Protocol
Deze studie werd uitgevoerd met toestemming van de deelstaat Saksen en Saksen-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, volgens artikel 8 van de Duitse wet voor de bescherming van dieren (24D-9168,11-1 / 2008-24).
1 celisolatie
1.1 Voorbereiding van het femur en de tibia
- Verdoven van de muis met behulp van een 5% isofluraan concentratie door verdampen isofluraan in een gesloten bak. Nadat de muis is gestopt met bewegen gedurende 3 sec, voer dan de cervicale dislocatie.
- Ontsmet de achterste ledematen met ethanol (96%). Verwijder de huid en de spieren en de botten te scheiden met een steriel scalpel.
- Begin met een lies incisie en verlengt de incisie naar de mediale malleolus en voer een cirkelvormige dissectie van de huid rond het onderste kuit. Schil de benen volledig door pellen proximaal.
- Maak de quadriceps spier uit het dijbeen met een scherp scalpel, verwijder zowel de voorste peroneusen de gastrocnemius spiergroepen en ontleden het been bij het heupgewricht door het lokaliseren en het ontleden van de ligamenten.
- Start naar voren en ga rond het gewricht door voorzichtig draaien van het been en transecting de ligamenten, waardoor het gewricht disarticulating.
- Was femur en tibia met 96% ethanol gedurende tenminste 90 sec aseptische celpreparaat garanderen. Blijven het wasproces met steriele PBS te spoelen resterende ethanol.
Opmerking: Alle volgende stappen moeten steriel om verontreiniging te voorkomen.
1.2 Het oogsten van Bone Marrow
- Knip het proximale en distale uiteinde van elk been met een paar fijne schaar om toegang tot de femorale en tibiale schachten krijgen. Wees voorzichtig met deze stap, omdat deze botten breken heel gemakkelijk.
- Spoel de botten met warme medium (M199 + 10% foetaal kalf serum (FCS), + 1% penicilline / streptomycine). Gebruik een steriele 28-G naald, een 1 ml spuit, en tussen 10-15 ml medium perbot voor het spoelen.
- Houd het bot met een fijn pincet en spoel één voor één, totdat het blijkt semi-doorzichtig. Breng zorgvuldig druk op het uiteinde van de zuiger om celstress minimaliseren.
- Filter het beenmerg door een 70 micrometer nylon web en het verzamelen van het filtraat. Om de maximale hoeveelheid beenmerg halen, herhaaldelijk spoelen van de distale en proximale uiteinden.
- Spoel de zeef met PBS en het verzamelen van het filtraat. Voorzichtig los puin en cellulaire conglomeraten door zacht roeren en pipetteren.
1.3 Teelt
- Centrifugeer de celsuspensie bij 250 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met ongeveer 25 ml medium. Herhaal een keer.
- Resuspendeer de cellen in 6 ml van medium na de tweede wasstap. Meng 50 ul van de cel oplossing met 50 ul van trypan blauw. Tel de cellen in een telkamer onder een lichtmicroscoop. Bereken het aantal Cellen in de oplossing met deze formule:
- Zaad de cellen op 6 putjes oppervlak ultra-low-bevestigingsplaten permanente hechting aan de onderzijde van de plaat te voorkomen. Gebruik een concentratie van 10 6 cellen per ml met 6 ml per putje.
- Aanvullen van de ophanging met 20 ng / ml M-CSF om celdifferentiatie te bevorderen.
- Culture de cellen gedurende 5 dagen bij 37 ° C en 5% kooldioxide en dagelijks observeren.
1.4 Het oogsten van Cellen
Opmerking: Deze stappen moeten worden uitgevoerd op ijs. Ga verder met ofwel 1.4.1 of 1.4.2 dienovereenkomstig.
- Op dit punt, de oogst van de hele cultuur, met inbegrip van gedifferentieerde macrofagen, dat zal zich houden aan de cultuur-platen, zelfs als ze zijn ultra-low-attachment oppervlak platen.
- Oogst de hele cultuur door zachte pipetteren en losmaken met een oplossing van 4 ° C PBS, 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA. Herhaal dit totdat de platen vrij zijn van resterende hechtende cellen - bevestigen onder een microscoop als onzeker.
- Als alternatief, gooi aanhangend macrofagen door het oogsten van de bovenstaande vloeistof met de cellen in suspensie, die voornamelijk bevatten monocyten.
