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Immunology and Infection

तरीके दहनशील तंबाकू उत्पाद की तैयारी के cytotoxicity और प्रतिरक्षादमन का मूल्यांकन करने के लिए

Published: January 10, 2015 doi: 10.3791/52351
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Microbiology and Immunology, Wake Forest University Health Sciences, 2R&D Department, R.J. Reynolds Tobacco Company

Abstract

अन्य pathophysiological परिवर्तन के अलावा, सिगरेट के धुएं के जीर्ण जोखिम माइक्रोबियल संक्रमण और ट्यूमर घटना के लिए धूम्रपान करने वालों की वृद्धि की संवेदनशीलता से जोड़ा गया है, जो सूजन और प्रतिरक्षा दमन का कारण बनता है। पूर्व vivo मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear में रिसेप्टर की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दमन (PBMCs) धुआं घटक के साथ इलाज तंत्र का अध्ययन करने और तंबाकू उत्पादों के लिए जोखिम की संभावना दीर्घकालिक प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण है। यहाँ, हम बैक्टीरियल lipopolysaccharide, एक टोल की तरह रिसेप्टर-4 ligand के द्वारा प्रेरित PBMCs का उपयोग करते हुए पूर्व vivo assays के प्रदर्शन करने के तरीकों अनुकूलित। पूरे धुआं वातानुकूलित मध्यम (WS-मुख्यमंत्री) के प्रभाव, एक दहनशील तंबाकू उत्पाद की तैयारी (टीपीपी), और निकोटीन पूर्व vivo assays में PBMCs द्वारा साइटोकाइन स्राव और लक्ष्य सेल हत्या पर जांच की गई। हम बताते हैं कि स्रावित साइटोकिन्स IFN-γ, टीएनएफ, आईएल 10, आईएल -6, और आईएल -8 और intracellular साइटोकिन्स IFN-47 ;, टीएनएफ-α, और एमआईपी-1α था-मुख्यमंत्री उजागर PBMCs में दबा दिया गया। एक K562 लक्ष्य सेल की हत्या परख द्वारा निर्धारित रूप में प्रेरक PBMCs की cytolytic समारोह, भी था-सीएम के लिए जोखिम से कम हो गया था; निकोटीन इन assays में न्यूनतम प्रभावी था। सारांश में, हम पूर्व vivo assays में TPPs के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए सुधार assays के एक सेट मौजूद है, और इन तरीकों आसानी हित के अन्य उत्पादों के परीक्षण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

हृदय रोग (सीवीडी), क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) और कैंसर 1,2 सहित पुराने सिगरेट पीने के प्रतिकूल प्रभाव स्वास्थ्य, ज्ञान अंक का एक बड़ा शरीर। लगातार सिगरेट पीने सूजन और प्रतिरक्षा दमन के कारण जाना जाता रहा है, और इन परिवर्तनों धूम्रपान करने वालों के तीन में सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण और कैंसर का खतरा बढ़ योगदान करने के लिए रिपोर्ट कर रहे हैं। इन विट्रो और पूर्व vivo तकनीक उपयोगी होते हैं के pathophysiological प्रभाव के आणविक आधार elucidating में सिगरेट के धुएं 4-9 (1 टेबल) और विभिन्न तम्बाकू उत्पादों 10,11 के उभरते विनियमन मार्गदर्शन के लिए महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में पहचाने जाते हैं।

उदाहरण के लिए, हम इस तरह पूरे धुआं वातानुकूलित मध्यम (WS-मुख्यमंत्री) और कुल बात कण (TPM) के रूप में दहनशील तंबाकू उत्पाद की तैयारी (TPPs) कहीं अधिक साइटोटोक्सिक और हानिकारक करने के लिए कर रहे हैं कि दिखा दिया हैगैर दहनशील TPPs या निकोटीन 12,13 से डीएनए। प्रकाशित काम के अनुरूप, यह हाल ही में दहनशील TPPs या निकोटीन 12,13 कि सूचना मिली थी। प्रकाशित काम के अनुरूप, हमने हाल ही में दहनशील TPPs चिह्नित प्रतिरक्षादमन के कारण होता है कि सूचना दी। इस रिसेप्टर (TLR) -ligands तरह Toll- के दमन से सबूत था, एक पूर्व vivo मॉडल 14 में PBMCs द्वारा हत्या (K562) साइटोकाइन स्राव को प्रेरित किया, और सेल को निशाना बनाया। सिगरेट के धुएं प्रेरित रोग प्रक्रियाओं में सूजन के महत्व को देखते हुए सिगरेट के धुएं की प्रतिरक्षा modulatory प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए परख शर्तों के आगे अनुकूलन इस रिपोर्ट में प्रस्तुत किया है।

पूर्व vivo assays के लिए आम तौर पर इंट्रासेल्युलर मापा और साइटोकिन्स के साथ ही assays के 14 की हत्या K562 सेल में साइटोटोक्सिक टी और एन.के. कोशिकाओं की cytolytic समारोह स्रावित। assays के WS-मुख्यमंत्री और निकोटीन और PBMC के बाद उत्तेजना के साथ पूर्व ऊष्मायन शामिलTLR के साथ तीन दिनों की अवधि में agonists; अंतिम readouts एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays के (ELISAs) का उपयोग और / या प्रवाह cytometry प्रदर्शन कर रहे हैं। हम TLR-4 रिसेप्टर्स को बांधता है और PBMCs intracellular साइटोकिन्स और साइटोकिन्स के स्राव के उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप को उत्तेजित करता है, जो जीवाणु lipopolysaccharide (LPS), का उपयोग किया। अलग-थलग PBMCs, कोशिका मृत्यु assays के, और आईएल -8 मात्रा का ठहराव के लिए TPPs, हम भी उपस्थित तरीकों में से immunomodulatory प्रभाव के मूल्यांकन के लिए विभिन्न परख चरणों के अनुकूलन के अलावा। इन विधियों अन्य अनुसंधान सवालों का पता करने के लिए आवेदन किया है और आगे नियामक संदर्भ में तंबाकू उत्पादों का मूल्यांकन करने के लिए परिष्कृत किया जा सकता है।

तालिका 1 में इन विट्रो की खबरों को प्रकाशित और पूर्व vivo विधियों तंबाकू उत्पाद की तैयारी के varilus pathophysiological प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल सीएस, सिगरेट के धुएं मध्यम। सीएससी, सिगरेट का धुआँ घनीभूत; सीएसई, सिगरेट का धुआँ निकालने; एलीएसए, immunosorbent परख एंजाइम से जुड़ी; GADPH, glyceraldehyde 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज; qPCR, मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; आर टी, वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; टीएस, तंबाकू का धुआं।

