Abstract
Unter anderen pathophysiologischen Veränderungen, chronische Exposition gegenüber Zigarettenrauch verursacht Entzündungen und Immununterdrückung, die mit einer erhöhten Anfälligkeit von Rauchern um mikrobielle Infektionen und Tumorhäufigkeit in Verbindung gebracht wurden. Ex-vivo-Unterdrückung der Rezeptor-vermittelten Immunantworten in humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) mit Rauchbestandteile behandelt ist ein attraktiver Ansatz für die Mechanismen untersuchen und bewerten die möglichen langfristigen Auswirkungen der Exposition gegenüber Tabakwaren. Hier optimierten wir Methoden zur Ex-vivo-Tests unter Verwendung von PBMCs durch bakterielles Lipopolysaccharid, ein Toll-like Rezeptor-4-Liganden stimuliert durchzuführen. Die Auswirkungen der ganze Rauch-konditioniertes Medium (WS-CM) wurde eine brennbare Tabakprodukt Zubereitung (TPP) und Nikotin auf die Zytokinsekretion und die Zielzelle Tötung durch PBMCs in den ex-vivo-Tests untersucht. Wir zeigen, dass Zytokine IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 und IL-8 und intrazellulären Cytokinen IFN-47 ;, TNF-α und MIP-1α in WS-CM-belichteten PBMCs drückt. Die cytolytische Funktion von Effektorzellen PBMCs, wie durch einen K562 Targetzelle töten Assay bestimmt wurde ebenfalls durch Einwirkung von WS-cm verringert; Nikotin war minimal wirksam in diesen Assays. Zusammenfassend stellen wir eine Reihe von verbesserten Assays, um die Auswirkungen TPPs in ex-vivo-Untersuchungen zu bewerten und diese Methoden ohne weiteres zur Prüfung andere Produkte von Interesse angepasst werden.
Introduction
Ein wesentlicher Körper des Wissens verweist auf die negativen gesundheitlichen Auswirkungen von chronischen Zigarettenrauchen, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD), chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) und Krebs 1,2. Chronischen Rauchens ist bekannt, Entzündung und Immunsuppression verursachen, und diese Veränderungen werden berichtet, um zu einer erhöhten Gefahr der mikrobiellen Infektion und Krebs bei Rauchern 3 beitragen. In-vitro- und ex-vivo-Techniken nützlich sind bei der Aufklärung der molekularen Grundlage der pathophysiologischen Wirkungen Zigarettenrauch 4-9 (Tabelle 1) und werden als wichtige Instrumente zur Führung des Schwellen Regulierung verschiedener Tabakwaren 10,11 anerkannt.
Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass brennbare Tabakprodukt Zubereitungen (TPPs) wie Vollrauch konditioniertes Medium (WS-CM) und die Gesamtpartikelmaterial (TPM) sind weitaus zytotoxische und schädlich fürDNA als nichtbrennbar TPPs oder Nikotin 12,13. In Übereinstimmung mit der veröffentlichten Arbeiten wurde kürzlich berichtet, dass brennbare TPPs oder Nikotin 12,13. In Übereinstimmung mit der veröffentlichten Arbeiten, die wir vor kurzem berichtet, dass brennbare TPPs verursacht deutliche Immunsuppression. Dies wurde durch die Suppression der Toll-like Rezeptor (TLR) -Liganden belegt, stimuliert Zytokinsekretion und Zielzelle (K562) Tötung durch PBMCs in einem ex vivo-Modell 14. Angesichts der Bedeutung der Entzündung im Zigarettenrauch induzierten Krankheitsprozesse wird eine weitere Optimierung der Testbedingungen, die immunmodulatorische Wirkung von Zigarettenrauch zu bewerten in diesem Bericht.
Die ex-vivo-Untersuchungen in der Regel gemessen und intrazelluläre Zytokine sowie die zytolytische Funktion von zytotoxischen T und NK-Zellen in K562-Zellen zu töten Assays 14. Die Assays beteiligt Vorinkubation mit WS-CM und Nikotin und nachfolgende Stimulation von PBMCs mit TLR-Agonisten über einen Zeitraum von 3 Tagen; die endgültige Auslesen durchgeführt werden unter Verwendung von Enzym-Immuntests (ELISAs) und / oder Durchflusszytometrie. Wir verwendeten bakteriellen Lipopolysaccharid (LPS), die TLR-4-Rezeptoren bindet und stimuliert PBMCs, was zur Produktion von intrazellulären Cytokinen und Sekretion von Zytokinen. Zusätzlich zur Optimierung der verschiedenen Assayschritte zum Auswerten der immunmodulatorischen Wirkung von TPPS präsentieren wir auch Verfahren zur Isolierung von PBMCs, Zelltodassays und IL-8 Quantifizierung. Diese Methoden angewendet werden, um andere Forschungsfragen anzugehen und weiter verfeinert, um Tabakwaren in der Regelungszusammenhang zu bewerten.