- Oogst de niet-hechtende cellen met een oplossing van EDTA-vrij PBS en 0,5% BSA. Oefen niet te veel kracht om te vermijden loskomen mild aanhangend macrofagen.
1.5 FACS-analyse (optioneel)
Opmerking: Het is mogelijk om de celsuspensie van CD117 + stam- en progenitorcellen verminderen door toepassing van MACS. Gebruik fabrikant protocollen voor deze procedure.
- Oogst de cellen volgens een stap 1.4.1 of 1.4.2.
- Centrifugeer de cellen bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en herhaal deze stap.
- Resuspendeer ten minste 250.000 cellen in 300 pi FACS bUffer per sonde.
- Transfercel oplossing op een 96-well plaat (30 ui per putje).
- Centrifugeer de celsuspensie bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 25 ul van antilichaam aan elk putje (gebruik fabrikant verdunning).
- Vlekken op de cellen met antilichamen (volgende protocollen van de fabrikant voor mobiele fenotypering na stappen 1.5.1-1.5.6. Veel gebruikte merkers voor monocyt / macrofaag identificatiegegevens CD11b, F4 / 80 (figuur 3), CD115 (figuur 2), en GR- 1.
Opmerking: Voor een verdere beschrijving van de mobiele oplossingen, is het gebruik van markers zoals CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G en CD192 aanbevolen. Cellulaire kenmerken werden eerder beschreven 12. - Incubeer de sondes gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Centrifugeer de probes bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en resuspendeer met 200 ui FACS-buffer. Herhaal this stap twee keer.
- Breng de sondes in FACS buizen en de FACS-analyse 12 uit te voeren.
- Voer FACS-analyse 12 op dag 0, 3 en 5 tot celdifferentiatie analyseren.
2. staartaderinjectie
2.1 Voorbereiding
- Verwarm de dieren op een verwarmingsplaat bij 37 ° C gedurende ongeveer 10 minuten. Observeer de dieren tijdens het opwarmen om tekenen van oververhitting te herkennen.
- Resuspendeer de monocyten, geïsoleerd in stappen 1.1- 1.4, in 150 ul van NaCl, en laadt de cellen in een 1 ml insuline spuit met een 30G naald. Lichtjes vortex de oplossing voor het laden van de spuit om ervoor te zorgen alle monocyten worden geïnjecteerd. Ga altijd cellen op ijs om warmte-gemedieerde gehechtheid en activering van monocyten te vermijden.
2.2 Tegenhouden
- Te storen andere muizen in de kooi bij het kiezen van een muis voor intraveneuze injectie.
- Plaats de muis in de restrainer. Vermijd te veel prEssure en wees voorzichtig met de achterpoten. (Figuur 4)
Opmerking: U kunt ook gebruik maken van algemene anesthesie om stress vrije omgang met de dieren te garanderen. - Zorg ervoor dat de muis heeft ruimte om te ademen voor het sluiten van de restrainer.
2.3 Injection
- Ontsmet de injectieplaats met desinfectiemiddel. Spray op de staart van de muis en laat minstens 1 min.
- Stop veneuze bloedstroom van de staart door het toepassen van lichte druk op de laterale zijde staart boven de injectieplaats, voor een betere zichtbaarheid van de aderen.
- Draai de staart 90 graden, vóór de injectie. (Figuur 5)
- Injecteer een hoek van 45 graden. Langzaam injecteren en niet meer dan 5 ul per g tot nadelige gevolgen voor dieren te voorkomen.
- Als er een blaar, wat een teken is van een mislukte injectie, stop dan onmiddellijk en herhaal de injectie meer proximaal.
- Stop het bloeden op de injectieplaats naast het toepassen van lichte pressure gedurende ongeveer 1 min.
- Aan het einde van de procedure, opent het oprolmechanisme en plaats de muis in de kooi.
- Neem de muis gedurende 20 minuten zodat het dier niet werd aangetast door de injectie en borstligging wordt gehandhaafd. Verleng de tijd van de waarneming, totdat de muis herwint voldoende bewustzijn. Zet de muis om het gezelschap van andere dieren pas nadat deze volledig is hersteld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De celoplossing uit het murine beenmerg voor verschillende celtypen. De belangrijkste celtypen zijn lymfocyten, granulocyten en monocyten. Celtypen kan worden geschat op grootte en granulariteit, die wordt getoond in figuur 1 voor zowel natief suspensies en cellen geoogst na 5 dagen differentiatie. Let op de verschuivende cellulaire samenstelling tijdens de teelt. Echter, moet nauwkeurige classificatie van de bevolking rekenen op de kenmerkende expressie van cellulaire merkers.
