Introduction
Retinite pigmentosa (RP) é uma doença hereditária que provoca a perda generalizada de fotorreceptores, que são as células na camada mais externa da retina responsável pela transdução de luz, sob a forma de fotões, em actividade neural. É importante ressaltar que pacientes com RP normalmente têm neurônios residuais das outras camadas de sua retina que ainda são funcionais. Próteses de retina são capazes de restaurar alguma visão limitada a esses pacientes, orientando esses neurônios sobreviventes com estimulação elétrica para ativar seu 1,2 via visual. Resultados da Percepção de ensaios clínicos têm mostrado resultados promissores início e, recentemente, alguns dispositivos foram aprovados para uso comercial. Atualmente, existem três principais localizações anatômicas em que as próteses de retina clínicos foram posicionados: epiretinally 3,4, 5,6 e subretinally suprachoroidally 7,8. Diferentes dispositivos utilizam diferentes materiais e sua forma é personalizadopara o local em que estão implantados. No entanto, todos eles criar percepções visuais ativando os neurônios remanescentes da retina com pulsos elétricos.
Existe o potencial para qualquer próteses médicas para danificar o tecido circundante devido a efeitos mecânicos da colocação inicial ou forças permanente subsequentes. No caso de estimuladores implantáveis, tais como as próteses da retina, há a consideração adicional, que os parâmetros eléctricos devem situar-se dentro dos limites de segurança. A segurança do paciente é fundamental, por isso os dispositivos devem ser rigorosamente testados em estudos pré-clínicos antes de avançar para a criação de uma clínica 9-15. Em nosso artigo companheiro, foi descrito um método para avaliar a histopatologia localizada do olho ao redor de um implante posicionado no espaço suprachoroidal 16. No presente artigo, são apresentadas uma técnica para a visualização de tecido ocular em torno de um conjunto de eletrodos presos ao retina epiretinally, em uma pré-clínica (felinha) modelo (Figura 1).
A localização epiretiniana é a posição mais comumente utilizado para a localização de uma prótese visual. Conjuntos de eléctrodos situados aqui são tipicamente fixado à retina de metal com uma aderência que penetra em todas as camadas do olho 17-20. Antes de as técnicas descritas na presente manuscrito, que era difícil de avaliar com precisão a retina e outros tecidos que circundam imediatamente uma aderência. Fixação padrão olho usando formalina tamponada neutra resultou em danos na retina artefacto devido ao movimento diferencial da retina e esclera contra o ponto fixo da aderência. Portanto, qualquer dano real causado pela aderência e matriz epirretiniana não pôde ser observado com precisão. Além disso, o corte do tecido do olho não pode ser realizada com a aderência da retina in situ como objectos metálicos não pode ser facilmente cortada com aparelhos histológico tradicional; removendo a aderência antes do processamento histológico também foiindesejável como esta também conduziu a danos na retina artificial.
O objetivo do presente estudo foi duplo: 1) reduzir retinal artefato descolamento de modo que qualquer dano causado pela aderência ea matriz implante epirretiniana pode ser avaliado de forma confiável; e 2) para visualizar a arquitectura da retina adjacente à aderência sem removê-la. A fim de alcançar este objectivo 1, uma nova técnica de fixação foi utilizada (tal como descrito no artigo associado 16), o que reduz a delaminação da retina artificial. A fim de cumprir o objectivo 2, modificamos um mergulho, moagem e polimento técnica, desenvolvida originalmente para observação in loco de eletrodos de implante coclear 21-23. Os métodos descritos neste manuscrito permitir a visualização da retina circundante e ao lado de um tack in situ, minimizando os danos da retina artifactual e, portanto, permitindo a avaliação precisa de qualquer dano potencial causado pela aderência e matriz epirretiniana.
Protocol
NOTA: Todos os procedimentos foram aprovados pelo The Royal Victorian Eye and Ear Research & Comitê de Ética do Hospital de animal (RVEEH AEC; # 10-199AB). Os assuntos foram tratados de acordo com o National Health and "Código australiana de Boas Práticas para o cuidado e uso de animais para fins científicos" do Conselho de Pesquisa Médica (2013) e "Prevenção da Crueldade contra os Animais Act" (1986, e alterações). Todos os procedimentos de avaliação e eletrofisiológicas cirúrgicos, clínicos foram realizados sob anestesia e foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento.
