Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

طرائق لتقييم السمسة والمناعة من احتراق التبغ الاستعدادات المنتج

Published: January 10, 2015 doi: 10.3791/52351

Abstract

ومن بين التغييرات الفيزيولوجية المرضية الأخرى، والتعرض المزمن لدخان السجائر يسبب التهاب وقمع المناعي، والتي تم ربطها إلى زيادة التعرض للمدخنين للعدوى الميكروبية وحدوث الأورام. خارج الحي قمع الردود بوساطة مستقبلات المناعة في خلايا الدم وحيدات النوى الطرفية البشرية (PBMCs) تعامل مع مكونات الدخان هو نهج جذابة لدراسة آليات وتقييم الآثار المحتملة على المدى الطويل من التعرض لمنتجات التبغ. هنا، نحن الأمثل طرق لأداء خارج الحي المقايسات باستخدام PBMCs تحفزها lipopolysaccharide في البكتيري، وتول مثل مستقبلات 4 يجند. آثار كله المتوسطة مكيفة الدخان (WS-CM)، وقد تم التحقيق لإعداد منتجات التبغ قابل للاحتراق (TPP)، والنيكوتين على إفراز خلوى وقتل الخلية المستهدفة من قبل PBMCs في المقايسات فيفو السابقين. وتبين لنا أن السيتوكينات يفرز IFN-γ، TNF، IL-10، IL-6، وIL-8 والسيتوكينات داخل الخلايا IFN-قمعت 47 ؛، TNF-α، وMIP-1α في PBMCs WS-CM يتعرض. تم تخفيض وظيفة لحل الخلايا من PBMCs المستجيب، على النحو الذي يحدده مقايسة قتل الخلية المستهدفة K562 أيضا عن التعرض لWS-CM. كان النيكوتين الحد الأدنى من الفعالية في هذه المقايسات. وباختصار، فإننا نقدم مجموعة من تحسين فحوصات لتقييم آثار TPPs في المقايسات فيفو السابقين، وهذه الطرق يمكن تكييفه بسهولة لاختبار المنتجات الأخرى ذات الاهتمام.

Introduction

مجموعة كبيرة من نقاط المعرفة إلى الآثار الصحية السلبية للتدخين السجائر المزمنة، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية، ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) وسرطان 1،2. وقد عرفت تدخين السجائر المزمنة أن تسبب الالتهاب وقمع المناعي، ويتم الإبلاغ عن هذه التعديلات للمساهمة في زيادة خطر العدوى الميكروبية والسرطان لدى المدخنين 3. في المختبر وتقنيات فيفو السابقين مفيدة في توضيح الأساس الجزيئي للآثار المرضية في جسم المريض ل يتم الاعتراف دخان السجائر 4-9 (الجدول 1)، وكأدوات هامة لتوجيه التنظيم الناشئة من منتجات التبغ المختلفة 10،11.

على سبيل المثال، لقد أثبتنا أن الاستعدادات القابلة للاحتراق منتجات التبغ (TPPs) مثل كله المتوسطة مكيفة الدخان (WS-CM) ومجموع الجسيمات (TPM) هي أكثر بكثير السامة للخلايا والضارة لDNA من TPPs غير قابلة للاحتراق أو النيكوتين 12،13. وتمشيا مع الأعمال المنشورة، أفيد مؤخرا أن TPPs قابل للاحتراق أو النيكوتين 12،13. وتمشيا مع الأعمال المنشورة، ونحن ذكرت مؤخرا ان TPPs احتراق تسبب المناعة ملحوظ. ومما يدل على ذلك عن طريق قمع النابعة مثل مستقبلات (TLR) -ligands، حفز إفراز السيتوكينات، واستهدفت خلية (K562) قتل من قبل PBMCs في نموذج خارج الحي 14. ونظرا لأهمية التهاب في السجائر عمليات المرض التي يسببها الدخان، ويرد مزيد من التحسين من الظروف فحص لتقييم الآثار تغييري المناعية للدخان السجائر في هذا التقرير.

وخارج الحي فحوصات قياس عادة داخل الخلايا ويفرز السيتوكينات فضلا عن وظيفة لحل الخلايا السامة للخلايا T والخلايا القاتلة الطبيعية في الخلية K562 مما أسفر عن مقتل 14 المقايسات. المقايسات تضمنت ما قبل الحضانة مع WS-CM والنيكوتين والتحفيز لاحق من PBMCالصورة مع TLR منبهات على مدى 3 أيام؛ يتم تنفيذ قراءات النهائية باستخدام فحوصات انزيم مرتبط المناعي (ELISAs) و / أو التدفق الخلوي. نحن تستخدم lipopolysaccharide في البكتيري (LPS)، والتي تربط لمستقبلات TLR-4 ويحفز PBMCs مما أدى إلى إنتاج السيتوكينات داخل الخلايا وإفراز السيتوكينات. بالإضافة إلى تعظيم الاستفادة من مختلف خطوات الفحص لتقييم الآثار المناعية للTPPs، ونحن أيضا الأساليب الحالية لعزل PBMCs، المقايسات موت الخلايا، وIL-8 الكمي. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لمعالجة المسائل البحثية الأخرى ومزيد من الصقل لتقييم منتجات التبغ في سياق تنظيمي.

الجدول 1. نشرت تقارير في المختبر، وبحكم فيفو طرق تستخدم لدراسة varilus الآثار المرضية في جسم المريض من الاستعدادات منتجات التبغ CS، ودخان السجائر المتوسطة؛ CSC، دخان السجائر المكثفات. CSE، والسجائر استخراج الدخان. ELISA، انزيم مرتبط المناعي فحص. GADPH، غليسيرألدهيد نازعة 3-الفوسفات. QPCR، الكمي تفاعل البلمرة المتسلسل. RT، في الوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل الكمي التفاعل؛ TS، دخان التبغ.