Tabelle 1 veröffentlichte Berichte über In-vitro- und Ex-vivo-Methoden zur Varilux pathophysiologischen Wirkungen von Tabakprodukt Vorbereitungen studieren CS, Zigarettenrauch Medium. CSC, Zigarettenrauch Kondensat; CSE, Zigarettenrauch-Extrakt; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; GADPH, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase; qPCR, quantitative Polymerase-Kettenreaktion; RT, Echtzeit quantitative Polymerase-Kettenreaktion; TS, Tabakrauch.
| Autor (Studienjahr) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Erden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Verwendeten Zellen | Menschen bronchiale Endothelzellen (BEAS-2B), humanen Neutrophilen | Menschen Alveolarepithelzellen (A549) | Menschlichen glatten Atemwegsmuskulatur (HASMC) | Menschen premonocytic U937-Zellen, menschlichen Monozyten | Alveolaren Typ II Epithelzellen (ATII) | Humanen monozytärenZellinie (THP-1), menschliche Lungenmakrophagen |
| TPP verwendet | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Methode verwendet | ELISA, qPCR, Migration, Elektroschalt | Immunhistochemische Chemie, Elektrophorese Array Kit, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, Elektrophorese | Gel-Mobility-Shift- | Lichtmikroskopie, Elektronenmikroskopie, Elektrophorese, ELISA | qPCR, ELISA, E-toxate Kits (Sigma), p65-Platten-Assay (TransAM), Elektrophorese, verschiedenen Immunoassay-Kits |
| Maßnahme | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-KB, Migration | Histonacetyltransferasen, Histondeacetylasen, NF-kappaB, IL-8, pI & kgr; B-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, Eotaxin | Hitzeschock / Stressproteine (HSP / Hsp70), HF-Transkriptionsfaktor, NF-kB,TNF-α | Surfactant Protein (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK-Phosphorylierung cJun: DNA-Bindung, Glutathion, p65: DNA-Bindung |
| Endergebnis | CSE herunterreguliert Zytokin-Produktion durch Unterdrückung der AP-1-Aktivierung. | H 2 O 2 und CSC verbessern Acetylierung von Histon-Proteine, zu verringern Histon-Deacetylase-Aktivität, differenziell reguliert proinflammatorische Zytokin-Freisetzung. | Zigarettenrauch kann die Freisetzung von IL-8 aus HASMC, durch TNF-α, 20% CSE weniger IL-8-Freisetzung, Hemmung der Eotaxin und RANTES erweitert durch Zigarettenrauch verursacht. | TS aktiviert HF Transkriptionsfaktor, der mit Hsp70-Überexpression und Hemmung der NFkB-Bindungsaktivität und TNF-α Freisetzung assoziiert war. | Reduzierte ATII Zellen abgeleiteten Chemokin Ebenen Kompromisse alveolar Reparatur, einen Beitrag zur Zigarettenrauch induzierten Alveolarschaden und Emphysem. | Daten liefern mechanistische Erklärung dafür, warum Raucher haben erhöhte Atmungsinfektionen. Unterdrückung des unspezifischen Reaktion wird durch einen Anstieg der IL-8 begleitet. |
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Protocol
HINWEIS: Eine schriftliche Einverständniserklärung, diese Studie zu tun, wurde in einem örtlichen klinischen Forschergruppe unter IRB-Zulassung erhalten, pro Good Clinical Practices. Verarbeitung von Blut, werden Isolierung von PBMCs und andere Zellkulturexperimenten unter sterilen Bedingungen durchgeführt, unter Verwendung von mikrobiologisch Sterilgut und Reagenzien.
1. WS-CM Herstellung
- Generieren WS-CM, wie zuvor beschrieben 12.
- Bereiten Sie WS-CM, indem Rauch von vier 3R4F Referenz Zigaretten über Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium ohne Phenolrot mit dem folgenden Raucher-Regime: 35-60-2, puff Volumen in ml, Blätterteig-Intervall in Sekunden, und puff Dauer in Sekunden auf. Jedes Präparat erzeugt eine 20 ml Probe.
- Label-Röhre (n) mit Datum, Uhrzeit abgeschlossen und Zigaretten Name und Nummer. Bewahren Sie die 500 ul Aliquots bei -80 ° C unmittelbar nach dem Rauchen beendet ist.
- Analysieren Sie Teilmengen von gefrorenem WS-CM, Um die Mengen an Nikotin, spezifischen Nitrosamine und polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe zu bestimmen, wie zuvor beschrieben 12.
2. Isolierung von PBMCs
- Sammeln Sie frisches Blut von gesunden Spendern (der nicht-Konsumenten von Tabakerzeugnissen sind) Isolieren PBMCs von frischem Blut, wie nachstehend unter einer separaten Genehmigung von der Wake Forest Baptist Health IRB 15 beschrieben.
- Vor der Ankunft des Blutbeutels, eine 500 ml Flasche, Schere, Isolationspuffer und Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) (RT) bereit, in einer Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) Zellkultur Kapuze. Isolation Puffer muss vor Licht geschützt werden.
- Halten Sie den Blutbeutel auf den Kopf und schneiden Sie das Rohr direkt unter, wo es eingespannt worden ist, bleibt mindestens 3 cm Schlauch.
- Entfernen Sie die Kappe von der 500 ml Flasche und halten Sie den Schlauch über der Flaschenöffnung. Nehmen Sie den Blutbeutel und invertieren, damit das Blut ungehindert aus dem Beutel in t fließener die Flasche, bis der Beutel leer ist. Lassen Sie das Blut auf die Innenwand der Flasche gegenüber gerade nach unten zu fließen, wie um zu vermeiden, Blasen.
- Gießen Sie Isolierungspuffer in die Flasche zu einem 1: 5-Verhältnis von Isolierungspuffer, um Blut. Verschließen Sie die Flasche fest und vorsichtig umdrehen es, end-over-end, 10-mal. Lassen Sie die Flasche in der Zellkultur Haube mit Beleuchtung inkubiert aus, für 1 h bei RT.
