è monitorata da microarray o high-throughput sequencing 10.
La presunzione di idoneità monitorando dimensioni colonia di mutanti fisicamente Arrayed coltivate su agar solido contenente un composto bioattivo è anche un metodo efficace per identificare interazioni chimiche-genetica 11,12. Questo approccio offre un'alternativa conveniente per lo screening basato sulla concorrenza ed è adatto per saggiare le piccole librerie di sostanze chimiche.Delineato qui è una semplice metodologia per la produzione di un elenco di interazioni chimico-genetico in S. cerevisiae che non si basa su manipolazioni biologia molecolare o infrastrutture. Si richiede solo una collezione di eliminazione di lievito, un apparato pinning robotizzato o manuale, e liberamente disponibili software di analisi dell'immagine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Il flusso generale di questa procedura è illustrata nella figura 2.
1. Determinazione della Dose Growth-inibitorio
- Preparazione del lievito cultura durante la notte
NOTA: I media la crescita del lievito estratto-peptone-destrosio (YEPD) utilizzato in questo protocollo è una ricetta standard 13.- Streak out BY4741 (Mata his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) le cellule su un piatto agar YEPD e incubare per 48 ore a 30 ° C o fino a formare colonie visibili.
- Preparare culture durante la notte inoculando 5 ml di YEPD mezzi liquidi in un recipiente di coltura sterile con una singola colonia. Incubare una notte a 30 ° C con rotazione continua o agitazione. La cultura tipicamente raggiungere la saturazione del mattino (~ 2 × 10 8 cellule / ml).
- Preparazione agar solido contenente vari dosaggi chimici
- Preparare alcuni stock diil prodotto chimico da testare a 100x la concentrazione finale desiderata in un solvente appropriato.
NOTA: Le concentrazioni efficaci dipendono dalla chimica, e devono essere determinati empiricamente. Si consiglia pertanto di verificare inizialmente un'ampia gamma concentrazione finale, vale a dire, dal basso all'alto mM mM. - Per ciascuna concentrazione della sostanza chimica da testare, un'aliquota 3 ml di agar fuso YEPD ad un vari provetta sterile. Luogo in 55 ° C bagnomaria per evitare di solidificazione.
- Per ogni concentrazione di sostanza chimica da testare aggiungere 30 ml di composto 100x ai media fusi, vortice 2-3 secondi per mescolare, e pipetta 1 ml in ogni coppia di pozzetti duplicati in un 12-pozzetti. Assicurati di includere un solo veicolo di controllo. Lasciare piastre di impostare notte a temperatura ambiente. Eliminare qualsiasi supporto aggiuntivo.
- Preparare alcuni stock diil prodotto chimico da testare a 100x la concentrazione finale desiderata in un solvente appropriato.
- Cellule spread placcatura
- Seminare 10 ml di YEPD mezzi liquidi con 2 ml di una cultura lievito saturo, coltivate durante la notte, come nella fase 1.1.2.
- Piatto 25 ml di cultura lievito diluito per pozzetto, distribuiti in modo uniforme con perline di vetro sterili o asta, e permettono la piastra si asciughi sotto una fiamma. Incubare la piastra a 30 ° C per 48 ore.
- Valutare la crescita del lievito (sia numero totale e la dimensione delle colonie) sulle piastre. Selezionare una concentrazione sub-letale di composto che non inibisce la crescita di oltre l'10% -15% per eseguire lo schermo.
2. sistematica schermo chimica genetica
- Manutenzione di delezione-mutante-array (DMA) e preparazione della Sorgente Piastra
- Per una descrizione dettagliata sulla costruzione di matrici mutanti cancellazione dalle scorte glicerolo consultare Baryshnikova et al. 14. Una volta mutanti di delezione sono schierati con una densità di 384 colonie per piastra, il DMA può essere conservato per parecchi mesi a 4 ° C. Replica su agar YEPD contenente 200 mg / ml di G418, se necessario, per evitare le colonie di crescere in ognialtro.
NOTA: Multiple repliche di serie dovrebbero essere evitati per prevenire la perdita dei ceppi a crescita lenta e ridurre al minimo la comparsa di mutanti soppressori. Ciò è particolarmente importante se il mantenimento delle collezioni come aploidi. - Eseguire il replica-placcatura usando un microbica arraying sistema robotico. In alternativa, manipolare le colonie usando strumenti pinning manuali schierati.
