Introduction
La retinitis pigmentosa (RP) es un trastorno hereditario que causa la pérdida generalizada de los fotorreceptores, que son las células en la capa más externa de la retina responsable de la transducción de la luz, en forma de fotones, en la actividad neural. Es importante destacar que, los pacientes con RP tienen típicamente neuronas residuales en las otras capas de la retina que todavía son funcionales. Prótesis de retina son capaces de restaurar algo de visión limitada a estos pacientes por la orientación de estas neuronas supervivientes con estimulación eléctrica para activar su 1,2 vía visual. Resultados de percepción de los ensayos clínicos han mostrado resultados iniciales prometedores y recientemente algunos dispositivos han sido aprobados para su uso comercial. Actualmente, hay tres principales localizaciones anatómicas en el que las prótesis de la retina clínicos se han posicionado epiretinally: 3,4, 5,6 y subretinally suprachoroidally 7,8. Diferentes dispositivos utilizan diferentes materiales y su forma es personalizadoa la ubicación en la que se implantan. Sin embargo, todos ellos crean percepciones visuales mediante la activación de las neuronas residuales de la retina con impulsos eléctricos.
Existe el potencial para cualquier prótesis médica para dañar el tejido circundante debido a los efectos mecánicos de la colocación inicial o fuerzas en curso posteriores. En el caso de estimuladores implantables, tales como prótesis de la retina, está la consideración adicional de que los parámetros eléctricos deben estar dentro de los límites de seguridad. La seguridad del paciente es de suma importancia, por lo que los dispositivos deben ser rigurosamente en estudios preclínicos antes de avanzar a establecer una clínica 9-15. En nuestro compañero artículo, se describe un método para evaluar la histopatología localizada del ojo que rodea a un implante colocado en el espacio supracoroidal 16. En el presente manuscrito, se describe una técnica para la visualización de tejido del ojo que rodea una matriz de electrodos viró a la retina epiretinally, en un preclínica (Femodelo de línea) (Figura 1).
La ubicación epirretiniana es la posición más comúnmente utilizado para la localización de una prótesis visual. Conjuntos de electrodos situados aquí suelen colocarse en la retina con una tachuela de metal que penetra en todas las capas del ojo 17-20. Antes de las técnicas descritas en el presente manuscrito, era difícil evaluar con precisión la retina y otros tejidos que rodean una tachuela. La fijación del ojo estándar utilizando formalina tamponada neutra dio lugar a daño en la retina de artefactos debido al movimiento diferencial de la retina y la esclerótica en contra de la punta de la tachuela fijo. Por lo tanto cualquier daño real causado por la pegajosidad y la matriz epirretiniana no se pudo observar con precisión. Además, seccionar el tejido ocular no pudo realizarse con el puño de amura de la retina in situ como objetos de metal no se pueden cortar fácilmente con aparatos histológico tradicional; la eliminación de la pegajosidad antes del procesamiento histológico fue tambiénindeseable ya que esto también llevó a daño en la retina artefactos.
El objetivo del presente estudio fue doble: 1) para reducir el artefacto desprendimiento de retina por lo que los daños causados por la adherencia y la matriz de implante epiretinal se puede evaluar de forma fiable; y 2) para visualizar la arquitectura de la retina adyacente a la pegajosidad sin eliminarlo. A fin de lograr objetivo 1, se utilizó una nueva técnica de fijación (como se describe en el artículo de compañía 16), lo que reduce la deslaminación de la retina artefactual. A fin de lograr objetivo 2, modificamos una incrustación, molienda y pulido técnica, desarrollado originalmente para la observación in situ de electrodos de implantes cocleares 21-23. Los métodos descritos en este manuscrito permiten la visualización de la retina circundante y adyacente a una tachuela in situ mientras se minimiza el daño de la retina artefactual y por lo tanto permite una evaluación precisa de cualquier daño potencial causado por el puño de amura y la matriz epirretiniana.
Protocol
NOTA: Todos los procedimientos fueron aprobados por el Royal Victorian Eye y Ear Comité de Investigación y Ética Animal Hospital (RVEEH AEC; # 10-199AB). Los sujetos fueron tratados de acuerdo con la Salud de la Nación y "Código Australiano de Prácticas para el Cuidado y Uso de animales con fines científicos" del Consejo de Investigación Médica (2013) y la "Prevención de la Crueldad contra los Animales Act" (1986, y sus modificaciones). Todos los procedimientos de evaluación y electrofisiológicos quirúrgicos, clínicos se llevaron a cabo bajo anestesia y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
1. La enucleación y Fijación
NOTA: Siga el procedimiento enucleación y fijación se describe en detalle en el manuscrito acompañante 16, teniendo especial cuidado alrededor de los cables de dispositivos o puertos de vitrectomía, si está presente. En pocas palabras, se trata de:
- Transcardially perfundir el tema con solución salina tibia seguida de buffe neutro fríoformalina rojo.
