Summary
بروتوكول خطوة بخطوة لوضع بين الموضعية من الأنسجة المهندسة سفن (TEVs) في الشريان السباتي من الأغنام باستخدام نهاية إلى نهاية مفاغرة في الوقت الحقيقي والتقييم الرقمي في الجسم الحي حتى التضحية الحيوانية.
Abstract
وتقدمت تطوير الأنسجة المهندسة سفن (TEVs) من خلال القدرة على TEVs زرع بشكل روتيني وفعال (4-5 ملم في القطر) في نموذج حيواني كبير. يوصف بروتوكول خطوة بخطوة لوضع بين الموضعية للتقييم TEV في الوقت الحقيقي والرقمي للTEV والشرايين السباتية الأم هنا. ويتكون في الجسم الحي الرصد ممكن عن طريق غرس تحقيقات التدفق، والقسطرة وبلورات بالموجات فوق الصوتية (قادرة تسجيل التغييرات قطر الديناميكية للTEVs زرع الشرايين السباتية والأم) في وقت الجراحة. مرة واحدة زرعها، يمكن للباحثين حساب الشرايين أنماط تدفق الدم، وضغط الدم الغازية وقطر الشريان العائد المعلمات مثل سرعة موجة النبض، ومؤشر زيادة، والضغوط النبض والامتثال. ويتم إنجاز الحصول على البيانات باستخدام برنامج كمبيوتر واحد لتحليل طوال مدة التجربة. يوفر هذه البيانات لا تقدر بثمن نظرة ثاقبة TEV مصفوفة إعادة عرض، resemblan لهام إلى الأم الضوابط / صورية والأداء TEV الكلي في الجسم الحي.
Introduction
كان التركيز الأساسي لتطوير TEVs لتوفير بديل لاستبدال الكسب غير المشروع ذاتي عندما السفن ذاتي لا تتوفر والحد المانحة البصر الاعتلال. على سبيل المثال، فقد تجاوز عدد العمليات الجراحية الشريان التاجي الالتفافية سنويا 350،000 في الولايات المتحدة الأمريكية، ويبقى مصدرا مثاليا للترقيع الشريان الثديي مناسبة الداخلي الأيسر، الأمامي الأيسر تنازلي الشريان التاجي والوريد الصافن 1. منذ العديد من الأفراد الذين يعانون من أمراض الأوعية الدموية قد لا يكون الشرايين والأوردة المناسبة لاستبدال الكسب غير المشروع ذاتي، وهكذا أصبح تطوير TEVs حقل مكثفة للبحث عن عقود 1-6. في حين الهندسية والاستفادة المثلى من TEVs جديدة خضعت العديد من التطورات، وتقديم التقارير على التقنيات الجراحية المستخدمة لزرع TEVs لم يكن أنفسهم موضوع هذه المناقشة المكثفة. بدلا من ذلك، يتم ترك إلى حد كبير بروتوكولات بشأن زرع TEVs في النماذج الحيوانيةيصل للبحث المحققين.
يوضح مخطوطة التالية كيفية زرع TEVs من خلال الاستفادة من نهج مفاغرة نهاية إلى نهاية. وكان هذا الإجراء الأمثل باستخدام نمط معين خياطة تفاغري، وتحقيق الاستقرار تقنية خياطة، وتحسين التوتر الطولي وإضافة في الجسم الحي أجهزة للرصد. ويتناقض هذا الأسلوب مع بعض من كثير من الاختلافات التي تم استخدامها سابقا. وعلاوة على ذلك، يصف هذا الإجراء كيفية اكتساب المعلمات مثل ضغط الدم الشرياني، TEV قطر / الامتثال ومعدل التدفق من خلال TEV بعد الجراحة حتى explantation. يوفر هذا جمع البيانات تحليلا لا غنى عنه في TEV أثناء وجوده في عملية التجديد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان في جامعة ولاية نيويورك في بوفالو.
1. إعداد ما قبل العمليات الجراحية
- استخدام الأغنام (دورست الصليب، أنثى، حوالي 1-3 سنوات من العمر مع وزن 40-60 كلغ) لدراسة التالية. إدارة السيكلوسبورين A (200 ملغ / يوم)، والأسبرين (975 ملغ / يوم)، والكومادين (20-30 ملغ / يوم) عن طريق الفم، بدءا 3 أيام قبل الجراحة ويستمر لمدة كل الدراسات.
- ضمان الأغنام قد صام 12 ساعة قبل الجراحة (تغذية العادية = 1.8 كجم تبن و 0.4 كغ من الحبوب).