NOTA: La collezione cancellazione lievito è disponibile come aploidi e diploidi da diverse fonti commerciali e in genere viene fornito come scorte glicerolo in piastre da 96 pozzetti.
- Per una descrizione dettagliata sulla costruzione di matrici mutanti cancellazione dalle scorte glicerolo consultare Baryshnikova et al. 14. Una volta mutanti di delezione sono schierati con una densità di 384 colonie per piastra, il DMA può essere conservato per parecchi mesi a 4 ° C. Replica su agar YEPD contenente 200 mg / ml di G418, se necessario, per evitare le colonie di crescere in ognialtro.
- Condensazione la matrice delezione mutante
- Preparare 250 ml di agar YEPD contenente 200 mg / ml di G418. La concentrazione effettiva dei G418 può variare e ciascuna partita deve essere testato empiricamente.
- Preparare cinque piastre di agar YEPD versando 50 ml di agar YEPD contenente 200 mg / ml di G418 per piastra. Fare questo un giorno prima condensazione matrice e consentono le piastre raffreddare a temperatura ambienteerature durante la notte su una superficie piatta.
NOTA: Quattro piastre saranno necessari per la raccolta a densità 1.536-deformazione, il quinto piatto viene versato come un extra. - Rimuovere le 16 piastre Petri contenenti raccolta delezione mutante con una densità di 384 colonie per piastra e lasciare riposare a temperatura ambiente (~ 1 ora).
- Asciugare la condensa che si è formata sul coperchio di ogni piatto con un compito delicato pulire. In caso contrario si può causare gocce d'acqua depositato sulla matrice e la contaminazione incrociata dei mutanti schierati.
- Utilizzando una matrice pinning robot microbica, condensare il DMA da una densità di 384 colonie per piastra (16 piatti Petri) a 1.536 colonie per piastra (4 piatti Petri). Eseguire questo in modo che il 1 ° colonia dalla piastra 1 perni alla riga 1 colonna 1 della matrice condensata, il 1 ° colonia di piastra 2 alla riga 1, colonna 2, 1 ° colonia di piastra 3 alla riga 2 e colonna 1, e la colonia 1 ° piatto 4 a Row 2colonna 2.
- Incubare la matrice consolidato a 30 ° C per una notte.
- Esaminare la matrice di garantire il trasferimento uniforme delle colonie da lastre di origine. Ci saranno diverse posizioni vuote, appositamente incorporate nella matrice, che fungono da guida per garantire la DMA è stato condensato correttamente (Figura 4A).
NOTA: Questi saranno i piatti di origine per la placcatura replica sul supporto contenente il composto in esame. Una piastra singola fonte può essere utilizzata per più pinnings. Anche molti robot avranno una funzione di compensazione, che garantirà un numero simile di lievito vengono trasferiti ogni volta.
- Piastra Replica matrice eliminazione mutante
- Preparare 700 ml di controllo (solo veicolo) e 700 ml di mezzi sperimentali (-chimici contenenti). Questo è sufficiente per l'esecuzione del test in triplice copia (12 piastre per condizione, più due extra).
- Versare 50 ml di YEPD agar contenenti test chimico o di controllo per piastra. Lasciare le piastre to raffreddare a temperatura ambiente per una notte su una superficie piatta.
- Utilizzando il robot piatto replica, inoculare il DMA su tre serie di piastre contenenti sostanze chimiche a concentrazione determinato sperimentalmente, così come tre set di piastre contenenti il controllo del veicolo. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 24-48 ore.
3. piastrine e analisi dei dati
- Rimuovere le piastre da incubatore e permettere loro di venire a temperatura ambiente (~ 1 ora) prima di imaging. Questo consentirà di evitare la formazione di condensa, mentre l'imaging le piastre.
- Fosfori a 24 e 48 ore rimuovendo il coperchio e mettendo la faccia in giù su un letto piano dello scanner. Catturare immagini con una risoluzione di almeno 300 dpi. In alternativa, utilizzare una fotocamera digitale per catturare le immagini. Se così facendo, piatti segnaposto faccia in su uno sfondo scuro e rimuovere i coperchi di immagine.