1. A enucleação e Fixação
NOTA: Siga o procedimento de enucleação e fixação descritos em detalhes no manuscrito companheiro 16, tomando cuidado extra em torno de cabos de dispositivos ou portas de vitrectomia, se presente. Resumidamente, este envolve:
- Transcardialmente perfuse o assunto com soro fisiológico morno seguido de buffe neutro frioformalina vermelho.
- Amarre suturas para o globo ocular para servir como pontos de referência.
- Enuclear o olho 16, mantendo os cabos do dispositivo e qualquer apego patches / guias.
- Post-fixar o olho em solução de Davidson para 18 - 36 h.
- Transferir para etanol a 50% para de 6 - 8 horas.
- Transferir para etanol a 70% e refrigerar (4 ° C) até dissecção.
2. remoção do eléctrodo e Dissection.
NOTA: Nem todos os implantes epirretiniana terá o mesmo fator de forma, mas, em geral, haverá um conjunto de eletrodos e alguma forma de material de suporte flexível e moldável. Os dispositivos que são pregados à retina apresentam um buraco onde o tack tack de metal penetra na matriz e parte de trás do olho, mantendo-los juntos.
- Visualize o implante e o ponto em que é fixada à retina.
- Usando uma lâmina de 15 graus fazer uma incisão trans-corneal circunferencial e retire a tampa da córnea para expose a íris subjacentes e lente.
- Usando uma lâmina de 15 graus, as fibras zonulares disinsert da lente e remover a lente na sua globalidade, a exposição da câmara posterior com o implante epiretiniana e a aderência do metal in situ.
- Dependendo do implante e o estudo a ser realizado, remover os componentes estranhas antes de posterior dissecação.
NOTA: No presente exemplo, a matriz epiretiniana sendo avaliada consistiu de um pacote hermético eléctrodo diamante e electrónica protótipo alojado dentro de um veículo conformada de silicone (produzida em casa; referem-se a 20).- Aqui, extrair cuidadosamente o pacote de eletrodo de diamante por dissecção bem com um bisturi. Deixar o corpo do implante de silicone juntamente com a aderência da retina e os restos da fiação de platina (Figura 2). Se uma matriz / casas incorporado não é parte do projeto do dispositivo sob investigação, então omitir esta etapa (2.2).
- Cuidadosamentedissecar uma amostra que inclui a aderência tecido circundante e na orientação desejada. Use tesouras de dissecação fina para cortar tiras de espessura total a partir da parte posterior do olho, incluindo a esclerótica, coróide e retina. Tomar uma amostra, que dá uma secção transversal longitudinal da aderência, que mostra todas as camadas da retina adjacente à aderência (Figura 2)
NOTA: A orientação desejada para a amostra pode ser diferente, dependendo do resultado específico desejado. Por exemplo, se se pretende analisar a proximidade dos danos aderência ao disco óptico, em seguida, o disco óptico devem ser incluídos dentro da amostra.
3. A desidratação, a incorporação, montagem, Grinding, coloração, e Imagem
- Desidratar a amostra ao longo de três dias em estágios progressivos de etanol:
- Desidratar a amostra em etanol a 70% duas vezes durante 2 horas.
- Desidratar a amostra em etanol a 80% durante 2 horas e, em seguida, duas vezes por S / N.
- Desidratar a amostra em etanol de 90% para 2 hr twice.
- Desidratar a amostra em etanol a 100% durante 2 horas e, em seguida, duas vezes por S / N.
- Desidratar a amostra em 100% de acetona, durante 2 horas, duas vezes.
- Retirar a amostra a acetona e observá-lo sob um microscópio de luz que faça secar em temperatura ambiente. Transferir a amostra para epóxi (consulte o passo 3.4), pouco antes de começar a enrolar / colapso.
NOTA: remover líquido dos tecidos moles resulta em células desmoronados e encolhimento. Uma apreciação de quando ocorre a ondulação tecido / colapso é desenvolvido com a experiência.
- Retirar a amostra a acetona e observá-lo sob um microscópio de luz que faça secar em temperatura ambiente. Transferir a amostra para epóxi (consulte o passo 3.4), pouco antes de começar a enrolar / colapso.