- Ate suturas para el globo ocular para servir como puntos de referencia.
- Enuclear el ojo 16, el mantenimiento de los cables del dispositivo y cualquier archivo adjunto parches / pestañas.
- Post-fijar los ojos en solución de Davidson durante 18 - 36 h.
- Traslado al 50% de etanol por 6-8 hr.
- Transferencia a etanol al 70% y refrigerar (4 ° C) hasta que la disección.
2. Eliminación del electrodo y la disección.
NOTA: No todos los implantes epirretinianas tendrán el mismo factor de forma, pero en general habrá una serie de electrodos y algún tipo de material de soporte flexible y adaptable. Los dispositivos que se adosa a la retina tienen un agujero tachuela donde la tachuela de metal penetra en la matriz y la parte posterior del ojo, manteniendo estos juntos.
- Visualizar el implante y el punto en el que se asegura a la retina.
- Utilizando una cuchilla de 15 grados hacer una incisión circunferencial trans-corneal y retire la tapa de la córnea a expose el iris y el cristalino subyacentes.
- Utilizando una cuchilla de 15 grados, disinsert las fibras zonulares de la lente y quitar la lente en su totalidad, la exposición de la cámara posterior con el implante epirretiniana y la pegajosidad de metal in situ.
- Dependiendo del implante y el estudio que se realizaron, eliminar los componentes extraños antes de una nueva disección.
NOTA: En el presente ejemplo, la matriz epirretiniana que está siendo evaluado consistió en un paquete hermético electrodo de diamante y la electrónica prototipo alojado dentro de un vehículo de silicona conformal (producido en casa; consulte 20).- Aquí, extraer cuidadosamente el paquete de electrodo de diamante mediante disección fina con un bisturí. Deja el cuerpo de silicona del implante junto con la tachuela de la retina y los restos de los cables de platino (Figura 2). Si un array / vivienda incrustado no es parte del diseño del dispositivo objeto de la investigación, a continuación, omitir este paso (2.2).
- Cuidadosamentediseccionar una muestra que incluye el puño de amura y el tejido circundante en la orientación deseada. Utilice tijeras de disección finas para cortar tiras de grosor completo de la parte posterior del ojo, incluyendo la esclerótica, la coroides y la retina. Tomar una muestra, lo que da una sección transversal longitudinal de la tachuela, mostrando todas las capas de la retina adyacentes a la pegajosidad (Figura 2)
NOTA: La orientación deseada para la muestra puede diferir dependiendo del resultado particular deseado. Por ejemplo, si se desea examinar la proximidad de la tachuela daños en el disco óptico, entonces el disco óptico debe ser incluido dentro de la muestra.
3. La deshidratación, incrustación, Montaje, Moler, tinción, e Imagen
- Deshidratar la muestra a lo largo de tres días en etapas progresivas de etanol:
- Deshidratar la muestra en etanol al 70% durante 2 horas dos veces.
- Deshidratar la muestra en etanol al 80% durante 2 horas dos veces y luego O / N.
- Deshidratar la muestra en etanol al 90% durante 2 horas twice.
- Deshidratar la muestra en etanol al 100% durante 2 horas dos veces y luego O / N.
- Deshidratar la muestra en acetona al 100% durante 2 horas dos veces.
- Retire la muestra de la acetona y observarlo bajo un microscopio de luz ya que las seca al aire a temperatura ambiente. Trasladar la muestra a epoxi (consulte el paso 3.4) justo antes de que comience a curvarse / colapso.
NOTA: La eliminación de líquido de los tejidos blandos resultados en células colapsadas y contracción. Una apreciación de cuando se produce el rizado tejido / colapso se desarrolla con la experiencia.
- Retire la muestra de la acetona y observarlo bajo un microscopio de luz ya que las seca al aire a temperatura ambiente. Trasladar la muestra a epoxi (consulte el paso 3.4) justo antes de que comience a curvarse / colapso.