NOTA: Il formato del file e posizionamento delle piastre dipenderanno dal programma di quantificazione utilizzato. Eseguire la quantificazione e il confronto delle dimensioni della colonia di matrice utilizzando uno dei numerosi programmi open source, tra cui Balony 15, SGAtools 16, e ScreenMill 17.
4. Validazione di schermo
NOTA: In questa fase diverse eliminazioni di lievito mutanti segnerà come ipersensibili alla chimica di interesse. Queste interazioni chimiche-genetici devono essere convalidati prossimo in due modi. Innanzitutto l'identità di ceppi sensibili dovrebbe essere confermata mediante PCR. In secondo luogo, la sensibilità chimica deve essere segnato in modo indipendente. Per eseguire un breve protocollo per l'esecuzione di test avvistamento per convalidare ceppo ipersensibilità, una tecnica comune in lievito biologia.
- Streak out desiderato (ipersensibilità) mutanti della collezione eliminazione lievito su agar YEPD contenente 200 mg / ml di G418. Incubare a 30 ° C fino formano colonie. Verificare il genotipo del ceppo mediante PCR diagnostico con primer secondoprotocollo del produttore.
- Seminare 5 ml del liquido YEPD per ogni ceppo e incubare una notte a 30 ° C con rotazione o agitazione.
- Misurare OD 600 e diluire ogni ceppo di OD 600 = 1 in dH sterile 2 O. Queste sono oggi le colture di lieviti normalizzati.
- Dispensare 100 l di normalizzato wild-type di lievito (BY4741) cultura e A1 di una piastra a 96 pozzetti. Dispensare 100 l di fino a sette ceppi supplementari per pozzi B1-H1.
- Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 90 ml di dH 2 O sterile per pozzi A2-H2 attraverso A6-H6. Infine, preparare una serie di diluizioni 1:10 di colture di lieviti normalizzati. Inizia in serie pipettando 10 ml di colonna 1, colonna 2, con una pipetta multicanale, e continuare attraverso la piastra a 96 pozzetti prima di aver effettuato sei diluizioni (ie, 10 0-10 -5).
- Trasferire 2-5 ml di colture di lievito diluito in una griglia con un multicanalepipetta su terreni solidi YEPD contenenti prodotti chimici e dei veicoli di controllo. Incubare le piastre a temperatura appropriata per 24-48 ore.
- Ispezionare le piastre e confrontare la sensibilità di selezionare mutanti ad agenti chimici (rispetto al BY4741 controllo). Fosfori a 24 e 48 ore come al punto 3.2.
NOTA: Mentre l'identificazione di diversi ceppi ipersensibili con ontologie geniche correlate o funzioni presta fiducia alla validità dello schermo, la trasformazione di un ceppo delezione ipersensibile con un plasmide contenente una copia del gene wild-type è necessaria per stabilire formalmente che un gene cancellazione di interesse (e le mutazioni non nascosti secondo sito) provoca la sensibilità ai farmaci.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Come una convalida di questo approccio abbiamo effettuato un rappresentante chimica schermo interazione genetica dell'agente chemioterapico 5-fluorouracile (5-FU) seguendo il protocollo descritto sopra. 5-FU si caratterizza per interrompere timidilato sintasi così come DNA e RNA metabolismo 18. Le interazioni genetiche chimiche su 5-FU sono ben studiati e sono stati studiati con tecniche di lievito barcode microarray utilizzando collezioni cancellazione eterozigoti e omozigoti 8,19. Qui mostriamo che risultati simili possono essere ottenuti quantificazione comparativa delle dimensioni della colonia mutante.
Va notato che lo schermo eseguito utilizza la raccolta non essenziale delezione del gene aploide. Questo tipo di schermo può anche essere eseguita utilizzando ceppi diploidi, mutanti termosensibili e alleli hypomorphic, permettendo l'inserimento di geni mutanti essenziali. Un vantaggio ad utilizzare la collezione cancellazione aploide aumenta Sensitiv drogalità di percorsi di destinazione, data l'assenza del prodotto del gene. Tuttavia, due svantaggi significativi sono che l'ipersensibilità gene essenziale non può essere interrogato, e la collezione aploidi è soggetto a mutazioni spontanee soppressori selezionati per su più propagazioni. Questo può portare a un deterioramento della collezione. Pertanto, vi è un trade off tra intrinseca l'integrità e la larghezza della matrice e sensibilità effetto del farmaco. Questo deve essere preso in considerazione e la collezione mutante più appropriato selezionato in base all'applicazione desiderata.
