Introduction
색소 성 망막염 (RP)는 신경 활동으로, 광자의 형태로, 광 열 변환 할 책임이 망막의 최 외층에있는 광 수용체 세포의 광범위한 손실을 일으키는 유전 질환이다. 중요한 것은, RP 환자는 일반적으로 여전히 작동 그들의 망막의 다른 층에 잔류 신경 세포가있다. 망막 보철물 시각적 통로 1,2- 활성화와 전기 자극이 신경 세포 생존을 대상으로 환자에게 어떤 시각을 복원 할 수있다. 임상 시험에서 지각 결과는 초기 결과를 약속 보여 최근 일부 장치는 상업적 목적으로 승인되었습니다. subretinally 5, 6 및 suprachoroidally 7,8 epiretinally 3,4 : 현재 세 가지 주요 해부학 임상 망막 보철이 배치되어있는 위치가있다. 다른 장치는 다른 재료를 활용하여 자신의 양식은 사용자 정의됩니다그들은 주입되는 위치. 하지만, 그들 모두는 전기 펄스와 망막 뉴런의 잔류를 활성화하여 시각적 지각 표상을 만든다.
어떤 의료 보철물 때문에 초기 배치의 영향이나 기계적 이후 지속적인 힘 주변 조직 손상시킬 수있는 가능성이있다. 망막 이식 보철물 같은 자극의 경우에서, 전기 파라미터는 안전 한계 내에 있어야 추가적인 고려 사항이있다. 환자의 안전이 가장 중요하므로 장치는 엄격하게 임상은 9-15 설정에 진출하기 전에 임상 연구에서 테스트해야합니다. 우리 컴패니언 글에서는 맥락막 상강 공간 (16) 내에 위치 임플란트 주변의 눈 국소 조직 병리학을 평가하기위한 방법을 설명했다. 본 논문에서는 (FE를 임상에서 epiretinally 망막 식은 전극 어레이를 둘러싸는 눈 조직 시각화 기법을 서술라인) 모델 (그림 1).
망막 위치는 시각적 보철물을 찾기위한 가장 일반적으로 이용되는 위치이다. 여기에 위치한 전극 어레이는 전형적으로 17-20 눈의 모든 층을 관통하는 금속 압정 망막에 부착된다. 앞서 본 원고에 기재된 기술로, 정확하게 망막 즉시 압정을 둘러싼 다른 조직을 평가하기 어려웠다. 중성 포르말린을 사용하여 표준 눈을 고정으로 인해 택의 고정 점에 대한 망막과 공막의 차동 운동에 인공적인 망막 손상의 결과. 따라서 택 및 망막 배열로 인해 발생한 실제 손해를 정확하게 관찰 할 수 없습니다. 금속 물체가 용이하게 기존의 조직 학적 장치로 절단 할 수 없으므로 또한, 눈 조직 절편 것은 시츄 망막 압정 수행 될 수 없었다; 조직 학적 처리도되기 전에 택을 제거이것은 또한 인공적인 망막 손상에지도로 바람직하지 않은.
본 연구의 목적은 두 가지였다 : 택 및 망막 임플란트 배열로 인한 손상이 안정적으로 평가 될 수 있도록 1) 망막 박리의 유물을 줄이기 위해; 2) 삭제하지 않고 압정에 인접한 망막 구조를 시각화. 인공적 망막 박리를 감소시키고, (컴패니언 제 16의 설명 참조) 한 목적을 달성하기 위해, 새로운 고정술들이 이용 하였다. 이 목적을 달성하기 위해, 우리는 연삭, 원래 인공 와우 전극 21-23 원위치 관찰에 대한 기술 개발을, 연마, 임베딩 변성. 인공적 망막 손상을 최소화하고, 따라서 망막 택 및 배열로 인한 잠재적 인 손상의 정확한 평가를 허용하면서,이 원고에 기재된 방법은 반응계 내에서 가용 접 주변 망막의 가시화를 허용 인접.