- تعقيم جميع المعدات الجراحية باستخدام الأوتوكلاف بخار في درجة حرارة 121 مئوية و 15 رطل لمدة 30 دقيقة.
- وضع العناصر التالية في بارافورمالدهيد مجفف 48 ساعة قبل الجراحة: 4 مم تحقيقات تدفق دوبلر، 1 مم بلورات بالموجات فوق الصوتية، سكنى القسطرة الشريانية، تمديد الأنابيب، و 42 "أنابيب Tygon.
ملاحظة: جدول المعدات الطبية ذات الصلة اللازمة ليتم سرد الجراحة والتعقيم في الجدول 1. وقبل التنسيب للأجهزة في أنابيب Tygon في هذه الخطوة تساعد على توفير الوقت أثناء الجراحة.- تسمية كل نهاية تحقيقات، القسطرة والبلورات كما اليسار واليمين، إن وجدت.
2. عملية جراحية
- حمل الأغنام للتخدير مع الديازيبام (0.5 ملغ / كلغ) والكيتامين (4 ملغ / كلغ) عن طريق الوريد (IV). بدلا من ذلك، استخدم Telazol (4 ملغ / كلغ) IV.
- أداء التنبيب فموي رغامي التي يبلغ قطرها 8،5 حتي 10،0 ملم الداخلي مكبلة القصبة الهوائية أنبوب 7.
- إدارة التخدير نشوق من خلال دائرة إعادة التنفس مع جهاز التنفس الصناعي المد والجزر حجم (7-10 مل / كغم) أو جهاز التنفس الصناعي الضغط التنظيم (15-20 سم H 2 O). استخدام المرذاذ الدقة لإدارة الأيزوفلورين أو سيفوفلوران في مبلغ مناسب (3٪ -4٪ في البداية) للوصول إلى وسيلة لالعميقة مرحلة التخدير الجراحي. تركيز السنخية الحد الأدنى للالأغنام 1.4٪ أو 1.9٪ على التوالي 8.
- تقييم عمق التخدير من خلال مراقبة استجابة للمؤثرات الحركية، منعكس الجفن، موقف العين، ومعدل ضربات القلب. مراقبة تشبع الأكسجين في الدم (95٪ -100٪) باستخدام النبض قياس التأكسج، CO 2 التركيز (45-55 ملم زئبقي) في غازات الزفير باستخدام capnography والحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء العملية (38،5-39،5 ° C) باستخدام السيارات ينظم الاحترار بطانية.
- حلاقة الصوف من الرقبة كاملة من الغنم، وأكثر من الوريد رأسي واحد، وذلك باستخدام شفرة # 40 على لوس انجليس كليبرز القياسية. تحضير الجلد من كلا الموقعين لعملية جراحية باستخدام 70٪ الإيزوبروبيل و 7.5٪ بتدين فرك الشاش مشبعة. تبدأ بشاش الكحول لتسهيل إزالة زيوت الجلد. بالتناوب بين الشاش بتدين والكحول الشاش ثلاث مرات.
- وضع الأغنام على طاولة العمليات في الاستلقاء الظهري على رأس بطانية الاحترار. تمرير أنبوب orogastric متوسطة الحجم للسماح للطرد السلبي من محتويات المعدة. تمديدالرقبة الغنم وتستخدم توسيد داعمة حسب الحاجة للحفاظ على التنسيب.
- إجراء فرك العقيم النهائي باستخدام 7.5٪ بتدين غارقة الشاش والسماح للجلوس لمدة 5 دقائق قبل الجراحة.
- إدارة السوائل الوريدية (محلول رينغر اللاكتاتي أو 0.9٪ المالحة) في 10 مل / كغ / ساعة خلال angiocath وضعها في الوريد رأسي. إدارة المضادات الحيوية أثناء العملية وتسكين: البنسلين G بروكايين 6،600 U / كغ العضل (IM)، جنتاميسين 1.6 ملغ / كغ IM، والبوبرينورفين 0،005-،01 ملغ IV أو IM.
- جعل سم شق ~ 12 بالطول على الرقبة خط الوسط بطني باستخدام الكي الكهربائي. عزل اليسار واليمين الشرايين السباتية (~ 6 سم) عن طريق إزالة النسيج الضام باستخدام تقنية تشريح حادة. التعادل قبالة وكوى السفن الصغيرة المتفرعة من الشرايين السباتية للحد من النزيف.