In primo luogo, la concentrazione appropriata sub-letale di 5-FU da utilizzare nella schermata stato determinato in 10 micron da una crescente BY4741 (Mata his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) celle crescente concentrazione di 5-FU e valutare visivamente la crescita del lievito colonie ( Figura 3A). In alternativa, risultati simili possono essere ottenuti da una crescente yeast in micropiastre in coltura liquida e frequente monitoraggio della culture densità ottica con un lettore di micropiastre (figura 3B), come indicato da precedenti gruppi 10,20.
Utilizzando la Singer ROTOR, il DMA lievito è stato replicato a 1536 colonie per densità piastra su supporti contenenti 10 micron 5-FU o un controllo dimetilsolfossido (DMSO) (Figura 4A). Queste piastre sono state incubate per 24 ore a temperatura ambiente e ripreso su uno scanner base piana. Misura di formato Colony per ciascun mutante su entrambe le piastre sperimentali e di controllo è stato effettuato utilizzando l'immagine Balony motore di analisi 15. Il software Balony calcola il rapporto dimensioni delle colonie sulla matrice sperimentale relativa al controllo. L'utente è in grado di impostare una soglia di rapporto e se viene eseguito lo schermo in almeno triplicare un p-value verrà assegnato per ogni mutante. Nei nostri mutanti schermo rappresentativi che hanno mostrato un rapporto di ≤0.8 stati considerareed essere colpi. I risultati della quantificazione colonia possono essere presentati graficamente tracciando il rapporto di formato per ogni colonia y e l'eliminazione gene ordinata per posizione di matrice (Figura 4B) o il rapporto (Figura 4C) sul asse x.
Malati sintetica / mutanti letali identificati nella schermata possono essere raggruppati in base alle descrizioni funzionali eseguendo ontologia gene (GO) analisi. Ci sono diversi strumenti pubblicamente disponibili per l'analisi GO di liste di S. geni cerevisiae; compresi Funspec 21, DAVID Bioinformatica Database 22,23, e il Saccharomyces Genome Database (SGD) Go Term Finder 24. Delezioni gene che avevano un rapporto inferiore o uguale a 0,8 nella schermata 5-FU sono stati usati come un elenco ingresso per Funspec. Funspec accetta un elenco di nomi di geni di lievito sistematica o comune e uscite riassunti delle ontologie geniche, classificazioni funzionali, localizzazione, complessi di proteine e otle classificazioni utili che si arricchiscono in tale elenco. Lo schermo rappresentante eseguito ha mostrato un arricchimento delle ontologie per il metabolismo dell'RNA, compresa tRNA traballa, modifica uridina e macchinari di sorveglianza RNA, e la risposta al danno al DNA (Tabella 1). Questi risultati sono in accordo con gli studi precedenti che hanno dimostrato 5-FU risultati del trattamento l'accumulo di RNA non codificanti poliadenilato, che vengono elaborati dal TRF / Rrp6 / Aria / MTR4 poliadenilazione (TRAMP) exosome nucleare 25. Così questi risultati sono in accordo con precedenti schermi genetici chimici e il noto meccanismo di 5-FU bioattività 8,19.
Come per tutte le high-throughput approcci di genomica funzionale è necessario per convalidare i risultati. Per convalidare chimici interazioni genetiche mutanti di lievito devono prima essere PCR-validati con primer che anneal nel promotore del gene bersaglio e KANMX cassette interruzioni. Selezione di ceppi di validozione è un po 'arbitraria, tuttavia con priorità mutanti che mostrano una forte fenotipo e gruppo fornisce funzionalmente un buon punto di partenza. Avanti, ipersensibilità a una sostanza chimica viene confermata mediante analisi avvistare, un approccio comune per la misurazione fisica di mutanti di lievito. A tal fine, diluizioni seriali di ceppi di lievito sono macchiati in una griglia su terreni contenenti la dose chimica appropriata così come controllo. Come esempio, si conferma l'interazione genetica chimica del 5-FU con Air1 e trf5 mutanti del complesso TRAMP (Figura 5). Questi geni codificano componenti della exosome nucleare TRAMP. Notiamo che il ceppo rrp6, manca il nucleo 3'-5 'attività esonucleasica di TRAMP, è stato perso in alta densità collezione DMA del nostro laboratorio. Su ottenendo un rrp6 mutante fresco confermiamo che rrp6 e 5-FU anche visualizzare una interazione genetica chimica, che stabilisce che l'attività TRAMP è tenuto a tollerare 5-FU. Questo illustrache l'integrità di grandi collezioni di eliminazione può diventare compromessa nel corso del tempo, facendo una corretta manutenzione DMA e la convalida deformazione critica.
