Summary
Een stap-voor-stap protocol voor de inter-positionele plaatsing van weefselengineering Vessels (Tevs) in de halsslagader van een schaap met end-to-end anastomose en real-time digitale evaluatie in vivo tot dierenoffers.
Abstract
De ontwikkeling van Weefselmanipulatieproducten Vessels (Tevs) wordt gevorderd door het vermogen om routinematig en effectief implantaat Tevs (4-5 mm in diameter) in een groot diermodel. Een stap voor stap protocol voor onderlinge positionele plaatsing van de TEV en real-time digitale evaluatie van de TEV en natieve halsslagaders wordt beschreven. In vivo opvolging wordt mogelijk gemaakt door de inplanting van stroom sondes, katheters en ultrasone kristallen (geschikt opnametijd veranderingen dynamische diameter van geïmplanteerde Tevs en inheemse halsslagaders) en het moment van de operatie. Eenmaal geïmplanteerd, onderzoekers kunnen arteriële bloedstroom patronen, invasieve bloeddruk en vaatdiameter waardoor parameters zoals polsgolfsnelheid, augmentatie index, polsdruk en compliance te berekenen. Registratie wordt bewerkstelligd via één computerprogramma voor analyse gedurende de duur van het experiment. Dergelijke waardevolle data geeft inzicht in TEV matrix ombouw, zijn resemblanCE om inheemse / sham controles en de algehele TEV prestaties in vivo.
Introduction
De primaire focus voor de ontwikkeling van Tevs is geweest om een substituut voor autologe transplantatie vervanging bieden bij autologe schepen niet beschikbaar zijn en om donor zicht morbiditeit te beperken. Zo is het aantal coronaire bypass operaties per jaar 350.000 overschreden in de VS en de ideale bron van geschikte transplantaten blijft de linker interne mammaire arterie, links voorste dalende kransslagader en vena saphena 1. Omdat veel mensen die lijden aan vasculaire ziekten misschien niet geschikt zijn slagaders en aders voor autologe transplantatie vervangen, heeft de ontwikkeling van Tevs daarmee uitgegroeid tot een intense gebied van onderzoek decennialang 1-6. Terwijl de engineering en optimalisatie van nieuwe Tevs veel vooruitgang hebben ondergaan, rapportage over de chirurgische technieken gebruikt om de Tevs zelf heeft geen onderwerp van zulke intense discussie te implanteren. Veeleer zijn protocollen betreffende de implantatie van Tevs in diermodellen dat grotendeelstot onderzoekers onderzoeken.
De volgende manuscript wordt gedemonstreerd hoe u Tevs implanteren door gebruik te maken van een end-to-end anastomose aanpak. Deze procedure werd geoptimaliseerd door een specifiek anastomose hechten patroon, stabiliserende hechtdraad techniek optimaliseren longitudinale spanning en de toevoeging van in vivo opvolging instrumentatie. Deze werkwijze staat in tegenstelling tot sommige van de vele variaties die eerder zijn gebruikt. Bovendien is deze procedure wordt beschreven hoe u parameters zoals bloeddruk, TEV diameter / compliance te verwerven en het debiet door de TEV na de operatie tot explantatie. Deze gegevensverzameling een onmisbaar analyse van de TEV terwijl het in het proces van hermodellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Dit protocol is aan de State University van New York in Buffalo door de Animal Care en gebruik Comite.
1. Pre-operatieve voorbereiding
- Gebruik schapen (Dorset kruis, vrouw, ongeveer 1-3 jaar oud met een gewicht van 40-60 kg) voor de volgende studie. Dien cyclosporine A (200 mg / dag), aspirine (975 mg / dag), en coumadin (20-30 mg / dag) oraal, beginnend 3 dagen voor de operatie en verder gedurende de duur van alle studies.
- Zorg ervoor dat de schapen heeft gevast 12 uur voor de operatie (normale voeding = 1,8 kg hooi en 0,4 kg graan).
- Steriliseer alle chirurgische benodigdheden via stoom autoclaaf bij 121 ° C en 15 psi gedurende 30 min.
- Plaats de volgende items in een paraformaldehyde exsiccator 48 uur voorafgaand aan de operatie: 4 mm Doppler sondes, 1 mm ultrasone kristallen, inwonende arteriële katheters, uitbreiding slangen, en 42 "Tygon Tubing.
OPMERKING: Een tabel van relevante medische apparatuur die nodig is voor dechirurgie en sterilisatie wordt in tabel 1. Pre-plaatsing van de apparatuur in de Tygon-buis in deze stap helpt tijd besparen tijdens de operatie.- Label elk uiteinde van de sondes, katheters en kristallen links en rechts, indien van toepassing.
2. Chirurgische Operatie
- Laten schapen voor anesthesie met diazepam (0,5 mg / kg) en ketamine (4 mg / kg) intraveneus (IV). U kunt ook gebruik maken van Telazol (4 mg / kg) IV.