De belangrijkste marker gebruikt om cellen van het MPS-systeem vast is CD115, die fungeert als de M-CSF-receptor en wordt specifiek tot expressie gebracht op monocyten progenitors, monocyten en macrofagen. Daarom kan het niet worden gebruikt om onderscheidende MPS-subgroepen te identificeren, maar kan een betrouwbare schatting van de absolute hoeveelheid cellen gedreven in de monocyten / macrofagen differentiatie. Zie figuur 2 voor een tijdlijn van CD115 expressie tijdens de verschillenentiation.
De looptijd marker F4 / 80 is het nuttig om juveniele monocyten, rijpe monocyten en macrofagen differentiëren. Macrofagen tonen sterke expressie van F4 / 80 in vergelijking met monocyten voorlopercellen, die negatief zijn voor de marker zijn jeugdige. Rijpe monocyten tonen tussenliggende uitdrukking van F4 / 80. Een combinatie van CD115 en F4 / 80 markers is derhalve een haalbare werkwijze voor het kwantificeren en bewaken celdifferentiatie (zie figuur 3).
De combinatie van CD115 en F4 / 80 volstaat routine cultuur observatie en kwaliteitscontrole voor het aanbrengen van cellen. Een meer gedetailleerd onderzoek van het beenmerg-afgeleide monocyten op dag 5 van de teelt bevestigt hun structurele en functionele eigenschappen in overeenstemming met die van het perifere bloed monocyten 12.
Het is belangrijk de muis zorgvuldig vast in de weerhouder vermijden spanning op de staart. Beperken freedom verkeer zoveel mogelijk zonder remmen ademhaling de injectie te vergemakkelijken.
Figuur 1. Links paneel:. Samenstelling van celtypen op dag 1 in de cultuur van de Cel zijn soorten lymfocyten, monocyten en granulocyten. Rechter paneel: Let op de verschuivende cellulaire samenstelling tijdens de teelt. Celpopulatie omvat monocyten en macrofagen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. tijdlijn van CD115 expressie tijdens differentiatie. Merk op dat> 95% van de cellen positief na 5 dagen differentiatie CD115, wat aangeeft dat de overgrote meeste cellen zijn ofwel monocyten of macrofagen. De indeling kan worden gebaseerd op de celgrootte en granulariteit, maar specifieke cellulaire markers zijn betrouwbaarder. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Het verhogen van de expressie van monocyten / macrofagen looptijd marker F4 / 80 Dag 5:. Let op de verschijning van een populatie met tussenliggende F4 / 80 expressie, die in overeenstemming is met de monocyten fenotype. Dag 7:. Let op de rechter shift van F4 / 80 expressie, in overeenstemming met macrofagen rijping Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
e 4 "src =" / files / ftp_upload / 52347 / 52347fig4highres.jpg "/>
Figuur 4. Muis vast in restrainer voor staartaderinjectie. De muis Na zorgvuldig beteugeling, draai de staart 90 graden totdat de aders zijn zichtbaar op de rugzijde. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Schematische dwarsdoorsnede van de muis staart. De afbeelding toont de plaats van vaartuigen in de muis staart. De slagaders (rood) bevinden zich op de ventrale en dorsale zijde, en de aderen zijn aan de laterale zijde van de staart. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een eenvoudige en kosteneffectieve methode om grote hoeveelheden muizen monocyten uit beenmerg te isoleren. In vergelijking met andere protocollen gebruiken perifeer bloed, die monocyt opbrengsten 5 1,4 x10 6 te verkrijgen, kunnen we hogere opbrengsten te verkrijgen van 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monocyten van een enkele donor muis.