Il nostro schermo anche identificato mutanti in numerosi enzimi di riparazione del DNA (compresi rad50, RAD52 e MRE11) come 5-FU sensibili. Punteggio di dimensioni delle colonie ha indicato la relativa idoneità di questi mutanti su 10 micron 5-FU come 0,7, 0,65 e 0,42 rispetto al tipo selvaggio. Sulla base dei nostri test di avvistamento di conferma (Figura 5), questi valori sono una probabile sottostima dovuta alla limitata gamma dinamica di misura Fitness di dimensioni delle colonie di punteggio. Questo mette in evidenza una seconda ragione per confermare in modo indipendente interazioni individuando seriale: la grandezza di alcune interazioni genetiche chimiche può essere sottovalutata in analisi primaria dei dati. I nostri risultati dimostrano che uno schermo genetico chimico crescita basata eseguita con ~ 4.800-deformazione raccolta delezione aploidi, in triplice copia, fornisce adeguata risol ution isolare fiducia specifiche interazioni genetiche chimiche.
Figura 1:. Delezioni Rappresentazione schematica chimici genetiche interazioni geniche che provocano ipersensibilità ai perturbazioni chimiche permettono l'identificazione dei processi biologici mirati da una sostanza chimica. Vie (A) convergenti possono essere disturbate da uno delezione del gene (Genea) o chimicamente (geneB). Individualmente, questi insulti cellulari possono essere tollerati a causa della ridondanza intrinseca in percorsi biologici. Tuttavia, in vitalità cellulare combinazione è compromessa causando sia un fenotipo sinteticamente malato o letale. (B) Soppressione di geni (geneC) critici per mitigare lo stress indotto chimicamente anche causare ipersensibilità e indicare percorsi biologici perturbato da trattamento chimico. jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Flusso di lavoro per Chemical Schermo genetica (A) Determinazione della dose di sub-inibitorio:. Lieviti genitori sono cresciuti a fase stazionaria, diluito 1: 5.000, e la diffusione placcato su supporti YEPD solidi contenenti l'aumentare della dose chimica. La concentrazione più alta avendo non superiore al 10-15% inibizione della crescita è stato selezionato per lo screening contro il DMA. (B) sistematica chimica Schermo Genetica: Usando una matrice high-throughput pinning robot S. cerevisiae DMA è replica placcata sul supporto contenente la concentrazione appropriata della sostanza chimica in esame. Le piastre vengono incubate a temperatura ambiente per 24-48 ore, ripreso e dimensioni delle colonie relativa determinata.ref = target "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg" = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3 :. Determinazione della concentrazione Sub-inibitori. (A) Crescita di cellule BY4741 su terreni solidi contenenti 5-fluouracil. Cultura saturi BY4741 diluito 1: 5.000 e placcato sulle concentrazioni crescenti di 5-fluorouracile. Curva (B) La crescita del BY4741 cellule in mezzi liquidi contenenti 5-fluorouracile. ~ 4 × 10 4 cellule sono state depositate in triplice copia in concentrazioni crescenti di 5-FU e OD sono stati misurati ogni 10 minuti per 22 ore.