- Ein leichtes, strohgelbe Schicht wird über dem Blut aufzubauen. Entfernen Sie diese Schicht unter Verwendung einer 25 ml serologische Pipette in 50 ml konische Röhrchen. Der gesammelte Betrag kann variieren von 50 - 300 ml, je nach dem Gegenstand, die Blut gespendet.
- Zentrifugiere die Röhrchen bei 200 x g für 10 min bei RT.
- Saugen Sie das durchscheinende Überstand, so dass die dunkle Blutfarbenen Pellets. Das Pellet wird lose aber viskos sein.
- Pipette 3 ml Isolationspuffer in 15 ml konische Röhrchen.
- Zu dem Pellet, 20 ml DPBS für je 50 ml strohfarbene Flüssigkeit in s gesammelttep 2.1.5. Vortex, um gründlich zu mischen, und Konsolidierung des resuspendierten Flüssigkeit aus mehreren Rohren. Diese Flüssigkeit suspendiert Blutkörperchen enthält.
- Mit einer Transferpipette Transfer 5 ml der suspendierten Blutzellen auf 3 ml Isolationspuffer in Schritt 2.1.8. Kippen Sie die 15 ml konischen Röhrchen, die die Zellsuspension enthält langsam und sanft, zwei getrennte Schichten zu schaffen. Zentrifugiere die Röhrchen bei 400 × g für 40 min bei RT mit minimalen Beschleunigungs- und ohne Bremse.
- Verwenden einer Transferpipette, die entstehende trübe Mittelschicht (buffy coat) enthält PBMCs in ein 50 ml konisches Röhrchen zu entfernen. Vermeiden Zeichnung andere klare Schichten darunter. Bringen Sie nicht mehr als 25 ml in jede 50 ml konischen Röhrchen.
- 25 ml kaltem Puffer, um die Zellen zu waschen (oder mehr, die gesamte Restvolumen der 50 ml konischen Röhrchen zu füllen). Zentrifugiere die Zellen bei 400 g für 10 min bei 4 ° C.
- Das Pellet mit 10 ml Laufpuffer. Diese enthält PBMCs. Zählen Sie die Zellen, und verwenden Sie immittelbar oder auf Eis zum Einfrieren.
3. Einfrieren und Auftauen der PBMCs
- Zentrifugation der PBMCs, die in Schritt 2.1.13 für 10 min bei 400 x g gesammelt wurden.
- Füllen Sie den Gefrierbehälter mit Isopropylalkohol pro Anweisungen des Herstellers. ACHTUNG: Isopropylalkohol ist brennbar und akut toxisch.
- Das Pellet mit RPMI 1640-Medium (4 ° C), das 20% fötales Rinderserum (FBS) und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO). Dies ist RPMI 1640 Einfriermedium. Das Pellet mit einer Menge an Gefriermedium, das in einer Suspension mit ca. 5 x 10 7 Zellen / ml auf. Die Anzahl der Zellen zum Einfrieren kann abweichen.
- Dispense 1 ml Aliquots der Zellsuspension in 2 ml Kryoröhrchen und legen Sie die Kryoröhrchen im Gefrierbehälter. Stellen Sie das Gefrierbehälter mit Kryoröhrchen in einem Gefrierschrank bei -80 ° C bis O / N zu speichern und entfernen Sie die Kryoröhrchen und Transfer zum in einem GeschäftTiefkühlschranks zwischen -150 ° C bis -190 ° C.
- Entfernen der Kryoröhrchen aus kryogenen Lagerung und Auftauen rasch unter leichtem Rühren in einem Wasserbad bei 37 ° C.
- Die aufgetauten PBMCs in Kryoröhrchen sofortige Umsetzen in ein 15 ml konisches Röhrchen mit 10 ml RPMI 1640 Komplettmedium (4 ° C), das 10% FBS, 1% Pen / Strep und 1% L-Glutamin. Der Inhalt des aufgetauten Kryoröhrchen sollte so schnell wie möglich übertragen werden, um eine maximale Lebensfähigkeit der Zellen 15 zu erhalten.
- Zentrifugieren PBMCs bei 400 × g für 10 min.
- Das Pellet mit 5 ml RPMI 1640 Komplettmedium und zählen Sie die Zellen.
- Messen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen durch etablierte Verfahren wie Trypanblau-Ausschluss-Verfahren. Allgemein Zellviabilität bei dieser Methode ist zu 90 bis 95%. Die PBMCs können nun in Experimenten verwendet werden.
4. Cell Death Bestimmung
HINWEIS: Verdünnungen hier aufgeführten sind für die Zwecke dieses study. Die Verdünnungen können entsprechend geändert werden.
- Verdünne WS-CM oder Nikotin in einer 96-Well-Platte unter Verwendung von RPMI Komplettmedium auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung, wie unten angegeben.
- Verdünne WS-CM auf die folgenden Konzentrationen: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, und 5 ug / ml in gleichem Nikotin Einheiten (basierend auf der Nikotingehalt in WS-CM) 12.
- Verdünne Nikotin in RPMI-Medium mit den folgenden Konzentrationen: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 und 3000 ug / ml. ACHTUNG: Nikotin ist akut toxisch und umweltgefährdend.
- 100 l PBMCs in RPMI Komplettmedium zu jeder suspendiert und bei einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / Vertiefung. Das Gesamtvolumen der Zellen plus WS-CM oder Nikotin werden 200 ul / Vertiefung sein.