Protocol
참고 : 모든 절차가 로얄 빅토리아 눈과 귀 병원의 동물 연구 윤리위원회에 의해 승인되었다 (RVEEH AEC # 10-199AB). 대상은 국민 건강과 (2013)과 "동물 학대 방지법"의학 연구위원회 (Medical Research Council)의 "관리 및 과학적인 목적을위한 동물의 사용을위한 연습의 호주 코드"에 따라 처리 된 (및 개정 1986). 모든 외과 적, 전기 생리 학적 및 임상 평가 절차는 마취 하에서 수행하고, 모든 노력이 고통을 최소화 하였다.
1. 핵의 제거 및 고정
참고 : 존재하는 경우, 장치 케이블 또는 유리체 절제술 포트 주위에 추가 돌보는은 관련 원고 (16)에 자세히 설명 탈핵 및 고정 절차를 따르십시오. 간단히 말해서,이 포함됩니다 :
- 로 transcardially 차가운 중립 buffe 다음에 따뜻한 식염수 주제를 관류빨간색 포르말린.
- 랜드 마크 역할을하는 안구에 봉합을 묶어.
- 케이블 장치 및 부착 패치 / 탭을 유지, 눈 (16)을 명백히하다.
- 36 시간 - 18 데이비슨의 솔루션에 눈을 포스트 - 수정.
- 8 시간 - 6 50 % 에탄올로 전송합니다.
- 해부까지 70 % 에탄올 냉장 (4 ℃)에 전송합니다.
2. 전극 제거 및 해부.
주 : 모든 망막 임플란트는 동일한 폼 팩터를 가질 것이지만, 일반적으로 전극 어레이 및 유연성 순응성 담체 물질의 일부 형태가있을 것이다. 망막 식은되는 장치는 금속 압정 함께 이러한 유지 어레이 및 눈의 뒷면을 관통하는 구멍을 점착 기능.
- 임플란트는 망막에 고정되는 점을 시각화.
- 15도 블레이드를 사용하여 원주 트랜스 각막 절개를 그리고 특급하기 위해 각막 뚜껑을 제거기본 조리개와 렌즈 OSE.
- 15도 블레이드를 사용하여, 망막 임플란트 시츄 금속 압정 후방 챔버를 노출시키는 렌즈의 소 대상의 섬유 및 토토 disinsert 렌즈를 제거한다.
- 임플란트와 연구 수행에 따라 추가 해부하기 전에 외부 구성 요소를 제거합니다.
참고 : 본 예에서, 평가중인 망막 배열 등각 실리콘 캐리어 내에 수용 프로토 밀폐형 다이아몬드 전극 및 전자 패키지 구성되었다 (집 제조 20 참조).- 여기에 조심스럽게 메스와 미세 절개하여 다이아몬드 전극 패키지의 압축을 풉니 다. 망막 압정과 백금 배선의 잔해 (그림 2)와 함께 임플란트의 실리콘 몸을 둡니다. 임베디드 어레이 / 하우징 내사 장치 설계의 일부가 아닌 경우,이 단계 (2.2)를 생략.
- 주의하여원하는 방향으로 택 및 주변 조직을 포함하는 샘플을 해부. 공막, 맥락막과 망막을 포함한 눈의 뒤쪽에서 전체 두께 스트립을 잘라 미세 해부 가위를 사용합니다. 압정에 인접한 모든 망막 층을 보여 택의 종단면을 제공하는 샘플을 보자 (그림 2)
참고 : 샘플 원하는 방향으로 원하는 특정 결과에 따라 다를 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 광학 디스크가 시료 내에 포함되어야한다 광학 디스크에 손상 압정 근방을 조사하고자.
3. 탈수, 임베드, 설치, 연삭, 염색, 및 이미징
- 진보적 인 에탄올 단계에서 삼일을 통해 샘플을 탈수 :
- 회 2 시간 동안 70 % 에탄올에서 샘플 탈수.
