Summary
En trinn-for-trinn-protokollen for den inter-posisjon plassering av Tissue Konstruert Vessels (TEVs) i halspulsåren av en sau ved hjelp av ende-til-ende-anastomose og real-time digital vurdering in vivo til dyreoffer.
Abstract
Utviklingen av vev konstruert fartøy (TEVs) føres frem ved evnen til å rutinemessig og effektivt implantat TEVs (4-5 mm i diameter) inn i en stor dyremodell. Et trinn for trinn protokoll for inter-posisjonsplassering av TEV og sanntids digital vurdering av TEV og innfødte carotis er beskrevet her. In vivo overvåkning er gjort mulig ved implantering av strømnings sonder, katetre og ultrasoniske krystaller (stand med å samle inn dynamiske diameter endringer av implanterte TEVs og innfødte carotis) på tidspunktet for kirurgi. Når implantert, kan forskerne beregne arterielle blodstrømningsmønster, invasiv blodtrykk og arterie diameter givende parametere som puls bølgehastighet, styrking indeks, pulstrykk og etterlevelse. Datainnsamlingen blir oppnådd ved hjelp av en enkelt datamaskin-program for analyse i løpet av varigheten av eksperimentet. Slik uvurderlig data gir innsikt i TEV matrise ombygging, sin resemblance til morsmålsopplæring / humbug kontroller og generell TEV ytelse in vivo.
Introduction
Det primære fokus for utvikling av TEVs har vært å gi en erstatning for autolog pode erstatning når autologe fartøy er ikke tilgjengelig, og å begrense donor syn sykelighet. For eksempel har antallet hjerte bypass operasjoner per år oversteg 350.000 i USA, og den ideelle kilden til egnede grafts forblir den venstre indre brystarterie, venstre fremre nedstigende koronar og saphenavene en. Siden mange personer som lider av vaskulære sykdommer ikke kan ha egnede arterier og vener for autolog pode erstatning, har utviklingen av TEVs dermed bli en intens forskningsfelt i flere tiår 1-6. Mens ingeniør- og optimalisering av nye TEVs har gjennomgått mange fremskritt, rapportering på de kirurgiske teknikker ansatt for å implantere de TEVs seg selv har ikke vært et tema for en slik intens diskusjon. Snarere er protokoller vedrørende implantasjon av TEVs i dyremodeller hovedsakelig venstreopp til forskning etterforskere.
Følgende manuskript demonstrerer hvordan å implantere TEVs ved å utnytte en ende-til-ende-anastomose tilnærming. Denne prosedyren ble optimalisert ved bruk av en spesifikk anastomotisk suturering mønster, stabiliserende sutur teknikk, å optimalisere langsgående strekk, og tilsetningen av in vivo overvåkning instrumentering. Denne metode er i motsetning til noen av de mange variasjoner som tidligere har blitt benyttet. Videre beskriver denne fremgangsmåten hvordan å skaffe parametre slik som arterielt blodtrykk, TEV diameter / compliance og strømningshastighet gjennom TEV etter operasjonen inntil explantation. Denne datainnsamlingen gir en uunnværlig analyse av TEV mens den er i ferd med ombygging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne protokollen er godkjent av Animal Care og bruk komité ved State University of New York i Buffalo.
1. Pre-kirurgisk Forberedelse
- Bruk sau (Dorset kors, kvinne, ca 1-3 år gammel med en vekt på 40-60 kg) for følgende studie. Administrere cyklosporin A (200 mg / dag), aspirin (975 mg / dag), og coumadin (20-30 mg / dag) oralt, med start 3 dager før kirurgi, og fortsetter så lenge alle studier.
- Sikre sauene har fastet 12 timer før kirurgi (normal fôr = 1,8 kg høy og 0,4 kg korn).
- Sterilisere alle kirurgisk utstyr med en dampautoklav ved 121 ° C og 15 psi i 30 min.
- Plasser følgende elementer i en paraformaldehyde eksikkator 48 timer før operasjonen: 4 mm Doppler strømnings sonder, en mm ultralyd krystaller, inneliggende arterielle katetre, forlengelse rør, og 42 "Tygon slange.
MERK: En tabell med relevant medisinsk utstyr som trengs for denkirurgi og for sterilisering er oppført i tabell 1. Pre-plassering av instrumentering inn i Tygon slangen på dette trinnet vil bidra til å spare tid under operasjonen.- Merk hver ende av sonder, katetre og krystaller som venstre og høyre, hvis det er aktuelt.
2. kirurgisk operasjon
- Indusere sau for anestesi med diazepam (0,5 mg / kg) og ketamin (4 mg / kg) intravenøst (IV). Alternativt kan du bruke Telazol (4 mg / kg) IV.
