Protocol
Diese Studie wurde mit Genehmigung des Landes Sachsen und Sachsen-Anhalt, Regierungspräsidium Dresden / Halle durchgeführt werden, nach § 8 des Gesetzes für den Tierschutz (24D-9168,11-1 / 2008-24).
1 Zellisolation
1.1 Herstellung von Ober- und Unterschenkel
- Anesthetize der Maus unter Verwendung einer 5% Isofluran Konzentration durch Verdampfen von Isofluran in einem geschlossenen Behälter. Wenn sich die Maus nicht mehr bewegt für 3 Sekunden, führen Sie den Genickbruch.
- Desinfizieren Sie die Hinterbeine mit Ethanol (96%). Haut und Muskeln entfernen und trennen Sie die Knochen mit einem sterilen Skalpell.
- Beginnen Sie mit einem Leistenhautschnitt, und verlängern die Inzision in Richtung der Innenknöchel und die eine Kreis Präparation der Haut um den Unterschenkel. Entfernen Sie die Haut der Beine vollständig durch Abziehen es proximal.
- Nehmen Sie den Quadrizeps vom Femur mit einem scharfen Skalpell entfernen sowohl die vorderen peroneusund die Wadenmuskelgruppen und desartikulieren das Bein im Hüftgelenk durch die Anordnung und sezieren die Bänder.
- Starten Sie nach vorne und fahren rund um das Gelenk durch vorsichtiges Drehen des Beins und Durchschneiden der Bänder, wodurch der gemeinsame disarticulating.
- Waschen Femur und Tibia mit 96% Ethanol für ein Minimum von 90 Sekunden auf eine aseptische Zellpräparation zu gewährleisten. Fahren Sie mit der Waschprozess mit sterilem PBS abzuspülen restliche Ethanol.
Hinweis: Alle nachfolgenden Schritte müssen steril zur Vermeidung von Verunreinigungen sein.
1.2 Ernte von Knochenmark
- Schneiden Sie das proximale und distale Ende jedes Knochens mit einer feinen Schere, um den Zugriff auf die Ober- und Unterschenkelwellen zu gewinnen. Seien Sie vorsichtig mit diesem Schritt, da diese Knochen sehr leicht brechen.
- Spülen die Knochen mit warmem Medium (M199 + 10% fötales Kälberserum (FCS) + 1% Penicillin / Streptomycin). Verwenden Sie eine sterile 28-G-Nadel, eine 1-ml-Spritze und zwischen 10 bis 15 ml Medium proKnochen zum Spülen.
- Halten Sie die Knochen mit einer feinen Pinzette und spülen Sie eins nach dem anderen, bis sie halbdurchscheinend macht. Druck vorsichtig auf das Ende des Spritzenkolbens anwenden, um die Zellspannung zu minimieren.
- Filtern Sie das Knochenmark durch einen 70 & mgr; m Nylon-Web und sammeln das Filtrat. Um die maximale Menge an Knochenmarkextrakt wiederholt gründlich von den distalen und proximalen Enden.
- Spülen Sie das Sieb mit PBS und sammeln das Filtrat. Vorsichtig zu entfernen Schmutz und Zellkonglomerate durch leichtes Rühren und Pipettieren.
1.3 Anbau
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 · g für 10 min bei RT. Überstand verwerfen und die Zellen resuspendieren mit etwa 25 ml Medium. Wiederholen Sie einmal.
- Die Zellen in 6 ml Medium nach der zweiten Waschstufe. Mischungs 50 ul der Zell-Lösung mit 50 ul Trypanblau. Zählen Sie die Zellen in einer Zählkammer unter einem Lichtmikroskop. Berechnung der Anzahl von cEllen in der Lösung mit dieser Formel:
- Seed die Zellen auf 6-Well-Ultra-Low-Befestigungsfläche Platten dauerhafte Haftung an der Unterseite der Platte zu verhindern. Verwenden Sie eine Konzentration von 10 6 Zellen pro ml mit bis zu 6 ml pro Vertiefung.
- Ergänzen Sie die Suspension mit 20 ng / ml M-CSF auf die Zelldifferenzierung fördern.
- Kultur die Zellen für 5 Tage bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid und beobachten täglich.
1.4 Die Ernte der Zellen
Hinweis: Diese Schritte sollten auf Eis durchgeführt werden. Gehen Sie entweder mit 1.4.1 oder 1.4.2 entsprechend.