المؤلف (سنة الدراسة) LAAN وآخرون (2004) مودي وآخرون (2004) أولتمان وآخرون (2005) Vayssier (1998) Witherden وآخرون (2004) Birrell وآخرون (2008)
الخلايا المستخدمة خلايا البطانة الشعب الهوائية الإنسان (BEAS-2B)، العدلات الإنسان الخلايا الظهارية السنخية الإنسان (A549) الهوائية السلس خلايا العضلات الإنسان (HASMC) خلايا U937 premonocytic الإنسان، وحيدات الإنسان نوع السنخية II الخلايا الظهارية (ATII) وحيدي البشريخط الخلية (THP-1)، الضامة رئة الإنسان
TPP المستخدمة CSE CSC CSE TS CSE CS
الطريقة المستخدمة ELISA، QPCR، والهجرة، والتحول electromobility Immunohisto الكيمياء، الكهربي، مجموعة Arrayscan، RT-PCR، ELISA ELISA، RT-PCR، QPCR، الكهربي تحول جل التنقل المجهر الضوئي، المجهر الإلكتروني، الكهربي، ELISA QPCR، ELISA، طقم-toxate E (سيغما)، لوحة P65 فحص (TransAM)، الكهربي، ومختلف مجموعات المناعية
قياس IL-8، GM-CF، AP-1، NF كيلوبايت، والهجرة acetyltransferases هيستون، deacetylases هيستون، NF كيلوبايت، IL-8، بي كيلوبايت-α، GADPH HO-1، GADPH، RANTES، IL-8، eotaxin حرارة بروتينات الصدمة / الإجهاد (HSP / HSP70)، HF عامل النسخ، NF كيلوبايت،TNF-α بروتين بالسطح (SP-A، SP-C)، IL-8، MCP-1، GRO-α، TNF-α، IL-1β، IFN-γ IL-8، IL-1β، IL-6، TNF-α، MIP1-α، GRO-α، MAPK / JNK / ERK الفسفرة، cJUN: الحمض النووي ملزمة، الجلوتاثيون، P65: الحمض النووي ملزمة
النتيجة النهائية CSE أسفل ينظم إنتاج السيتوكينات عبر قمع AP-1 التنشيط. H 2 O 2 و CSC تعزيز أستلة من البروتينات هيستون، وانخفاض النشاط deacetylase هيستون، تفاضلي تنظيم الإفراج proinflammatory سايتوكاين. قد يسبب دخان السجائر إطلاق سراح IL-8 من HASMC، تتعزز TNF-α، و 20٪ CSE أقل IL-8 الإفراج عنهم، تثبيط eotaxin وRANTES بدخان السجائر. TS تنشيط عامل HF النسخ، والذي كان مرتبطا مع HSP70 overexpression وتثبيط NFkB النشاط وإطلاق TNF-α ملزمة. انخفاض ATII مستويات chemokine المستمدة من خلية وسطا alveoإصلاح لار، والمساهمة في السجائر التي يسببها الدخان ضرر السنخية وانتفاخ الرئة. توفر البيانات تفسير الآلية لماذا زادت المدخنين التهابات الجهاز التنفسي. ويرافق قمع الاستجابة الفطرية زيادة في IL-8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على موافقة خطية مطلعة أن تفعل هذه الدراسة في وحدة الأبحاث السريرية المحلية في ظل موافقة IRB، في الممارسات السريرية الجيدة: ملاحظة. تجهيز الدم، يتم تنفيذ عزل PBMCs وغيرها من تجارب زراعة الخلايا تحت ظروف معقمة، وذلك باستخدام إمدادات معقمة الميكروبيولوجية والكواشف.

1. WS-CM إعداد

  1. توليد WS-CM كما هو موضح سابقا (12).
    1. إعداد WS-CM عن طريق تمرير الدخان من أربعة 3R4F السجائر المرجعية من خلال معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 وسيط وبدون الفينول الأحمر باستخدام نظام التدخين التالية: 35-60-2، وحجم نفخة في مل، فاصل نفخة في ثانية، ومدة نفخة في ثانية، على التوالي. كل إعداد يولد عينة 20 مل.
  2. أنبوب تسمية (s) مع التاريخ والوقت الانتهاء، واسم السجائر والعدد. تخزين 500 مكل في -80 درجة مئوية فورا بعد اكتمال التدخين.
  3. تحليل aliquots من WS المجمدة-CM لتحديد مستويات النيكوتين، النتروزامين الخاصة بالتبغ، والهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات كما هو موضح سابقا (12).

2. عزل PBMCs

  1. جمع دماء جديدة من المتبرعين الأصحاء (الذين هم غير المستهلكين لمنتجات التبغ) عزل PBMCs من الدم الطازج كما هو موضح أدناه بموجب موافقة منفصلة عن ويك فورست المعمدانية الصحة IRB 15.
    1. وقبل وصول كيس الدم، ولها زجاجة 500 مل، مقص، وعازلة العزلة، والفوسفات المالحة Dulbecco ومخزنة (DPBS) (RT) جاهزا في مستوى السلامة الحيوية 2 (BSL-2) ثقافة الخلية غطاء محرك السيارة. يجب حماية عازلة بمعزل عن الضوء.
    2. عقد كيس الدم رأسا على عقب وقطع أنبوب أسفل حيث تم فرضت عليه ترك 3 سم على الأقل من الأنابيب.
    3. إزالة الغطاء من زجاجة مل 500 و عقد الأنبوب فوق فتح زجاجة. التقاط كيس الدم وعكس ذلك للسماح بتدفق الدم بحرية من الكيس إلى روقال انه حتى زجاجة حقيبة فارغة. السماح بتدفق الدم على الجدار الداخلي للزجاجة مقابل رأسا إلى أسفل لتجنب خلق فقاعات.
    4. صب عازلة العزلة في زجاجة في نسبة 1: 5 من العازلة العزلة إلى الدم. سقف الزجاجة بإحكام وعكس ذلك بلطف، نهاية الإفراط في نهاية المطاف، 10 مرات. ترك الزجاجة في الخلية هود الثقافة لاحتضان مع الأنوار، لمدة 1 ساعة على RT.
    5. سوف A، طبقة بلون القش الخفيفة تتراكم فوق الدم. إزالة هذه الطبقة باستخدام 25 مل ماصة المصلية إلى 50 مل أنابيب مخروطية. قد تختلف كمية جمعت 50-300 مل، اعتمادا على هذا الموضوع الذي تبرع الدم.
    6. أنابيب الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    7. نضح طاف شفافة، وترك بيليه الدم داكن اللون. سوف بيليه تكون فضفاضة ولكن لزج.
    8. ماصة 3 مل من العازلة العزلة إلى 15 مل أنابيب مخروطية.
    9. إلى Resuspend بيليه، إضافة 20 مل من DPBS لكل 50 مل من القش الملون السائل التي تم جمعها في الصورةتيب 2.1.5. دوامة لمزيج دقيق، وتوطيد السائل معلق من أنابيب متعددة. هذا السائل يحتوي على تعليق خلايا الدم.
    10. مع الماصة نقل، ونقل 5 مل من خلايا الدم مع وقف التنفيذ على 3 مل من العازلة العزلة في الخطوة 2.1.8. إمالة 15 مل المخروطية الأنبوب الذي يحتوي على تعليق خلية ببطء وبرفق لخلق طبقتين منفصلتين. أنابيب الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 40 دقيقة في RT مع الحد الأدنى من تسارع وبدون الفرامل.
    11. استخدام الماصة نقل لإزالة الناتجة الطبقة الوسطى غائم جزئيا (معطف الشهباء) التي تحتوي على PBMCs إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تجنب وضع طبقات أخرى واضحة تحتها. نقل ما لا يزيد عن 25 مل إلى 50 مل كل أنبوب مخروطي الشكل.
    12. إضافة 25 مل من العازلة جارية باردة (أو أكثر لملء وحدة التخزين بالكامل المتبقية من 50 مل أنبوب مخروطي) لغسل الخلايا. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    13. resuspend الكرية مع 10 مل تشغيل العازلة. هذا يحتوي على PBMCs. عدد الخلايا واستخدام الدردشةبتوسط أو مكان على الجليد لتجميد.