- Voeren orotracheal intubatie met een 8,5-10,0 mm inwendige diameter endotracheale tube 7.
- Dien inhalatie anesthesie door het gesloten circuit met een slagvolume ventilator (7-10 ml / kg) of een geregelde druk ventilator (15-20 cm H2O). Gebruik een precisie vaporizer aan isofluraan of sevofluraan toedienen bij een geschikte hoeveelheid (3% -4% in eerste instantie) op een gemiddelde tot diepe chirurgische verdoving stadium te bereiken. De minimale alveolaire concentratieschaap is 1,4% respectievelijk 8 1,9%.
- Beoordelen verdoving diepte door het observeren van motorische reactie op stimuli, ooglidreflex, ooghoogte, en hartslag. Monitor bloed zuurstofverzadiging (95% -100%) met behulp van pulsoxymetrie, CO 2 -concentratie (45-55 mmHg) in uitademgassen behulp capnografie- en onderhouden van de lichaamstemperatuur tijdens de procedure (38,5-39,5 ° C) met behulp van een auto geregeld warmtedeken.
- Scheren wol van de gehele hals van de schapen, en meer dan een hoofdader, met behulp van een # 40 mes op standaard tondeuse. Bereid de huid van beide sites voor een operatie met behulp van 70% isopropylalcohol en 7,5% betadine scrub verzadigd gaas. Beginnen met alcohol gaasje om het verwijderen van de huid oliën vergemakkelijken. Afwisselend betadine gaas en alcohol gaas drie keer.
- Plaats schapen op de operatietafel rug gelegd bovenop een warmtedeken. Passeren een middelgrote orogastric buis om voor passieve uitzetting van de maaginhoud. Verleng denek schapen en gebruik ondersteunende demping als nodig is om de plaatsing te behouden.
- Voer een laatste aseptische scrub met behulp van 7,5% betadine gedrenkt gaas en laat het zitten voor 5 minuten voorafgaand aan de operatie.
- Dien IV vloeistoffen (Ringer Lactaat oplossing of 0,9% zoutoplossing) op 10 ml / kg / uur via een angiocath geplaatst in de hoofdader. Dien intraoperative antibiotica en pijnstilling: Penicilline G Procaine 6.600 U / kg intramusculair (IM), gentamicine 1,6 mg / kg IM, en Buprenorfine 0,005-,01 mg IV of IM.
- Maak een ~ 12 cm incisie in de lengte over de ventrale middellijn nek met behulp van electro cauterisatie. Isoleer linker en rechter halsslagaders (~ 6 cm) door bindweefsel met een stompe dissectie techniek. Afhechten en micro-schepen vertakking van de halsslagaders te bloeden minimaliseren cauterize.
- Handhaaf steriliteit door gebruik (een niet-steriel) chirurgische verpleegkundige te helpen bij gravende bedrading en leidingen (stromingsonde ultrasoon kristal dradenen katheterbuis) in de subcutane laag van de huid. Gebruik een afgestompte trocar, die verlaat door het chirurgisch klaargestoomd incisie aan de dorsolaterale nek.
- Bereik onder steriele doek en draai de kop van het schaap zodat de zijde van de nek onder het doek kan worden gevisualiseerd.
- Gebruik een 8 cm gebogen hemostaat tunnel door de subcutane ruimte tussen de ventrale middellijn incisie hals en de zijkant van de nek. Openen en sluiten van de hemostaat om botweg te ontleden een ruimte voor de buis ~ 1,5 cm breed. De uiteinden van de hemostaat moet halverwege tussen de kop en schouders ongeveer 10 cm caudaal naar rechts of links oor bevinden. Draai de hemostaat zodat de tips wijzen in de richting van de oppervlakkige huid.
- Bereik onder steriele doek en een 1,5 cm incisie door de huid, de uiteinden van de hemostaat met een steriele # 11 blad. Visualiseren uiteinden van de hemostaat een duidelijke exit door de huid te bevestigen.
- Passeer de Tygon buis met eenll bedrading en slangen door de subcutane tunnel. Houd de draden en leidingen boven het steriel laken.
- Bereiken in het laken naar de buitenste Tygon buis van de hals te verwijderen, waardoor de geïmplanteerde bedrading zoals de hals van de schapen verlaat. Trek individuele lijnen uit om eventuele speling in de subcutane ruimte te minimaliseren. Laat voldoende afstand tot de instrumentatie goed te hechten aan de slagader.
- Plaats 4 mm Doppler sondes beide halsslagaders en een eerste aflezing (figuur 1) te bereiken. Dien 100 U / kg heparine IV 30 min voor het klemmen van de slagader.
- Verder heparine 100 U / kg / uur tot het einde van chirurgie. Klem de halsslagader met behulp van niet inklemming vasculaire klemmen en uitsnijden van een gedeelte (ongeveer 4 cm lang). De contralaterale halsslagader debiet stijgt van 50% -100% bloedstroom naar de hersenen te handhaven.