Bij het overwegen problemen met deze methode is het belangrijk om de mogelijkheid te vermelden vervuiling bij het werken onder niet-steriele omstandigheden. Als gespoeld wordt en de volgende wasstappen niet goed gevolgd besmetting door bacteriën en schimmels waarschijnlijk. Daarnaast beenmerg voor heterogene celsuspensies, zoals granulocyten, lymfocyten en erythroïde cellen. Normaal worden deze cellen verdwijnen tussen dag 2 en 3 van de teelt door het ontbreken van groeifactoren. Na groeifactor gedreven differentiatie, macrofagen zijn de voornaamste bron van contaminatie. Wat heHij aantal macrofagen laag en de differentiatie van monocyten tot macrofagen minimaliseren het gebruik van ultra-lage bevestigingsplaten en de wasstappen bovengenoemde kritisch.
Het is moeilijk om een merker die uitsluitend monocyt-specifieke identificeren. Interferentie tussen merkers is het gebruik van meer dan één merker, en er is variabiliteit in de korreligheid en grootte van cellen in celsuspensies analyseren. De markers en beschrijvingen weergegeven in de figuren 1-3 zijn goede alternatieven voor representatieve soorten cellen in cultuur. Het kan moeilijk zijn de verschillende celtypen te onderscheiden, vooral na dag 5. Daarom is het essentieel om andere markers zoals CD115 en F4 / 80 gebruiken.
Gezien de expansie van beenmergcellen onder wrij- vrije omstandigheden, kan macrofaag differentiatie worden verlengd en ongedifferentieerde monocyten kunnen ophopen. Macrofaag differentiatie geeft besmetting; echter due hun lijm natuur zelfs op ultra-low-attachment teelt oppervlakken, kunnen ze gemakkelijk worden weggegooid, terwijl slechts het oogsten niet-klevende cellen van cultuur. In eerdere experimenten 1,3, is besmetting door macrofagen niet geleid tot ernstige klinische bijwerkingen. Histologische opwerking van organen en spieren van muizen na celtransplantatie gebleken dat geïnjecteerd macrofagen opgenomen in organen zoals milt, lever of longen. De assimilatie van macrofagen uit deze organen toonde geen waarneembare klinische effecten bij muizen. Het moleculaire mechanisme geactiveerd door deze macrofagen kunnen zijn interessante vragen voor verder onderzoek.
Monocyten alsook macrofagen beïnvloeden arteriogenese bij perifeer vaatlijden, vooral als systemisch toegepast. Klinische bijwerkingen zoals embolie of massief systemische ontsteking kan niet worden waargenomen, zelfs na injectie van meer dan 2,5 miljoen monocyten, maar deze cellen kan leiden tot ontsteking en potentieel ernstige systemische effecten. In menselijke proeven, deze effecten zijn waarschijnlijk klinische betekenis te hebben. Het activeren van arteriogenese kan tumorgroei of diabetische retinopathie, en dergelijke mogelijke systemische effecten van geïnjecteerde cellen oplossingen moeten worden onderzocht in toekomstige studies beïnvloeden.
Vorige publicaties 9 beschrijven verschillen tussen de kenmerken van perifere bloed- en beenmerg afgeleide monocyten, die waarom de eigenschappen van monocyten uit beenmerg kunnen verschillen van die geïsoleerd uit perifere bloedcellen.
De werkwijze van isolatie van klinisch belang ook. Tekening bloed in plaats van extraheren menselijke beenmerg praktischer in het kader van klinische geneeskunde. Het is belangrijk om het welzijn van de dieren en analgesie toepassing indien nodig. Voor intraveneuze injecties, is het essentieel om te oefenen afhandelaar van het dier en de spuit tegelijkertijd. Als een enkele animal ondergaat meerdere injecties, de kwaliteit van de aderen en de huid van de staart lijden.
Ondanks deze nadelen is deze werkwijze zeer nuttig voor het gedrag en eigenschappen van monocyten bestuderen. Experimenten op het gebied van atherosclerose, immunologie of ontsteking kunnen profiteren van deze methode. Slechts 30 minuten nodig zijn bij de winning van het beenmerg naar het zaaien van cellen op 6-well ultra-low-attachment oppervlak platen. Ethische bezwaren worden geminimaliseerd, omdat de hoge opbrengst van dit protocol minimaliseert het aantal benodigde dieren als donoren. Deze nieuwe methode is nuttig voor veel studies met monocyten zijn.
Wij zijn gericht op therapeutische vergroting van het onderpand groei vaartuig via transplantatie van monocyten. De multifactoriële karakter van dit proces kan verklaren waarom enkele factor benaderingen voor vergroting van arteriogenese hebben gegenereerd gemengde resultaten 13,14. Dit heeft geleid tot de inopsporingsonderzoek van cel-gebaseerde therapieën. Autologe beenmerg afgeleide stamcellen en progenitorcellen geïdentificeerd als potentiële cellen voor transplantatie, maar slechts matige klinische voordelen gemeld 15. Naast het onderzoek naar de dosering, isolatie methoden, en toedieningswijzen en is verder onderzoek nodig om de optimale celtype te bepalen. Een nadeel van autologe celtransplantatie kunnen hun onvermogen om de aangeboren en / of adaptieve immuunrespons te activeren, en beide zijn essentieel voor arteriogenese. Het verhogen van de lokale ontsteking kan de beste stimulans voor arteriogenese 16 vertegenwoordigen.
Intraveneuze injectie van monocyten is een gebruikelijke methode om celtransplantatie in muizenmodellen als systemische geneesmiddelafgifte gewenst. Vanwege de systemische effecten, kunnen de bijwerkingen ook optreden. Zorg ervoor dat de ader is bedoeld voor injectie. Het is gebruikelijk om slagaders en aders, vooral bij het injecteren sterk gepigmenteerde mic verwarrene. Arteriële injectie kan embolie, die leiden tot systemische problemen in omloop veroorzaken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well-ultra-low-attachment plate | Corning Incorporated, NY, USA | 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile | |
| 8- 12 week old, male, balb/c mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| 96-well-plate | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Blue dead cell stain | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ||
| Bovine serum albumine | GE Healthcare, Freiburg, Germany | Fraction V, pH 7.0 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, USA | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, USA | 53-0112 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | With cap, steril | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra® X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | Kodan Tinktur forte | |
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Ethanol 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Extraction unit Pipetus | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Düsseldorf, Germany | MCA497APC | |
| FACS buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3 | |
| FACS device | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | BD FACS Canto II | |
| FACS tubes | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Falcon® pipette | Becton Dickenson Labware, NY, USA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, USA | 53-5931 | |
| Heating plate | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 °C | |
| Macrophage-Colony Stimulating Factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Mechanical shaker | IKA, Staufen, Germany | ms2 minishaker | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Warm in 37 °C water bath before use | |
| Micro test tubes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| NaN3 (sodium acide) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Nylon cellsieve | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | Cell strainer, 70 µm mesh size | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Phosphate buffered saline | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | pH 7.4, sterile | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µl/100µl/200µl/1,000µl | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Serological pipette | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 1 ml Omnifix® -F insuline syringe | |
| Tubes with cap | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | 15 ml/50 ml Cellstar tubes | |
| Warm water bath | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany | Julabo SW22 |
References
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).
- Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Isolation and transduction of monocytes: promising vehicles for therapeutic arteriogenesis. Langenbecks Arch Surg. 391 (2), 72-82 (2006).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American Journal Of Translational Research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Leon, B., et al. Dendritic cell differentiation potential of mouse monocytes: monocytes represent immediate precursors of CD8- and CD8+ splenic dendritic cells. Blood. 103 (7), 2668-2676 (2004).
- Timmerman, J. M., Levy, R. Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 50, 507-529 (1999).
- Salem, M. L. The use of dendritic cells for Peptide-based vaccination in cancer immunotherapy. Methods Mol Biol. 1139, 479-503 (2014).
- Timmerman, J. M., et al. Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients. Blood. 99 (5), 1517-1526 (2002).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
- Houthuys, E., Movahedi, K., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. Journal Of Immunological Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Seeger, F. H., Tonn, T., Krzossok, N., Zeiher, A. M., Dimmeler, S. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. European Heart Journal. 28 (6), 766-772 (2007).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. The Journal Of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Francke, A., Herold, J., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Generation of mature murine monocytes from heterogeneous bone marrow and description of their properties. J. Histochem. Cytochem. 59 (9), 813-825 (2011).
- Sneider, E. B., Nowicki, P. T., Messina, L. M. Regenerative medicine in the treatment of peripheral arterial disease. Journal Of Cellular Biochemistry. 108 (4), 753-761 (2009).
- Van Royen, N., Piek, J. J., Schaper, W., Fulton, W. F. A critical review of clinical arteriogenesis research. J Am Coll Cardiol. 55 (1), 17-25 (2009).
- Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy. J Vasc Surg. 53 (2), 445-453 (2011).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