3. تجميد والذوبان في PBMCs

  1. أجهزة الطرد المركزي في PBMCs التي تم جمعها في الخطوة 2.1.13 لمدة 10 دقيقة في 400 ز س.
  2. ملء حاوية تجميد مع ايزوبروبيل فقا لتعليمات الشركة الصانعة. تنبيه: الإيزوبروبيل غير قابلة للاشتعال وذات سمية حادة.
  3. resuspend الكرية مع المتوسط ​​1640 RPMI (4 ° C) تحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). هذا هو RPMI 1640 تجميد المتوسطة. resuspend الكرية مع مبلغ تجميد المتوسطة التي من شأنها أن تؤدي إلى تعليق جود حوالي 5 × 10 7 خلية / مل. فإن عدد الخلايا المتاحة لتجميد تختلف.
  4. الاستغناء 1 مل aliquots من تعليق خلية في 2 مل cryotubes ووضع cryotubes في حاوية التجمد. وضع الحاوية تجميد مع cryotubes في الثلاجة عند -80 درجة مئوية لتخزين O / N ثم قم بإزالة cryotubes ونقل لتخزين فيالفريزر المبردة بين -150 درجة مئوية إلى -190 درجة مئوية.
  5. إزالة cryotube من التخزين المبردة وذوبان الجليد بشكل سريع مع الإثارة لطيف في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
  6. نقل على الفور PBMCs إذابة في cryotube إلى 15 مل أنبوب مخروطي مع 10 مل المتوسط ​​1640 RPMI الكامل (4 ° C) تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ القلم / بكتيريا و 1٪ L-الجلوتامين. يجب نقل محتويات cryotube إذابة في أقرب وقت ممكن للحصول على خلية القصوى الجدوى 15.
  7. الطرد المركزي PBMCs في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
  8. resuspend الكرية مع 5 مل المتوسط ​​1640 RPMI كاملة وعدد الخلايا.
  9. قياس بقاء الخلية التي أنشئت طرق مثل طريقة التريبان الأزرق الاستبعاد. عموما بقاء الخلية مع هذا الأسلوب هو حوالي 90 - 95٪. وPBMCs هي الآن جاهزة للاستخدام في التجارب.

4. خلية تحديد الموت

ملاحظة: التخفيفات المذكورة هنا هي لأغراض هذه ستودى. التخفيفات يمكن تغيير وفقا لذلك.

  1. تمييع WS-CM أو النيكوتين في لوحة 96-جيدا باستخدام RPMI المتوسطة كاملة إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكرولتر / جيد، كما هو مبين أدناه.
  2. تمييع WS-CM إلى التركيزات التالية: 0.1، 0.5، 1، 1.5، 2، 2.5، 3، 4، و 5 ميكروغرام / مل من وحدات متساوية النيكوتين (على أساس محتوى النيكوتين في WS-CM) 12.
  3. تمييع النيكوتين في RPMI متوسطة إلى التركيزات التالية: 100، 200، 500، 750، 1000، 2000 و 3000 ميكروغرام / مل. تنبيه: النيكوتين هو ذات سمية حادة وخطرة على البيئة.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من PBMCs معلقة في RPMI المتوسطة كاملة إلى كل بئر بتركيز 1 × 10 6 خلايا / جيد. فإن الحجم الكلي للخلايا بالإضافة إلى WS-CM أو النيكوتين يكون 200 ميكرولتر / جيد.
  5. لغرض هذه الدراسة، وإعداد مجموعتين من لوحات على النحو الوارد أعلاه. تغطية لوحات واحتضان لوحة واحدة لمدة 24 ساعة وصفيحة واحدة لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. ضبط نقاط زمنية حسب الضرورة. غسل الخلايا في RT بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق، الشفط طاف، vortexing لأسفل اللوحة مع لوحة مغطاة، وأخيرا إعادة التعليق الخلايا مع 200 ميكرولتر من الجليد الباردة عازلة على التوالي، وكرر الخطوة غسل واحد لمزيد من الوقت.
  6. إضافة 95 ميكرولتر من تشغيل عازلة تليها 5 ميكرولتر من 7 aminoactinomycin D (7AAD) إلى كل بئر لإجمالي حجم 100 ميكرولتر / جيد. احتضان لوحة في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من تشغيل عازلة لأنابيب العنقودية. نقل وحدة التخزين بالكامل من تعليق خلية من كل بئر من لوحة للأنابيب العنقودية والحصول على العينات على تدفق عداد الكريات.
  8. تحديد نسبة الخلايا 7AAD الإيجابي باستخدام التدفق الخلوي برامج التحليل.

5. EC 50 تقرير

  1. يتم تحديد القيم EC 50 من WS-CM والنيكوتين كل 7AAD الإيجابي تلطيخ PBMCs.
  2. يتم تعريف EC 50 القيمة على أنها اضربentration الذي 50٪ من الخلايا لم تعد قابلة للحياة في مقايسة 24 ساعة، ويتم التعبير عن القيم كما ميكروغرام من-متساو النيكوتين وحدة / مل.
  3. لأغراض هذه الدراسة، تم تحديد القيم EC 50 لتكون 1.56 ميكروغرام / مل و 1،650 ميكروغرام / مل لWS-CM والنيكوتين، على التوالي.