लेखक (अध्ययन का साल) Laan एट अल। (2004) मूडी एट अल। (2004) Oltmanns एट अल। (2005) Vayssier (1998) Witherden एट अल। (2004) Birrell एट अल। (2008)
कोशिकाओं का इस्तेमाल किया मानव ब्रोन्कियल अन्तःचूचुक कोशिकाओं (ब्यास-2 बी), मानव न्यूट्रोफिल मानव वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं (A549) मानव airway के चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (HASMC) मानव premonocytic U937 कोशिकाओं, मानव monocytes वायुकोशीय प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं (ATII) मानव monocyticसेल लाइन (THP-1), मानव फेफड़ों मैक्रोफेज
टीपीपी इस्तेमाल किया सीएसई सीएससी सीएसई टीएस सीएसई सीएस
विधि का इस्तेमाल किया एलिसा, qPCR, प्रवास, electromobility पारी Immunohisto-रसायन, वैद्युतकणसंचलन, Arrayscan किट, आरटी पीसीआर, एलिसा एलिसा, आरटी पीसीआर, qPCR, वैद्युतकणसंचलन जेल गतिशीलता पारी लाइट माइक्रोस्कोपी, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, वैद्युतकणसंचलन, एलिसा qPCR, एलिसा, ई-toxate किट (सिग्मा), P65 थाली परख (TRANSAM), वैद्युतकणसंचलन, विभिन्न Immunoassay किट
उपाय आईएल -8, जीएम-सीएफ, एपी -1, एनएफ-κB, माइग्रेशन हिस्टोन acetyltransferases, हिस्टोन deacetylases, एनएफ-κB, आईएल -8, पीआई κB-α, GADPH ओ -1, GADPH, RANTES, आईएल -8, eotaxin गर्मी झटका / तनाव प्रोटीन (HSP / Hsp70), HF के प्रतिलेखन कारक, एनएफ-κB,टीएनएफ-α Surfactant प्रोटीन (सपा-ए, सपा-सी), आईएल -8, एमसीपी -1, GRO-α, टीएनएफ-α, आईएल 1β, IFN-γ आईएल -8, आईएल 1β, आईएल -6, टीएनएफ-α, MIP1-α, gro-α, MAPK / JNK / ERK फास्फारिलीकरण, cJUN: डीएनए बाध्यकारी, Glutathione, P65: डीएनए बाध्यकारी
अंतिम परिणाम सीएसई एपी-एक सक्रियण के दमन के माध्यम से साइटोकाइन उत्पादन नीचे-नियंत्रित करता है। एच 2 ओ 2 और सीएससी विभिन्न, हिस्टोन deacetylase गतिविधि में कमी, हिस्टोन प्रोटीन की एसिटिलीकरण बढ़ाने proinflammatory साइटोकाइन रिहाई को विनियमित। सिगरेट के धुएं सिगरेट के धुएं से टीएनएफ-α, 20% सीएसई कम आईएल -8 रिहाई, eotaxin का निषेध और RANTES से बढ़ाकर HASMC से आईएल -8 की रिहाई हो सकती है। टीएस Hsp70 overexpression और गतिविधि और टीएनएफ-α रिहाई बाध्यकारी NFkB के निषेध के साथ जुड़े थे, जो HF के प्रतिलेखन कारक सक्रिय। कम ATII सेल व्युत्पन्न केमोकाइन स्तरों समझौता ALVEOLAR मरम्मत, सिगरेट का धुआँ प्रेरित वायुकोशीय नुकसान और वातस्फीति के लिए योगदान दे। डाटा क्यों धूम्रपान करने वालों की वृद्धि हुई है श्वसन संक्रमण के लिए यंत्रवत स्पष्टीकरण प्रदान करते हैं। सहज प्रतिक्रिया के दमन आईएल -8 में वृद्धि के साथ है।

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Protocol

नोट: लिखित सूचित सहमति इस अध्ययन करने के लिए अच्छा नैदानिक ​​प्रथाओं के अनुसार, आईआरबी अनुमोदन के तहत एक स्थानीय क्लीनिकल रिसर्च यूनिट में प्राप्त हुई थी। खून के प्रसंस्करण, PBMCs और अन्य सेल संस्कृति प्रयोगों के अलगाव microbiologically बाँझ आपूर्ति और अभिकर्मकों का उपयोग कर, बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं।

1. था-मुख्यमंत्री तैयारी

  1. पहले से 12 के रूप में वर्णित किया गया था-मुख्यमंत्री उत्पन्न करता है।
    1. 35-60-2, एमएल में कश मात्रा सेकंड में कश अंतराल, और कश अवधि: रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) निम्न रहित आहार का उपयोग कर लाल फिनोल के बिना 1640 के माध्यम से चार 3R4F संदर्भ सिगरेट से धूम्रपान से गुजर रहा था-मुख्यमंत्री को तैयार क्रमशः सेकंड में। प्रत्येक तैयारी एक 20 मिलीलीटर नमूना उत्पन्न करता है।
  2. तारीख, पूरा समय है, और सिगरेट का नाम और नंबर के साथ लेबल ट्यूब (एस)। -80 डिग्री से कम 500 μl aliquots के तुरंत धूम्रपान करने के बाद पूरा सी दुकान।
  3. जमे हुए था की aliquots का विश्लेषण करेंपहले से 12 के रूप में वर्णित -CM निकोटीन, तंबाकू विशिष्ट nitrosamines, और POLYCYCLIC सुरभित हाइड्रोकार्बन के स्तर को निर्धारित करने के लिए।