- Für die Zwecke dieser Studie bereiten zwei Sätze von Platten, wie oben. Decken Sie die Platten und Inkubation eine Platte für 24 Stunden und eine Platte für 3 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Passen Zeitpunkte wie nötig. Die Zellen werden bei Raumtemperatur durch Zentrifugation bei 300 × g für 3 min, Absaugen des Überstandes, Verwirbeln der Unterseite der Platte mit der Platte abgedeckt, und schließlich resuspendiert die Zellen mit 200 ul eiskaltem Laufpuffer, und ein weiteres Mal wiederholt den Waschschritt.
- Hinzufügen 95 ul Laufpuffer, gefolgt von 5 & mgr; l 7-Aminoactinomycin D (7AAD) in jede Vertiefung für ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung. Inkubieren der Platte in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für 15 min.
- 100 l Laufpuffer zum Cluster Rohre. Übertragen das gesamte Volumen der Zellsuspension aus jeder Vertiefung der Platte, um die Cluster-Röhrchen und erwerben die Proben am Durchflusszytometer.
- Bestimmen Sie den Prozentsatz der 7AAD-positiven Zellen mit Durchflusszytometrie-Analyse-Software.
5. EC 50 Bestimmung
- Die EC 50 -Werte von WS-CM und Nikotin werden von 7AAD-positive Färbung von PBMCs bestimmt.
- Der EC 50 Wert wird als konzentrierte definiertentration, bei der 50% der Zellen wurden in einem 24-Stunden-Test nicht mehr lebensfähig, und die Werte sind als & mgr; g equi-Nikotin-Einheiten / ml ausgedrückt.
- Für die Zwecke dieser Studie wurden die EC 50 -Werte bestimmt als 1,56 & mgr; g / ml und 1,650 & mgr; g / ml für WS-CM und Nikotin auf.
6. Zytokine
HINWEIS: hier aufgeführten Verdünnungen werden für die Zwecke dieser Studie. Die Verdünnungen können entsprechend angepasst werden.
- Verdünne WS-CM in einer 96-Well-Platte unter Verwendung von RPMI Komplettmedium auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung in einer Konzentration von 0,3, 1,56, 3 und 5 ug / ml in gleichem Nikotineinheiten.
- Verdünne Nikotin an den folgenden Konzentrationen: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 und 3000 ug / ml. ACHTUNG: Nikotin ist akut toxisch und umweltgefährdend.
- 100 l PBMCs in RPMI Komplettmedium zu jeder suspendiert und bei einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / Vertiefung.Das Gesamtvolumen der Zellen plus WS-CM oder Nikotin werden 200 ul / Vertiefung sein.
- Die Platte und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Die Zellen werden bei Raumtemperatur durch Zentrifugation bei 300 × g für 3 min, Absaugen des Überstandes, Verwirbeln der Unterseite der Platte mit der Platte bedeckt und schließlich Suspendieren der Zellen mit 200 ul eiskaltem Laufpuffer und Wiederholen der Waschschritt noch einmal.
- Fügen Sie 200 ul RPMI Komplettmedium, und ein weiteres Mal wiederholen Sie den Waschschritt.
- Nach Zugabe von 200 ul von 10 ug / ml LPS Medium zu jeder Vertiefung.
- Die Platte und Inkubation für 4 h, 24 h, 48 h oder 72 h bei 37 ° C und 5% CO 2. Einzustellen Inkubationszeiten wie nötig.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 × g für 3 min.
- Nehmen Sie 175 ul des Überstands aus jeder Vertiefung und an einem Gefrierschrank bei -80 ° C, um die Tests in den Schritten 7 und 8 durchzuführen.
7. Cytometric Bead Array Assay
<ol>8. IL-8-ELISA
- Tauen die Zellüberstände aus Schritt 6.10 und den Einsatz in der IL-8-ELISA. Führen der ELISA-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers.
9. intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie
HINWEIS: hier aufgeführten Verdünnungen werden für die Zwecke dieser Studie. Die Verdünnungen können entsprechend angepasst werden.
- Verdünne WS-CM in einer 96-Well-Platte unter Verwendung von RPMI Komplettmedium auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung in einer Konzentration von 0,3, 1,56, 3 und 5 ug / ml in gleichem Nikotineinheiten.
- In der gleichen Platte, verdünnten Nikotin den folgenden Konzentrationen: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 und 4000 ug / ml. ACHTUNG: Nikotin ist akut toxisch und umwelt hazardous.
- 100 l PBMCs in RPMI-Vollmedium suspendiert bei einer Konzentration von 1 × 10 6 Zellen / Vertiefung. Das Gesamtvolumen der Zellen plus WS-CM oder Nikotin werden 200 ul / Vertiefung sein.
- Die Platte und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Die Zellen werden bei Raumtemperatur durch Zentrifugation bei 300 × g für 3 min, Absaugen des Überstandes, Verwirbeln der Unterseite der Platte mit der Platte abgedeckt, und schließlich resuspendiert die Zellen mit 200 ul eiskaltem Laufpuffer, und ein weiteres Mal wiederholt den Waschschritt.
- Fügen Sie 200 ul RPMI Komplettmedium auf die Platte, und ein weiteres Mal wiederholen Sie den Waschschritt.
- Bereiten Sie die Arbeitskonzentrationen von 2 ul / ml GolgiPlug und 10 ug / ml LPS mit RPMI Komplettmedium und 200 ul in jede Vertiefung.