6. السيتوكينات يفرز

ملاحظة: التخفيفات المذكورة هنا هي لأغراض هذه الدراسة. التخفيفات يمكن تعديلها وفقا لذلك.

  1. تمييع WS-CM في لوحة 96-جيدا باستخدام RPMI المتوسطة كاملة إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكرولتر / جيد في تركيز 0.3، 1.56، 3، و 5 ميكروغرام / مل من وحدات متساوية النيكوتين.
  2. تمييع النيكوتين إلى التركيزات التالية: 100، 200، 500، 750، 1000، 2000 و 3000 ميكروغرام / مل. تنبيه: النيكوتين هو ذات سمية حادة وخطرة على البيئة.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من PBMCs معلقة في RPMI المتوسطة كاملة إلى كل بئر بتركيز 1 × 10 6 خلايا / جيد.فإن الحجم الكلي للخلايا بالإضافة إلى WS-CM أو النيكوتين يكون 200 ميكرولتر / جيد.
  4. تغطية لوحة واحتضان لمدة 3 ساعات في 37 ° C وCO 2 5٪.
  5. غسل الخلايا في RT بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق، الشفط طاف، vortexing لأسفل اللوحة مع لوحة مغطاة، وأخيرا وقف الخلايا مع 200 ميكرولتر من الجليد الباردة تشغيل العازلة وتكرار الخطوة غسل واحد لمزيد من الوقت.
  6. إضافة 200 ميكرولتر من RPMI المتوسطة كاملة، وكرر الخطوة غسل واحد لمزيد من الوقت.
  7. إضافة 200 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل LPS المتوسطة إلى كل بئر.
  8. تغطية لوحة واحتضان لمدة 4 ساعات، 24 ساعة، 48 ساعة، أو 72 ساعة على 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. ضبط الأوقات الحضانة عند الضرورة.
  9. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300 × ز لمدة 3 دقائق.
  10. تأخذ 175 ميكرولتر من طاف من كل بئر وتخزينها في الثلاجة عند -80 درجة مئوية إلى إجراء فحوصات في الخطوات 7 و 8.

7. Cytometric الخرزة صفيف الفحص

<رأ>
  • ذوبان الجليد في supernatants خلية أعدت من الخطوة 6.10 واستخدامها في فحص CBA. أداء مجموعة حبة cytometric (CBA) مقايسة حسب تعليمات الشركة المصنعة.
  • 8. IL-8 ELISA

    1. ذوبان الجليد في supernatants خلية من الخطوة 6.10 واستخدامها في IL-8 ELISA. إجراء فحص ELISA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

    9. بين الخلايا تلطيخ والتدفق الخلوي

    ملاحظة: التخفيفات المذكورة هنا هي لأغراض هذه الدراسة. التخفيفات يمكن تعديلها وفقا لذلك.

    1. تمييع WS-CM في لوحة 96-جيدا باستخدام RPMI المتوسطة كاملة إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكرولتر / جيد في تركيز 0.3، 1.56، 3، و 5 ميكروغرام / مل من وحدات متساوية النيكوتين.
    2. في نفس لوحة، وتمييع النيكوتين إلى التركيزات التالية: 2، 10، 50، 100، 500، 2000، و 4000 ميكروغرام / مل. تنبيه: النيكوتين هو ذات سمية حادة وهزار للبيئةدوس.
    3. إضافة 100 ميكرولتر من PBMCs معلقة في RPMI المتوسطة كاملة بتركيز 1 × 10 6 خلايا / جيد. فإن الحجم الكلي للخلايا بالإضافة إلى WS-CM أو النيكوتين يكون 200 ميكرولتر / جيد.
    4. تغطية لوحة واحتضان لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
    5. غسل الخلايا في RT بواسطة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 3 دقائق، الشفط طاف، vortexing لأسفل اللوحة مع لوحة مغطاة، وأخيرا إعادة التعليق الخلايا مع 200 ميكرولتر من الجليد الباردة عازلة على التوالي، وكرر الخطوة غسل واحد لمزيد من الوقت.
    6. إضافة 200 ميكرولتر من RPMI المتوسطة الكامل إلى لوحة، وكرر الخطوة غسل واحد لمزيد من الوقت.
    7. إعداد تركيزات العمل من 2 ميكرولتر / مل GolgiPlug و 10 ميكروغرام / مل LPS باستخدام RPMI المتوسطة كاملة وإضافة 200 ميكرولتر إلى كل بئر.
    8. احتضان لوحة لمدة 6 ساعات في 37 ° C وCO 2 5٪.
    9. في نهاية الخطوة 9.8، وغسل الخلايا مع تشغيل عازلة (4 ° C)، والغزل في 300x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
    10. إضافة 100 ميكرولتر من Cytofix إلى كل بئر واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    11. غسل الخلايا 3 مرات كما هو موضح في الخطوة 9.9 مع 1X Permwash (4 ° C) في 300 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
    12. إضافة 45 ميكرولتر من 1X Cytoperm إلى كل تليها جيدا بنسبة 5 ميكرولتر من كل واحد من الأجسام المضادة التالية إلى كل بئر: TNF-α-فلور اليكسا 488، IFN-γ V500، MIP-1α PE. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    13. غسل الخلايا مرتين كما هو موضح في الخطوة 9.9 مع 1X Permwash (4 ° C) ومرة ​​واحدة مع تشغيل عازلة (4 ° C) في 300 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
    14. resuspend الخلايا مع 200 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد (4 ° C). نقل الخلايا إلى 12 × 75 مم أنابيب، وتحليل العينات على تدفق عداد الكريات. تنبيه: لامتصاص العرق غير قابلة للتآكل، شديد السمية ويشكل خطرا على الصحة.

    10. K562 قتل الفحص

    يجب أن نمت الخلايا K562: ملاحظةفي الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 مع RPMI المتوسطة كاملة حتى تصل إلى 80٪ التقاء قبل الفحص.