- Zu diesem Zeitpunkt ernten die gesamte Kultur, einschließlich differenzierter Makrophagen, die zu den Kulturplatten haftet, auch wenn sie ultra-low-Befestigungsfläche Platten.
- Ernte der gesamten Kultur durch vorsichtiges Pipettieren und Abnehmen mit einer Lösung von 4 ° C PBS, 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA. Wiederholen, bis die Platten frei von verbleibenden anhaftenden Zellen - Bestätigung unter dem Mikroskop, wenn nicht sicher.
- Alternativ verwerfen adhärenten Makrophagen durch Ernte des Überstands mit den Zellen in Suspension, die überwiegend Monozyten enthalten.
- Ernte der nicht-adhärenten Zellen mit einer Lösung von EDTA-freies PBS und 0,5% BSA. Sie nicht zu viel Kraft, um zu vermeiden, verdrängen leicht anhaftenden Makrophagen gelten.
1.5 FACS-Analyse (optional)
Anmerkung: Es ist möglich, die Zellsuspension von CD117 + Stamm- und Vorläuferzellen durch die Verwendung von MACS abzureichern. Verwenden Hersteller Protokolle für dieses Verfahren.
- Ernte der Zellen gemäß einem der Schritte 1.4.1 oder 1.4.2.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 × g für 10 Minuten bei 4 ° C und wiederholen Sie diesen Schritt wieder.
- Resuspendieren mindestens 250.000 Zellen in 300 ul FACS buffer pro Sonde.
- Übertragungszelle Lösung auf eine 96-well-Platte (30 & mgr; l pro Vertiefung).
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
- Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 25 ul Antikörper in jede Vertiefung (Verwendung Hersteller Verdünnung).
- Färben die Zellen mit Antikörpern (nach Herstellerprotokollen für Zell Phänotypisierung nach den Schritten 1.5.1-1.5.6. Üblicherweise verwendete Marker für Monozyten / Makrophagen zur Identität CD11b, F4 / 80 (Figur 3), CD115 (Abbildung 2), Gr- 1.
Anmerkung: Für eine weitere Beschreibung von Zell Lösungen ist die Verwendung von Markern, wie CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G und CD192 empfohlen. Cellular Eigenschaften wurden zuvor beschrieben 12. - Die Sonden für 20 min Inkubation bei 4 ° C.
- Zentrifuge die Sonden bei 250 × g für 5 min bei 4 ° C und Resuspension mit 200 ul FACS-Puffer. Wiederholen thist Schritt zweimal.
- Übertragen Sie die Sonden in FACS-Röhrchen und führen Sie die FACS-Analyse 12.
- Führen FACS-Analyse 12 am Tag 0, 3 und 5, um die Zelldifferenzierung zu analysieren.
2. Injektion in die Schwanzvene
2.1 Vorbereitung
- Erwärmen die Tiere auf einer Heizplatte bei 37 ° C für ca. 10 min. Beachten Sie die Tiere unter Erwärmung auf Anzeichen einer Überhitzung zu erkennen.
- Resuspendieren der Monozyten, isoliert in Schritten 1.1- 1.4, in 150 ul NaCl, und laden Sie die Zellen in eine 1 ml Insulinspritze mit einer 30G Nadel. Die Lösung leicht vortexen vor dem Laden der Spritze, um sicherzustellen, dass alle Monozyten injiziert werden. Immer Griff Zellen auf Eis, Wärme-vermittelte Bindung und Aktivierung von Monozyten zu vermeiden.
2.2 Einstweilige
- Vermeiden Sie andere Mäuse stören im Käfig bei der Auswahl einer Maus zur intravenösen Injektion.
- Platzieren Sie die Maus in die Restrainer. Vermeiden Sie zu viel prEssure und seien Sie vorsichtig mit den Hinterbeinen. (Figur 4)
Hinweis: Alternativ können Sie auch eine Vollnarkose zu stressfreien Umgang mit den Tieren zu gewährleisten. - Stellen Sie sicher, dass die Maus bietet Platz zum Atmen vor dem Schließen der Verzögerer.
2.3 Injection
- Desinfizieren Sie die Injektionsstelle mit Desinfektionsmittel. Spray auf dem Schwanz der Maus und lassen Sie stehen für mindestens 1 min.
- Stoppen Venenblutdurchfluß des Schwanzes durch sanften Druck auf die seitlichen Heckseite oberhalb der Injektionsstelle, für eine bessere Sichtbarkeit der Venen.
- Drehen Sie den Schwanz 90 Grad, vor der Injektion. (Figur 5)
- Injizieren bei einem Winkel von 45 Grad. Injizieren Sie langsam und nicht mehr als 5 & mgr; l pro g zu schaden Tiere zu vermeiden.
- Wenn es eine Blase, die ein Zeichen für eine fehlgeschlagene Einspritzung ist, ab sofort nicht und wiederholen Sie die Injektion weiter proximal.
- Stoppen Sie die Blutungen an der Injektionsseite durch leichten pressure für etwa 1 min.
- Am Ende des Verfahrens, öffnen Sie die Rückziehvorrichtung und die Maus in seinem Käfig.
- Beachten Sie die Maus für 20 Minuten, um sicherzustellen, dass das Tier nicht von der Injektions geschädigt und Brustlage beibehalten wird. Verlängern Sie die Zeit der Beobachtung, bis die Maus gewinnt ausreichend Bewusstsein. Bringen Sie die Maus, um das Unternehmen von anderen Tieren nur nachdem sie vollständig erholt hat.
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Representative Results
Das aus dem Knochenmark der Maus extrahiert Zelllösung besteht aus verschiedenen Zelltypen. Die wichtigsten Zelltypen sind Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten. Zelltypen können durch Grße und Granularität, die in Abbildung 1 für native Suspensionen und Zellen nach 5 Tagen der Differenzierung geerntet gezeigt wird geschätzt werden. Beachten Sie die Verschiebung zelluläre Zusammensetzung während der Kultivierung. Jedoch muss eine genaue Klassifizierung der Bevölkerung auf die markante Expression zellulärer Marker angewiesen.
Der wichtigste Marker verwendet, um Zellen des MPS-System zu identifizieren ist CD115, welches als M-CSF-Rezeptor fungiert und speziell auf Monozyten Progenitoren, Monozyten und Makrophagen exprimiert. Es ist daher nicht verwendet werden könnte, um markante MPS-Untergruppen zu identifizieren, aber verlässlich schätzen kann die absolute Menge von Zellen in die Monozyten / Makrophagen-Differenzierung angetrieben. Siehe Abbildung 2 für eine Zeitleiste der CD115-Expression während unterscheidenzierung.
Die Laufzeit-Marker F4 / 80 ist nützlich, um juvenile Monozyten reifen Monozyten und Makrophagen zu differenzieren. Makrophagen zeigen starke Expression von F4 / 80 im Vergleich zu Monozyten-Vorläuferzellen, die negativ für die Marker sind juvenile. Mature Monozyten zeigen Zwischen Ausdruck F4 / 80. Eine Kombination von CD115 und F4 / 80-Marker stellt somit eine mögliche Methode zur Messung und Überwachung der Zelldifferenzierung (siehe Abbildung 3).
Die Kombination von CD115 und F4 / 80 ist ausreichend für die Routine zum Beobachten von Kulturen und Qualitätskontrolle vor dem Aufbringen der Zellen. Eine genauere Untersuchung der Knochenmark-abgeleiteten Monozyten an Tag 5 des Anbaus bestätigt ihre strukturellen und funktionellen Eigenschaften in Übereinstimmung mit denen von Monozyten im peripheren Blut 12.
Es ist wichtig, um die Maus vorsichtig in den Rückhalter zu fixieren, die Spannung auf dem Schwanz zu vermeiden. Beschränken freedom der Bewegung so weit wie möglich, ohne die Hemmung Atmung, die Injektion zu erleichtern.
Abbildung 1. Linker Bereich:. Zusammensetzung von Zelltypen am Tag 1 in Kultur Zelltypen umfassen Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten. Rechts: Beachten Sie die Verschiebung zelluläre Zusammensetzung während der Kultivierung. Zellpopulation umfasst Monozyten und Makrophagen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Zeitleiste der CD115-Expression während der Differenzierung. Beachten Sie, dass> 95% der Zellen CD115 positiv nach 5 Tagen der Differenzierung, der darauf hinweist, dass die überwiegende Mehrzahl von Zellen sind entweder Monozyten oder Makrophagen. Die Einstufung kann auf Zellgröße und Granularität, aber spezifische zelluläre Marker sind zuverlässiger basieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Erhöhung der Expression von Monozyten / Makrophagen-Reifemarker F4 / 80. 5. Tag: Beachten Sie das Aussehen einer Bevölkerung mit Zwischen F4 / 80-Expression, die im Einklang mit Monozyten-Phänotyp. 7. Tag:. Beachten Sie die Rechts-Shift F4 / 80-Expression, die mit Makrophagen Reifung Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Abbildung 4. Maus in Rainer für Schwanzveneninjektion festgelegt. Nach sorgfältiger Zurückhalten der Maus, drehen Sie den Schwanz 90 Grad, bis die Adern auf der Rückenseite sichtbar sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5: Schematischer Querschnitt der Maus Schwanz. Das Bild zeigt die Position von Schiffen innerhalb der Maus Schwanz. Die Arterien (rot) sind an der ventralen und dorsalen Seite der Stadt, und die Venen sind auf der lateralen Seite des Schwanzes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Wir beschreiben ein einfaches und kostengünstiges Verfahren, um große Mengen an murine Monozyten aus Knochenmark zu isolieren. Im Vergleich zu anderen Protokollen mit dem peripheren Blut, die Monozyten Ausbeuten 5 von 1,4 x10 6 zu erhalten, werden wir in der Lage, höhere Ausbeuten an 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 Monozyten aus einer Spendermaus erhalten.
Wenn angesichts Herausforderungen mit diesem Verfahren ist es wichtig, die Möglichkeit einer Verunreinigung beim Arbeiten unter nicht sterilen Bedingungen zu nennen. Wenn Spülen und die folgenden Waschschritte nicht befolgt werden, eine Verunreinigung durch Bakterien und Pilze ist wahrscheinlich. Zusätzlich Knochenmark aus heterogenen Zellsuspensionen, einschließlich Granulozyten, Lymphozyten und Erythrozyten. Normalerweise verschwindet diese Zellen zwischen 2. und 3. Tag der Kultivierung durch den Mangel an Wachstumsfaktoren. Nach Wachstumsfaktor angetrieben Differenzierung Makrophagen die Hauptquelle der Kontamination. Um halten ter Anzahl von Makrophagen niedrig und die Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen zu minimieren, die Verwendung von ultraniedrigen Befestigungsplatten und die vorstehend erwähnten Waschschritte sind unkritisch.
Es ist schwierig, einen Marker, der ausschließlich monozytenspezifischen identifizieren. Interferenzen zwischen den Markern macht die Verwendung von mehr als einem Marker, und es gibt die Variabilität in der Granularität und Größe der Zellen, die in der Analyse von Zellsuspensionen. Die Markierungen und Beschreibungen in den Figuren 1-3 gezeigt, sind gute Alternativen für repräsentative Zelltypen in Kultur. Es kann schwierig sein, die verschiedenen Zelltypen zu unterscheiden, vor allem für Tag 5. daher entscheidend für andere Marker wie CD115 und F4 / 80 zu verwenden ist.
Angesichts der Erweiterung des Knochenmarkzellen unter haftungsfreien Bedingungen kann Makrophagendifferenzierung verlängert und undifferenzierte Monozyten ansammeln kann. Makrophagen-Differenzierung zeigt Kontamination; aber due, um ihre Haft Natur selbst auf Ultra-Low-Befestigung Anbauflächen, können sie leicht entsorgt werden, während nur die Ernte nicht haftende Zellen von Kultur. In früheren Experimenten 1,3 hat Kontamination durch Makrophagen nicht zu schweren klinischen Nebenwirkungen geführt. Die histologische Aufarbeitung der Organe und Muskeln von Mäusen nach Zelltransplantation zeigten, dass injizierten Makrophagen in Organen wie Milz, Leber oder Lunge assimiliert. Die Assimilation von Makrophagen in diesen Organen zeigten keine beobachtbaren klinische Wirkungen bei Mäusen. Der molekulare Mechanismus von diesen Makrophagen ausgelöst können interessante Fragen für weitere Untersuchungen sein.
Monozyten und Makrophagen beeinflussen Arteriogenese in periphere arterielle Verschlusskrankheit, vor allem, wenn sie systemisch angewendet. Klinische Nebenwirkungen, wie Embolien oder massiven systemischen Entzündung konnte nicht einmal nach der Injektion von mehr als 2,5 Millionen Monozyten beobachtet werden, aber diese Zellen können Entzündungen und po auslösentenziell zu schweren systemischen Wirkungen. In Studien am Menschen sind diese Wirkungen, die klinische Bedeutung haben. Das Auslösen Arteriogenese Tumorwachstum oder diabetischer Retinopathie und solche möglichen systemischen Wirkungen des injizierten Zell Lösungen sollten in zukünftigen Studien erforscht werden beeinflussen.
Früheren Veröffentlichungen 9 beschreiben Unterschiede zwischen den Eigenschaften der peripheren Blut- und Knochenmark abgeleiteten Monozyten, die erklären, warum die Eigenschaften der Monozyten aus dem Knochenmark kann aus den von den peripheren Blutzellen isoliert abweichen.
Die Methode der Isolierung ist von klinischem Interesse als auch. Blutentnahme statt Extrahieren menschlichem Knochenmark ist praktischer im Rahmen der klinischen Medizin. Es ist wichtig, nach dem Wohlbefinden der Tiere zu betrachten und Analgesie gelten, wenn nötig. Für intravenöse Injektionen, ist es wichtig zu üben Umgang sowohl das Tier und die Spritze zur gleichen Zeit. Wenn eine einzelne animal durchläuft mehrere Injektionen, die Qualität der Adern und die Haut des Schwanzes leiden.
Trotz dieser Nachteile ist dieses Verfahren sehr nützlich, um das Verhalten und die Eigenschaften der Monozyten zu untersuchen. Experimente auf dem Gebiet der Atherosklerose, Immunologie oder Entzündungen können von diesem Verfahren profitieren. Nur 30 Minuten sind aus der Gewinnung von Knochenmark in die Aussaat von Zellen auf 6-Well-Ultra-Low-Befestigungsfläche Platten erforderlich. Ethische Bedenken werden minimiert, weil die hohe Ausbeute an diesem Protokoll die Zahl der Tiere als Zellspender erforderliche Minimum. Diese neue Methode ist hilfreich für viele Studien mit Monozyten sein.
Wir haben uns auf therapeutische Verstärkung der Sicherheiten Gefäßwachstum über die Transplantation von Monozyten konzentriert. Die multifaktorielle Natur dieses Prozesses könnte erklären, warum einzelne Faktor Ansätze zur Verstärkung der Arteriogenese haben gemischte Ergebnisse erzeugt 13,14. Dies hat zu der in führtensuchung von zell-basierte Therapien. Autologe Knochenmark abgeleiteten Stammzellen und Vorläuferzellen sind als potentielle Zellen zur Transplantation identifiziert worden, aber nur mäßige klinischen Nutzen berichtet worden 15. Neben der Forschung über die Dosierung, Isolationsverfahren und Verabreichungswegen ist weitere Forschung nötig, damit die optimale Zelltyp zu bestimmen. Ein Nachteil der autologen Stammzelltransplantation könnte ihre Unfähigkeit, die angeborene und / oder adaptive Immunantwort zu aktivieren, und beide entscheidend für Arteriogenese sind. Zunehmende lokale Entzündung kann die beste Anregung für Arteriogenese 16 darstellen.
Die intravenöse Injektion von Monozyten ist eine übliche Methode zur Zelltransplantation in Mausmodellen, wenn systemische Arzneimittelabgabe erwünscht ist. Aufgrund der systemischen Wirkungen können Nebenwirkungen wie auch auftreten. Sicherzustellen, dass die Vene zur Injektion gezielt. Es ist üblich, Arterien und Venen, insbesondere beim Einspritzen stark pigmentierten mic verwirrene. Arterielle Injektion können Embolien, die systemische Fragen im Umlauf führen können.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well-ultra-low-attachment plate | Corning Incorporated, NY, USA | 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile | |
| 8- 12 week old, male, balb/c mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| 96-well-plate | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Blue dead cell stain | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ||
| Bovine serum albumine | GE Healthcare, Freiburg, Germany | Fraction V, pH 7.0 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, USA | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, USA | 53-0112 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | With cap, steril | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra® X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | Kodan Tinktur forte | |
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Ethanol 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Extraction unit Pipetus | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Düsseldorf, Germany | MCA497APC | |
| FACS buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3 | |
| FACS device | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | BD FACS Canto II | |
| FACS tubes | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Falcon® pipette | Becton Dickenson Labware, NY, USA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, USA | 53-5931 | |
| Heating plate | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 °C | |
| Macrophage-Colony Stimulating Factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Mechanical shaker | IKA, Staufen, Germany | ms2 minishaker | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Warm in 37 °C water bath before use | |
| Micro test tubes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| NaN3 (sodium acide) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Nylon cellsieve | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | Cell strainer, 70 µm mesh size | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Phosphate buffered saline | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | pH 7.4, sterile | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µl/100µl/200µl/1,000µl | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Serological pipette | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 1 ml Omnifix® -F insuline syringe | |
| Tubes with cap | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | 15 ml/50 ml Cellstar tubes | |
| Warm water bath | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany | Julabo SW22 |
References
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