OPMERKING: Het is mogelijk om longitudinale stretch beperken door terugslag van inheemse vaartuig door het verwijderenkortere segmenten van te worden vervangen en / of strekken van de inheemse slagader met vasculaire klemmen om kloof te korten tot de volledige anastomose procedure is afgerond. Dit zal helpen beperken de spanning op individuele bedrijf hechtingen en de geïmplanteerde transplantaat. - Hechten de TEV op zijn plaats met behulp van eenvoudige onderbroken steken met 7-0 proline ethalloy dubbel gewapende monofilament hechtdraad. Zonodig in vasculaire gladde spierrelaxantia zoals papaverine (15 mg / ml) of nicardipine (1.25 mg / ml) topisch aan het natieve vasculatuur om vasoconstrictie die anastomose hechten zouden belemmeren voorkomen.
OPMERKING: Begin het plaatsen van hechtingen met ongeveer 1 mm tussenruimte. Dit kan sterk verschillen van geval tot geval. De samenstelling en de TEV dikte zal invloed hebben op de effectieve afstand tussen de hechtingen. Als de dikte van het natieve weefsel of TEV afneemt, kan het nodig zijn de hechtingen dichter bij elkaar plaatsen.- Eerst anker vier punten van de TEV de natieve slagader door twee tegengestelde stitches zowel proximale en distale uiteinden (figuur 2-di). Houd elke anker gegeven met behulp van arterieklem.
OPMERKING: Proximale en distale beschrijvingen met betrekking tot de richting van bloedstroom door het papier. - Voeg 5-6 hechtingen aan de oppervlakkige kant van zowel de proximale en distale einden aan de anastomose starten. (Figuur 2 Pr). Draai tegelijkertijd de vasculaire klemmen 180 graden.
- Herstel spanning op de verankering hechtingen. Voeg extra (5-6) onderbroken hechtingen met proximale en distale einden op gedraaid zijde van de TEV.
- Eerst anker vier punten van de TEV de natieve slagader door twee tegengestelde stitches zowel proximale en distale uiteinden (figuur 2-di). Houd elke anker gegeven met behulp van arterieklem.
- Zodra de TEV stevig plaats gehecht, draai het terug naar de oorspronkelijke positie en verwijder de vasculaire klemmen een voor een distaal klem eerste. Lichte bloeden bij de anastomose sites is gemeenschappelijk. Dit kan natuurlijk op te lossen na een paar minuten van de klem vrijkomen en omspannen of eisen dat de plaatsing van extra hechtingen. Plaats de Doppler probe (Figuur 3-FL) Terug op inheemse slagader proximale om de bloedstroom het invoeren van de TEV en de monitor debiet.
OPMERKING: Verwacht de stroomsnelheden van de linker en rechter carotide na ongeveer 15 minuten equilibreren. Indien het debiet van de halsslagader met geïmplanteerde TEV gestaag daalt, is het mogelijk de TEV stolt. Andere mogelijke afwijkingen betrekking stroom kan worden toegeschreven aan vernauwing van de natieve slagaders proximaal of distaal van de TEV. Als dit gebeurt, kan het gebruik van extra vasculaire gladde spierverslapper worden toegepast, en de inheemse schip moet terugkeren naar een basale toon na 30-60 min na de sluiting van het weefsel over de graft website.- Indien gewenst, accijnzen de contralaterale halsslagader en hechten het terug op zijn plaats als een "schijnvertoning" controle. Dit is klinisch relevant dan wanneer de rechter halsslagader alleen en uitsluitend bevestigen van de stromingsonde, ultrasone kristallen en katheter. Als een schijnvertoning controle wordt gezocht, voert u deze voordat u doorgaat naar stap 2.11.
- Hechtdraad 1 mm ultrasone kristallen (figuur 3 -cr1 CR2) aan tegenoverliggende zijden van de TEV behulp 7-0 Proline. Rijg hechtdraad door de ultrasone kristal hoofd en steek alleen de oppervlakkige laag van de TEV.
- Katheteriseren de slagader met een aangepaste 18 G katheter met een Teflon geweven sluiting (Figuur 3- Ca en figuur 4A). Plaats de katheter distaal van de TEV op inheemse arteriële weefsel.
- Hechten de sluiting aan de slagaderwand met 5/0 Ethibond om het bloeden onder controle. Gebruik cyclohexanon aan de microbore slang zich aan de katheter die is gespoeld met een zoutoplossing. Gebruik de slang als een extensie lijn.
- Gebruik een 20 G Luer Stub-adapter met een Surflo Injectie Plug aan de exteriorized einde van de slang (figuur 4B) te dichten. Om doorgankelijkheid van de katheter te handhaven op door het vulvolume van de lijn en spoelen met 10 ml zoutoplossing en vervolgens 5000 U / ml heparine natrium injectie elke 2-3 dagen.
- Noteer de afstand tussen de stromingsonde en ultrasone kristallen, evenals de afstand tussen de stromingsonde en de katheter. Hierdoor zal polsgolfsnelheid worden berekend in combinatie met software. Indien dergelijke berekeningen niet nodig zijn, hoeft een katheter niet te implanteren.
- Het verkrijgen van een intra-operatieve lezen indien gewenst aan alle geïmplanteerde hardware zorgen is functioneel (zie paragraaf 3).
- Secure geïmplanteerd lijnen en draden naar het nabijgelegen spieren met behulp van 2/0 Zijde en een taper naald (figuur 3).
- Plaats de vasculaire stroom sonde draad parallel aan het vaartuig, met de sonde staartvin en de draad craniaal te breiden, en dan het maken van een "U-Turn" in de richting van de laterale spieren. Bevestig de draad aan aangrenzende spieren, met 2-0 zijde op een tapse naald op twee plaatsen, zodat de draad of stroming probe desondanks geen belasten op het schip. Wees er zeker van hechtingen zijn gezellig, maar niet te vast aandraaien en wurgen musculatuur (figuur 3).
- Hecht de kristal draden en arteriële catheter lijn naar de zijdelingse spierstelsel, waardoor -1,5 cm speling, vergelijkbaar met eerdere stappen voor het vastzetten stroming probe (Figuur 3).
- Groep alle draden en lijnen samen en verankeren ze aan musculatuur net voor uit te verlaten door middel van subcutane tunnel, vergelijkbaar met de vorige stappen.
- Sluit de chirurgische site met een 2-0 Vicryl hechtdraad in lagen met behulp van een lopende hechtdraad patroon op dashboard en onderhuidse, hardlopen matras steek op de huid (dashboard, niet snijden naald, huid, het snijden van de naald). Sluit de 1,5 cm incisie in de dorsale nek rond de geëxterioriseerde draden en lijnen met behulp van 2/0 Vicryl en een scherpe naald.
- Plaats stromingsonde draad katheter lijnen en ultrasone kristal draden in een zakje (10 cm x 10 cm) die stevig is gehecht aan de huid van het schaap (Figuur 5 - na herstel).
- Geleidelijk spenen het schaap uit narcoseen het ademvolume ventilator extuberen dan de schapen bij spontane ademhaling wordt hervat. Verwijder de angiocath ingebracht in de hoofdader en bandage indien nodig.
- Bandage de nek met behulp van drievoudige antibiotische zalf op de incisies, een Telfa pad, strekrol gaas, en elasticon.
- Dien postoperatieve analgesie: flunixin meglumine- 2,2 mg / kg IM eenmaal tijdens het herstel, dan 1,1 mg / kg IM eenmaal per dag gedurende twee dagen, buprenorfine 0,005-,01 mg IV of IM twee keer per dag voor een dag.
3. In Vivo Monitoring
- Plaats schapen in de mobiele kar om u te beschermen waarborgen. Dit laat de schapen om kalm en bewust blijven zonder afbreuk te doen aan de hardware. Moet mogelijk schapen acclimatiseren winkelwagen 2 of 3 maal gedurende 30 min voor het verkrijgen instrumentatie opnames.
- Verwijder alle kabels en leidingen van zakje en verbinding maken met de controle-inrichtingen. Sluit stroom sonde naar een flowmeter, 1 mm ultrasone kristallen verbonden met TRB-USB Doos, en de katheter lijnen om druktransducers. Een stroomschema van deze opstelling is (figuur 6).
- Kalibreren stroom sondes en druktransducers voorafgaand aan de data-acquisitie.
LET OP: In verband met mogelijke variabiliteit tussen softwareversies en verschillen in de gebruikte apparatuur, kalibraties en instellingen zal variëren van geval tot geval. - Gebruik maken van een oscilloscoop te fine-tunen van de Sonometrics kristal meten, volgens het protocol van de fabrikant.
- Record gegevens met behulp van computersoftware (Figuur 7). Sporen in de bovenste helft van figuur 7 in witte kleur overeen met de geïmplanteerde TEV, terwijl sporen in de onderste helft rode kleur overeen met de Sham / inheemse. Voor zowel de TEV en Sham het debiet (ml / min), arteriële bloeddruk (mm Hg) en diameter (mm) worden live opgenomen.
- Neem gedurende minimaal 1 min, zonder storingen. Deze gegevens te exporteren voor meer gedetailleerde analyse. Na de opname, Verbreekect alle draden en plaats terug in de buidel gehecht op de hals van de schapen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Meer dan 30 schapen hebben de chirurgische techniek in dit rapport beschreven voor de implantatie van Tevs (in press) 9 ondergaan. Een tabel met een overzicht van de meest recente schapen operaties na protocol optimalisatie zijn weergegeven in tabel 2. Alle schapen hersteld na TEV implantatie zonder levensbedreigende complicaties. In sommige dieren, werd fibrose waargenomen bij natief slagader dichtbij het uiteinde van de inwonende arteriële catheter. Een significante toename van ontsteking met de aanwezigheid van toegevoegde instrumentatie is niet waargenomen. Zelden (1 van 18 katheters), de katheter is obstructie van de bloedstroom door het TEV veroorzaakt. Deze obstructie zich na een maand. Minor complicaties van de katheter omvatten demping van de arteriële signaal en onvermogen om aspireren bloed. De meest gemelde gegevens bij het nastreven van het onderzoek in TEV ontwikkeling zijn meestal doorgankelijkheid, debieten en compliance. Dit protocol toont aan dat het mogbaar om dergelijke waardevolle gegevens gedurende de looptijd van het experiment te verkrijgen. Hoewel dit rapport richt zich op het verwerven van debiet, diameter en arteriële druk; compliance, augmentatie index en pulse-wave velocity kan ook worden berekend.
Figuur 1. Geïsoleerde halsslagader. Geïsoleerde halsslagader wordt getoond met aangehechte stroom sonde. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Implantatie van TEV. Figuur 2-Di illustreert de distale zijde van het TEV 2 van de oorspronkelijke vier ankerpunten gebruikt om de TEV zijn plaats te verankeren. Zodra de TEV is verankerd, voeg addit ional steken zoals weergegeven in figuur 2-Pr, waarbij de proximale zijde van de TEV duidt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Instrumentation van TEV. 1 mm ultrasone kristallen gestikt op elke zijde van de geïmplanteerde TEV (CR1 en CR2). Di duidt de distale zijde van de TEV terwijl Pr duidt proximale. De flowprobe (Fl) is geplaatst proximaal van de TEV terwijl de katheter (Ca) distaal is geplaatst. Flow sonde en katheter zijn gestikt naar het nabijgelegen musculatuur (gestippelde ovaal). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
een "src =" / files / ftp_upload / 52354 / 52354fig4.jpg "/>
Figuur 4A. Katheter worden gebruikt voor instrumentatie van TEV. Katheter in combinatie met een Teflon Plaquet voordat ze geplaatst distale naar TEV op inheemse weefsel. Figuur 4B. Eindassemblage van katheter vóór implantatie. Catheter uitgebreid met Tygon slangen (aangegeven met vierkante) samen met 20 G Luer Stub-adapter met Surflo injectie plug (aangegeven met ovaal). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Pouch bevestigd aan de huid van schapen. Pouch is bevestigd aan de nek van de schapen aan de bedrading van 1 mm ultrasone kristallen te beschermen, stromen sonde en de katheter wanneer niet in gebruik. Gelieve click hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Stroomdiagram van elektronica gebruikt voor het opnemen van ultrasone kristal afstanden, de doorbloeding en de arteriële druk. Verloopdiagram setup gebruikt om afstanden tussen ultrasone kristallen, arteriële doorbloeding en arteriële druk op te nemen. * Met behulp van een oscilloscoop kan helpen bij de helderheid van het ontvangen van de 1 mm ultrasone kristallen signalen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7. Het opnemen van real-time ultrasone kristal afstanden, de doorbloeding en de arteriële druk op computersoftware. White-kleurige sporen indtificaat opnamen van TEV. T01 R02 en T02 R01 aangeven communicatie tussen ultrasone kristal CR1 CR2 en CR2 naar respectievelijk CR1. ARP geeft opgenomen arteriële druk, terwijl ABF geeft arteriële bloedstroom. Dezelfde notatie wordt gebruikt voor roodgekleurde sporen die de inheemse / schijnvertoning halsslagader. De opgenomen afstand tussen de ultrasone kristallen tijdens het opgenomen polsdruk van arteriële druk geven het percentage naleving van TEV / Sham. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Medische apparatuur | ||||
| Uitrusting | Fabrikant | Serial / Catalog # | Aantal Stuks | Aantekeningen |
| Druk TransdÜçer | Becton Dickinson | P23XL-1 | 1+ (1 per slagader) | Gebruikt met water gevulde membraan koepels |
| Versterker en transducer doos | Gould | 5900 Signal Conditioner Cage | 1 | Twee transducers en versterkers worden opgenomen in kooi. Hoewel dit specifieke apparaat kan worden stopgezet, zal andere commercieel verkrijgbare drukomvormers met een BNC / analoge uitgang communiceren met de Sonometrics apparatuur. |
| T403 Console met TS420 perivasculair flowmeter module (x2) | Transonic Systems | T403 module en TS420 (x2) | 1 | Flow probes meten stroom door elk van de halsslagaders zal verbinden met elk van de TS420 eenheden. |
| Digitale ultrasone meeteenheid | Sonometrics | TR-USB | ||
| Stromen Probe Precisie S-serie 4 mm Transonic Systems Inc. | MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA | 2 | ||
| 1 mm Sonometrics Crystals | Sonometrics Systems | 1R-38S-20-NC-SH | 2-4 (2 voor elke slagader) | |
| Katheter voor implantatie | BD (Becton Dickinson) | 381.447 | 1+ (1 per slagader) | De katheter wordt gesneden en bevestigd aan buizen microbore, wordt stilet gebruikt voor insertie. |
| Tygon microbore Tubing | Norton Performance Plastics | (AAQ04127) Formulering S-54-HL | NA (Lengte gesneden voor een uitbreiding set) | |
| Luer Stub Adapter | BD (Becton Dickinson) | 427.564 (20 G) | 1+ (1 voor elke arteriële katheter) | |
| Surflo Injectie Plug | Terumo SR-IP2 | 1+ (1 voor elke arteriële katheter) | ||
| Meadox | PTFE (Teflon) Vilt | 019.306 | NA (Op maat) | De PTFE vilt gebruikt in onze studie werd beëindigd. Echter, vergelijkbare bedrijven zoals "chirurgisch gaas" aanbieding van producten die gelijkwaardig zijn. |
Tabel 1. Tabel alle relevante apparatuur voor chirurgische procedure.
| Chirurgische ingreep Resultaten | ||||
| Instrumentatie | TEV | Schijn | Aantal Schapen | Procedure (uren) |
| Geen | Ja Well | Geen | 8 | 2.61 ± 0.25 |
| Geen | Ja Well | Ja Well | 3 | 4.17 ± 0.28 |
| Ja Well | Ja Well | Ja Well | 10 | 6.26 ± 0.75 |
Tabel 2. tabel met een overzicht meest recente schapen die TEV en / of Sham implantatie hebben ondergaan. De volgende tabel geeft een overzicht van onze meest recente TEV implantaten. Alle schapen doorleefd chirurgische operatie en had geen complicaties te posten herstel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van dit rapport is om een betrouwbaar en reproduceerbaar procedure verstrekken aan implantaat Tevs van interesse in de schapen halsslagader. De inheemse halsslagaders van de dieren die worden gebruikt in dit model waren 0,5-0,75 mm in dikte en 4,5-5 mm buitendiameter. De chirurgische techniek die hier beschreven is succesvol geweest voor het implanteren Tevs variërende geometrieën meten 0,25-1 mm dikte, 5/4 mm buitendiameter en 4 cm lang met succes blijkt effectief tot 3 maanden durende het beoogde eindpunt. Het gebruik van deze chirurgische techniek is het verkrijgen van gegevens mogelijk gemakkelijker te verzamelen en consistent.
Voorts heeft de mogelijkheid om real time parameters in vivo remodeling meten beschreven. Verschillende diameters kunnen met succes worden toegepast in dit model afhankelijk gewenste gebied van mismatch en ontwerp van geïmplanteerde TEV, ook kan de duur van implantatie worden verlengd tot of voorbij 1 jar.
Een van de grootste vooruitgang in de optimalisatie van dit protocol is het gebruik van end-to-end anastomose met een onderbroken hechtdraad techniek. De huidige TEV ontwerp gebruikt bij de bereiding van dit verslag oorspronkelijk gebruikt end-to-end anastomose met een doorlopende draad techniek waardoor een hoog percentage mislukkingen (n = 3). De precieze reden hiervoor is niet bekend, maar het zou kunnen te wijten zijn aan de lichte stenotische of niet-conforme effect van een doorlopende draad bij de anastomotische plek. Bij het zoeken naar alternatieve methoden voor de chirurgische procedure te optimaliseren bleek dat eerder beschreven chirurgische technieken in de literatuur beschreven zijn enigszins vaag. Dit is voornamelijk te wijten aan woord beperkingen opgelegd door tijdschriften dwingen onderzoekers om hun chirurgische technieken in een korte en obscure mode melden. Sommige rapporten simpelweg stellen dat dieren ondergingen TEV implantatie 10-12. Anderen melden het gebruik van end-to-side 3,5,13,14, ofend-to-end anastomose 4,6. Tot slot, anderen specifiek aangegeven het gebruik van onderbroken 4, of het ononderbroken lopen hechtdraad 15. Dit gebrek aan detail maakt het moeilijk te reproduceren of verbeteren vasculaire onderzoek waarbij operatie, in het bijzonder op grote diermodellen. Hoewel er geen significant verschil gerapporteerd doorgankelijkheid van end-to-end en end-to-side techniek 16 in de grote diermodel hier vermeld, end-to-end is voordelig wanneer het systeem op de halsslagader door de anatomie en lengte van de Tevs gewoonlijk geëvalueerd. Echter een groot verschil tussen de natieve slagader en TEV aanwezig is, kan het geschikt zijn om een end-to-side techniek die veelbelovende resultaten vertoont bij ratten 17 vast.
Ervoor zorgen dat de chirurgische techniek is geen reden tot TEV falen stelt onderzoekers in staat om zich te concentreren op andere mogelijke verklaringen voor occlusie. Als kortdurende patency en blootstelling aan fysiologische omstandigheden zoals bloeden de druk is de enige belangstelling, een eerder gemelde manuscript is beschikbaar. Hier is het gebruik van een schaap ex vivo arterioveneuze shunt model ontworpen TEV implantability evalueren geoptimaliseerd 18. Dit model heeft bewezen zeer effectief in het snel testen van meerdere Tevs met één dier voor het plegen van het implanteren van een TEV voor de lange termijn studies.
Bij het evalueren van de integriteit van een geïmplanteerde TEV gewenst, nog gebruikelijke technieken nadelen. Momenteel ultrasonografie of beeldvorming angiogram de enige methoden om de integriteit van de TEV in vivo 3,5,6,10-14 evalueren. Echografie meestal niet zorgen voor de resolutie die nodig is om de naleving veranderingen van de TEV observeren. Angiografie is invasief, duur en vereist verdoving van het dier. Echter, door het implanteren stroom probes, arteriële katheters en ultrasone kristallen veel van deze informatie kan worden verkregen in een eenvoudiger manier. Dit instrumentation van de geïmplanteerde TEV maakt ook parameters zoals pulse-golfsnelheid en augmentatie index worden berekend.
Het voordeel van het gebruik van schapen voor TEV implantatie leent ook sterkte voor de vertaling van Tevs in een klinische setting. Kleine diermodellen zoals muizen, ratten en konijnen geen realistisch parallel bieden die van een klinische omgeving en dus grote diermodellen worden onderzocht 19. Hoewel een groot diermodel is betrouwbaarder en klinisch relevant model bestaan er zorgen over de voor TEV implantaties soorten. Honden en varkens bijvoorbeeld, terwijl vaak gebruikt bij vasculaire onderzoek endothelialize zeer snel. Schapen anderzijds enige endothelialize dichtbij de anastomose plaatsen, en niet spontaan binnen de TEV. Dit lijkt nauwer de genezing van de mens 14,19-22.
Om verder te begrijpen wat er gebeurd is met betrekking tot de verbouwing, de gastheerTEV worden geëxplanteerd en onderzocht om celmigratie, immobilisatie en differentiatie beschrijven. Eerder werk heeft aangetoond dat de toevoeging van lipofiele kleurstof zoals Dil en het gebruik van GFP + endotheelcellen betrouwbare methoden voor het lot van geïmplanteerde cellen te beoordelen op TEV 5,6. Onze groep heeft ook aangetoond dat SRY kleuring (Sex-bepalend gebied Y eiwit) tegen het mannelijke Y-chromosoom is een effectieve methode om mannelijke geïmplanteerde cellen in een vrouwelijke host (in press) te volgen. Collageen en elastine inhoud kan ook worden gemeten na weefsel wordt geëxplanteerd, meer licht te werpen op de omvang van de in vivo remodeling. Het is ook mogelijk om te bepalen of pre-implantatie en geëxplanteerde weefsels kunnen reageren op vasoconstrictoren en vaatverwijders wanneer geplaatst in een orgaanweefsel bad. Tenslotte kan Tevs ook getest om hun mechanische eigenschappen zoals modulus, treksterkte en rek 6,9,23,24 bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Nationale Hart en Long Instituut (R01 HL086582) en de New York Stem Cell Science Fund (NYSTEM, Contract # C024316) om STA en DDS Illustraties gebruikt in Jupiter video werden ingevuld door John Nyquist; Medische Illustrator van State University of New York in Buffalo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pressure Transducer | Becton Dickinson | P23XL-1 | Quantity: 1+ (1 for each artery). Used with water-filled diaphragm domes. |
| Amplifier and transducer box | Gould | 5900 Signal Conditioner Cage | Quantity: 1. Two transducers and amplifiers should be included in cage. While this specific unit may be discontinued, other commercially available pressure transducers with a BNC/analog output will communicate with the Sonometrics equipment. |
| T403 Console with TS420 perivascular flowmeter module (x2) | Transonic Systems | T403 module and TS420 (x2) | Quantity: 1. Flow probes measuring flow through each of the carotid arteries will connect to each of the TS420 units. |
| Digital ultrasonic measurement unit | Sonometrics | TR-USB | Quantity: 1 |
| Flow Probe Precision S-Series 4 mm | Transonic Systems Inc. | MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA | Quantity: 2 |
| 1 mm Sonometrics Crystals | Sonometrics Systems | 1R-38S-20-NC-SH | Quantity: 2-4 (2 for each artery) |
| Catheter for implantation | BD (Becton Dickinson) | 381447 | Quantity: 1+ (1 for each artery). Catheter is cut and secured to microbore tubing, stylette is utilized for insertion. |
| Tygon Microbore Tubing | Norton Performance Plastics | (AAQ04127) Formulation S-54-HL | Cut to length for an extension set |
| Luer Stub Adapter | BD (Becton Dickinson) | 427564 (20 gauge) | Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter) |
| Surflo Injection Plug | Terumo | SR-IP2 | Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter) |
| Meadox | PTFE (Teflon) Felt | 19306 | Cut to size. The PTFE felt used in our studies was discontinued. However, comparable companies such as “Surgical Mesh” offer products which are equivalent. |
References
- Goldman, S., et al. Long-term patency of saphenous vein and left internal mammary artery grafts after coronary artery bypass surgery: Results from a Department of Veterans Affairs Cooperative Study. Journal of the American College of Cardiology. 44, 2149-2156 (2004).
- Achouh, P., et al. Long-term (5- to 20-year) patency of the radial artery for coronary bypass grafting. The Journal of Thoracic And Cardiovascular Surgery. 140, 73-79 (2010).
- Conklin, B. S., Richter, E. R., Kreutziger, K. L., Zhong, D. S., Chen, C. Development and evaluation of a novel decellularized vascular xenograft. Medical Engineering & Physics. 24, 173-183 (2002).
- Zhu, C., et al. Development of anti-atherosclerotic tissue-engineered blood vessel by A20-regulated endothelial progenitor cells seeding decellularized vascular matrix. Biomaterials. 29, 2628-2636 (2008).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 9214-9219 (2011).
- Kaushal, S., et al. Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo. Nat Med. 7, 1035-1040 (2001).
- Galatos, A. D. Anesthesia and Analgesia in Sheep and Goats. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 27, 47-59 (2011).
- Okutomi, T., Whittington, R. A., Stein, D. J., Morishima, H. O. Comparison of the effects of sevoflurane and isoflurane anesthesia on the maternal-fetal unit in sheep. J Anesth. 23, 392-398 (2009).
- Swartz, D. D., Russell, J. A., Andreadis, S. T. Engineering of fibrin-based functional and implantable small-diameter blood vessels. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 288, H1451-H1460 (2005).
- Niklason, L. E., et al. Functional arteries grown in vitro. Science. 284, 489-493 (1999).
- Dahl, S. L. M., et al. Readily Available Tissue-Engineered Vascular Grafts. Science Translational Medicine. 3, 68ra69 (2011).
- Wu, W., Allen, R. A., Wang, Y. Fast-degrading elastomer enables rapid remodeling of a cell-free synthetic graft into a neoartery. Nature Medicine. 18, 1148-1153 (2012).
- Saami, K. Y., Bryan, W. T., Joel, L. B., Shay, S., Randolph, L. G. The fate of an endothelium layer after preconditioning. Journal of vascular surgery : Official Publication, the Society for Vascular Surgery [and] International Society for Cardiovascular Surgery, North American Chapter. 51, 174-183 (2010).
- Ueberrueck, T., et al. Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses. Journal of Surgical Research. 124, 305-311 (2005).
- Labbé, R., Germain, L., Auger, F. A. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. The FASEB Journal. 12, 47-56 (1998).
- Samaha, F. J., Oliva, A., Buncke, G. M., Buncke, H. J., Siko, P. P. A clinical study of end-to-end versus end-to-side techniques for microvascular anastomosis. Plastic and Reconstructive Surgery. 99, 1109-1111 (1997).
- Huang, H., et al. A novel end-to-side anastomosis technique for hepatic rearterialization in rat orthotopic liver transplantation to accommodate size mismatches between vessels. European Surgical Research. 47, 53-62 (2011).
- Peng, H., Schlaich, E. M., Row, S., Andreadis, S. T., Swartz, D. D. A Novel Ovine ex vivo Arteriovenous Shunt Model to Test Vascular Implantability. Cells, Tissues, Organs. 195, 108 (2011).
- Zilla, P., Bezuidenhout, D., Human, P. Prosthetic vascular grafts: Wrong models, wrong questions and no healing. Biomaterials. 28, 5009-5027 (2007).
- Berger, K., Sauvage, L. R., Rao, A. M., Wood, S. J. Healing of Arterial Prostheses in Man: Its Incompleteness. Annals of Surgery. 175, 118-127 (1972).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. C. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. Journal of Vascular Surgery : Official Publication, the Society for Vascular Surgery [and] International Society for Cardiovascular Surgery, North American Chapter. 52, 176-195 (2010).
- Swartz, D. D., Andreadis, S. T. Animal models for vascular tissue-engineering. Current Opinion in Biotechnology. 24, 916-925 (2013).
- Liang, M. -S., Andreadis, S. T. Engineering fibrin-binding TGF-β1 for sustained signaling and contractile function of MSC based vascular constructs. Biomaterials. 32, 8684-8693 (2011).
- Han, J., Liu, J. Y., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. Molecular and functional effects of organismal ageing on smooth muscle cells derived from bone marrow mesenchymal stem cells. Cardiovascular Research. 87, 147-155 (2010).