- Prepare resina epoxi de grau médico de acordo com as instruções do fabricante. Para curar a resina, utilizar ou 55 ° C durante 1 h ou 24 horas à temperatura ambiente. Colocar em uma câmara de vácuo durante ~ 5 min a ~ 50 mbar para remoção de bolhas de ar. Regular o vácuo manualmente como um vácuo excessivo fará com que a mistura de epóxi para ferver e desgaseificação não ocorrerá de forma eficaz
NOTA: Execute o passo 3.3 concorrentemente com o passo 3.2. - Incorporar o sample em resina epóxi transparente. Mergulhe o tecido do olho em epóxi desgaseificado em um recipiente lacrado adequada e deixa O / N à temperatura ambiente para a cura.
- Tome cuidado para incorporar a amostra na orientação desejada (Figura 2), redimensionando e re-incorporação ao bloco epoxi curada. Re-incorporar o bloco redimensionada contendo o tecido do olho de modo a que o eixo do comprimento da aderência é orientada paralelamente ao fundo do molde (copo amarelo - Figura 3A).
- Monte a resina em um suporte de amostra de moagem e moagem da amostra (230-250 rpm com água em, moagem manual) usando papel de carboneto de silício (começando com 800 grade; Figuras 3C e 3E).
- Para a coloração, molhe a superfície do solo em toluidine mancha azul por 3-5 min, ou até que a mancha se desenvolve (Figura 3F).
- Enxágüe com água da torneira (Figura 3G).
- Imagem da superfície do solo da amostra com um escopo dissecção de alta potência para visualizar as camadas celulares daretina (Figura 3H). Aplicar uma gota de água destilada sobre a superfície de topo do epóxi em cima da amostra para suavizar o difracção na interface ar-epoxi. Use uma fonte de luz de fibra óptica "pescoço de ganso" para iluminar a amostra.
- Repita os passos 3,6-3,9, cada tempo de moagem de distância uma espessura pré-definido de amostra (incremento exacto e reprodutível mínima moagem de suporte da amostra é de 20 mm).
Representative Results
O protocolo de fixação reduziu substancialmente descolamento artifactual e delaminação da retina 16. Orientação do espécime dentro do bloco epoxi foi conseguida consistentemente usando o processo de incorporação de duas etapas descrito. O processo de moagem incrementais exigido um nível moderado de destreza manual para obter os melhores resultados, mas foi ajudado pelo titular ajustável espécime que proporcionou um bom controle sobre a resolução de incremento. Em todos os casos (n = 5), a aderência foi localizado e terra / polido com resultados desejáveis e consistentes. O retinae adjacente às tachas foram resolvidos e coradas de forma adequada. Polimento da superfície do bloco de resina epoxi com um grau P # 800 papel de carboneto de silício era suficiente para a imagem da macroestrutura celular do tecido embebido. Papel de melhor qualidade, ou pasta de diamante podem ser usadas para polir a superfície posterior, em qualquer profundidade, se desejado. Um microscópio de dissecção e de fibra óptica "pescoço de ganso" lighfonte t verificou-se ser adequado para imagiologia da superfície do bloco de solo e a amostra de tecido embebido. A posição da fonte de luz foi variado por tentativa e erro para descobrir uma localização e ângulo que deu a melhor iluminação e contraste através do microscópio. A adição de uma gota de água destilada sobre a superfície do bloco, por cima da amostra, era útil para reduzir a luz caminho de difracção e / ou distorções lisas na interface ar-epoxi. A Figura 4 mostra exemplos de imagens de tecido da retina visualizadas imediatamente adjacente a uma retina de titânio alinhavar usando esta técnica. Descolamento da retina e não-artefactual de dobragem pode ser visto de ambos os lados do silicone (Figura 4A). O eixo de aderência é visível incorporado em silicone; o chefe do tack penetrou na retina e esclera. Há descolamento da retina não artefactual na retina não corado ambos os lados do silicone (Figura 4C). A técnica tem mostrado que, neste exemplo, o there é desorganização da retina adjacente à aderência e compressão da retina de um lado devido a um ângulo oblíquo de inserção. Note-se que as imagens apresentadas são meramente ilustrações do sucesso da técnica, não é representativo de aderência-dano histopatológico em geral.