- Utføre orotrakeale intubasjon med en 8,5 til 10,0 mm indre diameter håndjern endotrakealtuben 7.
- Administrere sniffe anestesi gjennom et gjenpusting krets med et tidevolum ventilator (7-10 ml / kg) eller en trykkregulert ventilator (15-20 cm H 2 O). Bruke en presisjonsfordamper for å administrere isofluran eller sevoflurane ved en passende mengde (3% -4% innledning) for å nå et medium til dyp bedøvelse kirurgisk fase. Den minste alveolære konsentrasjon forsau er 1,4% og 1,9% av henholdsvis 8.
- Vurdere bedøvelse dybde ved å observere motor respons på stimuli, øyelokksrefleks, øye posisjon og hjerterytmen. Overvåke blod oksygenmetning (95% -100%) ved hjelp av pulsoksymetri, CO 2 -konsentrasjon (45-55 mmHg) i ekspiratoriske gasser ved hjelp av kapnografi og opprettholde kroppstemperaturen under prosedyren (38,5 til 39,5 ° C) ved hjelp av en automatisk regulert oppvarming teppe.
- Barbere ull fra hele halsen på sau, og over en kefalvenen, ved hjelp av en # 40 blad på standard klippere. Forbered huden på begge områder for kirurgi ved hjelp av 70% isopropylalkohol og 7,5% Betadine skrubb mettet gasbind. Begynn med alkohol gasbind for å lette fjerning av hudfett. Veksle mellom Betadine gasbind og alkohol gasbind tre ganger.
- Plasser sau på operasjonsbordet i ryggleie, på toppen av en varmende teppe. Passere en mellomstor orogastric tube for å tillate passiv utvisning av mageinnhold. Forlengesau nakke og bruke støttende demping som nødvendig for å opprettholde plasseringen.
- Utføre en endelig aseptisk skrubb bruker 7,5% Betadine gjennomvåt gasbind og la den sitte i 5 min før operasjonen.
- Administrere intravenøse væsker (Ringers løsning eller 0,9% saltoppløsning) ved 10 ml / kg / time gjennom en angiocath plassert i kefalvenen. Administrere intra antibiotika og smertestillende: Penicillin G Procaine 6600 U / kg intramuskulært (IM), Gentamicin 1,6 mg / kg IM, og Buprenorfin 0,005 til 0,01 mg IV eller IM.
- Lag en ~ 12 cm snitt på langs over ventral midtlinjen halsen ved hjelp av elektrokirurgi. Isolere venstre og høyre carotis (~ 6 cm) ved å fjerne bindevev ved hjelp av en stump disseksjon teknikk. Feste og cauterize mikro fartøy forgreninger fra carotis å minimere blødning.
- Opprettholde sterilitet ved å benytte (en ikke-steril) kirurgisk sykepleier for å bistå med gravende all kabling og rør (strømningsprobe, ultralyd krystall ledningerog kateterrøret) i det subkutane laget av huden. Bruk en avstumpet trokar, som kommer ut gjennom kirurgisk prepped snitt på dorsolateral halsen.
- Nå under sterile drapere og slå hodet av sau slik at den siden av halsen kan visualiseres under drapere.
- Bruke en 8 cm buet hemostat til tunnelen gjennom den subkutane rom mellom ventrale midtlinje nakkesnitt og på siden av halsen. Åpne og lukke pinsetten til omsvøp dissekere en plass for slangen ~ 1,5 cm bred. Tips av pinsetten bør ligge halvveis mellom hodet og skuldre, ca 10 cm hale til høyre eller venstre øre. Slå pinsetten slik at tipsene peker mot det overfladiske hud.
- Nå under sterile drapere og lage en 1,5 cm snitt gjennom huden, over tips av pinsetten med en steril # 11 blad. Visualisere tips av pinsetten for å bekrefte en klar exit gjennom huden.
- Passere Tygon rør som inneholder enll ledninger og rør via subkutan tunnel. Holde ledningene og rør over den sterile drapere.
- Komme til under overtrekket for å fjerne den ytre Tygon rør fra halsen, utsette den implanterte ledninger som det forlater halsen av sau. Trekk enkelte linjer ut for å minimere eventuell slakk i det subkutane plass. La det være nok avstand til skikkelig feste instrumentering til arterien.
- Plasser 4 mm Doppler strømnings sonder på begge halspulsårene og oppnå en første lesning (figur 1). Administrer 100 U / kg heparin IV 30 min før klemarterien.
- Fortsett heparin administrasjon på 100 E / kg / time til slutten av operasjonen. Klem halspulsåren ved hjelp av ikke-knusing vaskulære klemmer og avgiftsdirektoratet en del (ca 4 cm i lengde). Kontralateral carotis strømningshastighet vil øke 50% -100% for å opprettholde blodstrømmen til hjernen.
MERK: Det er mulig å begrense langsgående strekning av rekyl av innfødte fartøy ved å fjernekortere segmenter enn erstattes og / eller strekke den innfødte arterie med vaskulær klemmer til forkorte gapet inntil full anastomotisk prosedyren er fullført. Dette vil bidra til å begrense spenningen på individuelle holde sting og implanterte pode. - Sutur TEV på plass ved hjelp av enkle avbrutte sting med 7-0 prolin ethalloy dobbel væpnet monofilament sutur. Om nødvendig, vaskulære glatte muskelavslappende midler så som Papaverin (15 mg / ml) eller nikardipin (1,25 mg / ml) topisk til det native blodkar for å hindre vasokonstriksjon som ville hemme anastomotisk suturering.
MERK: Begynn å plassere sting med ca 1 mm avstand. Dette kan i stor grad variere fra sak til sak. Sammensetningen og tykkelsen TEV vil påvirke den effektive avstanden mellom suturer. Ettersom tykkelsen av det opprinnelige vev eller TEV avtar, kan det være nødvendig å plassere suturene tettere sammen.- Første anker fire poeng av TEV til de innfødte arterien ved å plassere to motstridende stitches på både proksimale og distale ender (figur 2 -di). Hold hver anker undervist ved hjelp hemostats.
MERK: nære og fjerne beskrivelser er i referanse til retning av blodstrøm gjennom papiret. - Tilsett 5-6 flere suturer på overflatisk side av både den proksimale og distale endene til å begynne anastomosen. (Figur 2-Pr). Samtidig rotere vaskulær klemmer 180 grader.
- Re-etablere spenning på forankrings sting. Legg ekstra (5 til 6) avbrutt sting til proksimale og distale ender på roterte side av TEV.
- Første anker fire poeng av TEV til de innfødte arterien ved å plassere to motstridende stitches på både proksimale og distale ender (figur 2 -di). Hold hver anker undervist ved hjelp hemostats.
- Når TEV er godt sydd på plass, rotere den tilbake til utgangsposisjon og fjerne den vaskulære klemmer en om gangen, distal klemme først. Liten blødning på anastomose nettsider er vanlig. Dette kan selvsagt løse etter flere minutters klemme utgivelsen og reclamping eller kreve plassering av flere sting. Plasser Doppler flow probe (Figur 3-Fl) Tilbake på mors arterie proksimale til blodstrømmen inn i TEV og monitor strømningshastighet.
MERK: Forvent strømningsrater på venstre og høyre carotis til stabilisering etter ca 15 min. Dersom vannmengden på halspulsåren med implantert TEV stadig faller, er det mulig at TEV er blodpropp. Andre mulige uregelmessigheter vedrørende strømnings kan tilskrives innsnevring av det native arterier proksimalt eller distalt til TEV. Hvis dette skjer, kan bruk av ekstra vaskulær glatt muskelavslappende brukes, og de innfødte fartøyet skal returnere til en basal tone etter 30-60 min etter nedlegging av vev over pode nettstedet.- Dersom det er ønskelig, eksisere kontralaterale halspulsåren og sy den tilbake på plass som en "Sham" kontroll. Dette er mer klinisk relevant enn å forlate den høyre arteria carotis alene og kun feste strømningsprobe, ultralyd krystaller, og kateter. Hvis en humbug kontroll er ønsket, utføre dette før du går videre til trinn 2.11.
- Suturer 1 mm ultralyd krystaller (figur 3 -cr1 CR2) til motstående sider av TEV ved hjelp 7-0 Prolin. Tråd sutur gjennom ultralyd krystall hodet og sy bare til den overfladiske lag av TEV.
- Kateterisere arterien ved hjelp av en modifisert 18 G kateter med en Teflon vevd placket (figur 3 Ca & Figur 4A). Plassere kateterets distale til TEV på mors arterielt vev.
- Sy stolpen til arterieveggen med 5/0 Ethibond å kontrollere blødninger. Bruk cyclohexanon å feste microbore slangen til kateter som har blitt spylt med saltvann. Bruk slangen som en forlengelse linje.
- Bruk en 20 G Luer Stub Adapter med en Surflo Injection Plug å forsegle exteriorized enden av slangen (Figur 4B). For å opprettholde åpenhet av kateteret, skaffe fyllevolum av linjen og skylles med 10 ml saltvann og deretter 5000 U / ml heparin-natrium injeksjon hver 2-3 dager.
- Registrere avstanden mellom strømningssonden og ultralyd krystaller, så vel som avstanden mellom strømningssonden og kateteret. Dette vil muliggjøre pulsbølgehastighet til å bli beregnet i forbindelse med programvare. Ved slike beregninger ikke er nødvendig, ikke implantere et kateter.
- Få en intraoperativ lesing hvis ønskelig for å sikre alle implantert maskinvare er funksjonell (se avsnitt 3).
- Sikre implantert linjer og ledninger til nærliggende muskulatur bruker 2/0 Silk og en taper nål (figur 3).
- Plasser den vaskulære strømningsprobe ledning parallelt med fartøyet, med proben caudal og tråden som strekker seg kranialt, og deretter gjøre en "U-sving" mot det laterale muskulatur. Fest ledningen til tilstøtende muskulatur, ved hjelp av 2-0 silke på en taper nål på to steder, slik at ledningen eller strømningsprobe er ikke i stand til å plassere noen belastning på fartøyet. Sørg sting er tettsittende, men ikke stram og strangulate musculaTure (figur 3).
- Sutur krystall ledninger og arterielt kateter linje til den laterale muskulatur, slik at for ~ 1,5 cm av slakk, i likhet med foregående trinn for å sikre strømnings probe (figur 3).
- Gruppere alle ledninger og linjer sammen og forankrer dem til muskulaturen like før du avslutter ut gjennom subkutan tunnel, lik tidligere trinn.
- Lukke operasjonsstedet med en 2-0 Vicryl sutur i lag med en som kjører sutur mønster på dashbordet og subdermal, kjører madrass sy på huden (dashbordet, ikke-skjærende nål, hud, skjærende nål). Lukke 1,5 cm snitt på rygg halsen rundt exteriorized ledninger og linjer ved hjelp av 2/0 Vicryl og et skjære nål.
- Plasser strømningsprobe ledninger, kateter linjer, og ultralyd krystall ledninger inn i en pose (10 cm x 10 cm) som er sikkert suturerte til huden på sauen (Figur 5 - etter recovery).
- Gradvis avvenne sauene av anestesiog tidevolum ventilator deretter extubate sauene når spontan pusting er gjenopptatt. Fjern det angiocath innsatt i kefalvenen og bandasje hvis nødvendig.
- Bandasje halsen ved hjelp trippel antibiotisk salve på snittene, en Telfa pad, stretch rull gasbind, og elasticon.
- Administrere postoperativ analgesi: fluniksin meglumine 2,2 mg / kg IM gang under utvinning, deretter 1,1 mg / kg IM en gang om dagen i to dager, buprenorfin 0,005 til 0,01 mg IV eller IM to ganger om dagen for en dag.
3. I Vivo Monitoring
- Plassere sauene inn mobil cart for å sikre riktig tilbakeholdenhet. Dette gjør at sauene å forbli rolig og bevisst uten at maskinvaren. Kan ha behov for å akklimatisere sau i handlevogn to eller tre ganger i 30 min før å skaffe instrumentering innspillinger.
- Fjern alle ledninger og linjer fra posen og koble til overvåkingsenheter. Koble strømningsprobe til en strømningsmåler, 1 mm ultralyd krystaller koblet til TRB-USB Boks, og kateter linjer til trykktransduktorer. Et flytskjema av dette oppsettet er gitt (figur 6).
- Kalibrere strømnings prober og trykkgivere før datainnsamling.
MERK: På grunn av potensiell variasjon mellom programvareversjoner og forskjeller i utstyr som brukes, kalibreringer og innstillinger vil variere fra sak til sak. - Utnytte et oscilloskop for å finjustere Sonometrics krystall måling, i henhold til produsentens protokoll.
- Rekord data ved hjelp av dataprogram (figur 7). Spor i den øverste halvdelen av figur 7 i hvit farge tilsvarer det implanterte TEV, mens spor i den nederste halvdelen i rød farge tilsvarer Sham / Native. For både TEV og Sham strømningshastigheten (ml / min), arterielle blodtrykk (mm Hg) og diameter (mm) er spilt inn live.
- Rekord i minst 1 min, uten forstyrrelser. Eksportere disse dataene for mer detaljerte analyser. Etter innspillingen, DISCONNect alle ledninger og sted tilbake i posen sydd på halsen av sauene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mer enn 30 sauer har gjennomgått den kirurgiske teknikken som er beskrevet i denne rapporten for implantering av TEVs (i pressen) 9. En tabell som oppsummerer de nyligste sauer operasjoner etter protokoll optimalisering er vist i tabell 2. Alle sauene gjenvunnet etter TEV implantasjon uten livstruende komplikasjoner. I noen dyr, ble fibrose observert i native arterie nær spissen av den iboende arteriekateter. En betydelig økning av inflammasjon med tilstedeværelse av tilsatt instrumentering er ikke blitt observert. Sjelden (1 av 18 katetre), har kateteret forårsaket hindring for blodstrømmen gjennom TEV. Denne hindring skjedde etter en måned. Mindre komplikasjoner fra kateteret inkluderer demping av den arterielle signal og manglende evne til å suge blod. De hyppigst rapporterte data når forfølge forskning i TEV utvikling er typisk åpenhetsgrader, strømningsrater og etterlevelse. Denne protokollen demonstrerer at det er mulighetible å oppnå slike verdifulle data under hele forsøket. Selv om denne rapporten fokuserer på oppkjøp av strømningshastighet, diameter og arterietrykk; compliance, forstørrelse indeks og puls-bølgehastighet kan også beregnes.
Figur 1. Isolert halspulsåren. Isolert halspulsåren er vist med strømningsprobe vedlagt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Implantasjon av TEV. Figur 2-di illustrerer den distale side av TEV med to av de opprinnelige fire festepunkter som brukes for å feste TEV på plass. Når TEV er forankret, legge addit ional masker som vist i figur 2-Pr, som betegner den proksimale siden av TEV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Instrumentering av TEV. 1 mm ultralyd krystaller er sydd på hver side av den implanterte TEV (CR1 og CR2). Di betegner den distale side av TEV mens Pr betegner proksimalt. Den flowprobe (Fl) plasseres proksimalt fra TEV mens kateteret (Ca) er plassert distal. Strømningsprobe og kateter er sydd til nærliggende muskulatur (stiplet oval). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
en "src =" / files / ftp_upload / 52354 / 52354fig4.jpg "/>
Figur 4A. Kateter brukes for instrumentering av TEV. Kateter kombinert med en Teflon Plaquet før de blir plassert distal til TEV på mors vev. 4B. Sluttmontering av kateter før implantasjon. Kateter utvidet med Tygon rør (merket med firkant) sammen med 20 G Luer Stub Adapter med Surflo injeksjon plugg (merket med oval). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Pouch festet til huden av sau. Pouch er festet til halsen av sau for å beskytte kabling av 1 mm ultralyd krystaller, flyt sonde og kateter når den ikke er i bruk. Vennligst click her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Flytskjema av elektronikk som brukes for opptak ultralyd krystall avstander, blodstrøm og arterietrykk. Flytskjema av oppsett brukes til å registrere avstander mellom ultralyd krystaller, arteriell blodstrøm og blodtrykk. * Bruk et oscilloskop kan hjelpe til klarhet av signalene som mottas fra 1 mm ultralyd krystaller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Opptak av sanntids ultralyd krystall avstander, blodstrøm og blodtrykk på dataprogrammer. White-farget spor indicate opptak fra TEV. T01 R02, og T02 R01 indikerer kommunikasjon mellom ultralyd krystall CR1 å CR2 og cr2 til CR1 hhv. ARP indikerer registrert arterietrykk mens ABF indikerer arteriell blodstrøm. Det samme beskrivelse brukes for rød-farget spor som er den innfødte / humbug halspulsåren. Den registrerte avstand mellom ultralyd krystaller under innspilt pulstrykk av arterietrykk indikere prosent overholdelse av TEV / Sham. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Medisinsk Utstyr | ||||
| Utstyr | Produsent | Serial / Catalog # | Kvantitet | Notater |
| Trykk Transducer | Becton Dickinson | P23XL-en | 1+ (En for hver arterie) | Brukes med vannfylte membran kupler |
| Forsterker og svinger boks | Gould | 5900 Signal Conditioner Cage | 1 | To transdusere og forsterkere bør inkluderes i bur. Mens dette spesifikke enheten kan avsluttes, vil andre kommersielt tilgjengelige trykk transdusere med en BNC / analog utgang kommunisere med Sonometrics utstyr. |
| T403 Console med TS420 perivaskulær målere modul (x2) | Transonic Systems | T403 modul og TS420 (x2) | 1 | Strømnings prober måler strømmen gjennom hver av carotis vil koble til hver av de TS420 enheter. |
| Digital ultralyd måleenhet | Sonometrics | TR-USB | ||
| Flyte Probe Precision S-Series 4 mm Transonic Systems Inc. | MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA | 2 | ||
| 1 mm Sonometrics Krystaller | Sonometrics Systems | 1R-38S-20-NC-SH | 2-4 (To for hver arterie) | |
| Kateter for implantasjon | BD (Becton Dickinson) | 381447 | 1+ (En for hver arterie) | Kateteret er kuttet og festet til microbore rør, er stylette benyttes for innsetting. |
| Tygon Microbore Tubing | Norton ytelse plast | (AAQ04127) Formulering S-54-HL | NA (Kuttet til lengde for en forlengelse sett) | |
| Luer Stub Adapter | BD (Becton Dickinson) | 427564 (20 G) | 1+ (En for hver arteriekateter) | |
| Surflo Injection Plug | Terumo SR-IP2 | 1+ (En for hver arteriekateter) | ||
| Meadox | PTFE (Teflon) Felt | 019306 | NA (Kuttet til størrelse) | PTFE følte brukt i våre studier ble avviklet. Men sammenlignbare selskaper som "Kirurgisk Mesh" tilby produkter som er likeverdige. |
Tabell 1. Tabell av all relevant utstyr som brukes for kirurgiske prosedyren.
| Kirurgiske prosedyreresultater | ||||
| Instrumentering | TEV | Sham | Antall Sheep | Prosedyre Tid (timer) |
| Ikke | Ja | Ikke | 8 | 2.61 ± 0.25 |
| Ikke | Ja | Ja | 3 | 4.17 ± 0.28 |
| Ja | Ja | Ja | 10 | 6.26 ± 0.75 |
Tabell 2. Tabell oppsummerer nyeste sau som har gjennomgått TEV og / eller Sham implantasjon. Tabellen nedenfor oppsummerer våre nyeste TEV implantater. Alle sauene levde gjennom kirurgisk operasjon og hadde ingen komplikasjoner poste utvinning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hensikten med denne rapporten er å gi en pålitelig og reproduserbar prosedyre til implantat TEVs av interesse i sau halspulsåren. De innfødte carotis av dyrene som brukes i denne modellen var 0,5-0,75 mm i tykkelse og 4,5-5 mm i utvendig diameter. Den kirurgiske teknikken beskrevet her har vært vellykket for å implantere TEVs av varierende geometrier som måler 0,25 til 1 mm i tykkelse, 4-5 mm utvendig diameter og 4 cm i lengde med stor suksess beviser effektiv opp til 3 måneders varighet, den tiltenkte sluttpunkt. Bruken av dette kirurgisk teknikk har gjort det mulig oppkjøp av data for å være lettere å samle og mer konsekvent.
Videre har evnen til å måle sanntids parametere av in vivo ombygging blitt beskrevet. Forskjellige diametere kan anvendes med hell i denne modellen, avhengig av ønsket område av mistilpasning og utforming av implantert TEV, i tillegg, kan varigheten av implantasjon forlenges til eller forbi en jar.
En av de største fremskritt i optimaliseringen av denne protokollen er bruken av ende-til-ende-anastomose ved å bruke en avbrutt sutur teknikk. Den nåværende TEV utforming brukes i utarbeidelsen av denne rapporten opprinnelig brukt ende-til-ende anastomoser bruker en løpende sutur teknikk som resulterte i en høy strykprosent (n = 3). Den nøyaktige årsak til dette er ikke kjent, men det kunne ha vært potensielt grunn av den stenotiske svak eller ikke-kompatibel virkning av en løpende sutur på anastomosestedet. I letingen etter alternative metoder for å optimalisere den kirurgiske prosedyren ble det funnet at tidligere rapportert kirurgiske teknikker som er beskrevet i litteraturen er noe uklar. Dette er hovedsakelig på grunn av ordet begrensninger som følger av tidsskrifter tvinge forskere til å rapportere sine kirurgiske teknikker i en kort og uklar måte. Noen rapporter bare staten som dyr gikk TEV implantasjon 10-12. Andre rapporterer anvendelse av ende-til-side-3,5,13,14, ellerende-til-ende 4,6 anastomose. Til slutt, andre spesifikt sier bruk av avbrutt 4, eller kontinuerlig drift sutur 15. Denne mangel på detaljer som gjør det vanskelig å reprodusere eller forbedre vaskulær forskning krever kirurgi, spesielt på store dyremodeller. Mens det ikke er noen signifikant forskjell rapportert i åpenhet mellom ende-til-ende og ende-til-side-teknikk 16 i den store dyremodell som rapporteres her, er fordelaktig ende-til-ende ved bruk av halspulsåren på grunn av anatomien og Lengden av de TEVs vanligvis evaluert. Imidlertid, hvis en stor uoverensstemmelse mellom den native arterien og TEV er til stede, kan det være ideelt å anvende en ende-til-side-teknikk som har vist seg lovende i rotter 17.