- Inkubieren der Platte für 6 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Am Ende von Schritt 9.8, Waschen der Zellen mit Laufpuffer (4 ° C) und Schleudern bei 300g für 3 min bei 4 ° C.
- 100 l Cytofix in jede Vertiefung und Inkubation für 20 min bei 4 ° C.
- Die Zellen werden 3 Mal wie in Schritt 9.9 mit 1x Permwash (4 ° C) bei 300 g für 3 min bei 4 ° C beschrieben.
- Hinzufügen 45 ul 1x Cytoperm zu jeder Vertiefung, gefolgt von 5 ul jeder einer der folgenden Antikörper zu jeder Vertiefung: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Inkubieren bei 4 ° C für 30 min.
- Waschen Sie die Zellen zweimal wie in Schritt 9.9 mit 1x Permwash (4 ° C) und einmal mit Laufpuffer (4 ° C) bei 300 g für 3 min bei 4 ° C beschrieben.
- Die Zellen werden mit 200 ul 2% igem Paraformaldehyd (4 ° C). Übertragen Sie die Zellen in 12 × 75 mm Rohre, und die Proben auf Flow Cytometer analysiert. ACHTUNG: Paraformaldehyd ist ätzend, akut giftig und gesundheitsschädlich.
10. K562 Töten Assay
HINWEIS: K562 Zellen sollten kultiviert werdenin der Kultur bei 37 ° C und 5% CO 2 mit RPMI Komplettmedium, bis sie bis zu 80% Konfluenz vor dem Assay.
- Bereiten Sie eine 5 mM Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE) Stammlösung durch Zugabe von 18 & mgr; l DMSO in das Fläschchen.
- Verdünne WS-CM oder Nikotin in einer 96-Well-Platte unter Verwendung von RPMI Komplettmedium auf ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung zu den gewünschten gleichwinklig Nikotineinheiten oder Nikotinkonzentrationen für jede Vertiefung zu erzielen. ACHTUNG: Nikotin ist akut toxisch und umweltgefährdend.
- 100 l PBMCs in RPMI Komplettmedium in einer Konzentration von 1,5 x 10 6 Zellen / Vertiefung. Das Gesamtvolumen der Zellen, die mit WS-CM oder Nikotin werden 200 ul / Vertiefung sein.
- Die Platte und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Waschen Sie die K562-Zellen durch Zugabe von 10 ml DPBS und Zentrifuge bei 400 × g für 8 Minuten bei RT.
- Die Zellen mit 10 ml DPBS und zählen Sie die K562-Zellen.
- Bereiten CFSE working Lösung durch Zugabe von 1 ul CFSE-Stammlösung zu 1 ml DPBS.
- 1 ml des CFSE-Arbeitslösung in 1 ml der K562-Zellsuspension, die 1 - 2 x 10 7 Zellen. Vortex und Inkubation genau 2 Minuten lang bei RT.
- Sofort im 200 ul FBS. Vortex und Inkubation genau 2 Minuten lang bei RT.
- 10 ml RPMI Komplettmedium und Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 g für 8 Minuten bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Überstand RPMI und brechen die Pellets und die Zellen werden mit 10 ml RPMI Komplettmedium und zählen Sie die CFSE-markierte K562-Zellen.
- Durch Zentrifugieren der Platte bei 300 × g für 3 min bei RT Waschen der PBMCs. Saugen Sie den Überstand durch Dekantieren der Flüssigkeit. Setzen Sie den Deckel und mischen Sie den Boden der Platte. Fügen Sie 200 ul RPMI Komplettmedium und ein weiteres Mal wiederholen Waschschritt.
- Hinzufügen CFSE-markierte K562-Zellen in einem Verhältnis von 1:15 (100.000 K562s: 1.5 x 10 6 PBMCs) in jede Probenvertiefung der PBMC Platte und weiteren incubate 5 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Durch Zentrifugation bei 300 × g für 3 min bei RT Waschen der Zellmischung. Saugen Sie den Überstand durch die Flüssigkeit verworfen. Setzen Sie den Deckel und mischen Sie den Boden der Platte.
- Fügen Sie 200 ul des Laufpuffers und wiederholen Sie die in Schritt 10,14 noch einmal beschrieben Waschschritt.
- Hinzufügen 95 ul Laufpuffer, gefolgt von 5 ul 7AAD zu jeder Vertiefung für ein Gesamtvolumen von 100 ul / Vertiefung. Inkubieren der Platte in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für 15 min.
- Füge 100 ul Laufpuffer in jede Vertiefung und übertragen das gesamte Volumen der Zellsuspension aus jeder Vertiefung der Platte, um die Cluster-Röhrchen und Zytometer erwerben die Proben auf Fluss.
- Bestimmen Sie den Prozentsatz der 7AAD-positive und CFSE-positiven Zellen mit Durchflusszytometrie-Analyse-Software.
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Representative Results
Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (vier Spenderproben) dargestellt. Des Studenten-t-Tests zwischen den behandelten und unbehandelten Kontrollproben wurde unter Verwendung von Excel-Software sowie die T-Testvergleiche für alle Behandlungen mit ihren entsprechenden Kontrollen. Die statistische Signifikanz wurde angegeben: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005.