    1. إعداد 5 ملي carboxyfluorescein حل succinimidyl استر (CFSE) الأسهم من خلال إضافة 18 ميكرولتر من DMSO إلى القارورة.
    2. تمييع WS-CM أو النيكوتين في لوحة 96-جيدا باستخدام RPMI المتوسطة كاملة إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكرولتر / جيد لتحقيق وحدات متساوية النيكوتين المطلوبة أو تركيزات النيكوتين لكل بئر. تنبيه: النيكوتين هو ذات سمية حادة وخطرة على البيئة.
    3. إضافة 100 ميكرولتر من PBMCs في RPMI المتوسطة كاملة بتركيز 1.5 × 10 6 خلايا / جيد. فإن الحجم الكلي للخلايا مع WS-CM أو النيكوتين يكون 200 ميكرولتر / جيد.
    4. تغطية لوحة واحتضان لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
    5. غسل الخلايا K562 بإضافة 10 مل من DPBS وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 8 دقائق في RT.
    6. resuspend الخلايا مع 10 مل من DPBS وعدد الخلايا K562.
    7. إعداد CFSE workiحل نانوغرام بإضافة 1 ميكرولتر من CFSE حل الأسهم إلى 1 مل DPBS.
    8. إضافة 1 مل من محلول العمل CFSE إلى 1 مل من تعليق خلية K562 تحتوي على 1 - 2 × 10 7 الخلايا. دوامة واحتضان بالضبط لمدة 2 دقيقة في RT.
    9. إضافة على الفور 200 ميكرولتر من FBS. دوامة واحتضان بالضبط لمدة 2 دقيقة في RT.
    10. إضافة 10 مل من RPMI المتوسطة كاملة وأجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 400 x ج لمدة 8 دقائق في RT.
    11. إزالة طاف RPMI وكسر بيليه و resuspend الخلايا مع 10 مل من RPMI المتوسطة كاملة وعدد الخلايا K562 CFSE المسمى.
    12. غسل PBMCs بواسطة الطرد المركزي لوحة في 300 x ج لمدة 3 دقائق في RT. نضح طاف بواسطة الصب السائل. استبدال الغطاء ودوامة الجزء السفلي من لوحة. إضافة 200 ميكرولتر من RPMI المتوسطة كاملة وتكرار غسل خطوة واحدة لمزيد من الوقت.
    13. إضافة خلايا K562 CFSE المسمى بنسبة 1:15 (100،000 K562s: 1.5 × 10 6 PBMCs) لكل عينة بئر من لوحة PBMC ومزيد من طncubate لمدة 5 ساعة عند 37 ° C وCO 2 5٪.
    14. غسل مزيج الخلية عن طريق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق في RT. نضح طاف بواسطة التخلص من السائل. ضع الغطاء ودوامة الجزء السفلي من لوحة.
    15. إضافة 200 ميكرولتر من تشغيل العازلة وكرر الخطوة غسل موضح في الخطوة 10.14 مرة أخرى.
    16. إضافة 95 ميكرولتر من تشغيل عازلة تليها 5 ميكرولتر من 7AAD إلى كل بئر لإجمالي حجم 100 ميكرولتر / جيد. احتضان لوحة في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
    17. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة على التوالي إلى كل بئر ونقل وحدة التخزين بالكامل من تعليق خلية من كل بئر من لوحة للأنابيب العنقودية والحصول على العينات على تدفق عداد الكريات.
    18. تحديد النسبة المئوية للخلايا 7AAD إيجابية وCFSE إيجابية باستخدام التدفق الخلوي برامج التحليل.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    وعرضت النتائج على النحو يعني الخطأ ± المعياري للمتوسط ​​(أربع عينات المانحة). تم إجراء اختبار t الطالب بين عينات مراقبة المعالجة وغير المعالجة باستخدام برنامج إكسل وكذلك مقارنات اختبار t لجميع العلاجات مع الضوابط المقابلة الخاصة بهم. وأشار إلى الأهمية الإحصائية عن طريق: *، P <0.05. **، P <0.005. ***، P <0.0005.

    لقياس تأثير التعرض لWS-CM والنيكوتين، تم علاج PBMCs مع تركيزات مختلفة من WS-CM والنيكوتين لمدة 3 ساعات أو 24 ساعة. تم قياس موت الخلايا بواسطة طريقة قوية وموثوق بها 7AAD تلطيخ، كما intercalates 7AAD في الأحماض النووية المزدوج تقطعت بهم السبل ويمكن ان تخترق أغشية الخلايا من الموت أو الخلايا الميتة 16. ولوحظ وجود زيادة تعتمد على الجرعة في موت الخلايا مع WS-CM في 24 ساعة، مع القريب موت الخلايا 80٪ في الكشف عن 4 ميكروغرام / مل من وحدات متساوية النيكوتين (الشكل 1A). وكانت هناك درجة مماثلة من موت الخلاياوأشار فقط في 3،000 ميكروغرام / مل النيكوتين (الشكل 1B). وبما أننا يتعرض PBMCs لمدة 3 ساعة مع WS-CM والنيكوتين لتقييم تأثيرها الحث خلوى والقدرة على قتل الخلايا المستهدفة، كان من الضروري تحديد ما إذا كان WS-CM يسبب السمية الخلوية الهامة التالية 3 العلاج ساعة. PBMCs تعامل مع 5 ميكروغرام / مل من وحدات متساوية النيكوتين من WS-CM لم تشهد سمية كبيرة (<5٪، الشكل 1A). العلاج مع النيكوتين لمدة 3 ساعة تسببت وفاة قابلة للقياس (8٪) خلية فقط في 2،000 ميكروغرام / مل (الشكل 1B). وهكذا، لم التعرض لWS-CM أو النيكوتين في الجرعات المشار إليها وفترات العلاج لا يسبب السمية الخلوية كبيرة في ظل الظروف التجريبية.

    لقياس الآثار المناعية، وتحفيز PBMCs مع LPS لفترات زمنية مختلفة، وتم قياس السيتوكينات التي يفرزها فحص CBA. لتحسين الوقت التحفيز LPS، فإننا يتعرض PBMCs إلى التحفيز LPS لمدة 4 ساعة، 2تم قياس 4 ساعة، 48 ساعة، و 72 ساعة، والسيتوكينات يفرز. على سبيل المثال، التحفيز LPS لمدة 24 ساعة أسفرت عن إفراز القصوى من السيتوكينات IL-6 و IL-8 (الشكل 2)، ولم فترات زمنية ممتدة لا يؤدي إلى زيادات أخرى (IL-6) أو النقصان (IL-8) في خلوى إفراز. وتم الحصول على نتائج مماثلة مع السيتوكينات أخرى يفرز مثل IL-10، IL-1β وTNF-α (لا تظهر البيانات).