Sikre at den kirurgiske teknikken er ikke en årsak til TEV svikt tillater forskere å fokusere på andre mulige forklaringer på okklusjon. Ved kortvarig åpenhet og eksponering til fysiologiske betingelser, slik som blodog press er den eneste interessen, en tidligere rapportert manuskriptet er tilgjengelig. Her har bruken av en sau ex vivo arteriovenøs shuntmodell utformet for å evaluere TEV implantability blitt optimalisert 18. Denne modellen har vist seg å være svært effektive i raskt testing av flere TEVs med ett dyr før du forplikter deg til å implantere en TEV for langtidsstudier.
Ved evaluering av integriteten til en implantert TEV er ønskelig, dessverre konvensjonelle teknikker har ulemper. Foreløpig ultralyd eller angiografi bildebehandling er de eneste metodene som brukes for å evaluere integriteten til TEV in vivo 3,5,6,10-14. Ultralydavbildning ikke vanligvis gir oppløsningen som trengs for å observere compliance endringer av TEV. Angiografi er invasiv, kostbart og krever bedøvelse av dyret. Men ved å implantere strømnings sonder, arterielle katetre og ultralyd krystaller mye av disse dataene kan bli kjøpt på en mer forenklet måte. Dette istrumentation av den implanterte TEV tillater også parametere slik som puls-bølgehastighet og styrking indeks som skal beregnes.
Fordelen med å bruke sau for TEV implantering også gir styrke for oversettelse av TEVs inn i en klinisk sammenheng. Små dyremodeller som mus, rotter og kaniner tilbyr ikke en realistisk parallell til de av en klinisk setting og derfor store dyremodeller må utforskes 19. Imidlertid, mens en stor dyremodell er en mer pålitelig og klinisk relevant modell, der finnes angående arten som brukes for TEV implantasjoner. Hunder og griser for eksempel, mens ofte brukt i vaskulær forskning, endothelialize meget raskt. Sau på den annen side bare endothelialize nær anastomose områder, og ikke spontant i TEV. Dette mer ligner helbredelsen av mennesker 14,19-22.
For ytterligere å forstå hva som har skjedd med hensyn til å være vert ombygging, denTEV må eksplantert og undersøkes, for å beskrive cellemigrering, immobilisering og differensiering. Tidligere arbeid har vist at tilsetning av lipofilt fargestoff som Dil, så vel som anvendelse av GFP + endotelceller er pålitelige metoder for å vurdere skjebnen til implanterte celler på TEV 5,6. Vår gruppe har også vist at SRY flekker (Sex bestemmende region Y protein) mot mannlig kromosom Y er en effektiv metode for å spore mannlige implantert celler i en kvinnelig vert (i pressen). Kollagen og elastin innhold kan også måles etter vevet er eksplantert, Shedding mer lys over omfanget av in vivo ombygging. Det er også mulig å bestemme hvorvidt pre-implantat samt eksplanterte vev kan reagere på vasokonstriktorer og vasodilatorer når den plasseres i et organ vev-bad. Til slutt kan TEVs også testes for å bestemme mekaniske egenskaper som Youngs modulus, strekkfasthet, og tøyelighet 6,9,23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Heart and Lung Institute (R01 HL086582) og New York Stem Cell Science Fund (NYSTEM, Contract # C024316) til STA og DDS Illustrasjonene som brukes i Jove video ble gjennomført av John Nyquist; Medisinsk Illustrator fra State University of New York i Buffalo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pressure Transducer | Becton Dickinson | P23XL-1 | Quantity: 1+ (1 for each artery). Used with water-filled diaphragm domes. |
| Amplifier and transducer box | Gould | 5900 Signal Conditioner Cage | Quantity: 1. Two transducers and amplifiers should be included in cage. While this specific unit may be discontinued, other commercially available pressure transducers with a BNC/analog output will communicate with the Sonometrics equipment. |
| T403 Console with TS420 perivascular flowmeter module (x2) | Transonic Systems | T403 module and TS420 (x2) | Quantity: 1. Flow probes measuring flow through each of the carotid arteries will connect to each of the TS420 units. |
| Digital ultrasonic measurement unit | Sonometrics | TR-USB | Quantity: 1 |
| Flow Probe Precision S-Series 4 mm | Transonic Systems Inc. | MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA | Quantity: 2 |
| 1 mm Sonometrics Crystals | Sonometrics Systems | 1R-38S-20-NC-SH | Quantity: 2-4 (2 for each artery) |
| Catheter for implantation | BD (Becton Dickinson) | 381447 | Quantity: 1+ (1 for each artery). Catheter is cut and secured to microbore tubing, stylette is utilized for insertion. |
| Tygon Microbore Tubing | Norton Performance Plastics | (AAQ04127) Formulation S-54-HL | Cut to length for an extension set |
| Luer Stub Adapter | BD (Becton Dickinson) | 427564 (20 gauge) | Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter) |
| Surflo Injection Plug | Terumo | SR-IP2 | Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter) |
| Meadox | PTFE (Teflon) Felt | 19306 | Cut to size. The PTFE felt used in our studies was discontinued. However, comparable companies such as “Surgical Mesh” offer products which are equivalent. |
References
- Goldman, S., et al. Long-term patency of saphenous vein and left internal mammary artery grafts after coronary artery bypass surgery: Results from a Department of Veterans Affairs Cooperative Study. Journal of the American College of Cardiology. 44, 2149-2156 (2004).