PBMCs 2. अलगाव

  1. (तंबाकू उत्पादों की गैर उपभोक्ताओं को जो कर रहे हैं) स्वस्थ दाताओं से ताजा रक्त एकत्र जागो वन बैपटिस्ट स्वास्थ्य आईआरबी 15 से एक अलग अनुमोदन के तहत नीचे वर्णित के रूप में ताजा खून से PBMCs पृथक।
    1. रक्त बैग के आगमन से पहले, एक 500 मिलीलीटर की बोतल, कैंची, अलगाव बफर, और है Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) (आरटी) एक जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) सेल संस्कृति हुड में तैयार किया गया है। अलगाव बफर प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।
    2. उल्टा रक्त बैग पकड़ो और सिर्फ यह ट्यूबिंग के कम से कम 3 सेमी छोड़ने clamped किया गया है जहां से नीचे ट्यूब काटा।
    3. 500 मिलीलीटर की बोतल से टोपी निकालें और बोतल खोलने के ऊपर ट्यूब पकड़। रक्त बैग उठाओ और रक्त टी में बैग से स्वतंत्र रूप से प्रवाह के लिए अनुमति देने के लिए इसे पलटनाबैग खाली है जब तक वह बोतल। रक्त बुलबुले बनाने से बचने के लिए सीधे नीचे के रूप बनाम बोतल के अंदर दीवार पर प्रवाह करने की अनुमति दें।
    4. रक्त के लिए अलगाव बफर के 5 अनुपात: एक एक पर बोतल में अलगाव बफर डालो। अंत ओवर के अंत में, 10 बार, कसकर बोतल कैप और धीरे यह पलटना। आरटी पर 1 घंटे के लिए, रोशनी के साथ बंद सेते सेल संस्कृति हुड में बोतल छोड़ दें।
    5. एक प्रकाश, पीले रंग का परत खून से ऊपर का निर्माण होगा। 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग इस परत निकालें। रक्त दान किया है जो इस विषय पर निर्भर करता है, 300 मिलीलीटर - एकत्र राशि 50 से भिन्न हो सकते हैं।
    6. आरटी पर 10 मिनट के लिए 200 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    7. अंधेरे खून के रंग गोली छोड़ रहा है, पारदर्शी सतह पर तैरनेवाला aspirate। गोली ढीला लेकिन चिपचिपा हो जाएगा।
    8. पिपेट 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में अलगाव बफर के 3 मिलीलीटर।
    9. Resuspend गोली के लिए, एस में एकत्र पीले रंग का तरल के हर 50 मिलीलीटर के लिए DPBS के 20 मिलीलीटर जोड़ने2.1.5 TEP। भंवर मिश्रण अच्छी तरह से, और कई ट्यूब से resuspended तरल मजबूत करने के लिए। यह तरल रक्त कोशिकाओं को निलंबित कर दिया होता है।
    10. एक हस्तांतरण pipet, कदम 2.1.8 में अलगाव बफर के 3 मिलीलीटर पर स्थानांतरण निलंबित रक्त कोशिकाओं के 5 एमएल के साथ। दो अलग-अलग परतों बनाने के लिए धीरे धीरे और धीरे सेल निलंबन जिसमें 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब झुकाएँ। न्यूनतम त्वरण के साथ और ब्रेक के बिना आरटी पर 40 मिनट के लिए 400 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    11. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में PBMCs युक्त जिसके परिणामस्वरूप से बादल मध्यम परत (Buffy कोट) को हटाने के लिए एक हस्तांतरण pipet का प्रयोग करें। इसके नीचे अन्य स्पष्ट परतों ड्राइंग से बचें। प्रत्येक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोई अधिक से अधिक 25 मिलीलीटर स्थानांतरण।
    12. कोशिकाओं को धोने के लिए (50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के पूरे शेष मात्रा को भरने के लिए या अधिक) ठंडा चल रहा बफर के 25 मिलीलीटर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
    13. बफर चल रहे 10 एमएल के साथ गोली Resuspend। इस PBMCs शामिल हैं। कोशिकाओं की गणना और आईएम का उपयोगmediately या जगह ठंड के लिए बर्फ पर।

3. बर्फ़ीली और PBMCs विगलन

  1. अपकेंद्रित्र 400 x जी पर 10 मिनट के लिए कदम 2.1.13 में एकत्र किए गए थे कि PBMCs।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार isopropyl शराब के साथ ठंड कंटेनर भरें। चेतावनी: इसोप्रोपाइल शराब ज्वलनशील और तीव्रता से विषैला होता है।
  3. 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 10% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) युक्त RPMI 1640 मध्यम (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ गोली resuspend। यह 1640 RPMI ठंड माध्यम है। के बारे में 5 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल वाले निलंबन में परिणाम होगा कि मध्यम ठंड की राशि के साथ गोली Resuspend। ठंड के लिए उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या अलग अलग होंगे।
  4. 2 मिलीलीटर cryotubes में सेल निलंबन के 1 एमएल aliquots बांटना और ठंड कंटेनर में cryotubes जगह है। हे / एन की दुकान और फिर cryotubes को हटाने और एक में स्टोर करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजर में cryotubes के साथ ठंड कंटेनर रखें-190 डिग्री सेल्सियस -150 डिग्री सेल्सियस के बीच क्रायोजेनिक फ्रीजर।
  5. क्रायोजेनिक भंडारण से cryotube निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में कोमल आंदोलन के साथ तेजी से यह पिघलना।
  6. इसके तत्काल बाद 10% FBS के, 1% पेन / Strep और 1% एल glutamine युक्त 10 मिलीलीटर 1640 RPMI पूरा मध्यम (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में cryotube में thawed PBMCs हस्तांतरण। thawed cryotube की सामग्री को अधिक से अधिक सेल व्यवहार्यता 15 प्राप्त करने के लिए जितनी जल्दी हो सके स्थानांतरित किया जाना चाहिए।
  7. 10 मिनट के लिए 400 XG पर PBMCs अपकेंद्रित्र।
  8. 5 मिलीलीटर 1640 RPMI पूरा मध्यम के साथ गोली Resuspend और कोशिकाओं की गिनती।
  9. ऐसे trypan नीले अपवर्जन विधि के रूप में स्थापित तरीकों से सेल व्यवहार्यता उपाय। 95% - आम तौर पर इस विधि के साथ सेल व्यवहार्यता के बारे में 90 है। PBMCs अब प्रयोगों में उपयोग करने के लिए तैयार हैं।

4. सेल मौत निर्धारण

नोट: यहाँ सूचीबद्ध dilutions इस छात्र के उद्देश्य के लिए कर रहे हैंवि। dilutions के तदनुसार बदला जा सकता है।

  1. 100 μl की कुल मात्रा को RPMI पूरा माध्यम का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से थाली में था-मुख्यमंत्री या निकोटीन पतला / खैर, नीचे संकेत के रूप में।
  2. निम्नलिखित सांद्रता के लिए WS-मुख्यमंत्री पतला: 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, (WS मुख्यमंत्री में निकोटीन सामग्री के आधार पर) सम-निकोटीन इकाइयों का 2.5, 3, 4, और 5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल 12।
  3. निम्नलिखित सांद्रता के लिए RPMI माध्यम में निकोटीन पतला: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, और 3000 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर। चेतावनी: निकोटीन तीव्रता से विषैले और पर्यावरण की दृष्टि से खतरनाक है।
  4. अच्छी तरह से 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में / अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए RPMI पूरा मध्यम में निलंबित कर दिया PBMCs के 100 μl जोड़ें। कोशिकाओं के साथ साथ था-मुख्यमंत्री या निकोटीन की कुल मात्रा 200 μl / अच्छी तरह से किया जाएगा।
  5. इस अध्ययन का उद्देश्य के लिए, ऊपर के रूप में प्लेटों के दो सेट तैयार करते हैं। प्लेटों को कवर किया और 24 घंटे और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए एक थाली के लिए एक थाली सेते हैं। आवश्यक के रूप में समय बिंदुओं को समायोजित करें। बर्फ के ठंडे चल रहे बफर के 200 μl के साथ कोशिकाओं resuspending अंत में, तीन मिनट के लिए 300 XG पर centrifuging सतह पर तैरनेवाला aspirating, कवर प्लेट के साथ प्लेट के नीचे vortexing और से आरटी पर कोशिकाओं को धो लें, और धोने कदम एक बार और दोहराएँ।
  6. / अच्छी तरह से 100 μl की कुल मात्रा के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 7-aminoactinomycin डी (7AAD) के 5 μl द्वारा पीछा चल बफर के 95 μl जोड़ें। 15 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में थाली सेते हैं।
  7. क्लस्टर ट्यूबों के लिए चल बफर के 100 μl जोड़ें। क्लस्टर ट्यूबों के लिए थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन की पूरी मात्रा स्थानांतरण और प्रवाह पर नमूने हासिल।
  8. विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometry का उपयोग 7AAD पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करते हैं।

5. चुनाव आयोग 50 निर्धारण

  1. WS-मुख्यमंत्री और निकोटीन की चुनाव आयोग 50 मूल्यों PBMCs की 7AAD पॉजिटिव धुंधला द्वारा निर्धारित कर रहे हैं।
  2. चुनाव आयोग 50 मूल्य सान्द्र रूप में परिभाषित किया गया हैentration जिस पर कोशिकाओं के 50% एक 24 घंटा परख में अब कोई व्यवहार्य थे, और मूल्यों को सम-निकोटीन इकाइयों / मिलीलीटर की माइक्रोग्राम प्रति के रूप में व्यक्त कर रहे हैं।
  3. इस अध्ययन के प्रयोजनों के लिए, चुनाव आयोग 50 मूल्यों क्रमश: WS-मुख्यमंत्री और निकोटीन के लिए 1.56 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल और 1650 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / होने के लिए निर्धारित किया गया है।

6. स्रावित साइटोकिन्स

नोट: यहां सूचीबद्ध dilutions इस अध्ययन का उद्देश्य के लिए कर रहे हैं। dilutions के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।

  1. / अच्छी तरह से की एकाग्रता में 100 μl की कुल मात्रा को RPMI पूरा माध्यम का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से थाली में था-मुख्यमंत्री पतला 0.3, 1.56, सम-निकोटीन इकाइयों में से 3, और 5 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर।
  2. निम्नलिखित सांद्रता के लिए निकोटीन पतला: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, और 3000 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल। चेतावनी: निकोटीन तीव्रता से विषैले और पर्यावरण की दृष्टि से खतरनाक है।
  3. अच्छी तरह से 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में / अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए RPMI पूरा मध्यम में निलंबित कर दिया PBMCs के 100 μl जोड़ें।कोशिकाओं के साथ साथ था-मुख्यमंत्री या निकोटीन की कुल मात्रा 200 μl / अच्छी तरह से किया जाएगा।
  4. प्लेट कवर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।
  5. 3 मिनट के लिए 300 XG पर centrifuging सतह पर तैरनेवाला aspirating, कवर प्लेट के साथ प्लेट के नीचे vortexing और अंत में बर्फ के ठंडे के 200 μl बफर चल रहा है और धोने कदम एक बार और दोहरा साथ कोशिकाओं को निलंबित करके आरटी पर कोशिकाओं को धो लें।
  6. RPMI पूरा मध्यम के 200 μl जोड़ें, और धोने कदम एक बार और दोहराएँ।
  7. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / LPS के माध्यम के 200 μl जोड़ें।
  8. प्लेट कवर और 4 घंटा, 24 घंटा, 48 घंटा, या 37 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं। आवश्यक के रूप में ऊष्मायन बार समायोजित करें।
  9. 3 मिनट के लिए 300 × छ पर थाली अपकेंद्रित्र।
  10. चरणों 7 और 8 में assays के प्रदर्शन करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजर में अच्छी तरह से प्रत्येक और दुकान से सतह पर तैरनेवाला के 175 μl ले लो।

7. cytometric मनका ऐरे परख

<राजभाषा>
  • CBA परख में कदम 6.10 और उपयोग से तैयार सेल supernatants गला लें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार cytometric मनका सरणी (CBA) परख प्रदर्शन करते हैं।

    • 8. आईएल -8 एलिसा

    1. आईएल -8 एलिसा में कदम 6.10 और उपयोग से सेल supernatants गला लें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एलिसा परख प्रदर्शन करते हैं।

    9. Intracellular धुंधला और फ्लो

    नोट: यहां सूचीबद्ध dilutions इस अध्ययन का उद्देश्य के लिए कर रहे हैं। dilutions के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।

    1. / अच्छी तरह से की एकाग्रता में 100 μl की कुल मात्रा को RPMI पूरा माध्यम का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से थाली में था-मुख्यमंत्री पतला 0.3, 1.56, सम-निकोटीन इकाइयों में से 3, और 5 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर।
    2. एक ही थाली में, निम्न सांद्रता के लिए निकोटीन पतला: 2, 10, 50, 100, 500, 2000, और 4000 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर। चेतावनी: निकोटीन तीव्रता से विषैले और पर्यावरण की दृष्टि से हज़ार हैdous।
    3. अच्छी तरह / 1 × 10 6 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में RPMI पूरा मध्यम में निलंबित कर दिया PBMCs के 100 μl जोड़ें। कोशिकाओं के साथ साथ था-मुख्यमंत्री या निकोटीन की कुल मात्रा 200 μl / अच्छी तरह से किया जाएगा।
    4. प्लेट कवर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।
    5. बर्फ के ठंडे चल रहे बफर के 200 μl के साथ कोशिकाओं resuspending अंत में, तीन मिनट के लिए 300 × छ पर centrifuging सतह पर तैरनेवाला aspirating, कवर प्लेट के साथ प्लेट के नीचे vortexing और से आरटी पर कोशिकाओं को धो लें, और धोने कदम एक बार और दोहराएँ।
    6. थाली करने के लिए RPMI पूरा मध्यम के 200 μl जोड़ें, और धोने कदम एक बार और दोहराएँ।
    7. RPMI पूरा माध्यम का उपयोग कर 2 μl / एमएल GolgiPlug का काम कर रहे सांद्रता और 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / LPS के लिए तैयार है और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 200 μl जोड़ें।
    8. 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए थाली सेते हैं।
    9. कदम 9.8 के अंत में, बफर (4 डिग्री सेल्सियस) चल रहा है और 300 पर कताई के साथ कोशिकाओं को धोने4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए XG।
    10. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए Cytofix के 100 μl जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 300 XG पर 1x Permwash (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ कदम 9.9 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को तीन बार धोएं।
    12. के लिए निम्न एंटीबॉडी के एक से प्रत्येक के 5 μl द्वारा प्रत्येक अच्छी तरह से पालन करने के लिए 45 μL 1x Cytoperm की जोड़ें प्रत्येक अच्छी तरह से: टीएनएफ-α-एलेक्सा Fluor 488, IFN-γ V500 के एमआईपी-1α पीई। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    13. 1x Permwash (4 डिग्री सेल्सियस) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 300 XG पर बफर (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ चल रहे एक समय के साथ कदम 9.9 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को दो बार धोएं।
    14. 2% paraformaldehyde (4 डिग्री सेल्सियस) के 200 μl के साथ कोशिकाओं Resuspend। 12 × 75 मिमी ट्यूबों में कोशिकाओं स्थानांतरण, और प्रवाह पर नमूनों का विश्लेषण। चेतावनी: Paraformaldehyde तीव्रता से जहरीले और स्वास्थ्य के लिए खतरा, संक्षारक है।

    10 K562 हत्या परख

    नोट: K562 कोशिकाओं हो जाना चाहिएRPMI पूरा मध्यम के साथ 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में संस्कृति में वे परख से पहले 80% संगम तक।

    1. शीशी DMSO के 18 μl जोड़कर succinimidyl एस्टर (CFSE) शेयर समाधान Carboxyfluorescein एक 5 मिमी तैयार करें।
    2. / अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए वांछित सम-निकोटीन इकाइयों या निकोटीन सांद्रता को प्राप्त करने के लिए 100 μl की कुल मात्रा को RPMI पूरा माध्यम का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से थाली में था-मुख्यमंत्री या निकोटीन पतला। चेतावनी: निकोटीन तीव्रता से विषैले और पर्यावरण की दृष्टि से खतरनाक है।
    3. / अच्छी तरह से 1.5 x 10 6 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में RPMI पूरा मध्यम में PBMCs के 100 μl जोड़ें। WS-मुख्यमंत्री या निकोटीन के साथ कोशिकाओं की कुल मात्रा 200 μl / अच्छी तरह से किया जाएगा।
    4. प्लेट कवर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।
    5. आरटी पर आठ मिनट के लिए 400 XG पर 10 DPBS के मिलीलीटर और सेंट्रीफ्यूज जोड़कर K562 कोशिकाओं को धो लें।
    6. DPBS के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं Resuspend और K562 कोशिकाओं गिनती।
    7. CFSE में काम कर रहे तैयार करें1 मिलीलीटर DPBS के लिए CFSE शेयर समाधान की एक μl जोड़कर एनजी समाधान।
    8. 2 10 x 7 कोशिकाओं - 1 युक्त K562 सेल निलंबन के 1 एमएल CFSE काम कर समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। भंवर और आरटी पर 2 मिनट के लिए ठीक सेते हैं।
    9. इसके तत्काल बाद FBS की 200 μl जोड़ें। भंवर और आरटी पर 2 मिनट के लिए ठीक सेते हैं।
    10. RPMI पूरा माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें और आरटी पर आठ मिनट के लिए 400 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    11. RPMI सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली तोड़ने के लिए और RPMI पूरा माध्यम के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं resuspend और CFSE लेबल K562 कोशिकाओं गिनती।
    12. आरटी पर 3 मिनट के लिए 300 XG पर थाली centrifuging द्वारा PBMCs धो लें। तरल decanting से सतह पर तैरनेवाला aspirate। कवर बदलें और प्लेट के नीचे भंवर। RPMI पूरा मध्यम के 200 μl जोड़ें और धोने कदम एक बार और दोहराएँ।
    13. (: 1.5 एक्स 10 6 PBMCs 100,000 K562s) PBMC प्लेट और आगे मैं के प्रत्येक नमूने अच्छी तरह से करने के लिए 01:15 के अनुपात में CFSE लेबल K562 कोशिकाओं जोड़ें37 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए ncubate।
    14. आरटी पर 3 मिनट के लिए 300 XG पर centrifuging द्वारा सेल मिश्रण धो लें। तरल discarding से सतह पर तैरनेवाला aspirate। कवर प्लेस और प्लेट के नीचे भंवर।
    15. चल बफर के 200 μl जोड़ें और कदम 10.14 एक और अधिक समय में वर्णित धोने कदम दोहराएँ।
    16. / अच्छी तरह से 100 μl की कुल मात्रा के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 7AAD के 5 μl द्वारा पीछा चल बफर के 95 μl जोड़ें। 15 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में थाली सेते हैं।
    17. प्रत्येक अच्छी तरह से चल बफर के 100 μl जोड़ें और क्लस्टर ट्यूबों के लिए थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन की पूरी मात्रा हस्तांतरण और प्रवाह पर नमूने हासिल।
    18. विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometry का उपयोग 7AAD पॉजिटिव और CFSE पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करते हैं।

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    Representative Results

    परिणाम मतलब (चार दाता नमूने) का मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया गया। और इलाज नियंत्रण के नमूने के बीच छात्र के टी परीक्षण उनके इसी नियंत्रण के साथ सभी उपचार के लिए एक्सेल सॉफ्टवेयर के रूप में अच्छी तरह से टी परीक्षण तुलना उपयोग किया गया था। सांख्यिकीय महत्व से संकेत दिया गया था: *, पी <0.05; **, पी <0.005; ***, पी <.0005।

    WS-मुख्यमंत्री और निकोटीन के लिए जोखिम के प्रभाव को मापने के लिए, PBMCs 3 घंटे या 24 घंटे के लिए अलग था-मुख्यमंत्री की सांद्रता और निकोटीन के साथ इलाज किया गया। कोशिका मृत्यु डबल असहाय न्यूक्लिक एसिड में 7AAD intercalates के रूप में मजबूत और विश्वसनीय 7AAD धुंधला विधि द्वारा मापा गया था और मर रहा है या मृत कोशिकाओं को 16 साल की कोशिका झिल्ली घुसना कर सकते हैं। कोशिका मृत्यु में एक खुराक पर निर्भर वृद्धि सम-निकोटीन इकाइयों (चित्रा 1 ए) के चार माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / पर पता चला एक के पास 80% कोशिका मृत्यु के साथ, 24 घंटा में था-मुख्यमंत्री के साथ मनाया गया। कोशिका मृत्यु का एक तुलनीय डिग्री थाकेवल 3000 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / निकोटीन (चित्रा 1 बी) पर संतोष व्यक्त किया। हम था-मुख्यमंत्री और साइटोकाइन प्रेरण और लक्ष्य कोशिकाओं को मार करने की क्षमता के अपने प्रभाव का आकलन करने के निकोटीन के साथ तीन घंटे के लिए PBMCs उजागर बाद से, यह था-मुख्यमंत्री 3 घंटा इलाज के बाद महत्वपूर्ण cytotoxicity का कारण बनता है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए जरूरी हो गया था। PBMCs महत्वपूर्ण विषाक्तता का अनुभव नहीं था था-मुख्यमंत्री के सम-निकोटीन इकाइयों के 5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के साथ इलाज (<5%, चित्रा 1 ए)। तीन घंटे के लिए निकोटीन के साथ उपचार केवल 2000 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल (चित्रा 1 बी) में औसत दर्जे का (8%) कोशिका मृत्यु का कारण बना। इस प्रकार, संकेत खुराक और उपचार की अवधि में था-मुख्यमंत्री या निकोटीन के लिए जोखिम प्रयोगात्मक शर्तों के तहत महत्वपूर्ण cytotoxicity कारण नहीं था।

    Immunomodulatory प्रभाव को मापने के लिए, PBMCs अलग समय अवधियों के लिए LPS के साथ प्रेरित कर रहे थे, और स्रावित साइटोकिन्स CBA परख द्वारा मापा गया। LPS उत्तेजना समय का अनुकूलन करने के लिए, हम 4 घंटा, 2 लिए LPS उत्तेजना के PBMCs उजागर4 घंटा, 48 घंटा, 72 घंटा, और secreted साइटोकिन्स मापा गया। उदाहरण के लिए, 24 घंटा लिए LPS उत्तेजना साइटोकिन्स आईएल -6 और आईएल -8 (चित्रा 2) के अधिक से अधिक स्राव झुकेंगे, और विस्तारित समय अवधि साइटोकाइन में आगे बढ़ जाती है (आईएल -6) या कम हो जाती है (आईएल 8) में परिणाम नहीं था स्राव। इसी तरह के परिणाम ऐसे आईएल 10, आईएल 1β और टीएनएफ-α के रूप में अन्य स्रावित साइटोकिन्स के साथ प्राप्त किया गया (डेटा) नहीं दिखाया।

    पायलट समय पाठ्यक्रम प्रयोगों LPS के द्वारा TLR-4 उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाओं में साइटोकिन्स का अधिक से अधिक उत्पादन 24 घंटा से होती है जो सुझाव दिया है, और इसलिए, स्रावित साइटोकिन्स बाद के सभी प्रयोगों में 24 घंटा में मापा गया। LPS के साथ TLR-4 रिसेप्टर की उत्तेजना के द्वारा पीछा किया गया था-मुख्यमंत्री और निकोटीन, साथ उपचार, स्रावित साइटोकिन्स (चित्रा 3) की एक खुराक पर निर्भर कमी के परिणामस्वरूप। WS-मुख्यमंत्री के साथ उपचार IFN-γ का गहरा कम हो जाती है (चित्रा 3 ए), टीएनएफ (3B चित्रा), आईएल-10 (चित्रा -3 सी <में हुईकम सम-निकोटीन इकाइयों (1.56 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) में> / मजबूत) और आईएल -6 (चित्रा 3 डी)। साइटोकिन्स का दमन भी निकोटीन के साथ स्पष्ट हो गया था। हालांकि, निकोटीन के साथ साइटोकिन्स के दमन में काफी अधिक मात्रा में हुआ है, और दमन की डिग्री व्यक्ति साइटोकिन्स के बीच विविध। आईएल -6 का परीक्षण सर्वोच्च एकाग्रता (4 मिलीग्राम / एमएल) (Figurie 3 डी) में दबा दिया गया था, जबकि उदाहरण के लिए, IFN-γ, काफी 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / पर निकोटीन के साथ दबा दिया जा दिखाई दिया। अगला, हम एक एलिसा परख का उपयोग कर एक ही नमूनों में आईएल -8 के स्तर को मापा जाता है। आईएल -8 स्राव को प्रभावी ढंग से किया गया था-मुख्यमंत्री उजागर PBMCs में दबा दिया गया था; निकोटीन की दमनकारी प्रभाव 2 मिलीग्राम / एमएल (चित्रा 4) में महत्वपूर्ण थे।

    intracellular साइटोकिन्स के स्तर LPS के साथ उत्तेजना पर था-CM- और निकोटीन इलाज कोशिकाओं में मात्रा निर्धारित किया गया था। पहले हम तीन दिनों के लिए PBMCs उत्तेजित और मापने के लिए ऊष्मायन के पिछले 6 घंटा दौरान Golgiplug जोड़ाintracellular साइटोकिन्स 14। अब हम काफी 6 घंटा की कुल करने के LPS और गॉल्जी प्लग के साथ उत्तेजना के संयोजन से ऊष्मायन अवधि कम और intracellular साइटोकाइन पॉजिटिव कोशिकाओं (चित्रा 5) मापा जाता है। (5 IFN-γ पॉजिटिव कोशिकाओं में एक खुराक पर निर्भर प्रतिशत की कमी दिखाता है चित्रा चित्रा 5A), टीएनएफ-α पॉजिटिव nicotine- और WS-CM- दोनों में कोशिकाओं (चित्रा 5 ब) एमआईपी-1α पॉजिटिव कोशिकाओं में एक खुराक पर निर्भर प्रतिशत की कटौती (चित्रा 5C) जबकि मुख्यमंत्री था में मनाया गया, PBMCs उजागर -exposed PBMCs। इस परख में हम कम सम-निकोटीन इकाइयों (1.56 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) में था-मुख्यमंत्री के बाद प्रदर्शन करने के intracellular साइटोकाइन पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या में कमी मनाया। दोनों स्रावित साइटोकाइन और intracellular साइटोकाइन assays के IFN-γ स्तर या IFN-γ पॉजिटिव कोशिकाओं के मामले में इसी तरह के परिणाम से पता चला है।

    एक कार्यात्मक उपाय, WS-CM- और nicotine- की क्षमता के रूप मेंलक्ष्य K562 कोशिकाओं को मारने के लिए इलाज किया PBMCs निर्धारित किया गया था। चित्रा 6A नियंत्रण से (CFSE लेबल K562) सेल हत्या, WS-मुख्यमंत्री उजागर लक्ष्य की 7AAD पॉजिटिव धुंधला के प्रतिनिधि प्रवाह cytometric कच्चे डेटा को दर्शाया गया है, और निकोटीन का इलाज PBMCs। बॉक्स में नंबर प्रतिशत 7AAD पॉजिटिव CFSE लेबल K562 कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। 1.56 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के संपर्क में था-मुख्यमंत्री काफी नियंत्रण और कम खुराक के साथ तुलना PBMCs में प्रेरक कोशिकाओं की हत्या की क्षमता कम हो। निम्न और उच्च मात्रा में निकोटीन उपचार सेल हत्या के मामले में हस्तक्षेप नहीं किया। चित्रा 6B एक ही प्रयोग में कई दाताओं से मौत हो गई प्रतिशत K562 सेल में एक खुराक पर निर्भर कमी को दर्शाता है।

    चित्रा 1
    WS-मुख्यमंत्री (g / एमएल) और निकोटीन (g / एमएल) के सम-निकोटीन इकाइयों की सांद्रता में वृद्धि के लिए जोखिम के बाद PBMCs चित्रा 1. कोशिका मृत्यु। (ए) और 3 घंटा और 24 घंटा (बी) के लिए निकोटीन के साथ के लिए WS-मुख्यमंत्री के साथ इलाज किया गया। कोशिका मृत्यु 7AAD धुंधला द्वारा मापा गया था। प्रत्येक बिंदु एक प्रतिनिधि प्रयोग से चार दाताओं का मतलब ± एसडी त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व करता है। सांख्यिकीय महत्व ने संकेत दिया है: * पी <0.05; ** P <0.005, *** पी <.0005।

    चित्रा 2
    अलग समय बिंदुओं पर LPS के साथ प्रेरित PBMCs द्वारा आईएल -6 और आईएल 8 चित्रा 2. स्राव। PBMCs 4 घंटा, 24 घंटा, 48 घंटा, 72 घंटा के लिए LPS के साथ प्रेरित किया गया। सेल संस्कृति supernatants में आईएल -6 और आईएल 8 साइटोकिन्स का स्तर मानव भड़काऊ Cytokine किट (CBA किट) का उपयोग और प्रवाह cytometry निर्धारित किया गया है। इन आंकड़ों के तीन अलग अलग दाताओं से PBMCs का उपयोग करते हुए दो स्वतंत्र प्रयोगों में से एक से मतलब ± एसडी त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय एसआईgnificance ने संकेत दिया है: * पी <0.05; ** P <0,005।

    चित्रा 3
    LPS उत्तेजना के बाद था-मुख्यमंत्री (g / एमएल) और निकोटीन (g / एमएल) के सम-निकोटीन इकाइयों की सांद्रता में वृद्धि के साथ इलाज किया PBMCs द्वारा साइटोकाइन स्राव की चित्रा 3. कमी। PBMCs था-मुख्यमंत्री और निकोटीन के विभिन्न सांद्रता से अवगत कराया गया तीन घंटे के लिए और 24 घंटे के लिए LPS के साथ प्रेरित किया। IFN-γ (ए) के स्तर, सेल संस्कृति supernatants में टीएनएफ (बी), आईएल-10 (सी), और आईएल -6 (डी) साइटोकिन्स एक Th1 / Th2 CBA परख का उपयोग और प्रवाह cytometry निर्धारित किया गया है। इस डेटा में चार अलग अलग दाताओं से PBMCs का उपयोग कर तीन स्वतंत्र प्रयोगों में से एक से मतलब ± एसडी त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व करता है। सांख्यिकीय महत्व ने संकेत दिया है: * पी <0.05; ** P <0,005; *** पी <.0005। हायर चोर WS-मुख्यमंत्री के centrations भी *** पी <.0005 के साथ सांख्यिकीय महत्वपूर्ण थे।

    चित्रा 4
    LPS उत्तेजना के बाद था-मुख्यमंत्री (g / एमएल) और निकोटीन (g / एमएल) के सम-निकोटीन इकाइयों की सांद्रता में वृद्धि के साथ इलाज किया PBMCs द्वारा आईएल -8 स्राव की चित्रा 4. क्षीणन। PBMCs, WS-मुख्यमंत्री और निकोटीन से अवगत कराया गया 24 घंटा के लिए LPS के साथ प्रेरित है, और आईएल -8 एलिसा द्वारा मापा गया था स्रावित। इन आंकड़ों के चार अलग अलग दाताओं से PBMCs का उपयोग कर तीन स्वतंत्र प्रयोगों में से एक से मतलब ± एसडी त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय महत्व ने संकेत दिया है: * पी <0.05; ** P <0,005; *** पी <.0005। WS-मुख्यमंत्री के उच्च सांद्रता भी *** पी <.0005 के साथ सांख्यिकीय महत्वपूर्ण थे।

    जेपीजी "/>
    WS-मुख्यमंत्री (g / एमएल) और निकोटीन (g / एमएल) के सम-निकोटीन इकाइयों की सांद्रता में वृद्धि के साथ इलाज किया PBMCs में intracellular साइटोकाइन पॉजिटिव कोशिकाओं की चित्रा 5. कमी। PBMCs था-मुख्यमंत्री और निकोटीन के अलग सांद्रता से अवगत कराया गया तीन घंटे के लिए और छह घंटे के लिए LPS और Golgiplug साथ प्रेरित किया। WS-मुख्यमंत्री और निकोटीन के लिए वाहन नियंत्रण RPMI पूरा मध्यम था। Intracellular IFN-γ पॉजिटिव (ए), टीएनएफ-α पॉजिटिव (बी), और एमआईपी-1α पॉजिटिव (सी) कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया। इन आंकड़ों के चार अलग अलग दाताओं से PBMCs का उपयोग करते हुए चार स्वतंत्र प्रयोगों में से एक से मतलब ± एसडी त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय महत्व ने संकेत दिया है: * पी <0.05; ** P <0,005; *** पी <.0005। WS-मुख्यमंत्री के उच्च सांद्रता भी *** पी <.0005 के साथ सांख्यिकीय महत्वपूर्ण थे।

    चित्रा 6 PBMCs लक्ष्य की चित्रा 6 न्यूनीकरण था-मुख्यमंत्री (g / एमएल) और निकोटीन (g / एमएल) के सम-निकोटीन इकाइयों की सांद्रता में वृद्धि के लिए जोखिम के साथ क्षमता मौत हो गई। PBMCs 3 के लिए संकेत दिया था-मुख्यमंत्री की सांद्रता और निकोटीन के साथ इलाज किया गया मानव संसाधन, और CFSE लेबल K562 कोशिकाओं तो लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में जोड़ा गया है और अतिरिक्त 5 घंटे के लिए incubated रहे थे। प्रकोष्ठों 7AAD साथ दाग रहे थे और cytometry की हत्या की क्षमता गेज करने के लिए इस्तेमाल किया गया था प्रवाह। चित्रा 6A gated बक्से में दिखाया प्रतिशत हत्या के साथ परिणाम cytometry के प्रतिनिधि प्रवाह से पता चलता है। तीर उजागर 1.56 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर में प्रतिशत हत्या कम इंगित करता था-सेमी। चित्रा 6B चार अलग अलग दाताओं से PBMCs का उपयोग करते हुए चार स्वतंत्र प्रयोगों से प्रतिनिधि मतलब ± एसडी त्रुटि सलाखों से पता चलता है। सांख्यिकीय महत्व ने संकेत दिया है: ** पी <0.005; *** पी <.0005। WS-मुख्यमंत्री के उच्च सांद्रता भी सांख्यिकीय महत्वपूर्ण बुद्धि थेएच *** <.0005 पी।

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    Discussion

    हम और दूसरों को पहले से TPPs साथ PBMCs के उपचार अभिव्यक्ति और साइटोकिन्स और इस तरह के लक्ष्य सेल 14 की हत्या के रूप में कार्य उपायों का स्राव सहित कई प्रतिक्रियाएं, दबा है कि प्रदर्शन किया है। पिछले काम में वर्णित प्रयोगात्मक विधियों अब ऊष्मायन अवधि की आवश्यकता होती है और परिमाण 14 में मामूली थे। बुनियादी के लिए यह आकर्षक पूर्व vivo मॉडल के संभावित अनुप्रयोगों को देखते हुए और अनुप्रयुक्त अनुसंधान, हम इन बहु कदम जैविक assays में परख मापदंडों के किसी भी अनुकूलित किया जा सकता है कि क्या जांच की। यहाँ, हम एक टीपीपी इलाज पूर्व vivo PBMC मॉडल का उपयोग कर TLR की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मापने के लिए तरीकों को सरलीकृत प्रस्तुत करते हैं।

    व्यवहार्य PBMCs के अलगाव इन पूर्व vivo assays के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। संभावित दाताओं में व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता और शारीरिक स्थिति को देखते हुए यह उत्तरदायी हैं कि PBMCs प्राप्त करने के लिए आदर्श है। इस अध्ययन का उद्देश्य के लिए, हम अलग-थलगएक पहले प्रकाशित विधि 15 का उपयोग करते हुए आम तौर पर स्वस्थ वयस्क विषयों से डी PBMCs। इसके अलावा, दाताओं के बीच परिवर्तनशीलता को कम से कम करने के लिए इस अध्ययन में, हम एलर्जी, संक्रमण के साथ उन लोगों को बाहर रखा गया है, या जो किसी भी नुस्खे लेने या एस्पिरिन जैसे काउंटर दवाओं से अधिक थे। यह इष्टतम व्यवहार्यता और बाद के प्रयोगों में कोशिकाओं की कार्यप्रणाली को सुनिश्चित करता है के रूप में इसके साथ ही, हौसले से एकत्र रक्त से PBMCs के अलगाव, वांछनीय है।

    67-72 घंटे के लिए TLR एगोनिस्ट साथ उत्तेजना का उपयोग किया पिछले विधियों से intracellular साइटोकिन्स और स्रावित साइटोकिन्स 14 को मापने के लिए। (कोई था-मुख्यमंत्री या निकोटीन के साथ नियंत्रण की शर्तों के तहत) TLR उत्तेजित कोशिकाओं में साइटोकाइन स्राव की एक समय-बेशक अधिक से अधिक स्राव 24 घंटा में हुई सुझाव दिया। इसके अलावा, हम TLR agonists और Golgiplug साथ ऊष्मायन संयुक्त और intracellular साइटोकिन्स को मापने के लिए 6 घंटे की कुल करने के ऊष्मायन के समय कम कर दिया। इस उपाय करने के लिए एक अलग परख की आवश्यकता है, जबकिसाइटोकाइन पॉजिटिव कोशिकाओं, डेटा पिछले विधि 14 के साथ तुलना में अधिक मजबूत कर रहे हैं। पिछले परिणामों के साथ संगत, WS-मुख्यमंत्री जोरदार intracellular और स्रावित साइटोकिन्स की प्रेरण दबा दिया। इस प्रकार, इन संशोधनों काफी परख टाइम्स कम करने के लिए नेतृत्व और साहित्य में वर्णित उन के रूप में बहुत ही इसी तरह के परिणाम सामने आए। हम साइटोकाइन के स्तर का मूल्यांकन करने के फ्लो और एलिसा विधियों का उपयोग किया है, वहीं इस तरह की वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-qPCR) के रूप में अन्य तकनीकों का भी एक पूरक तकनीक के रूप में उपयोग किया जा सकता है।

    ऐतिहासिक, radiolabeled विधियों (उदाहरण के लिए, 51 करोड़ जारी-परख) का उपयोग किया प्रेरक PBMCs द्वारा सेल हत्या लक्ष्य। इस रिपोर्ट में वर्णित विधि रेडियोधर्मिता का उपयोग समाप्त और जिनकी उपस्थिति फ्लो द्वारा नजर रखी जा सकता है एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ लोड हो रहा है कोशिकाओं को रोजगार। वर्णित विधि का एक और लाभ के साथ साथ यह अपेक्षाकृत तेजी से है और adapte हो सकता हैउच्च throughput assays के लिए डी। लक्ष्य और प्रेरक कोशिकाओं के ऊष्मायन अवधि 5 घंटा है इसलिये परख 8 घण्टे में पूरा किया जा सकता है। यह है कि वे कई दिनों की अवधि में PBMCs और सक्रियण / उत्तेजना के उपप्रकार के अलगाव की आवश्यकता के रूप में और अधिक शामिल हैं जो अन्य प्रकाशित तरीकों के साथ विरोधाभासों में, या एन.के. सेल और K562 सेल conjugates के विश्लेषण cytotoxicity 17,18 नजर रखने के लिए। वर्तमान पद्धति का एक और लाभ यह है कि अधिक से अधिक लचीलापन देता है जो प्रेरक कोशिकाओं, के रूप में सीधे cryopreserved PBMCs का उपयोग करता है।

    सारांश में, हम आसानी से विभिन्न यौगिकों के परीक्षण के लिए लागू किया जा सकता है, जो दहनशील टीपीपी इलाज PBMCs में TLR की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए कई assays के वर्णन किया। cryopreserved घटकों के उपयोग ऐसे cytometry, CBA assays के, और मजबूत ELISAs, और अनुरूप परिणाम अलग प्रयोगशाला भर में तेजी से प्राप्त किया जा सकता प्रवाह के रूप में स्थापित तकनीक के साथ साथ महत्वपूर्ण लचीलापन के लिए अनुमति देता है, औरoratories।

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    Acknowledgments

    इस काम के मेडिसिन जागो वन विश्वविद्यालय के स्कूल के साथ एक सहयोगी अनुसंधान समझौते के तहत आरजे रेनॉल्ड्स तंबाकू कंपनी (RJRT) द्वारा वित्त पोषित है। जीएल प्रसाद RJRT के एक पूर्णकालिक कर्मचारी है।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    12 x 75 mm tubes BD Falcon 352058
    15 ml conical tubes Corning 430790
    2 ml microtubes Axygen MCT-150-C-S
    3R4F reference cigarettes Univ. of Kentucky, College of Agriculture 3R4F
    50 ml conical tubes Corning 430828
    500 ml bottle Corning 430282
    7AAD BD Pharmingen 559925
    96-well flat bottom plate Termo Nunc 439454
    96-well round bottom plates BD Falcon 353077
    Cell culture hood Thermo Scientific 1300 Series A2
    Centrifuge Eppendorf 58110R
    CFSE Molecular Probes Life Technologies C34554
    Cluster tubes Corning 4401 Harmful if swallowed, carcinogen
    Cytofix/Cytoperm (Permwash) BD Biosciences 555028 Flammable
    DMSO (dimethyl sulfoxide ) Sigma-Aldrich D8418
    DPBS Lonza 17-512F
    FBS Sigma-Aldrich F2442
    FCAP Array BD Biosciences 652099 Software analyzes CBA data
    Filter unit Nalgene 156-4020
    Flow cytometer BD Biosciences FACS Canto II 8 colors, at Ex 405 and Em 785.
    Flow cytometer BD Biosciences FACS Calibur 4 colors at Ex 495 and Em 785.
    Flow cytometry analysis software Tree Star FlowJo
    Freezing container Nalgene 5100-0001 Contains DMSO, irritant
    GogliPlug BD Biosciences 555029 Carcinogen, irritant, corrosive
    H2SO4 Sigma-Aldrich 339741
    Human Inflammatory Cytokine Kit BD Biosciences 551811
    IFN-γ V-500 Antibody BD Horizon 561980 skin sensitizer
    IL-8 ELISA Kit R and D Systems DY208
    Isolation buffer Isolymph, CTL Scientific Corp. 1114868 Flammable liquid, irritant
    Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907
    L-Glutamine Gibco Life Technologies 25030-081
    LPS Sigma-Aldrich L2630
    MIP1-α PE Antibody BD Pharmingen 554730 Acute toxicity, oral
    Monensin Sigma-Aldrich M5273
    NaCl Sigma-Aldrich S7653
    Nicotine Sigma-Aldrich N3876 Acute toxicity, environmental hazard
    Parafilm Bemis “M”
    Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Flammable, skin irritation
    Pen/strep Gibco Life Technologies 15140-122
    RPMI 1640 Gibco Life Technologies 11875-093
    Running buffer MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech 130-091-221
    Th1/Th2 CBA Kit BD Biosciences 551809
    TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody BioLegend 502915
    Transfer pipette Fisher Scientific 13-711-20
    Tris Base Sigma-Aldrich T1503

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
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    इम्यूनोलॉजी अंक 95 तंबाकू उत्पाद तैयार करने पूरे धुआं वातानुकूलित मध्यम मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear PBMC lipopolysaccharide कोशिका मृत्यु स्रावित साइटोकिन्स intracellular साइटोकिन्स K562 की हत्या परख।
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    Arimilli, S., Damratoski, B. E., G.L., P. Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations. J. Vis. Exp. (95), e52351, doi:10.3791/52351 (2015).

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