- Preparar resina epoxi de grado médico de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para curar la resina, utilizar cualquiera de 55 ° C durante 1 hora o 24 horas a RT. Colocar en una cámara de vacío durante ~ 5 min a ~ 50 mbar para la eliminación de burbujas de aire. Regular el vacío manualmente como un vacío excesivo hará que la mezcla de epoxi a hervir y desgasificación no ocurrirá efectivamente
NOTA: Realice el paso 3.3 simultáneamente a la etapa 3.2. - Incrustar el sample en resina epoxi claro. Sumergir el tejido ocular en epoxi desgasificado en un recipiente hermético apropiado y deje O / N a temperatura ambiente para curar.
- Tenga cuidado para incrustar la muestra en la orientación deseada (Figura 2) por el cambio de tamaño y volver a incrustar el bloque epoxi curada. Re-incrustar el bloque de redimensionado que contiene el tejido del ojo de tal manera que el eje largo de la tachuela está orientada paralela a la parte inferior del molde (taza amarilla - la Figura 3A).
- Monte la resina en un portamuestras moler y moler la muestra (230 a 250 rpm con el agua en, molienda manual) usando papel de carburo de silicio (a partir de 800 rejilla; Figuras 3C y 3E).
- Para la tinción, moje la superficie del suelo en la mancha azul de toluidina para 3-5 minutos, o hasta que se desarrolla la mancha (Figura 3F).
- Enjuague con agua del grifo (Figura 3G).
- Image la superficie del suelo de la muestra con un alcance de disección de alta potencia para visualizar las capas celulares de laretina (Figura 3H). Aplicar una gota de agua destilada en la superficie superior del epoxi por encima de la muestra para suavizar la difracción en la interfase aire-epoxi. Use una fibra fuente de luz óptica "cuello de cisne" para iluminar la muestra.
- Repetir los pasos 3.6 hasta 3.9, cada tiempo de molienda de distancia un espesor prefijado de la muestra (incremento preciso y reproducible mínimo de molienda de soporte de la muestra es de 20 micras).
Representative Results
El protocolo de fijación reduce sustancialmente el desprendimiento de artefactos y delaminación de la retina 16. Orientación de la muestra dentro del bloque de epoxi se consiguió consistentemente utilizando el proceso de incrustación de dos pasos descrito. El procedimiento de molienda gradual requiere un nivel moderado de destreza manual para lograr resultados óptimos, pero fue ayudado por el portamuestras ajustable que proporciona un control preciso sobre la resolución de la subasta. En todos los casos (n = 5) de la tachuela fue localizado y tierra / pulido con resultados deseables y consistentes. La retina adyacente a las tachuelas fueron resoluble y se tiñeron apropiadamente. Pulir la superficie del bloque de resina epoxi con un # 800 papel de carburo de silicio de grado P era suficiente para la imagen de la macroestructura celular del tejido embebido. Papel de grado superior, o suspensión de diamante se pueden utilizar para pulir aún más la superficie en cualquier profundidad dada si se desea. Un microscopio de disección y fibra óptica "cuello de cisne" light fuente se encontró que era adecuado para obtener imágenes de la superficie del bloque de suelo y la muestra de tejido incorporado. La posición de la fuente de luz se varió por ensayo y error para encontrar una ubicación y el ángulo que dio la mejor iluminación y contraste a través del microscopio. La adición de una gota de agua destilada a la superficie del bloque, por encima de la muestra, era útil para reducir la trayectoria de la luz de difracción y / o distorsiones lisas en la interfase aire epoxi. La Figura 4 muestra imágenes de ejemplo de tejido de la retina visualizados inmediatamente adyacente a una retina de titanio virar utilizando esta técnica. Desprendimiento de retina no artefactual y plegado se pueden ver en cada lado de la silicona (Figura 4A). El eje de la tachuela es visible incrustado en silicona; el jefe de la tachuela ha penetrado en la retina y la esclerótica. Hay desprendimiento de retina no artefactual en la retina sin teñir cada lado de la silicona (Figura 4C). La técnica ha demostrado que, en este caso, There es la desorganización de la retina adyacente a la pegajosidad y la compresión de la retina en un lado debido a un ángulo de inserción oblicua. Tenga en cuenta que las imágenes presentadas son meramente ilustraciones de la éxito de la técnica, no es representativo de la histopatología tack-daños en general.