    واقترح الطيار التجارب الوقت بالطبع أن الإنتاج القصوى من السيتوكينات في الردود على TLR-4 التحفيز عن طريق LPS يحدث من قبل 24 ساعة، وبالتالي، تم قياس السيتوكينات يفرز في 24 ساعة في جميع التجارب اللاحقة. العلاج مع WS-CM والنيكوتين، تليها تحفيز TLR-4 مستقبلات مع LPS، أدى إلى انخفاض تعتمد على الجرعة تفرز السيتوكينات (الشكل 3). أسفرت العلاج مع WS-CM إلى انخفاض عميقة من IFN-γ (الشكل 3A)، TNF (الشكل 3B)، IL-10 (الشكل 3C </ قوي>) وIL-6 (الشكل 3D) في وحدات متساوية النيكوتين منخفضة (1.56 ميكروغرام / مل). كان قمع السيتوكينات واضحا مع النيكوتين أيضا. ومع ذلك، حدث قمع السيتوكينات مع النيكوتين بجرعات أعلى بكثير، ودرجة القمع تفاوتت بين السيتوكينات الفردية. على سبيل المثال، يبدو IFN-γ أن قمعت بشكل ملحوظ مع النيكوتين في 50 ميكروغرام / مل، في حين قمعت IL-6 على أعلى تركيز (4 ملغ / مل) اختبار (Figurie 3D). وبعد ذلك، قمنا بقياس IL-8 مستويات في نفس العينات باستخدام فحص ELISA. قمعت IL-8 إفراز بشكل فعال في PBMCs WS-CM يتعرض؛ في حين كانت الآثار القمعية للنيكوتين هامة في 2 ملغ / مل (الشكل 4).

    تم كميا مستويات السيتوكينات داخل الخلايا في WS-CM- والخلايا المعالجة النيكوتين على التحفيز مع LPS. في السابق كنا حفز PBMCs لمدة 3 أيام، وأضاف Golgiplug خلال ساعة 6 الأخيرة من الحضانة إلى قياسالسيتوكينات داخل الخلايا 14. نحن الآن إلى خفض كبير في فترة الحضانة من خلال الجمع بين التحفيز مع LPS وجولجي المكونات إلى ما مجموعه 6 ساعة وقياس خلايا خلوى إيجابي داخل الخلايا (الشكل 5). الشكل 5 يوضح انخفاض تعتمد على الجرعة في المئة في الخلايا IFN-γ إيجابية ( الشكل 5A) الخلايا (الشكل 5B) في كل من نيكوتين وWS-CM-، TNF-α إيجابية يتعرض PBMCs، في حين أن الحد في المئة تعتمد على الجرعة في الخلايا MIP-1α إيجابية (الشكل 5C) لوحظ في WS-CM PBMCs -exposed. في هذا الاختبار لاحظنا انخفاضا في عدد خلايا خلوى إيجابي داخل الخلايا بعد التعرض لWS-CM في الدنيا وحدات متساوية-النيكوتين (1.56 ميكروغرام / مل). أظهر كلا يفرز خلوى والمقايسات خلوى داخل الخلايا نتائج مماثلة من حيث مستويات IFN-γ IFN-أو خلايا γ إيجابية.

    كإجراء وظيفي، فإن قدرة WS-CM- ونيكوتينتم تحديد PBMCs المعالجة لقتل الخلايا K562 الهدف. الشكل 6A يصور البيانات الخام تمثيلي تدفق cytometric من تلطيخ 7AAD إيجابية من الهدف (CFSE المسمى K562) قتل الخلايا عن طريق التحكم، WS-CM يتعرض، والمعالجة النيكوتين PBMCs. أرقام في مربع تمثل-7AAD إيجابي خلايا K562 CFSE المسمى في المئة. التعرض ل1.56 ميكروغرام / مل WS-CM إلى خفض كبير في قدرة قتل الخلايا المستجيب في PBMCs مقارنة مع السيطرة وأقل جرعات. لم العلاج النيكوتين في الجرعات المنخفضة والعالية لا تتداخل مع قتل الخلية. ويبين الشكل 6B انخفاضا تعتمد على الجرعة في الخلية K562 في المئة مما أسفر عن مقتل من الجهات المانحة متعددة في تجربة واحدة.

    الشكل (1)
    الشكل 1. موت الخلايا من PBMCs بعد التعرض لتركيزات متزايدة من وحدات متساوية النيكوتين من WS-CM (ميكروغرام / مل) والنيكوتين (ميكروغرام / مل). (A) ومع النيكوتين لمدة 3 ساعة و 24 ساعة (B). وقد تم قياس موت الخلايا التي 7AAD تلطيخ. كل نقطة تمثل الحانات يعني ± SD خطأ من أربعة مانحين من تجربة تمثيلية. يشار إلى الأهمية الإحصائية عن طريق: * P <0.05. ** P <0.005 ***، P <0.0005.

    الشكل 2
    الشكل 2. إفراز IL-6 و IL-8 التي كتبها PBMCs حفز مع LPS في نقاط زمنية مختلفة. وقد حفزت PBMCs مع LPS لمدة 4 ساعة، 24 ساعة، 48 ساعة، و 72 ساعة. مستويات IL-6 و IL-8 السيتوكينات في supernatants ثقافة خلية تم تحديدها باستخدام التهاب خلوى الإنسان كيت (CBA عدة) والتدفق الخلوي. وتمثل هذه البيانات القضبان يعني ± SD خطأ من واحد من اثنين من تجارب مستقلة باستخدام PBMCs من ثلاث جهات مانحة مختلفة. سي الإحصائييشار gnificance عن طريق: * P <0.05. ** P <0.005.

    الشكل (3)
    الشكل 3. الحد من إفراز السيتوكينات التي كتبها PBMCs تعامل مع زيادة تركيزات من وحدات متساوية النيكوتين من WS-CM (ميكروغرام / مل) والنيكوتين (ميكروغرام / مل) بعد التحفيز LPS. تعرضت PBMCs لتركيزات مختلفة من WS-CM والنيكوتين لمدة 3 ساعة وحفز مع LPS لمدة 24 ساعة. مستويات IFN-γ (A)، وتم تحديد TNF (B)، IL-10 (C)، وIL-6 (D) السيتوكينات في supernatants ثقافة الخلية باستخدام فحص TH1 / TH2 CBA والتدفق الخلوي. وتمثل هذه البيانات القضبان يعني ± SD خطأ من واحدة من التجارب الثلاث مستقلة باستخدام PBMCs من أربع جهات مانحة مختلفة. يشار إلى الأهمية الإحصائية عن طريق: * P <0.05. ** P <0.005. *** P <0.0005. يخدع العالي كانت centrations من WS-CM أيضا ذات دلالة إحصائية مع *** P <0.0005.