- Achouh, P., et al. Long-term (5- to 20-year) patency of the radial artery for coronary bypass grafting. The Journal of Thoracic And Cardiovascular Surgery. 140, 73-79 (2010).
- Conklin, B. S., Richter, E. R., Kreutziger, K. L., Zhong, D. S., Chen, C. Development and evaluation of a novel decellularized vascular xenograft. Medical Engineering & Physics. 24, 173-183 (2002).
- Zhu, C., et al. Development of anti-atherosclerotic tissue-engineered blood vessel by A20-regulated endothelial progenitor cells seeding decellularized vascular matrix. Biomaterials. 29, 2628-2636 (2008).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 9214-9219 (2011).
- Kaushal, S., et al. Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo. Nat Med. 7, 1035-1040 (2001).
- Galatos, A. D. Anesthesia and Analgesia in Sheep and Goats. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 27, 47-59 (2011).
- Okutomi, T., Whittington, R. A., Stein, D. J., Morishima, H. O. Comparison of the effects of sevoflurane and isoflurane anesthesia on the maternal-fetal unit in sheep. J Anesth. 23, 392-398 (2009).
- Swartz, D. D., Russell, J. A., Andreadis, S. T. Engineering of fibrin-based functional and implantable small-diameter blood vessels. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 288, H1451-H1460 (2005).
- Niklason, L. E., et al. Functional arteries grown in vitro. Science. 284, 489-493 (1999).
- Dahl, S. L. M., et al. Readily Available Tissue-Engineered Vascular Grafts. Science Translational Medicine. 3, 68ra69 (2011).
- Wu, W., Allen, R. A., Wang, Y. Fast-degrading elastomer enables rapid remodeling of a cell-free synthetic graft into a neoartery. Nature Medicine. 18, 1148-1153 (2012).
- Saami, K. Y., Bryan, W. T., Joel, L. B., Shay, S., Randolph, L. G. The fate of an endothelium layer after preconditioning. Journal of vascular surgery : Official Publication, the Society for Vascular Surgery [and] International Society for Cardiovascular Surgery, North American Chapter. 51, 174-183 (2010).
- Ueberrueck, T., et al. Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses. Journal of Surgical Research. 124, 305-311 (2005).
- Labbé, R., Germain, L., Auger, F. A. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. The FASEB Journal. 12, 47-56 (1998).
- Samaha, F. J., Oliva, A., Buncke, G. M., Buncke, H. J., Siko, P. P. A clinical study of end-to-end versus end-to-side techniques for microvascular anastomosis. Plastic and Reconstructive Surgery. 99, 1109-1111 (1997).
- Huang, H., et al. A novel end-to-side anastomosis technique for hepatic rearterialization in rat orthotopic liver transplantation to accommodate size mismatches between vessels. European Surgical Research. 47, 53-62 (2011).
- Peng, H., Schlaich, E. M., Row, S., Andreadis, S. T., Swartz, D. D. A Novel Ovine ex vivo Arteriovenous Shunt Model to Test Vascular Implantability. Cells, Tissues, Organs. 195, 108 (2011).
- Zilla, P., Bezuidenhout, D., Human, P. Prosthetic vascular grafts: Wrong models, wrong questions and no healing. Biomaterials. 28, 5009-5027 (2007).
- Berger, K., Sauvage, L. R., Rao, A. M., Wood, S. J. Healing of Arterial Prostheses in Man: Its Incompleteness. Annals of Surgery. 175, 118-127 (1972).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. C. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. Journal of Vascular Surgery : Official Publication, the Society for Vascular Surgery [and] International Society for Cardiovascular Surgery, North American Chapter. 52, 176-195 (2010).
- Swartz, D. D., Andreadis, S. T. Animal models for vascular tissue-engineering. Current Opinion in Biotechnology. 24, 916-925 (2013).
- Liang, M. -S., Andreadis, S. T. Engineering fibrin-binding TGF-β1 for sustained signaling and contractile function of MSC based vascular constructs. Biomaterials. 32, 8684-8693 (2011).
- Han, J., Liu, J. Y., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. Molecular and functional effects of organismal ageing on smooth muscle cells derived from bone marrow mesenchymal stem cells. Cardiovascular Research. 87, 147-155 (2010).