Figura 1. La colocación de un conjunto de electrodos epirretiniana. (A) Diagrama esquemático del ojo que muestra una sección transversal ampliada de la esclerótica posterior, la coroides y la retina degenerada (que carece de fotorreceptores). Un conjunto de electrodos se representa en azul, colocada epiretinally. (B) asistido por ordenador-dibujo de un conjunto de electrodos epiretinal. un circuito integrado ('chips') y el paquete de electrodos; b, titanio tachuela retina; c, la vivienda de silicona de grado médico; d, punto de salida de plomo. Panel A modificado a partir de un illustrati originalesen facilitado por Bionic Vision Australia, los derechos de autor de Beth Croce. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. remoción del electrodo y la disección del ojo. Alto rango dinámico de fotografías macro de un ojo felino enucleado con la tachuela epiretinal in situ. (A) de fijación del anuncio con fijador de Davidson para preservar la arquitectura de la retina 16, el ojo enucleado fue disecada. El paquete de matriz de electrodos fue retirado del portador de silicona (contorno cuadrado de trazos indica la ubicación original de matriz de electrodos), con la tachuela (flecha) y el cuerpo de silicona del implante restante. (B) El ojo se disecó con la sección transversal longitudinal adyacente a la tachuela(Línea discontinua). La pegajosidad permanece incrustado en la pared posterior de la ojera (flecha), estabilizado predominantemente por la esclerótica. La sección de tejido que contiene la tachuela fue preparado para la incrustación de resina y de molienda (segmento de la derecha), mientras que la sección que contiene la retina debajo de la matriz de electrodos eliminado fue preparado para el procesamiento histológico estándar 16 (segmento de la izquierda). Una regla con incrementos de 0,5 mm se muestra en el borde inferior de cada panel. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. empotramiento epoxi y molienda de la tachuela y el tejido de la retina. Fotografías del epoxi embebido y muestra de tejido alineado, molienda, tinción y de imagen de la tachuela y el tejido de la retina. (A) El tac k muestra fue incrustado en un bloque de resina epoxi. Usando el molde, la muestra se orientó de manera que el plano longitudinal es paralelo a la parte inferior del molde. (B) El bloque de epoxi curada que contiene la muestra pegajosidad. (C) El bloque de epoxi se montó en un soporte de la muestra de molienda, listos para la molienda . (D) La muestra se orienta de modo secciones de captación de imagen del tejido del suelo contienen las capas celulares de la retina y el eje longitudinal de la tachuela. (E) La muestra se molió usando papel de carburo de silicio en una rectificadora rotatoria. (F) La superficie del suelo de el bloque se tiñó con azul de toluidina para identificar las capas de la retina. (G) El bloque fue lavada con agua del grifo para eliminar el exceso de colorante. (H) El toluidina capas de la retina teñidas de azul y tachuela fueron imágenes utilizando un alto alcance disección con alimentación.
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Figura 4. Imágenes de potencia alta y baja de la tachuela y la retina. En varios puntos durante las imágenes de proceso de molienda fueron tomadas con un microscopio de disección, mostrando secciones longitudinales de la tachuela (asterisco) que penetran a través del ojo y que salen de la esclerótica ('S' ), Silicona (hash) y azul de toluidina manchado y la retina sin mancha ('R') contiguo. Tenga en cuenta estos son sólo imágenes de ejemplo para demostrar la presente técnica de visualización, y no son representativos de todos los implantes o tachuela resultados histológicos inserción epirretinianas. Restos de tierra de los cables de platino son visibles en los paneles AD ("W"). (A) la energía baja, imagen sin mancha de la tachuela penetrar la retina y la esclerótica. (B) Imagen de alta potencia del desprendimiento de retina y plegado en la retina sin mancha adyacente al vehículo de silicona imagen A. (C) Imagen de baja potencia en el centro del eje de rumbo.
Discussion
Técnicas histológicas estándar son incapaces de procesar los implantes de metal duro in situ debido a las limitaciones en cortar estos objetos de metal, vidrio o incluso discos de diamante. En nuestro documento complementario 16, se demostró que el uso de una técnica de fijación de ojos conjunto modificado podría reducir la delaminación retina artefactos. En el manuscrito actual, una molienda establecido y técnica de pulido para la visualización de los implantes cocleares 21-23 in situ se modificó para las prótesis de retina. Una tachuela de titanio, utilizado para asegurar un conjunto de electrodos a la retina, epiretinally, se ha incrustado en epoxi junto con el tejido ocular circundante. A continuación, este bloque de resina estaba orientado de manera adecuada y suelo progresivamente / pulido con el fin de revelar la morfología del tejido inmediatamente adyacente a la pegajosidad metal. Imágenes de la superficie pulida del bloque a varias profundidades fueron tomadas con un potente microscopio de disección. Esta técnica es útil para: visualizar y evaluating la respuesta del tejido adyacente al implante epirretiniana; para evaluar el trauma quirúrgico asociado con la implantación del implante; para determinar la reacción biológica a los componentes de metal duro; y para medir la distancia entre el implante y la superficie de la retina.