    الشكل (4)
    الشكل 4. التوهين من IL-8 إفراز من PBMCs تعامل مع زيادة تركيزات من وحدات متساوية النيكوتين من WS-CM (ميكروغرام / مل) والنيكوتين (ميكروغرام / مل) بعد التحفيز LPS. تعرضت PBMCs إلى WS-CM والنيكوتين، حفز مع LPS لمدة 24 ساعة، ويفرز تم قياس IL-8 بواسطة ELISA. وتمثل هذه البيانات القضبان يعني ± SD خطأ من واحدة من التجارب الثلاث مستقلة باستخدام PBMCs من أربع جهات مانحة مختلفة. يشار إلى الأهمية الإحصائية عن طريق: * P <0.05. ** P <0.005. *** P <0.0005. وكانت تركيزات أعلى من WS-CM أيضا ذات دلالة إحصائية مع *** P <0.0005.

    .JPG "/>
    الشكل 5. الحد من خلايا خلوى إيجابي داخل الخلايا في PBMCs تعامل مع زيادة تركيزات من وحدات متساوية النيكوتين من WS-CM (ميكروغرام / مل) والنيكوتين (ميكروغرام / مل). تعرضت PBMCs لتركيزات مختلفة من WS-CM والنيكوتين لمدة 3 ساعة وحفز مع LPS وGolgiplug لمدة 6 ساعة. وكانت السيطرة على السيارة لWS-CM والنيكوتين RPMI المتوسطة كاملة. وتم قياس كمية (C) خلايا MIP-1α إيجابية داخل الخلايا IFN-γ إيجابية (A)، TNF-α-الإيجابي (B)، والتدفق الخلوي. وتمثل هذه البيانات القضبان يعني ± SD خطأ من واحدة من تجارب مستقلة أربعة باستخدام PBMCs من أربع جهات مانحة مختلفة. يشار إلى الأهمية الإحصائية عن طريق: * P <0.05. ** P <0.005. *** P <0.0005. وكانت تركيزات أعلى من WS-CM أيضا ذات دلالة إحصائية مع *** P <0.0005.

    الشكل (6) الشكل 6. الحد من الهدف PBMCs قتل القدرة مع التعرض لتركيزات متزايدة من وحدات متساوية النيكوتين من WS-CM (ميكروغرام / مل) والنيكوتين (ميكروغرام / مل). وعولج PBMCs مع تركيزات المشار إليها من WS-CM والنيكوتين لمدة 3 ساعة، والخلايا K562 CFSE المسمى ثم تم إضافتها كما الخلايا المستهدفة وحضنت لمدة 5 ساعة إضافية. كانت ملطخة الخلايا مع 7AAD والتدفق الخلوي كانت تستخدم لقياس القدرة القتل. ويبين الشكل 6A تدفق تمثيلي الخلوي النتائج مع قتل في المئة هو مبين في صناديق بوابات. السهم يشير إلى انخفاض قتل في المئة في 1.56 ميكروغرام / مل يتعرض WS-CM. ويبين الشكل 6B الحانات يعني ± SD خطأ تمثيلية من أربع تجارب مستقلة باستخدام PBMCs من أربع جهات مانحة مختلفة. يشار إلى الأهمية الإحصائية حسب: ** P <0.005. *** P <0.0005. وكانت تركيزات أعلى من WS-CM أيضا إحصائيا خفة دم كبيرةح *** P <0.0005.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    نحن وآخرون قد أظهرت في وقت سابق ان علاج PBMCs مع TPPs يقمع عدة ردود، بما في ذلك التعبير وإفراز السيتوكينات وتدابير وظيفية مثل قتل الخلية المستهدفة 14. الطرق التجريبية وصفها في الأعمال السابقة تتطلب فترات حضانة أطول وكانت متواضعة في حجم 14. وبالنظر إلى التطبيقات المحتملة لهذا النموذج جذابا خارج الحي لالبحوث الأساسية والتطبيقية، ونحن التحقيق ما إذا كان أي من المعلمات مقايسة في هذه المقايسات البيولوجية متعددة الخطوات يمكن أن يكون الأمثل. هنا، نقدم مبسطة أساليب لقياس الاستجابات المناعية TLR بوساطة باستخدام المجراة سابقا PBMC نموذج TPP المعاملة.

    عزل PBMCs قابلة للحياة هو شرط أساسي لهذه المقايسات فيفو السابقين. ونظرا لتقلب الفردي والحالة الفسيولوجية في الجهات المانحة المحتملة، وهو مثالي للحصول على PBMCs التي تستجيب. لغرض هذه الدراسة، ونحن عزلPBMCs د من المواضيع البالغين الأصحاء عموما باستخدام طريقة نشرت سابقا 15. وعلاوة على ذلك، في هذه الدراسة لتقليل التباين بين الجهات المانحة، واستثنينا تلك يعانون من الحساسية، والالتهابات، أو الذين كانوا يتناولون أي وصفات طبية أو على مكافحة المخدرات مثل الأسبرين. بالإضافة إلى ذلك، عزل PBMCs من الدم جمعت حديثا أمر مرغوب فيه، لأنه يضمن بقاء الأمثل وظائف الخلايا في تجارب لاحقة.

    الأساليب السابقة تستخدم التحفيز مع منبهات TLR عن 67-72 ساعة لقياس السيتوكينات داخل الخلايا والسيتوكينات يفرز 14. اقترح A-مدار الساعة من إفراز خلوى في خلايا TLR حفز (تحت ظروف التحكم مع أي WS-CM أو النيكوتين) أن إفراز القصوى حدث في 24 ساعة. وعلاوة على ذلك، ونحن الجمع بين الحضانة مع منبهات TLR وGolgiplug وتقليل الوقت من الحضانة إلى ما مجموعه 6 ساعات لقياس السيتوكينات داخل الخلايا. في حين أن هذا يتطلب فحص مستقل لقياسخلايا خلوى إيجابي، فإن البيانات هي أكثر قوة مقارنة مع الطريقة السابقة 14. واتساقا مع النتائج السابقة، قمعت WS-CM بشدة تحريض السيتوكينات داخل الخلايا ويفرز. وهكذا، أدت هذه التعديلات إلى انخفاض كبير مرات الفحص وأسفرت عن نتائج مماثلة جدا لتلك التي وصفها في الأدب. ولئن كنا قد تستخدم التدفق الخلوي وطرق ELISA لتقييم مستويات خلوى، وتقنيات أخرى مثل الوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل الكمي رد فعل (RT-QPCR) ويمكن أيضا أن تستخدم كأسلوب التكميلية.