Figura 4: Chemical screening genetico di 5-Fluorouracile. (A) S. cerevisiae matrice delezione mutante replicato su agar YEPD contenente 10 mM 5-FU (a destra) e controllo DMSO (a sinistra). (B) I risultati della chimica screening genetico: la crescita relativa di mutanti su 10 micron 5-FU rispetto al controllo DMSO ordinato da posizione di matrice. (C) la crescita relativa di mutanti su 10 micron 5-FU rispetto al controllo DMSO ordinata dal rapporto dimensioni colonia. Una soglia rapporto ≤0.8 è indicato su entrambi i grafici. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Validazione dei chimici genetici interazioni. Diluizioni seriali di diversi isolati ceppi mutanti coltivati in DMSO controllo (A), 10 micron 5-FU (
| GO Categoria | P-value | Geni identificati (hits) | # colpi | Numero totale dei geni nella GO Categoria |
| tRNA oscillazione modifica uridina [GO: 0002098] | 2.24 × 10 -6 | SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 TUM1 ELP3 | 7 | 24 |
| la trascrizione, DNA-dipendente [GO: 0006351] | 1.69 × 10 -5 | PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 leo1 SSn3 SGF11 ELP3 | 32 | 540 |
| traduzione [GO: 0006412] | 4.28 × 10 -5 | RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7 RPS19B RPS19A RPS7A | 22 | 318 |
| tRNA posizione oscillazione uridine thiolation [GO: 0002143] | 1.88 × 10 -4 | NCS6 URM1 TUM1 | 3 | 5 |
| regolazione della trascrizione, DNA-dipendente [GO: 0006355] | 4.98 × 10 -4 | PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 SWI3 KTI12 ASH1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 leo1 SSn3 SGF11 ELP3 | 27 | 507 |
| proteine urmylation [GO: 0032447] | 6.33 × 10 -4 | NCS6 URM1 URE2 | 3 | 7 |
| mRNA export dal nucleo in risposta a stress termico [GO: 0031990] | 2.04 × 10 -3 | RPB4 NUP120 NUP133 | 3 | 10 |
| poliadenilazione-dipendente nucleare processo catabolico CUT [GO: 0071039] | 2.04 × 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 10 |
| triptofano processo metabolico [GO: 0006568] | 2.15 × 10 -3 | TRP5 TRP3 | 2 | 3 |
| presto endosome al trasporto Golgi [GO: 0034498] | 2.75 × 10 -3 | ENT5 TCA17 RCY1 | 3 | 11 |
| ribosomiale piccola subunità biogenesi [GO: 0042274] | 3,63 × 10 -3 | SAC3 LTV1 RPS19B RPS19A | 4 | 24 |
| modifica cromatina [GO: 0016568] | 3,64 × 10 -3 | LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ASH1 SGF11ELP3 | 9 | 114 |
| ATP processo metabolico [GO: 0046034] | 4.23 × 10 -3 | VMA2 VMA1 | 2 | 4 |
| vacuolar-protone trasporto V-tipo ATPasi assieme complesso [GO: 0070072] | 4.23 × 10 -3 | VMA21 VPH2 | 2 | 4 |
| cromosoma localizzazione [GO: 0050000] | 4.23 × 10 -3 | NUP120 NUP133 | 2 | 4 |
| trasporto mRNA [GO: 0051028] | 4.59 × 10 -3 | DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 | 6 | 58 |
| acidificazione vacuolar [GO: 0007035] | 4,89 × 10 -3 | VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 | 4 | 26 |
| rRNA export dal nucleo [GO: 0006407] | 5,63 × 10 <sup> -3 | NUP120 NUP133 RPS19B RPS19A | 4 | 27 |
| endocitosi [GO: 0006897] | 6,57 × 10 -3 | SLA1 EDE1 CDC50 art5 RCY1 VPS1 End3 | 7 | 82 |
| sorveglianza mRNA nucleare di trattamento mRNA 3'-end [GO: 0.071.031] | 6.92 × 10 -3 | AIR1 MPP6 | 2 | 5 |
| ncRNA poliadenilazione [GO: 0043629] | 6.92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| poliadenilazione-dipendente nucleare processo catabolico snoRNA [GO: 0071036] | 6.92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| poliadenilazione-dipendente nucleare processo catabolico snRNA [GO: 0071037] | 6.92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| triptofano processo di biosintesi [GO: 0000162] | 6.92 × 10 -3 | TRP5 TRP3 | 2 | 5 |
| inserimento proteine nella membrana ER [GO: 0045048] | 6.92 × 10 -3 | GET1 GET4 | 2 | 5 |
| stabilizzazione mRNA [GO: 0048255] | 6.92 × 10 -3 | ATP25 IGO1 | 2 | 5 |
| risposta al danno al DNA di stimolo [GO: 0006974] | 7.05 × 10 -3 | MUS81 RAD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 DEF1 MMS22 RAD52 MRE11 RAD50 RMI1 | 12 | 197 |
| GO Categoria | P-value | Geni identificati (hits) | in "> # successiNumero totale dei geni nella GO Categoria | |
| poliadenilazione-dipendente nucleare processo catabolico rRNA [GO: 0071035] | 8.46 × 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 16 |
Tabella 1: ontologia Gene (GO) Caratterizzazione di 5-fluorouracile Mutants sensibili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Delineato qui è un approccio per la generazione di profili di interazione chimico-genetico. Il metodo è semplice: confrontando le dimensioni delle colonie di ciascun ceppo in complete collezioni delezione genica in presenza e in assenza di una sostanza chimica, tutti i geni necessari per tollerare un insulto chimica sono identificati. Analisi annotazione arricchimento della lista risultante dei ceppi sensibili può quindi essere utilizzato per fornire una visione in una modalità di azione chimica. Mentre questo protocollo è stato ottimizzato per il lievito, può anche essere adattato per l'uso con altre raccolte soppressione microbiche Arrayed, come la E. raccolta coli Keio, che è stato usato con successo per sondare centinaia di perturbazioni cellulari 26,27.