Figura 1. Colocação de um conjunto de eléctrodos epiretiniana. (A) Representação esquemática do olho que mostra uma secção transversal ampliada da parte posterior da esclera, coróide e retina degenerada (falta fotorreceptores). Um conjunto de eletrodos é retratada em azul, aposta epiretinally. (B) assistida por computador desenho de um conjunto de eletrodos epirretiniana. uma, em circuito integrado ("chip") e um pacote de eletrodo; b, titânio tack da retina; c, habitação silicone de grau médico; d, ponto de saída de chumbo. Painel A modificado de um illustrati originaisem uma cortesia da Bionic Vision Australia, copyright Beth Croce. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. remoção do eletrodo e dissecção do olho. High Dynamic Range fotografias macro de um olho felino enucleated com tack epirretiniana in situ. (A) Publicar fixação com fixador de Davidson para preservar a arquitetura da retina 16, o olho enucleado foi dissecado. O pacote conjunto de eléctrodos foi removido a partir do suporte de silicone (contorno quadrado a tracejado indica o local original da disposição de eléctrodos) com a aderência (seta) e corpo do implante de silicone restante. (B) O olho foi dissecada com a secção transversal longitudinal adjacente ao tacha(Linha a tracejado). A aderência continua encravada na parede posterior da ocular (seta), estabilizado predominantemente pela esclera. A secção de tecido contendo a aderência foi preparado por incorporação de resina de moagem e (segmento direito), enquanto que a secção que contém a retina sob o conjunto de eléctrodos foi preparado removido para processamento histológico convencional 16 (segmento à esquerda). A régua com incrementos de 0,5 milímetros é mostrado na borda inferior de cada painel. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. embedment Epoxy e moagem do tack e tecido da retina. Fotografias da epoxy incorporado e amostra de tecido alinhado, moagem, de coloração e de imagem da aderência e tecido da retina. (A) A tac k amostra foi incorporado em um bloco de resina epóxi. Usando o molde, a amostra foi orientada de modo que o plano longitudinal seja paralela ao fundo do molde. (B) O bloco de epoxi curada que contém a amostra de aderência. (C) O bloco epoxi foi montado num suporte de amostra de moagem, pronto para moer . (D) A amostra foi orientada seções para imaged do tecido chão conter as camadas celulares da retina e eixo longitudinal da aderência. (E) A amostra foi moído usando papel de carboneto de silício em um moinho rotativo. (F) A superfície do solo de o bloco foi corado com azul de toluidina para identificar as camadas da retina. (G) O bloco foi lavado em água corrente para remover o excesso de corante. (H) O toluidine azuis camadas da retina manchado e aderência foram fotografadas usando um espaço da alta dissecção powered.
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Figura 4. imagens de alta potência e baixa da aderência e da retina. Em vários pontos durante as imagens processo de moagem foram tiradas com um escopo de dissecação, mostrando seções longitudinais do tack (asterisco) que penetram através do olho e que saem da esclera ('S' ), silicone (haxixe) e Azul de Toluidina e retina imaculada ('R') adjacente. Note que esses são imagens de exemplo apenas para demonstrar a presente técnica de visualização, e não são representativos de todos os implantes ou aderência resultados inserção histologia epirretiniana. Restos térreo da fiação de platina são visíveis em painéis AD ("W"). (A) de baixa potência, imagem imaculada do tack penetrar a retina e esclera. (B) Alta imagem alimentado do descolamento de retina e dobrando na retina unstained adjacente à transportadora silicone imagem A. (C) imagem de baixa potência em, no centro do eixo de rumo.
Discussion
Técnicas histológicas padrão são incapazes de processar implantes de metal duro em situ devido às limitações na corte desses objetos com metal, vidro ou até mesmo lâminas de diamante. Em nosso companheiro papel 16, nós mostramos que o uso de uma técnica de fixação de olhos toda modificada poderia reduzir a delaminação da retina artificial. No manuscrito actual, os já estabelecidos afiação e polimento técnica de visualização implantes cocleares 21-23 in situ foi modificada para próteses de retina. A aderência de titânio, usado para proteger um conjunto de eletrodos na retina, epiretinally, foi incorporado em epóxi, juntamente com o tecido do olho ao redor. Este bloco de resina foi então orientada de forma adequada e terreno progressivamente / polido, a fim de revelar a morfologia do tecido adjacente ao tack metal. Imagens da superfície polida do bloco em diversas profundidades foram tomados com um microscópio de dissecção poderoso. Esta técnica é útil para: visualização e Avaliado coming a resposta do tecido adjacente ao implante epirretiniana; para avaliar o trauma cirúrgico associado com a implantação do implante; para determinar a reacção biológica para os componentes de metal duro; e para medir a distância entre o implante e a superfície da retina.