Um den Effekt der Einwirkung von WS-CM und Nikotin zu messen, wurden PBMCs mit verschiedenen Konzentrationen von WS-CM und Nikotin für 3 h oder 24 h behandelt. Zelltod wurde durch die robuste und zuverlässige 7AAD Färbemethode als 7AAD interkaliert in doppelsträngige Nukleinsäuren gemessen und kann Zellmembranen zu sterben oder toten Zellen 16 durchdringen. Eine dosisabhängige Steigerung der Zelltod mit WS-cm bei 24 h beobachtet, mit einer der Nähe von 80% Zelltod bei 4 ug / ml in gleichem Nikotineinheiten (1A) erkannt. Ein vergleichbares Maß an Zelltod warmerkt nur bei 3,000 ug / ml Nikotin (1B). Da wir ausgesetzt PBMCs für 3 h mit WS-CM und Nikotin auf ihre Wirkung Cytokininduktion und die Fähigkeit, Zielzellen zu töten, zu bewerten, war es notwendig zu bestimmen, ob WS-CM verursacht signifikante Zytotoxizität folgenden 3 Stunden Behandlung. PBMCs mit 5 ug / ml von Equi-Nikotin-Einheiten von WS-CM behandelt keine signifikante Toxizität auftreten (<5%; 1A). Behandlung mit Nikotin während 3 Stunden verursachte messbar (8%) Zelltod nur bei 2000 ug / ml (Abbildung 1B). Somit Einwirkung WS-CM oder Nikotin in den angegebenen Dosen und Behandlungszeiten verursachte keine signifikante Cytotoxizität unter den Versuchsbedingungen.
Die immunmodulatorische Effekte zu messen, wurden PBMCs mit LPS für verschiedene Zeiträume stimuliert und die sezernierten Zytokine wurden durch das CBA-Assay gemessen. Um die LPS-Stimulation zu optimieren, ausgesetzt wir PBMCs zu LPS-Stimulation während 4 Stunden, 24 h, 48 h und 72 h und sekretierten Zytokine gemessen. B. LPS-Stimulierung für 24 h ergab maximale Sekretion der Zytokine IL-6 und IL-8 (Figur 2) und über längere Zeiträume hinweg nicht weiter erhöht (IL-6) oder abnimmt (IL-8) in Cytokin führen Sekretion. Ähnliche Ergebnisse wurden mit anderen sekretierten Zytokinen wie IL-10, IL-1β und TNF-α erhalten (Daten nicht gezeigt).
Die Pilotzeitverlaufsmessungen legen die maximale Produktion von Zytokinen in Antwort auf TLR-4-Stimulation durch LPS von 24 Stunden auftritt, und daher wurden Zytokine bei 24 Stunden in allen nachfolgenden Experimenten gemessen. Behandlung mit WS-CM und Nikotin, gefolgt durch die Stimulation von TLR-4-Rezeptor mit LPS führte zu einer dosisabhängigen Abnahme sezernierter Zytokine (Abbildung 3). Die Behandlung mit WS-CM führte zu tiefgreifenden Rückgänge von IFN-γ (3A), TNF (3B), IL-10 (3C </ Strong>) und IL-6 (Figur 3D) bei niedrigen equi-Nikotin-Einheiten (1,56 ug / ml). Unterdrückung von Zytokinen zeigte sich auch mit Nikotin. Jedoch ist die Unterdrückung von Zytokinen mit Nikotin trat bei deutlich höheren Dosen, und der Grad der Unterdrückung unter einzelnen Cytokine variiert. Beispielsweise erschien IFN-γ signifikant mit Nikotin bei 50 ug / ml unterdrückt werden, wohingegen IL-6 wurde bei der höchsten Konzentration (4 mg / ml) getestet (Figurie 3D) unterdrückt. Als nächstes maßen wir IL-8 Niveaus in denselben Proben unter Verwendung eines ELISA-Assays. IL-8-Sekretion wurde effektiv in WS-CM-exponierten PBMCs unterdrückt; während suppressiven Wirkungen von Nikotin waren bei 2 mg / ml (Figur 4) signifikant.
Die Niveaus der intrazellulären Zytokine wurden in WS-CM- und Nikotin behandelten Zellen bei Stimulation mit LPS quantifiziert. Bisher haben wir angeregt PBMCs für 3 Tage und das hinzugefügt Golgiplug während der letzten 6 Stunden Inkubation gemessenintrazelluläre Zytokine 14. Wir haben jetzt deutlich reduziert die Inkubationszeit durch Kombinieren der Stimulation mit LPS und Golgi Stecker insgesamt 6 h und gemessen intrazellulärem Cytokin-positiven Zellen (Figur 5), Fig. 5 zeigt eine dosisabhängige-prozentige Reduzierung der IFN-γ-positive Zellen ( 5A), TNF-α-positiven Zellen (5B) sowohl Nikotin- und WS-CM- ausgesetzt PBMCs, während eine Dosis-abhängige prozentige Reduktion MIP-1α-positiven Zellen (5C) in WS-CM beobachtet -exposed PBMCs. In diesem Test beobachtet man eine Abnahme der Anzahl der intrazellulären Cytokin-positiven Zellen nach Exposition mit WS-CM bei niedrigeren equi-Nikotin-Einheiten (1,56 ug / ml). Sowohl sekretierte Zytokine und intrazelluläre Cytokin-Assays zeigten ähnliche Ergebnisse hinsichtlich der IFN-γ Niveaus oder IFN-γ-positiven Zellen.