    تاريخيا، تستهدف قتل الخلية PBMCs المستجيب تستخدم أساليب رديولبلد (على سبيل المثال، 51 الكروم، إطلاق الفحص). الطريقة الموصوفة في هذا التقرير يلغي استخدام النشاط الإشعاعي ويعمل خلايا تحميل مع صبغة الفلورسنت التي يمكن مراقبتها من قبل التدفق الخلوي الوجود. ميزة أخرى لهذا الأسلوب هو موضح هنا هو أنه سريع نسبيا ويمكن أن تكون adapteد لفحوصات عالية الإنتاجية. منذ فترة حضانة الخلايا المستهدفة والمستجيب هو 5 ساعة، هذا الاختبار قد يتم الانتهاء في 8 ساعة. هذا في التناقضات مع الأساليب الأخرى المنشورة، والتي هي أكثر انخراطا لأنها تتطلب عزل أنواع فرعية من PBMCs وتفعيل / التحفيز على مدى عدة أيام، أو تحليل NK الخلية وتقارن خلية K562 لرصد سمية الخلايا 17،18. ميزة أخرى من الأسلوب الحالي هو أنه يستخدم PBMCs cryopreserved مباشرة إلى خلايا المستجيب، والذي يتيح قدرا أكبر من المرونة.

    وباختصار، وصفنا عدة فحوصات لتحديد تأثير الاستجابة المناعية TLR بوساطة في احتراق PBMCs TPP المعاملة، والتي يمكن تطبيقها بسهولة لاختبار مركبات مختلفة. استخدام مكونات cryopreserved يسمح للمرونة كبيرة، وجنبا إلى جنب مع تقنيات إنشاء مثل التدفق الخلوي، المقايسات CBA، وELISAs وقوية ونتائج متسقة يمكن الحصول بسرعة عبر مختبر مختلفةالخطابات.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    ويتم تمويل هذا العمل من قبل RJ شركة التبغ رينولدز (RJRT) بموجب اتفاق البحوث التعاونية مع جامعة ويك فوريست مدرسة الطب. GL براساد هو موظف بدوام كامل من RJRT.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    12 x 75 mm tubes BD Falcon 352058
    15 ml conical tubes Corning 430790
    2 ml microtubes Axygen MCT-150-C-S
    3R4F reference cigarettes Univ. of Kentucky, College of Agriculture 3R4F
    50 ml conical tubes Corning 430828
    500 ml bottle Corning 430282
    7AAD BD Pharmingen 559925
    96-well flat bottom plate Termo Nunc 439454
    96-well round bottom plates BD Falcon 353077
    Cell culture hood Thermo Scientific 1300 Series A2
    Centrifuge Eppendorf 58110R
    CFSE Molecular Probes Life Technologies C34554
    Cluster tubes Corning 4401 Harmful if swallowed, carcinogen
    Cytofix/Cytoperm (Permwash) BD Biosciences 555028 Flammable
    DMSO (dimethyl sulfoxide ) Sigma-Aldrich D8418
    DPBS Lonza 17-512F
    FBS Sigma-Aldrich F2442
    FCAP Array BD Biosciences 652099 Software analyzes CBA data
    Filter unit Nalgene 156-4020
    Flow cytometer BD Biosciences FACS Canto II 8 colors, at Ex 405 and Em 785.
    Flow cytometer BD Biosciences FACS Calibur 4 colors at Ex 495 and Em 785.
    Flow cytometry analysis software Tree Star FlowJo
    Freezing container Nalgene 5100-0001 Contains DMSO, irritant
    GogliPlug BD Biosciences 555029 Carcinogen, irritant, corrosive
    H2SO4 Sigma-Aldrich 339741
    Human Inflammatory Cytokine Kit BD Biosciences 551811
    IFN-γ V-500 Antibody BD Horizon 561980 skin sensitizer
    IL-8 ELISA Kit R and D Systems DY208
    Isolation buffer Isolymph, CTL Scientific Corp. 1114868 Flammable liquid, irritant
    Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907
    L-Glutamine Gibco Life Technologies 25030-081
    LPS Sigma-Aldrich L2630
    MIP1-α PE Antibody BD Pharmingen 554730 Acute toxicity, oral
    Monensin Sigma-Aldrich M5273
    NaCl Sigma-Aldrich S7653
    Nicotine Sigma-Aldrich N3876 Acute toxicity, environmental hazard
    Parafilm Bemis “M”
    Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Flammable, skin irritation
    Pen/strep Gibco Life Technologies 15140-122
    RPMI 1640 Gibco Life Technologies 11875-093
    Running buffer MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech 130-091-221
    Th1/Th2 CBA Kit BD Biosciences 551809
    TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody BioLegend 502915
    Transfer pipette Fisher Scientific 13-711-20
    Tris Base Sigma-Aldrich T1503

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
    2. Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
    3. Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
    4. Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
    5. Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
    6. Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
    7. Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
    8. Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
    9. Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
    10. Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
    11. Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
    12. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
    13. Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
    14. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
    15. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
    16. Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
    17. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
    18. Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).

    Tags

    علم المناعة، العدد 95، وإعداد منتجات التبغ، كله المتوسطة مكيفة الدخان، وخلايا الدم وحيدات النوى المحيطية الإنسان، PBMC، lipopolysaccharide في، موت الخلايا، السيتوكينات يفرز، السيتوكينات داخل الخلايا، مما أسفر عن مقتل K562 الفحص.
    طرائق لتقييم السمسة والمناعة من احتراق التبغ الاستعدادات المنتج
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Arimilli, S., Damratoski, B. E.,More

    Arimilli, S., Damratoski, B. E., G.L., P. Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations. J. Vis. Exp. (95), e52351, doi:10.3791/52351 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter