Abstract
Tra le altre modifiche fisiopatologiche, l'esposizione cronica al fumo di sigaretta provoca l'infiammazione e la soppressione immunitaria, che sono stati collegati a una maggiore suscettibilità dei fumatori a infezioni microbiche e di tumori. Ex vivo soppressione delle risposte immunitarie recettoriali nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) trattato con componenti del fumo è un approccio interessante per studiare i meccanismi e valutare i probabili effetti a lungo termine dell'esposizione ai prodotti del tabacco. Qui, abbiamo ottimizzato metodi per eseguire test ex vivo utilizzando PBMC stimolate da lipopolisaccaride batterico, una Toll-like receptor-4 ligando. Gli effetti di tutto a medio-fumo condizionata (WS-CM), una preparazione prodotto del tabacco combustibili (TPP), e la nicotina sono stati esaminati sulla secrezione di citochine e obiettivo l'uccisione delle cellule dai PBMC nelle ex vivo saggi. Abbiamo dimostrato che le citochine secrete IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 e IL-8 e citochine intracellulari IFN-47 ;, TNF-α, e MIP-1α sono stati soppressi in PBMC WS-CM-esposte. La funzione citolitica di PBMC effettrici, come determinato da un saggio di cellula bersaglio K562 uccidere è stato ridotto da esposizione a WS-CM; nicotina era minimamente efficace in questi test. In sintesi, vi presentiamo una serie di migliori test per valutare gli effetti delle centrali termiche nel ex vivo saggi, e questi metodi potrebbero essere facilmente adattato per testare gli altri prodotti di interesse.
Introduction
Un numero consistente di punti di conoscenza per gli effetti negativi per la salute del fumo di sigaretta cronica, tra cui malattie cardiovascolari (CVD), broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) e il cancro 1,2. Il fumo di sigaretta cronica è stato conosciuto per causare infiammazione e la soppressione immunitaria, e queste alterazioni sono segnalati per contribuire ad un aumento del rischio di infezioni microbiche e cancro nei fumatori 3. In vitro e ex vivo le tecniche sono utili a chiarire le basi molecolari degli effetti fisiopatologici di fumo di sigaretta 4-9 (Tabella 1) e sono riconosciuti come importanti strumenti per guidare la regolamentazione emergente di vari prodotti del tabacco 10,11.
Ad esempio, abbiamo dimostrato che sostanze infiammabili prodotti del tabacco (centrali termiche) come complesso medio-fumo condizionata (WS-CM) e particolato totale (TPM) sono di gran lunga più citotossici e dannoso perDNA di centrali termiche non combustibili o nicotina 12,13. Coerentemente con il lavoro pubblicato, è stato recentemente riportato che le centrali termiche combustibili o nicotina 12,13. Coerentemente con il lavoro pubblicato, abbiamo recentemente riportato che centrali termiche combustibili causato marcata immunosoppressione. Ciò è stato dimostrato dalla soppressione del numero verde come recettore (TLR) -ligands, stimolata la secrezione di citochine, e mirata delle cellule (K562) l'uccisione da PBMC in un modello ex vivo 14. Data l'importanza di infiammazione in processi di malattia fumo-indotta sigaretta, un'ulteriore ottimizzazione delle condizioni di analisi per valutare gli effetti modulatori immunitari del fumo di sigaretta è presentata in questo rapporto.
Gli ex vivo saggi tipicamente misurate intracellulare e citochine, nonché la funzione citolitica di T citotossici e le cellule NK nella cella K562 uccidendo 14 saggi secreti. I saggi coinvolti pre-incubazione con WS-CM e nicotina e successiva stimolazione di PBMCs con TLR agonisti per un periodo di 3 giorni; le letture finali sono eseguite utilizzando saggi immunoenzimatica (ELISA) e / o di citometria a flusso. Abbiamo utilizzato lipopolisaccaride batterico (LPS), che si lega a recettori TLR-4 e stimola PBMC conseguente produzione di citochine intracellulari e secrezione di citochine. Oltre all'ottimizzazione dei vari passaggi del test per valutare gli effetti immunomodulatori di centrali termiche, abbiamo anche i metodi attuali per PBMCs isolamento, saggi di morte cellulare, e IL-8 quantificazione. Questi metodi possono essere applicati per affrontare altre questioni di ricerca e ulteriormente raffinato per valutare i prodotti del tabacco nel contesto normativo.
Tabella 1. Pubblicato segnalazioni di in vitro e ex vivo i metodi utilizzati per studiare varilus effetti fisiopatologici di preparati prodotti tabacco CS, media fumo di sigaretta.; CSC, fumo di sigaretta condensa; CSE, estratto di fumo di sigaretta; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; GADPH, gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi; qPCR, reazione a catena della polimerasi quantitativa; RT, in tempo reale reazione a catena della polimerasi quantitativa; TS, fumo di tabacco.
| Autore (Anno di corso) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Le cellule utilizzate | Le cellule umane bronchiali endoteliali (BEAS-2B), neutrofili umani | Cellule epiteliali alveolari umani (A549) | Vie aeree liscio cellule muscolari umane (HASMC) | U937 premonocytic umane, monociti umani | Tipo alveolare II cellule epiteliali (ATII) | Monocitica umanalinea cellulare (THP-1), macrofagi polmonari umane |
| TPP usato | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Metodo utilizzato | ELISA, qPCR, immigrazione, spostamento elettromobilità | Immunoistochimica-chimica, elettroforesi, kit Arrayscan, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, elettroforesi | Spostamento Gel-mobility | La microscopia ottica, microscopia elettronica, elettroforesi, ELISA | qPCR, ELISA, kit E-toxate (Sigma), piastra di p65 dosaggio (Transam), elettroforesi, vari kit immunodosaggio |
| Misura | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, la migrazione | Acetiltransferasi istoni, istone deacetilasi, NF-kB, IL-8, pI kB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotassina | Calore scossa / di stress proteine (HSP / Hsp70), HF fattore di trascrizione NF-kB,TNF-α | Tensioattivo proteina (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, α-TNF, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK fosforilazione, cJun: legame al DNA, il glutatione, p65: legame al DNA |
| Risultato finale | CSE down-regola la produzione di citochine mediante la soppressione di AP-1 attivazione. | H 2 O 2 e CSC migliorare acetilazione delle proteine istoniche, diminuire l'attività dell'istone deacetilasi, differenziale regolano il rilascio di citochine proinfiammatorie. | Il fumo di sigaretta può causare il rilascio di IL-8 da HASMC, arricchito da TNF-α, il 20% CSE meno di IL-8 rilascio, inibizione di eotassina e RANTES dal fumo di sigaretta. | TS attivati fattore HF di trascrizione, che è stato associato con Hsp70 sovraespressione e l'inibizione di NFkB attività e di rilascio del TNF-α vincolante. | Ridotto ATII livelli chemochine derivati dalle cellule compromesso alveoriparazione lar, contribuendo al fumo di sigaretta indotto danno alveolare e l'enfisema. | I dati forniscono spiegazione meccanicistica del perché i fumatori sono aumentate le infezioni respiratorie. Soppressione della risposta innata è accompagnata da un aumento di IL-8. |
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Protocol
NOTA: consenso informato scritto per fare questo studio è stato ottenuto in una unità di ricerca clinica locale in corso di approvazione IRB, per Good Clinical Practices. Lavorazione di sangue, l'isolamento delle PBMC e altri esperimenti di coltura cellulare sono eseguite in condizioni sterili, utilizzando forniture microbiologicamente sterili e reagenti.
1. WS-CM Preparazione
- Generare WS-CM 12 come precedentemente descritto.
- Preparare WS-CM passando fumo di quattro sigarette 3R4F riferimento attraverso Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium senza rosso fenolo utilizzando il seguente regime di fumare: 35-60-2, il volume in ml soffio, soffio intervallo in secondi, e la durata puff in sec, rispettivamente. Ogni preparazione genera un campione di 20 ml.
- Tubo Label (s) con data, ora completato, e il nome e il numero di sigarette. Conservare i 500 microlitri aliquote a -80 ° C subito dopo il fumo è completato.
- Analizzare aliquote di WS congelate-CM Per determinare i livelli di nicotina, nitrosammine specifiche del tabacco, e gli idrocarburi policiclici aromatici come descritto in precedenza 12.
2. Isolamento di PBMC
- Prelevare il sangue fresco da donatori sani (che sono non consumatori di prodotti del tabacco) Isolare PBMC da sangue fresco come descritto di seguito nella sezione separata approvazione da Wake Forest Baptist Health IRB 15.
- Prima dell'arrivo della sacca di sangue, avere una bottiglia da 500 ml, forbici, buffer di isolamento, e tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) (RT) pronto in un livello di biosicurezza 2 (BSL-2) cappa coltura cellulare. Buffer di isolamento deve essere protetto dalla luce.
- Tenere la sacca di sangue capovolta e tagliare il tubo appena sotto dove è stato bloccato lasciando almeno 3 cm di tubo.
- Togliere il tappo dalla bottiglia da 500 ml e mantenere il tubo sopra l'apertura della bottiglia. Raccogliete la sacca di sangue e capovolgere per permettere al sangue di fluire liberamente dal sacchetto in tegli bottiglia fino al sacchetto è vuoto. Lasciare il sangue di fluire sulla parete interna della bottiglia rispetto verso il basso da evitare la creazione di bolle.
- Versare buffer di isolamento nella bottiglia in un rapporto 1: 5 di tampone di isolamento al sangue. Tappare il flacone e capovolgere delicatamente, end-over-end, 10 volte. Lasciare la bottiglia nella cappa coltura cellulare ad incubare con luci spente, per 1 ora a RT.
- A, strato di colore paglierino chiaro costruirà sopra il sangue. Rimuovere questo livello con un 25 ml pipetta sierologica in 50 ml provette coniche. La quantità raccolte possono variare 50-300 ml, a seconda del soggetto che sangue donato.
- Centrifugare le provette a 200 xg per 10 min a RT.
- Aspirare il surnatante trasparente, lasciando il pellet di sangue di colore scuro. Il pellet sarà sciolto ma viscoso.
- Pipettare 3 ml di tampone isolamento in 15 ml provette coniche.
- Per il pellet risospendere, aggiungere 20 ml di DPBS per ogni 50 ml di liquido color paglierino raccolti in sTep 2.1.5. Vortex a mescolare bene, e consolidare il liquido risospeso da più tubi. Questo liquido contiene globuli sospeso.
- Con una pipetta di trasferimento, trasferimento 5 ml di globuli sospesi su 3 ml di tampone di isolamento nel passaggio 2.1.8. Inclinare il tubo da 15 ml contenente lentamente e delicatamente la sospensione cellulare per creare due livelli separati. Centrifugare le provette a 400 xg per 40 min a RT con accelerazione minima e senza freno.
- Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere lo strato risultante torbida centrale (buffy coat) contenente PBMC in una provetta conica da 50 ml. Evitare disegno altri livelli chiari di sotto di essa. Trasferimento non più di 25 ml in ciascun tubo da 50 ml.
- Aggiungere 25 ml di tampone fredda (o più per riempire l'intero volume rimanente del tubo conico 50 ml) per lavare le cellule. Centrifugare le cellule a 400 xg per 10 min a 4 ° C.
- Risospendere il pellet con 10 ml di tampone di corsa. Questo contiene PBMC. Contare le celle e utilizzare immediatamente o posto in ghiaccio per congelamento.
3. gelo e disgelo il PBMC
- Centrifuga le PBMC che sono stati raccolti in fase 2.1.13 per 10 min a 400 x g.
- Riempire il contenitore congelamento con alcool isopropilico per le istruzioni del produttore. ATTENZIONE: alcol isopropilico è infiammabile e altamente tossici.
- Risospendere il pellet con terreno RPMI 1640 (4 ° C) contenente siero bovino fetale 20% (FBS) e il 10% dimetilsolfossido (DMSO). Questo è RPMI 1640 medium di congelamento. Risospendere il pellet con una quantità di congelamento mezzo che si tradurrà in una sospensione con circa 5 x 10 7 cellule / ml. Il numero di cellule disponibili per il congelamento varierà.
- Dispensare 1 ml aliquote di sospensione cellulare in 2 ml cryotubes e posizionare i cryotubes nel contenitore di congelamento. Posizionare il contenitore congelamento con cryotubes in un congelatore a -80 ° C per memorizzare O / N e quindi rimuovere i cryotubes e trasferire per memorizzare in uncongelatore criogenico tra -150 ° C a -190 ° C.
- Rimuovere il cryotube dallo stoccaggio criogenico e scongelare rapidamente con agitazione in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Trasferire immediatamente le PBMC scongelati nel cryotube in una provetta conica da 15 ml con 10 ml RPMI 1640 medium completa (4 ° C) contenente 10% FBS, 1% Pen / Strep e 1% di L-glutammina. Il contenuto del cryotube scongelata devono essere trasferite quanto prima possibile avere la vitalità cellulare massima 15.
- Centrifugare le PBMC a 400 xg per 10 min.
- Risospendere il pellet con 5 ml RPMI 1640 completo e contare le cellule.
- Misurare la vitalità delle cellule con metodi consolidati come trypan metodo di esclusione blu. Generalmente vitalità cellulare con questo metodo è circa il 90 - 95%. Le PBMC sono ora pronti per l'uso negli esperimenti.
4. Cella Morte Determinazione
NOTA: Le diluizioni elencati qui sono per lo scopo di questo study. Le diluizioni possono essere modificati di conseguenza.
- Diluire WS-CM o nicotina in una piastra a 96 pozzetti utilizzando RPMI terreno completo per un volume totale di 100 microlitri / pozzetto, come indicato di seguito.
- Diluire WS-CM alle seguenti concentrazioni: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, e 5 mg / mL di unità equi-nicotina (in base al contenuto di nicotina in WS-CM) 12.
- Diluire nicotina nel mezzo RPMI alle seguenti concentrazioni: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 e 3000 mg / ml. ATTENZIONE: La nicotina è acutamente tossico e pericoloso per l'ambiente.
- Aggiungere 100 ml di PBMC sospese in terreno RPMI completo a ciascun pozzetto ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / pozzetto. Il volume totale di cellule più WS-CM o nicotina, sarà di 200 microlitri / pozzetto.
- Ai fini di questo studio, preparare due serie di piastre come sopra. Coprire le piastre e incubare una piastra per 24 ore e una piastra per 3 ore a 37 ° C e 5% CO 2. Regolare punti di tempo, se necessario. Lavare le cellule a RT per centrifugazione a 300 xg per 3 min, aspirare il supernatante, vortex il fondo della piastra con piastra coperta e infine risospendere le cellule con 200 ml di ghiaccio freddo tampone di corsa, e ripetere la fase di lavaggio una volta.
- Aggiungere 95 ml di tampone di corsa seguiti da 5 ml di 7-aminoactinomycin D (7AAD) a ciascun pozzetto per un volume totale di 100 microlitri / pozzetto. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 15 min.
- Aggiungere 100 ml di tampone di corsa ai tubi del cluster. Trasferire l'intero volume di sospensione cellulare da ciascun pozzetto della piastra a tubi di cluster e acquisire i campioni al citofluorimetro.
- Determinare la percentuale di cellule 7AAD-positive in citometria a flusso software di analisi.
5. EC 50 Determinazione
- I valori di EC 50 di WS-CM e nicotina sono determinati da 7AAD-positivo colorazione dei PBMC.
- Il valore EC50 è definito come il concentration alla quale il 50% delle cellule non erano più vitali in un saggio di 24 ore, ed i valori sono espressi come pg di equi-nicotina unità / ml.
- Ai fini di questo studio, i valori di EC 50 sono stati determinati per essere 1,56 mg / ml e 1.650 mg / ml per WS-CM e la nicotina, rispettivamente.
6. citochine secrete
NOTA: Le diluizioni elencati qui sono per lo scopo di questo studio. Le diluizioni possono essere regolati di conseguenza.
- Diluire WS-CM in una piastra a 96 pozzetti utilizzando RPMI terreno completo per un volume totale di 100 microlitri / pozzetto alla concentrazione di 0,3, 1,56, 3, e 5 ug / ml di unità equi-nicotina.
- Diluire nicotina alle seguenti concentrazioni: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 e 3000 mg / mL. ATTENZIONE: La nicotina è acutamente tossico e pericoloso per l'ambiente.
- Aggiungere 100 ml di PBMC sospese in terreno RPMI completo a ciascun pozzetto ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / pozzetto.Il volume totale di cellule più WS-CM o nicotina, sarà di 200 microlitri / pozzetto.
- Coprire la piastra e incubare per 3 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Lavare le cellule a RT per centrifugazione a 300 xg per 3 min, aspirare il supernatante, vortex il fondo della piastra con piastra coperta e infine sospensione cellule con 200 ml di tampone di corsa ghiacciata e ripetendo la fase di lavaggio una volta.
- Aggiungere 200 ml di RPMI terreno completo, e ripetere la fase di lavaggio ancora una volta.
- Aggiungere 200 pl di 10 ug / ml di mezzo LPS in ciascun pozzetto.
- Coprire la piastra ed incubare per 4 ore, 24 ore, 48 ore, o 72 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. Regolare tempi di incubazione, se necessario.
- Centrifugare la piastra a 300 g per 3 min.
- Prendete 175 ml di surnatante da ogni bene e conservare in un freezer a -80 ° C per eseguire i test in step 7 e 8.
7. citometria Bead Array Assay
<ol>8. IL-8 ELISA
- Scongelare i supernatanti cellulari dal punto 6.10 e l'uso in IL-8 ELISA. Eseguire il test ELISA secondo le istruzioni del produttore.
9. intracellulare colorazione e Citometria a Flusso
NOTA: Le diluizioni elencati qui sono per lo scopo di questo studio. Le diluizioni possono essere regolati di conseguenza.
- Diluire WS-CM in una piastra a 96 pozzetti utilizzando RPMI terreno completo per un volume totale di 100 microlitri / pozzetto alla concentrazione di 0,3, 1,56, 3, e 5 ug / ml di unità equi-nicotina.
- Nella stessa piastra, diluire nicotina alle seguenti concentrazioni: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 e 4000 mg / ml. ATTENZIONE: La nicotina è acutamente tossico e Hazar dell'ambientedous.
- Aggiungere 100 ml di PBMC sospese in terreno RPMI completo ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / pozzetto. Il volume totale di cellule più WS-CM o nicotina, sarà di 200 microlitri / pozzetto.
- Coprire la piastra e incubare per 3 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Lavare le cellule a RT per centrifugazione a 300 xg per 3 min, aspirare il supernatante, vortex il fondo della piastra con piastra coperta e infine risospendere le cellule con 200 ml di ghiaccio freddo tampone di corsa, e ripetere la fase di lavaggio una volta.
- Aggiungere 200 ml di RPMI terreno completo alla piastra, e ripetere la fase di lavaggio ancora una volta.
- Preparate le concentrazioni di lavoro di 2 ml / ml GolgiPlug e 10 mcg / LPS ml con RPMI terreno completo e aggiungere 200 microlitri di ogni bene.
- Incubare la piastra per 6 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Al termine della fase 9.8, lavare le cellule con tampone di corsa (4 ° C) e centrifugazione a 300xg per 3 min a 4 ° C.
- Aggiungere 100 ml di Cytofix a ciascun pozzetto e incubare per 20 minuti a 4 ° C.
- Lavare le cellule 3 volte come descritto al punto 9.9 con 1x Permwash (4 ° C) a 300 xg per 3 min a 4 ° C.
- Aggiungere 45 ml di 1x Cytoperm ciascun pozzetto seguito da 5 ml di ciascuna di uno dei seguenti anticorpi in ciascun pozzetto: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incubare a 4 ° C per 30 min.
- Lavare le cellule due volte come descritto al punto 9.9 con 1x Permwash (4 ° C) e una volta con tampone di corsa (4 ° C) a 300 xg per 3 min a 4 ° C.
- Risospendere le cellule con 200 ml di 2% paraformaldeide (4 ° C). Trasferire le cellule in provette 12 × 75 mm, e analizzare i campioni citofluorimetro. ATTENZIONE: Paraformaldeide è corrosivo, acutamente tossico e pericoloso per la salute.
10. K562 Assay Uccidere
NOTA: K562 devono essere coltivatein coltura a 37 ° C e 5% CO 2 con mezzo completo RPMI fino a raggiungere 80% di confluenza prima del dosaggio.
- Preparare una 5mM carbossifluoresceina estere succinimidil (CFSE) stock soluzione con l'aggiunta di 18 ml di DMSO al flacone.
- Diluire WS-CM o nicotina in una piastra a 96 pozzetti utilizzando RPMI terreno completo per un volume totale di 100 microlitri / pozzetto per ottenere le unità equi-nicotina desiderati o concentrazioni di nicotina per ciascun pozzetto. ATTENZIONE: La nicotina è acutamente tossico e pericoloso per l'ambiente.
- Aggiungere 100 ml di PBMC in terreno RPMI completo ad una concentrazione di 1,5 x 10 6 cellule / pozzetto. Il volume totale di cellule con WS-CM o nicotina sarà di 200 microlitri / pozzetto.
- Coprire la piastra e incubare per 3 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Lavare le cellule K562 con l'aggiunta di 10 ml di DPBS e centrifugare a 400 xg per 8 minuti a temperatura ambiente.
- Risospendere le cellule con 10 ml di DPBS e contare le cellule K562.
- Preparare CFSE workisoluzione ng aggiungendo 1 ml di soluzione madre CFSE a 1 ml DPBS.
- Aggiungere 1 ml della soluzione di lavoro CFSE a 1 ml di sospensione cellulare K562 contenente 1 -, 2 x 10 7 cellule. Vortex e incubare proprio per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere immediatamente 200 ml di FBS. Vortex e incubare proprio per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 10 ml di RPMI terreno completo e centrifugare la provetta a 400 xg per 8 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante RPMI e rompere il pellet e risospendere le cellule con 10 ml di mezzo RPMI completo e contare le cellule K562-CFSE etichettati.
- Lavare le PBMC mediante centrifugazione la piastra a 300 xg per 3 min a RT. Aspirare il surnatante per decantazione del liquido. Riposizionare il coperchio e agitare la parte inferiore della piastra. Aggiungere 200 ml di RPMI terreno completo e ripetere lavaggio ancora una volta.
- Aggiungere cellule K562-CFSE etichettati con un rapporto di 01:15 (100.000 K562s: 1,5 x 10 6 PBMC) a ciascun pozzetto della piastra di PBMC e in seguito incubate per 5 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Lavare il mix cellule per centrifugazione a 300 xg per 3 min a RT. Aspirare il supernatante scartando il liquido. Posizionare il coperchio e agitare la parte inferiore della piastra.
- Aggiungere 200 ml di tampone di corsa e ripetere la fase di lavaggio descritto al punto 10.14 ancora una volta.
- Aggiungere 95 ml di tampone di corsa seguiti da 5 ml di 7AAD a ciascun pozzetto un volume totale di 100 microlitri / pozzetto. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 15 min.
- Aggiungere 100 microlitri di tampone di corsa a ciascun pozzetto e trasferire l'intero volume di sospensione cellulare da ciascun pozzetto della piastra a tubi di cluster e acquisire i campioni al citofluorimetro.
- Determinare la percentuale di cellule 7AAD-positivi e CFSE positivi citometria a flusso software di analisi.
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Representative Results
I risultati sono stati presentati come media ± errore standard della media (quattro campioni dei donatori). T-test di Student tra i campioni trattati e di controllo non trattati è stata effettuata utilizzando il software Excel nonché comparazioni t-test per tutti i trattamenti ai rispettivi controlli corrispondenti. La significatività statistica è stata indicata da: *, P <0,05; **, P <0,005; ***, P <0,0005.
Per misurare l'effetto dell'esposizione alla WS-CM e nicotina, PBMC sono state trattate con differenti concentrazioni di WS-CM e nicotina per 3 ore o 24 ore. La morte cellulare è stata misurata con il metodo di colorazione 7AAD robusto e affidabile, come intercala 7AAD in acidi nucleici a doppio filamento e può penetrare le membrane cellulari di morire o cellule morte 16. Un aumento dose-dipendente della morte cellulare è stata osservata con WS-CM a 24 ore, con un quasi morte cellulare 80% rilevato a 4 ug / ml di unità equi-nicotina (Figura 1A). A livello comparabile di morte cellulare eraosservato solo 3.000 nicotina ug / ml (Figura 1B). Poiché abbiamo esposto PBMCs per 3 ore con WS-CM e nicotina per valutare il loro effetto di induzione di citochine e la capacità di uccidere le cellule bersaglio, è stato necessario stabilire se WS-CM provoca notevole citotossicità dopo 3 ore di trattamento. PBMC trattati con 5 mg / ml di unità equi-nicotina di WS-CM non hanno manifestato tossicità significativa (<5%; Figura 1A). Il trattamento con nicotina per 3 ore causato morte misurabile (8%) di cellule soltanto a 2.000 mg / ml (Figura 1B). Pertanto, l'esposizione a WS-CM o nicotina alle dosi indicate e periodi di trattamento non provoca significative citotossicità nelle condizioni sperimentali.
Per misurare gli effetti immunomodulatori, PBMC sono state stimolate con LPS per diversi periodi di tempo, e le citochine secrete sono stati misurati con il test CBA. Per ottimizzare il tempo di stimolazione con LPS, abbiamo esposto PBMC alla stimolazione LPS per 4 ore, 24 ore, 48 ore, e 72 ore, e le citochine secrete sono stati misurati. Ad esempio, la stimolazione con LPS per 24 ore ha prodotto la secrezione massima delle citochine IL-6 e IL-8 (Figura 2), e periodi di tempo prolungati non ha determinato ulteriori aumenti (IL-6) o diminuisce (IL-8) a citochine secrezione. Risultati simili sono stati ottenuti con altre citochine secrete come IL-10, IL-1β e TNF-α (dati non mostrati).
Gli esperimenti volta portate pilota suggerito che la produzione massima di citochine in risposta alla stimolazione TLR-4 di LPS avviene per 24 ore, e quindi, citochine secrete sono stati misurati a 24 ore in tutti gli esperimenti successivi. Il trattamento con WS-CM e nicotina, seguita dalla stimolazione di recettori TLR-4 con LPS, ha determinato una riduzione dose-dipendente di citochine secrete (Figura 3). Il trattamento con WS-CM comportato sensibili riduzioni di IFN-γ (Figura 3A), TNF (figura 3B), IL-10 (Figura 3C </ Strong>) e IL-6 (Figura 3D) in unità equi-nicotina bassa (1,56 mg / ml). Soppressione di citochine è stato evidente con la nicotina anche. Tuttavia, la soppressione di citochine con nicotina verificato a dosi notevolmente più elevate, e il grado di soppressione variava tra singole citochine. Ad esempio, IFN-γ sembrava essere soppresso significativamente con la nicotina a 50 mcg / ml, mentre IL-6 è stata soppressa alla concentrazione massima (4 mg / ml) testato (Figurie 3D). Quindi, abbiamo misurato IL-8 livelli negli stessi campioni utilizzando un saggio ELISA. IL-8 secrezione è stato effettivamente soppresso nel PBMC WS-CM-esposti; mentre gli effetti soppressivi di nicotina erano significativi a 2 mg / ml (Figura 4).
I livelli di citochine intracellulari sono stati quantificati in WS-CM e le cellule trattate con nicotina dopo stimolazione con LPS. In precedenza abbiamo stimolato PBMCs per 3 giorni e abbiamo aggiunto Golgiplug durante l'ultimo 6 ore di incubazione per misurarecitochine intracellulari 14. Ora ridotto significativamente il periodo di incubazione combinando stimolazione con LPS e spina Golgi per un totale di 6 ore e misurato cellule positive citochine intracellulari (Figura 5). La Figura 5 illustra una riduzione percentuale dose-dipendente in cellule IFN-γ-positivi ( Figura 5A), cellule (Figura 5B) sia Nicotine- e WS-CM TNF-α-positive esposto PBMC, mentre una riduzione percentuale dose-dipendente in cellule MIP-1α-positivi (Figura 5C) è stato osservato in WS-CM PBMC -exposed. In questo test abbiamo osservato una diminuzione del numero di cellule positive citochine intracellulari dopo esposizione a WS-CM in equi-nicotina unità inferiori (1.56 mg / ml). Sia citochina secreta e dosaggi delle citochine intracellulari hanno mostrato risultati simili in termini di livelli di IFN-γ o cellule IFN-γ-positivi.
Come misura funzionale, la capacità di WS-CM- e Nicotine-PBMC trattati per uccidere le cellule K562 bersaglio è stato determinato. Figura 6A illustra citometria di flusso rappresentativi dati grezzi di colorazione 7AAD-positivo del target (CFSE marcato K562) uccisione delle cellule dal controllo, WS-CM-esposto, e PBMC nicotina trattati. I numeri nella casella rappresentano cento K562 CFSE-etichettati 7AAD-positivo. L'esposizione a 1,56 mg / ml WS-CM ridotto significativamente la capacità di uccisione delle cellule effettrici in PBMC rispetto al controllo e le dosi più basse. Trattamento nicotina a dosi basse e alte non ha interferito con l'uccisione delle cellule. La figura 6B mostra una riduzione dose-dipendente in percentuale di cellule K562 uccidere da più donatori in un singolo esperimento.
Figura 1. cellule morte di PBMC dopo esposizione a concentrazioni crescenti di unità equi-nicotina di WS-CM (ug / ml) e nicotina (ug / ml). (A) e con la nicotina per 3 ore e 24 ore (B). La morte cellulare è stata misurata mediante 7AAD colorazione. Ogni punto rappresenta la media ± SD barre di errore di quattro donatori da un esperimento rappresentativo. La significatività statistica è indicato da: * P <0.05; ** P <0,005, *** P <0,0005.
Figura 2. La secrezione di IL-6 e IL-8 da PBMC stimolati con LPS in diversi momenti. PBMC sono state stimolate con LPS per 4 ore, 24 ore, 48 ore, e 72 ore. I livelli di IL-6 e IL-8 citochine nei supernatanti di colture cellulari sono stati determinati utilizzando umano citochine infiammatorie Kit (kit CBA) e citometria a flusso. Tali dati rappresentano le barre media ± SD di errore da uno dei due esperimenti indipendenti utilizzando PBMC di tre differenti donatori. La statistica significance è indicato da: * P <0.05; ** P <0.005.
Figura 3. Riduzione della secrezione di citochine da PBMC trattate con concentrazioni crescenti di unità equi-nicotina di WS-CM (ug / ml) e nicotina (ug / ml) in seguito alla stimolazione con LPS. PBMC sono stati esposti a differenti concentrazioni di WS-CM e nicotina per 3 ore e stimolate con LPS per 24 ore. I livelli di IFN-γ (A), TNF (B), IL-10 (C), e IL-6 (D) citochine nei supernatanti di coltura cellulare sono stati determinati usando un test Th1 / Th2 CBA e citometria a flusso. Questi dati rappresentano le barre media ± SD di errore da uno dei tre esperimenti indipendenti utilizzando PBMC di quattro diversi donatori. La significatività statistica è indicato da: * P <0.05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Superiore con centrazioni di WS-CM erano anche statisticamente significativo *** P <0,0005.
Figura 4. Attenuazione di IL-8 secrezione da PBMC trattate con concentrazioni crescenti di unità equi-nicotina di WS-CM (ug / ml) e nicotina (ug / ml) in seguito alla stimolazione con LPS. PBMC sono stati esposti a WS-CM e nicotina, stimolate con LPS per 24 ore, e secreto IL-8 è stato misurato mediante ELISA. Tali dati rappresentano le barre media ± SD di errore da uno dei tre esperimenti indipendenti utilizzando PBMC di quattro diversi donatori. La significatività statistica è indicato da: * P <0.05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Concentrazioni più elevate di WS-CM erano anche statisticamente significativo *** P <0,0005.
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Figura 5. Riduzione di cellule positive citochine intracellulari in PBMC trattate con concentrazioni crescenti di unità equi-nicotina di WS-CM (ug / ml) e nicotina (ug / ml). PBMC sono stati esposti a concentrazioni variabili di WS-CM e nicotina per 3 ore e stimolati con LPS e Golgiplug per 6 ore. Il controllo del veicolo per WS-CM e la nicotina era RPMI terreno completo. Intracellulare (C), le cellule MIP-1α-positivi IFN-γ-positivi (A), TNF-α-positivi (B), e sono stati quantificati mediante citometria a flusso. Tali dati rappresentano le barre media ± SD di errore da uno dei quattro esperimenti indipendenti utilizzando PBMC di quattro diversi donatori. La significatività statistica è indicato da: * P <0.05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Concentrazioni più elevate di WS-CM erano anche statisticamente significativo *** P <0,0005.
Figura 6. ridurre bersaglio PBMC uccidere capacità con esposizione a concentrazioni crescenti di unità equi-nicotina di WS-CM (ug / ml) e nicotina (ug / ml). PBMC sono state trattate con concentrazioni indicate di WS-CM e nicotina per 3 hr, e le cellule K562 CFSE etichettati sono stati poi aggiunti come cellule bersaglio e incubate per ulteriori 5 ore. Le cellule sono state colorate con 7AAD e citometria a flusso è stato utilizzato per valutare la capacità di uccidere. La figura 6A mostra il flusso rappresentante citometria risultati con cento uccisione indicato nelle caselle gated. La freccia indica ridotto cento uccisione in 1,56 mg / ml esposti WS-CM. Figura 6B mostra rappresentativi bar media ± SD di errore da quattro esperimenti indipendenti utilizzando PBMCs provenienti da quattro diversi donatori. La significatività statistica è indicato da: ** P <0,005; *** P <0,0005. Concentrazioni più elevate di WS-CM erano anche statisticamente significativo with *** P <0,0005.
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Discussion
Noi e altri abbiamo già dimostrato che il trattamento dei PBMC con centrali termiche sopprime diverse risposte, tra cui l'espressione e la secrezione di citochine e misure funzionali come cellula bersaglio uccidendo 14. I metodi sperimentali descritti nel precedente lavoro richiedono periodi di incubazione più lunghi e sono stati modesti in grandezza 14. Date le potenziali applicazioni di questa affascinante ex vivo modello di ricerca di base e applicata, abbiamo studiato se nessuno dei parametri del test in questi saggi biologici multi-step potrebbe essere ottimizzato. Qui vi presentiamo semplificato metodi per misurare la risposta immunitaria TLR-mediate usando un modello ex vivo PBMC TPP-trattati.
Isolamento di PBMC vitali è un requisito fondamentale per questi ex vivo test. Data la variabilità individuale e lo stato fisiologico in potenziali donatori, è ideale per ottenere PBMCs che sono sensibili. Ai fini di questo studio, isoliamod PBMC da soggetti adulti generalmente sani utilizzando un metodo precedentemente pubblicato 15. Inoltre, in questo studio per ridurre al minimo la variabilità tra i donatori, abbiamo escluso quelli con allergie, infezioni, o che sono stati di prendere qualsiasi prescrizione o sopra i farmaci da banco come l'aspirina. Inoltre, isolamento di PBMC da sangue raccolto di recente è auspicabile, in quanto garantisce la vitalità e la funzionalità delle cellule negli esperimenti successivi ottimale.
I metodi precedenti utilizzati stimolazione con agonisti TLR per 67-72 h per misurare le citochine intracellulari e citochine secrete 14. Una volta portate a secrezione di citochine in cellule TLR-stimolate (in condizioni di controllo senza WS-CM o nicotina) ha suggerito che la secrezione massima si è verificato a 24 ore. Inoltre, abbiamo combinato l'incubazione con agonisti TLR e Golgiplug e ridotto il tempo di incubazione per un totale di 6 h per misurare citochine intracellulari. Mentre questo richiesto un dosaggio separata per misurarecellule citochine-positivi, i dati sono più robusti rispetto al metodo precedente 14. In linea con i risultati precedenti, WS-CM fortemente soppresso l'induzione di citochine intracellulari e secrete. Così, queste modifiche hanno portato ad una riduzione sostanziale volte dosaggio e hanno prodotto risultati molto simili a quelle descritte in letteratura. Mentre abbiamo utilizzato citometria di flusso e metodi ELISA per valutare i livelli di citochine, altre tecniche, come in tempo reale la reazione a catena della polimerasi quantitativa (RT-qPCR) possono anche essere utilizzati come tecnica complementare.
Storicamente, indirizzare l'uccisione delle cellule da PBMC effettrici utilizzati metodi radioattivi (ad esempio, test 51 Cr-release). Il metodo descritto nella presente relazione elimina l'utilizzo di radioattività e impiega celle di carico con un colorante fluorescente cui presenza potrebbe essere monitorato mediante citometria di flusso. Un altro vantaggio del metodo qui descritto è che è relativamente rapido e può essere adapted al test high-throughput. Dal momento che il periodo di incubazione di cellule bersaglio e effettrici è 5 ore, questo test può essere completato in 8 ore. Ciò in contrasto con altri metodi pubblicati, che sono più coinvolti in quanto richiedono isolamento di sottotipi di PBMC e di attivazione / stimolazione per un periodo di diversi giorni, o l'analisi di cellule NK e coniugati cellule K562 per monitorare citotossicità 17,18. Un altro vantaggio del metodo è che esso utilizza PBMC crioconservati direttamente come cellule effettrici, che consente una maggiore flessibilità.
In sintesi, abbiamo descritto diversi saggi per determinare l'effetto della risposta immunitaria TLR-mediata in combustibili PBMC TPP-trattati, che può essere facilmente applicato per testare composti diversi. L'utilizzo di componenti crioconservati permette una notevole flessibilità, e con tecniche consolidate come la citometria a flusso, le analisi CBA, e ELISA, robusto e risultati costanti potrebbero ottenere rapidamente tra i diversi laboratori.
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Acknowledgments
Questo lavoro è finanziato da RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) nell'ambito di un accordo di ricerca in collaborazione con la Wake Forest University School of Medicine. GL Prasad è un dipendente a tempo pieno di RJRT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 ml microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96-well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96-well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em 785. |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, irritant, corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
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