Esta técnica será útil em estudos de segurança futuras para visualização em situ da região adjacente a um tack retinal ou outros (por exemplo, metálico) objetos duros no olho. Isto tem aplicação direta na avaliação da segurança pré-clínica de próteses pregado na retina epiretinally. Também pode ser útil para avaliar o dano no tecido da retina em regiões em contacto com os implantes localizados na localização sub-retiniana.
Existem várias maneiras de verificar se a técnica foi realizado corretamente. Em cada fase, a retina deve permanecer ligado ao das camadas exteriores do olho. Se houver descolamento de retina artifactual bruto, isto pode índicoscomeram um problema com a fixação. Quando a amostra é incorporado e re-orientada na resina final bloquear a retina, deve ser quase ortogonal com a cara de moagem do bloco; isso vai minimizar o corte oblíquo. É útil para verificar que o número de etapas de moagem incrementais (de tamanho conhecido passo) necessário para percorrer um objecto (tal como uma aderência da retina) correlacionar em conformidade com as dimensões do objecto.
A técnica pode ser optimizada de várias maneiras. Arranhões na superfície do bloco de epóxi associado com o processo de moagem pode ser reduzida progressivamente com polimento grau mais fino. Para o presente estudo, foram utilizados 800, 1000, 1200, 2400, 4000 e papel de carboneto de silício de grau. Pasta de diamante, também poderia ser usado para melhorar o acabamento da superfície. Um acabamento de superfície mais fino dá uma imagem de qualidade superior, mas ao custo de tempo de polimento adicional. Outra consideração importante para melhorar o resultado desta técnica é a escolha e qualidade do optics e iluminação utilizada para a captura de imagem. Outras manchas histológicas básicas - particularmente manchas de Nissl, pode ser usado no lugar do azul de toluidina, mas podem exigir uma maior optimização. Algumas manchas irá manchar a resina, bem como o tecido (por exemplo, eosina), por conseguinte, um polonês raso pode ser necessário após a coloração de fundo para remover a descoloração. Manchas especializadas, corantes fluorescentes e de coloração imuno-histoquímica não foi tentada, mas a menos que um resultado muito específico for desejado, o tempo necessário para realizar estas manchas em cada nível de moagem é susceptível de ser proibitivo. No entanto, pode ser possível marcar o tecido como um todo, antes da etapa de incorporação (passo 3.4) 24.
A principal limitação desta técnica é que uma vez que a região de interesse foi moído distância, ele não pode ser reactivado, por conseguinte, é prudente capturar muitas imagens (possivelmente redundantes) com uma variedade de ampliações em cada fase de rectificação e polimento. Étambém importante o uso de pequenos incrementos para cada ajuste de profundidade de moagem. Outra limitação desta técnica é que o aumento de resolução óptica e comparado com o tecido montada sobre uma lâmina de vidro e visualizados com um padrão (transmissão) microscópio de luz. Para efeitos de criação de protótipos e avaliar a segurança de um dispositivo de implante novela, a avaliação patológica bruta é de interesse primário. Esta técnica proporciona um método eficiente para a observação de danos clinicamente relevantes associados com uma aderência da retina. Com a prática, o tempo total necessário para coletar moagem, polonês e fotografar uma dada amostra (uma vez incorporados) é comparável ao tempo que seria necessário para a seção de um bloco de parafina ou de congelação.
Há também a possibilidade de as técnicas actuais para ser alargado a outras aplicações fora do âmbito dos implantes de retina. Esta técnica é adequado para avaliar o tecido adjacente a um implante de disco, onde a extracção do implante é não feasible ou prejudicaria a interface. Por exemplo, esta técnica poderia ser expandida para avaliar implantes feitos a partir de metal (por exemplo, a platina, o nitinol, etc.) que não podem ser cortados com as técnicas histológicas convencionais, tais como alguns cerebral profunda ou eléctrodos de nervos periféricos, cânulas para administração de fármaco, os stents vasculares ou próteses ortopédicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
| Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
| Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
| Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
| AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
| Light microscope | Leica | MZ16 | |
| Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
| Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
| Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |
References
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