Esta técnica será útil en estudios de seguridad futuras para la visualización in situ de la región adyacente a una tachuela de retina u otros (por ejemplo, metálico) objetos duros en el ojo. Esto tiene aplicación directa en la evaluación de la seguridad preclínica de prótesis clavados a la retina epiretinally. También puede ser útil para evaluar el daño tisular en las regiones de la retina en contacto con los implantes situados en la ubicación sub-retinal.
Hay varias maneras de verificar que la técnica se ha realizado correctamente. En cada etapa, la retina debe permanecer adherida a las capas externas del ojo. Si hay desprendimiento de retina artifactual bruto, esto puede Indiccomió un problema con la fijación. Cuando se incrusta la muestra y re-orientado en la resina final bloquear la retina debe estar cerca ortogonal con la superficie de rectificación del bloque; esto reducirá al mínimo de corte oblicuo. Es útil para comprobar que el número de pasos incrementales de molienda (de tamaño de paso conocido) requerido para atravesar un objeto (tal como una tachuela de la retina) se correlaciona en consecuencia con las dimensiones del objeto.
La técnica se puede optimizar de varias maneras. Los arañazos en la superficie del bloque de epoxi asociado con el proceso de molienda se puede reducir con el pulido progresivamente más fino grado. Para el presente estudio, hemos utilizado 800, 1000, 1200, 2400, 4000 y papel de carburo de silicio de grado. Pasta de diamante también se podría utilizar para mejorar el acabado de superficie. Un acabado superficial más fino da una imagen de mayor calidad, pero a costa de tiempo de pulido adicional. Otra consideración crítica para mejorar el resultado de esta técnica es la elección y la calidad de la optics e iluminación utilizados para la captura de imágenes. Otras tinciones histológicas básicas - en particular las manchas de Nissl, se pueden utilizar en lugar de azul de toluidina, pero pueden requerir una mayor optimización. Algunas manchas se mancha la resina, así como el tejido (por ejemplo, Eosina), por lo tanto, un pulido superficial puede ser necesaria después de la tinción de fondo para eliminar la decoloración. Manchas especializados, colorantes fluorescentes y tinción inmunohistoquímica no se intentó, pero menos que se desee un resultado muy específico, el tiempo requerido para realizar estas manchas en cada nivel de molienda es probable que sea prohibitivo. Sin embargo, puede ser posible manchar el tejido en su conjunto antes de la etapa incrustación (paso 3.4) 24.
La principal limitación de esta técnica es que una vez que la región de interés se ha molido de distancia, no puede ser recuperada, por lo tanto, es prudente para capturar muchas imágenes (posiblemente redundantes) en una variedad de aumentos en cada etapa de esmerilado y pulido. EsTambién es importante utilizar pequeños incrementos para cada ajuste de la profundidad de molienda. Otra limitación de esta técnica es la de la ampliación óptica y la resolución en comparación con montado en un portaobjetos de vidrio y se ve con un estándar (transmisión) microscopio de luz de tejido. A los efectos de creación de prototipos y la evaluación de la seguridad de un dispositivo de implante novela, la evaluación patológica bruto es de interés primordial. Esta técnica proporciona un método eficiente para observar el daño clínicamente relevante asociada con una tachuela de la retina. Con la práctica, el tiempo total necesario para reunir moler, pulir y fotografiar una muestra dada (una vez integrados) es comparable al tiempo que se tardaría en sección de un bloque de parafina o sección de congelados.
Hay también el potencial de las presentes técnicas para extenderse a aplicaciones fuera del ámbito de aplicación de implantes de retina. Esta técnica es adecuada para evaluar el tejido adyacente a un implante duro, donde la extracción del implante no es feasible o dañarían la interfaz. Por ejemplo, esta técnica podría ampliarse para evaluar los implantes hechos de metal (por ejemplo, platino, nitinol, etc.) que no se puede cortar con técnicas histológicas convencionales, tales como algunos cerebral profunda o electrodos de los nervios periféricos, cánulas para la entrega de drogas, stents vasculares o prótesis ortopédicos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
| Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
| Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
| Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
| AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
| Light microscope | Leica | MZ16 | |
| Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
| Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
| Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |
References
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