Profiling chimico-genetico in lievito e altri organismi è ben consolidata. La maggior parte di questi studi hanno fatto affidamento su analisi della concorrenza che quantificano raggruppate mutanti di delezione attraverso l'analisi microarray o ad alta produttività Sequinfluen- zato di codici a barre genetici unici. Questo approccio si è dimostrato efficace nel produrre profili chimici-genetica robuste di grandi librerie chimiche. La metodologia qui descritta fornisce un'alternativa utile per l'analisi chimico-genetica di un numero minore di composti di prova. Il test fornisce una semplice lettura che è meno costo proibitivo di alta sequenziamento o microarray e non soffre di polarizzazione sequenza. Mentre il protocollo come delineato richiede uno strumento robotico per la manipolazione colonia, tali sistemi stanno diventando sempre più accessibile e, alternativamente il protocollo possa essere regolata per l'utilizzo con strumenti pinning manuali, esempi dei quali sono stati inclusi nella lista dei materiali.
È importante essere consapevoli dei limiti di questo approccio ed analisi genetica chimica in generale. Innanzitutto, il composto deve avere un effetto sulla vitalità in lievito erba, o l'organismo specifico che viene utilizzato. Mentre molti processi biologici fondamentalie le funzioni sono ben conservati tra gli eucarioti, specifiche interazioni genetiche chimiche dell'organismo possono variare notevolmente, così come l'assorbimento di sostanze chimiche nelle cellule. Va inoltre notato che diversi ceppi di delezione sono stati trovati per essere sensibili a più trattamenti farmacologici 8. Tra questi geni coinvolti nella efflusso di droga, la funzione vacuolare, e l'integrità della membrana. È importante prendere in considerazione la resistenza multi-farmaco quando effettuano conclusioni rispetto a dirigere e modi d'azione indiretti.
Lo schermo qui descritta è stata effettuata utilizzando la raccolta cancellazione aploidi, un approccio comune per l'analisi chimico-genetico in lievito. Ora ci sono più raccolte di mutanti di lievito disposizione ulteriore aiuto nella determinazione del modo di un composto chimico di azione. Questo include non solo l'omozigote completo ed eterozigoti collezioni cancellazione diploide, ma anche condizionali mutanti del gene essenziali sensibili alla temperatura, il Decreased Abbondanza da mRNA Perturbazione lievito (grezzo) biblioteca mutante, e un istone H3 e H4 sintetica raccolta mutante, che potrebbe essere utilizzato per studiare terapie molecolari basate epigenetici 3,4,28, Dato l'incredibile profondità degli strumenti a disposizione, la facilità di la metodologia e l'infrastruttura necessaria limitato, questo approccio fornisce un formato accessibile per accedere ricca informazioni funzionali rispetto al meccanismo di un composto chimico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
La ricerca in laboratorio CJN è sostenuto da sovvenzioni di funzionamento dal NSERC, la Canadian Cancer Society Research Institute (CCSRI), e la Canadian Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12-well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5 ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10 cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1,000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1,000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
References
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
- Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
- Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
- Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
- Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
- Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
- Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
- Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
- Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
- Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
- Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
- Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
- Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
- Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).