- O / N 두 차례 2 시간 동안 80 %의 에탄올의 샘플을 탈수.
- 2 시간의 TWIC 90 % 에탄올에 샘플을 탈수전자.
- O / N 배에서 2 시간 후, 100 % 에탄올에 샘플을 탈수.
- 회 2 시간 동안 100 % 아세톤 샘플 탈수.
- 아세톤에서 시료를 제거하고 실온에서 그 공기가 건조 등의 광학 현미경으로 관찰한다. 에폭시에 샘플을 전송은 / 축소를 곱슬 곱슬 시작 직전 (3.4 단계를 참조하십시오).
참고 : 붕괴 세포 수축의 부드러운 조직 결과에서 액체를 제거. 조직 컬링 / 축소가 발생했을 때의 감사 경험으로 개발되고있다.
- 아세톤에서 시료를 제거하고 실온에서 그 공기가 건조 등의 광학 현미경으로 관찰한다. 에폭시에 샘플을 전송은 / 축소를 곱슬 곱슬 시작 직전 (3.4 단계를 참조하십시오).
- 제조업체의 지시에 따라 의료용 에폭시 수지를 준비합니다. 수지를 경화하려면 1 시간 또는 실온에서 24 시간 동안 중 55 ° C를 사용합니다. 기포 제거에 대한 ~ 50 밀리바에서 ~ 5 분 동안 진공 챔버에서 발생. 끓여 에폭시 혼합물의 원인이됩니다 과도한 진공으로 수동으로 진공을 조절하고 가스 제거를 효과적으로 발생하지 않습니다
참고 : 단계 3.2와 동시에 단계 3.3을 수행합니다. - SAMP 퍼가기명확한 에폭시 수지 르. 적절한 밀폐 용기에 가스가 제거 된 에폭시의 안구 조직을 담그고 O를 떠나 / N RT에서 치료.
- 크기 조정 및 경화 된 에폭시 블록을 재-삽입하여 원하는 방향 (그림 2)에서 샘플을 포함 할주의하십시오. (-도 3a 노란색 컵) 점착성의 장축은 금형의 아래쪽에 평행하게 배향되도록, 안구 조직을 포함하는 크기가 조정 블록을 다시 임베드.
- 연삭 시편 홀더에 수지를 탑재하고 샘플 갈기 - 탄화 규소 종이 사용 (230 수동 연삭, 물과 함께 250 RPM)를 (800 격자로 시작하는,도 3C 및 3E).
- 염색의 경우, 3 톨루이딘 블루 염색에지면을 찍어 - 5 분, 또는 얼룩이 개발 될 때까지 (그림 3 층).
- 수돗물 (그림 3G)로 씻어.
- 이미지 고전력 해부 범위와 표본의 바닥면의 세포층을 나타낼망막 (그림 3H). 공기 계면에서 에폭시 회절을 부드럽게 시험편 상기 에폭시의 상면에 증류수 방울을 적용한다. 샘플을 조명하는 광섬유 '거위'광원을 사용합니다.
- 샘플의 미리 설정된 두께 연마하여 각각의 시간 (시편 홀더의 최소 정확하고 재현성있는 분쇄 증가가 20 μm의 경우), 3.9 - 반복 3.6 단계를 반복합니다.
Representative Results
정착 프로토콜은 실질적으로 인공적 망막 박리 (16)의 박리를 저감. 에폭시 블록 내의 시험편의 방향은 두 단계로 설명 매립 공정을 이용하여 지속적으로 유지시켰다. 증분 연마 과정은 최적의 결과를 달성하기 위해 손재주의 중간 수준을 요구하지만, 증가 해상도 미세 제어를 제공하는 조정 시험편 홀더의 도움을했다. 모든 경우에 (N = 5) 점착성이있는 분쇄 하였다 / 바람직하고 일관된 결과로 연마. 침에 인접한 망막은 확인할 수 있었다 적절 스테인드. 등급 P # 800의 탄화 규소 종이 에폭시 수지 블록의 표면을 연마하는 것은 매립 조직 세포 거대 영상에 충분 하였다. 높은 등급의 종이, 또는 다이아몬드 슬러리를 원하는 경우, 상기 임의의 주어진 깊이로 표면을 연마하는 데 사용될 수있다. 해부 현미경과 광학 섬유 '거위'LIGHt 소스는 접지 블록과 내장 조직 샘플의 표면을 이미징하기에 적합한 것으로 밝혀졌다. 광원의 위치는 현미경을 통해 최상의 조명 및 콘트라스트를 준 위치 및 각도를 찾기 위해 시행 착오에 의해 변화시켰다. 블록의 표면에 증류수 방울을 추가 샘플 위에 에폭시 공기 계면에서의 광로 회절 및 / 또는 매끄러운 왜곡을 감소시키기에 유용 하였다. 도표 4는 티탄 망막에 바로 인접 시각화 망막 조직의 예시적인 이미지를 도시 이 기술을 사용 압정. 비 인공적인 망막 박리 및 폴딩 실리콘 (그림 4A)의 양쪽에 볼 수 있습니다. 압정 샤프트는 실리콘에 포함 보이고, 압정의 머리는 망막과 공막에 침투하고있다. 실리콘 (도 4C)의 흠 망막 양쪽에서 인공적인 비 - 망막 박리가있다. 이 기술은 거기는,이 경우에, 그 보여 주었다E 인해 비스듬한 각도로 삽입 일측 망막 택 및 압축에 인접 망막 무질서하다. 제공되는 이미지는 단순히 기술이 아니라 일반적으로 점착성이 손상 조직 병리학 대표의 성공의 그림 유의하십시오.
망막의 전극 배열도 1 요구함. (A) 뒤쪽 공막, 맥락막 및 망막 변성 (감광체 결여)의 확대 단면도를 눈의 개략도. 전극 배열. epiretinally 부착, 파란색으로 묘사 망막 전극 배열의 (B) 컴퓨터 지원 - 도면이다. , 집적 회로 ( '칩') 및 전극 패키지; B, 티타늄 망막 압정; C, 의료용 실리콘 하우징; D, 납 종료 지점. 패널은 원래, 일러스트에서 수정슈퍼맨 비전 호주, 저작권 베스 크로체의 제공 의례에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 전극 제거 및 눈의 해부. 현장에서 망막 압정 탈핵 고양이 눈의 높은 동적 범위 매크로 사진. (A) 데이비슨의 정착과 포스트 고정 망막 구조 (16) 보존하기 위해 탈핵 눈 해부했다. 전극 어레이 패키지는 실리콘 캐리어로부터 제거하고 나머지 임플란트 압정 (화살표)과 실리콘 바디와 (점선 사각형 윤곽 전극 어레이의 원래 위치를 나타낸다). (B)의 눈은 인접한 종단면으로 해부했다 압정(점선). 압정이 아이 컵 (화살표)의 후벽에 포함 된 상태로 유지, 공막에 의해 주로 안정화. 제거 된 전극 어레이 아래를 함유하는 망막 부 표준 조직학 처리부 (16) (왼쪽 부분)를 위해 준비하는 동안 압정을 함유하는 조직 절편은, 수지 매립하고 연마 (우측 부분)에 대해 제조 하였다. 0.5 mm 단위와 눈금자가 각 패널의 하단에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 에폭시 매립 및 택 망막 조직의 연삭. 내장 된 에폭시의 사진 정렬 조직 샘플, 연삭, 염색 및 택 망막 조직의 영상. (A) 전술 k 개의 샘플을 에폭시 수지에 매립 블록 하였다. 금형을 사용하여, 시료 길이 평면 몰드의 저면에 평행하도록 배향되었다. 연마 용 (B)는 압정 형 샘플을 함유 경화 에폭시 블록. (C) 에폭시 블록 연삭 시험편 홀더에 장착시키고, 준비 . (D) 샘플은 1 조직이므로 이미지화 섹션 망막 세포층과 점착성의 종축을 포함 배향 하였다. (E) 샘플을 회전식 분쇄기 탄화 규소 용지를 사용하여 접지했다. (F)를지면의 블록은 망막 층을 식별 할 수 톨루이딘 블루로 염색했다. (G) 블록이 초과 얼룩을 제거하기 위해 수돗물에 헹구었다. (H) 푸른 스테인드 망막 층과 점성이 높은 전원이 공급되는 해부 범위를 사용하여 몇 군데 있었다 톨루이딘.
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택과 망막의 그림 4. 높은 및 낮은 전력 이미지. 여러 지점에서 연삭 가공 이미지 동안은 압정 (별표)의 종단면 ( 'S'공막을 눈 관통과 종료를 보여주는 해부 범위에서 측정 한 것 ), 실리콘 (해시) 및 스테인드 톨루이딘 블루와 흠없는 망막 ( 'R')를 인접. 이러한 예 이미지 만 본 시각화 기술을 보여주기 위해, 그리고 모든 망막 임플란트 또는 압정 삽입 조직 학적 결과를 대표하지 않습니다. 백금 배선의 접지 잔재 패널 AD에 ( 'W') 볼 수 있습니다. (A) 낮은 전력, 망막과 공막을 관통 택의 흠없는 이미지. (B) 망막 박리의 높은 전원이 공급되는 이미지와 흠없는 망막 인접한에게 폴딩 압정 형 샤프트의 중심에서 이미지 A. (C) 저전력 이미지 실리콘 캐리어.
Discussion
표준 조직 학적 기법으로 인해 금속, 유리 또는 다이아몬드 블레이드 이러한 개체를 절단의 제한 현장에서 하드 금속 임플란트를 처리 할 수 없습니다. 우리 컴패니언 용지 (16)에서는 개질 전체 눈 고정술의 사용은 인공적 망막 박리를 낮출 수있는 것으로 나타났다. 현재 원고에서, 연삭 설립 및 현장에서 21 ~ 23 망막 보철에 대한 수정 된 인공 와우 이식을 시각화 기술을 연마. 망막에 전극 배열을 확보하는 데 사용되는 티타늄 압정은, epiretinally, 주변의 눈 조직과 함께 에폭시에 포함되었다. 이 수지 블록이어서 금속 압정에 바로 인접 조직 형태를 공개하기 위해 적절히 방향이 점진적 접지 / 연마 하였다. 다양한 깊이에서 블록의 광택 표면의 이미지는 강력한 해부 현미경으로 촬영되었다. 비쥬얼과 evaluat :이 기술은 유용하다망막 임플란트에 인접한 조직 반응을 보내고; 임플란트의 이식과 관련된 수술 외상을 평가하는 단계; 경질 금속 성분에 생물학적 반응을 결정하는 단계; 임플란트 및 망막의 표면 사이의 거리를 측정한다.
이 기술은 눈의 망막 또는 다른 하드 압정 (예, 금속) 개체에 인접한 영역의 동일계 시각화에 대한 미래의 안전성 시험에서 유용 할 것이다. 이 epiretinally 망막에 압정으로 고정 보철물의 전임상 안전성 평가에 직접 응용 프로그램을 가지고있다. 또한 서브 망막 위치에 임플란트 접촉 영역에서 망막 조직 손상을 평가하기에 유용 할 수있다.
기술이 제대로 수행되었는지 확인하는 방법은 여러 가지가 있습니다. 각 단계에서, 망막은 눈의 외부 층에 부착 된 상태로 유지한다. 총 인공적 망막 박리가 발생했을 경우는 인도어 수도고정에 문제를 먹었다. 샘플 및 매립 블록의 연삭면 직교에 가까워 야 망막을 차단 최종 수지에 다시 지향 경우; 이 경사 절단을 최소화 할 수 있습니다. 그것은 (예 : 망막 압정으로) 객체를 통과하는 데 필요한 (공지의 스텝 사이즈) 증분 연삭 단계 번호가 개체의 크기와 상관 따라서 확인하는 것이 유용하다.
이 기술은 여러 방식으로 최적화 될 수있다. 연삭 공정과 관련된 에폭시 블록의 표면에 미세한 흠집이 점진적으로 연마 급 감소 될 수있다. 본 연구를 위해, 우리는 800, 1000, 1200, 2400 및 4000 등급 실리콘 카바이드 종이를 사용했다. 다이아몬드 페이스트는 표면 마무리를 향상시키기 위해 사용될 수있다. 미세한 표면이 더 높은 품질의 이미지를 제공하지만 추가 연마 시간의 비용. 이 기술의 결과를 개선하기위한 또 다른 중요한 고려 사항은 OPTI의 선택과 품질CS 및 조명 이미지 캡처에 사용. 기타 기본적인 조직학 얼룩 - 특히 얼룩 Nissl, 톨루이딘 블루 대신에 사용될 수 있지만, 더 최적화를 필요로 할 수있다. 일부 얼룩이 수지뿐만 아니라 조직 (예, 에오신), 따라서 얕은 광택제 배경 변색을 제거하는 염색 후에 요구 될 수 얼룩 것이다. 전문 얼룩, 형광 염료 및 면역 조직 화학 염색은 시도되지되었지만 매우 특정한 결과가 요구되지 않는 한, 각각의 연삭 단계에서 이러한 얼룩을 수행하는 데 필요한 시간은 금지 될 가능성이있다. 그러나, 매립 단계 (단계 3.4) (24) 전에 전체 조직을 염색하는 것이 가능할 수있다.
이 기술의 주요 제한은 따라서, 연삭 및 연마의 각 단계에서의 배율 다양한에서 많은 (아마도 중복) 이미지를 캡처하기 위해 신중한, 관심 영역이 얻어 접지되면,이를 검색 할 수 없다는 것이다. 그것은이다또한 중요한 각 연삭 깊이 조정을 위해 작은 단위를 사용합니다. 이 기술의 다른 제한은 그 조직 유리 슬라이드 상에 장착되고 표준 (송신) 광학 현미경으로 볼에 비해 광학 해상도의 배율. 프로토 타입 및 신규 한 임플란트 장치의 안전성을 측정하기위한 목적으로, 병리학 적 평가는 주요 관심사이다. 이 기술은 망막 점착성과 관련된 임상 적 손상을 관찰하기위한 효율적인 방법을 제공한다. 실제로, 갈기, 폴란드어를 수집하고 (한 번 포함) 지정된 표본을 촬영하는 데 필요한 전체 시간으로이 섹션에 파라핀 블록 또는 동결 절편을 걸리는 시간 비교입니다.
망막 임플란트의 범위 밖의 애플리케이션으로 확장 될 수있는 본 기술에 대한 가능성이있다. 이 기법은 주입 추출 feasib없는 하드 임플란트에 인접한 조직을 평가하기에 적합제작 또는 인터페이스에 손상을 것입니다. 예를 들어,이 기술은 약물 전달을위한 일부 깊은 뇌 또는 말초 신경 전극, 캐 뉼러로 종래의 조직 학적 기법을 절단 할 수없는 금속 (예, 백금, 니티놀, 등)에서 만든 임플란트를 평가하기 위해 확장 될 수있는, 혈관 스텐트 또는 정형 외과 보철.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
| Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
| Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
| Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
| AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
| Light microscope | Leica | MZ16 | |
| Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
| Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
| Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |
References
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