Als funktionelle Maßnahme der Fähigkeit WS-CM- und Nikotin-behandelten PBMCs zur Ziel K562-Zellen zu töten, wurde bestimmt. 6A zeigt repräsentative durchflusszytometrischen Rohdaten 7AAD-positive Färbung von Ziel (CFSE-markierten K562) Zellabtötung durch Steuer, WS-CM-exponierten und Nikotin behandelten PBMCs. Die Zahlen in der Box darstellen Prozent 7AAD-positive CFSE-markierte K562-Zellen. Einwirkung von 1,56 ug / ml WS-CM signifikant die Tötungsfähigkeit der Effektorzellen PBMCs in im Vergleich zur Kontrolle und den niedrigeren Dosen. Nikotinbehandlung bei niedrigen und hohen Dosen nicht mit dem Zellabtötung stören. 6B zeigt eine dosisabhängige Abnahme in Prozent K562 zelltötende von mehreren Spendern in einem einzigen Experiment.
Abbildung 1. Der Zelltod von PBMCs nach Belichtung mit steigende Konzentrationen von gleichwinklig Nikotineinheiten WS-CM (ug / ml) und Nikotin (ug / ml). (A) und mit Nikotin für 3 Stunden und 24 Stunden (B) behandelt. Zelltod wurde durch 7AAD Färbung gemessen. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± SD-Fehlerbalken von vier Spendern aus einem repräsentativen Experiment. Die statistische Signifikanz wird angezeigt durch: * p <0,05; ** P <0,005, *** p <0,0005.
Abbildung 2. Die Sekretion von IL-6 und IL-8 von PBMCs mit LPS stimuliert zu verschiedenen Zeitpunkten. PBMCs wurden mit LPS 4 h, 24 h, 48 h und 72 h stimuliert. Konzentrationen von IL-6 und IL-8-Zytokine in den Zellkulturüberständen unter Verwendung wurden bestimmt Menschliche inflammatorische Zytokin Kit (CBA kit) und Durchflusszytometrie. Diese Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD-Fehlerbalken von einer der zwei unabhängigen Experimenten unter Verwendung von PBMCs von drei verschiedenen Spendern. Die statistische significance wird angezeigt durch: * p <0,05; ** P <0,005.
Abbildung 3 Reduktion des Cytokin-Sekretion von PBMCs mit steigenden Konzentrationen von gleichwinklig Nikotineinheiten WS-CM (ug / ml) und Nikotin (ug / ml) nach der LPS-Stimulation behandelt. PBMCs wurden verschiedenen Konzentrationen von WS-CM und Nikotin ausgesetzt 3 Stunden und mit LPS für 24 Stunden stimuliert. Niveaus von IFN-γ (A) wurden TNF (B), IL-10 (C), und IL-6 (D) Cytokine in den Zellkulturüberständen unter Verwendung eines Th1 / Th2 CBA Assay und Durchflusszytometrie bestimmt. Diese Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD-Fehlerbalken von einer der drei unabhängigen Experimenten unter Verwendung von PBMCs von vier verschiedenen Spendern. Die statistische Signifikanz wird angezeigt durch: * p <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Höhere con zent von WS-CM waren ebenfalls statistisch signifikant mit *** p <0,0005.
Abbildung 4. Dämpfung von IL-8-Sekretion durch PBMCs mit steigenden Konzentrationen von gleichwinklig Nikotineinheiten WS-CM (ug / ml) und Nikotin (ug / ml) nach der LPS-Stimulation behandelt. PBMCs wurden WS-CM und Nikotin ausgesetzt, Stimulation mit LPS 24 h lang, und sezernierten IL-8 durch ELISA gemessen. Diese Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD-Fehlerbalken von einer der drei unabhängigen Experimenten unter Verwendung von PBMCs von vier verschiedenen Spendern. Die statistische Signifikanz wird angezeigt durch: * p <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Höhere Konzentrationen von WS-CM waren ebenfalls statistisch signifikant mit *** p <0,0005.
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Abbildung 5. Reduktion von intrazellulärem Cytokin-positiven Zellen in PBMCs mit steigenden Konzentrationen von gleichwinklig Nikotineinheiten WS-CM (ug / ml) und Nikotin (ug / ml) behandelt. PBMCs wurden verschiedenen Konzentrationen von WS-CM und Nikotin ausgesetzt 3 Stunden und mit LPS und Golgiplug stimuliert 6 Stunden. Die Fahrzeugsteuerung für WS-CM und Nikotin war RPMI Komplettmedium. Intrazelluläre IFN-γ-positive (A), TNF-α-positiv (B), und MIP-1α-positive (C) Zellen wurden durch Durchflusscytometrie quantifiziert. Diese Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD-Fehlerbalken von einem der vier unabhängigen Experimenten unter Verwendung von PBMCs von vier verschiedenen Spendern. Die statistische Signifikanz wird angezeigt durch: * p <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Höhere Konzentrationen von WS-CM waren ebenfalls statistisch signifikant mit *** p <0,0005.
Abbildung 6. Reduktion von PBMCs Ziel Töten Fähigkeit unter Einwirkung steigenden Konzentrationen von gleichwinklig Nikotineinheiten WS-CM (ug / ml) und Nikotin (ug / ml). PBMCs wurden mit den angegebenen Konzentrationen von WS-CM und Nikotin während 3 behandelten h und CFSE-markierten K562-Zellen wurden dann als Target-Zellen zugegeben und für weitere 5 h inkubiert. Die Zellen wurden mit 7AAD gebeizt und Strömungs wurde Zytometrie zur Tötung Fähigkeit zu messen. 6A zeigt den Vertreter Durchflusszytometrie Ergebnisse mit in den geschlossenen Kästen dargestellt Prozent Töten. Der Pfeil zeigt die reduzierte Prozent Tötung in 1,56 g / ml ausgesetzt WS-CM. 6B zeigt repräsentative Mittelwert ± Standardabweichung Fehlerbalken aus vier unabhängigen Experimenten unter Verwendung von PBMCs aus vier verschiedenen Spendern. Die statistische Signifikanz wird angezeigt durch: ** p <0,005; *** P <0,0005. Höhere Konzentrationen von WS-CM waren ebenfalls statistisch signifikant Witzh *** p <0,0005.
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Discussion
Wir und andere haben vorher gezeigt, dass die Behandlung der PBMCs mit TPPs drückt mehreren Antworten, von denen die Expression und Sekretion von Zytokinen und funktionellen Maßnahmen wie Ziel zelltötende 14. Die in der bisherigen Arbeit beschriebenen experimentellen Methoden erfordern längere Inkubationszeiten und waren bescheiden in der Größe 14. Angesichts der potentiellen Anwendungen dieser attraktiven ex vivo Modell für Grundlagen- und angewandten Forschung haben wir untersucht, ob einer der Testparameter in dieser mehrstufigen biologischen Assays könnte optimiert werden. Hier präsentieren wir vereinfachte Methoden, um TLR-vermittelten Immunantworten mit einem TPP-ex vivo behandelt PBMC Modell zu messen.
Isolation von lebensfähigen PBMCs ist eine wesentliche Voraussetzung für diese ex-vivo-Tests. Angesichts der individuellen Variabilität und physiologischer Zustand in potenziellen Spendern, ist es ideal, PBMCs, die ansprechen, zu erhalten. Für die Zwecke dieser Studie isolieren wird PBMCs von gesunden Erwachsenen in der Regel mit Hilfe eines zuvor veröffentlichten Verfahren 15. Ferner wird in dieser Studie der Variabilität zwischen den Gebern zu minimieren, schlossen wir die mit Allergien, Infektionen oder die nahmen keine Rezepte oder over the counter Medikamente wie Aspirin. Außerdem ist die Isolierung von PBMC aus frisch gesammeltem Blut wünschenswert, da sie eine optimale Lebensfähigkeit und Funktionsfähigkeit der Zellen in den nachfolgenden Experimenten wird sichergestellt.
Vorherige genutzt Stimulation mit TLR-Agonisten für 67-72 h Methoden zur intrazellulären Zytokine und Zytokine 14 zu messen. Ein Zeitverlauf der Zytokinsekretion in TLR-stimulierten Zellen (unter Kontrollbedingungen ohne WS-CM oder Nikotin) schlug vor, dass die maximale Sekretion trat bei 24 Stunden. Weiterhin kombinierten wir die Inkubation mit TLR-Agonisten und Golgiplug und reduziert die Zeit der Inkubation insgesamt 6 h zur Messung intrazellulärer Zytokine. Während dies benötigt einen separaten Assay zu messenCytokin-positiven Zellen sind die Daten robuster gegenüber dem bisherigen Verfahren 14. Im Einklang mit den bisherigen Ergebnissen, WS-CM stark unterdrückt die Induktion von intrazellulären und Zytokine. So führten diese Änderungen an Assayzeiten erheblich reduziert und ergab sehr ähnliche Ergebnisse wie in der Literatur beschrieben. Zwar haben wir die Durchflußzytometrie und ELISA-Verfahren verwendet wird, um Cytokin-Niveaus zu beurteilen, können andere Techniken, wie Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) auch mehr als eine Ergänzung verwendet werden.
Historisch Zielzellenabtötung durch genutzt radiomarkiertem Methoden (zB 51 Cr-Freisetzungstest) Effektorzellen PBMCs. Die in diesem Bericht beschriebenen Verfahren eliminiert die Verwendung von Radioaktivität und beschäftigt Laden Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff, dessen Anwesenheit könnte durch Flusszytometrie überwacht werden. Ein weiterer Vorteil der hier beschriebene Verfahren ist, dass es relativ schnell und kann adapte seind, um Hochdurchsatz-Assays. Da die Inkubationszeit von Ziel- und Effektorzellen 5 h, kann dieser Assay in 8 Stunden abgeschlossen werden. Das was im Gegensatz zu anderen veröffentlichten Verfahren, die einbezogen sind, wie sie Isolierung von Subtypen von PBMCs und Aktivierung / Stimulierung über einen Zeitraum von mehreren Tagen erforderlich, oder die Analyse von NK-Zellen und K562 Zellkonjugate Zytotoxizität 17,18 überwachen. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Verfahren ist, dass es verwendet kryokonservierten PBMCs direkt als Effektor-Zellen, die eine größere Flexibilität bietet.
Zusammenfassend haben wir beschrieben, mehrere Tests, um die Wirkung von TLR-vermittelte Immunantwort in brennbaren TPP behandelten PBMCs, die leicht zum Testen verschiedener Verbindungen angewendet werden kann bestimmen. Die Verwendung von kryokonservierten Komponenten ermöglicht eine erhebliche Flexibilität und mit etablierten Verfahren, wie Durchflußzytometrie, CBA-Assays und ELISAs, robuste und konsistente Ergebnisse können schnell in verschiedenen Labors erhalten werdenOratorien.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wird von RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) im Rahmen eines Sonderforschungsvereinbarung mit der Wake Forest University School of Medicine finanziert. GL Prasad ist ein Vollzeit-Mitarbeiter von RJRT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 ml microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96-well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96-well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em 785. |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, irritant, corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
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