- الحفاظ على العقم عن طريق استخدام (غير معقمة) ممرضة الجراحية للمساعدة في تختبئ جميع الأسلاك والأنابيب (مسبار التدفق، والأسلاك وضوح الشمس بالموجات فوق الصوتيةوالقسطرة أنابيب) في الطبقة تحت الجلد من الجلد. استخدام مبزل اضعافها، الذي يخرج من خلال شق هيأهم جراحيا في الرقبة الظهرية الوحشية.
- إليها تحت ثنى العقيمة وتحويل رأس من الأغنام بحيث يمكن تصور الجانب من الرقبة تحت الستارة.
- استخدام مرقئ المنحني 8 سم إلى نفق من خلال الفضاء تحت الجلد بين بطني شق خط الوسط الرقبة والجانب من الرقبة. فتح وإغلاق مرقئ لتشريح بصراحة مساحة للأنابيب ~ 1.5 سم. يجب على نصائح من مرقئ يقيم في منتصف الطريق بين الرأس والكتفين، ما يقرب من 10 سم الذيلية إلى الأذن اليمنى أو اليسرى. تحويل مرقئ بحيث نصائح يشيران نحو الجلد السطحي.
- إليها تحت ثنى العقيمة وجعل شق 1.5 سم من خلال الجلد، على نصائح من مرقئ مع معقمة # 11 شفرة. تصور نصائح من مرقئ لتأكيد خروج واضحة من خلال الجلد.
- تمرير أنبوب Tygon تحتوي علىالأسلاك والأنابيب ليرة لبنانية من خلال نفق تحت الجلد. عقد الأسلاك والأنابيب فوق ثنى العقيمة.
- إليها تحت ثنى لإزالة أنابيب Tygon الخارجي من الرقبة، وتعريض الأسلاك المزروع كما أنه يترك رقبة الغنم. سحب خطوط الفردية خارج للحد من أي تراخ في الفضاء تحت الجلد. ترك مسافة كافية لتوصيل الأجهزة بشكل صحيح إلى الشريان.
- ضع 4 مم تحقيقات تدفق دوبلر على كل من الشرايين السباتية وتحقيق قراءة أولية (الشكل 1). إدارة 100 U / كغ من الهيبارين IV 30 دقيقة قبل لقط الشريان.
- تواصل إدارة الهيبارين في 100 U / كغ / ساعة حتى نهاية عملية جراحية. المشبك الشريان السباتي باستخدام غير سحق المشابك الأوعية الدموية واستئصال جزء (حوالي 4 سم في الطول). فإن معدل تدفق السباتي المقابل زيادة 50٪ -100٪ للحفاظ على تدفق الدم إلى الدماغ.
ملاحظة: من الممكن للحد من امتداد طولي من قبل الارتداد من السفينة الأم عن طريق إزالةشرائح أقصر من أن استبدال و / أو تمتد الشريان الأصلي مع الأوعية الدموية المشابك لتقصير الفجوة حتى اكتمال إجراءات تفاغري الكامل. وهذا سوف يساعد لحد من التوتر على الغرز عقد الفردية والكسب غير المشروع المزروع. - خياطة TEV في مكانها باستخدام غرز توقف بسيطة مع 7-0 البرولين ethalloy مزدوجة حيدة خياطة المسلحة. إذا لزم الأمر، وتطبيق الأوعية الدموية مرخيات العضلات الملساء مثل الببافرين (15 ملغ / مل) أو نيكارديبين (1.25 ملغ / مل) موضعيا على الأوعية الدموية الأصلي من أجل منع تضيق الأوعية التي من شأنها أن تعيق خياطة المفاغرة.
ملاحظة: بيغن وضع الغرز مع ما يقرب من 1 ملم تباعد. وهذا يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا من حالة إلى أخرى. سوف تكوين وسمك TEV يؤثر على المسافة الفعالة بين الغرز. كما سمك الأنسجة الأم أو TEV النقصان، قد يكون من الضروري لوضع الخيوط معا.- مرساة الأول أربع نقاط من TEV إلى الشريان الأصلي عن طريق وضع اثنين الصورة معارضةtitches على حد سواء القريبة والبعيدة نهايات (الشكل 2 -Di). عقد كل مرساة تدرس استخدام المرقأة.
ملاحظة: الأوصاف القريبة والبعيدة هي في إشارة إلى اتجاه تدفق الدم في جميع أنحاء الورق. - إضافة 5-6 المزيد من الغرز على الجانب السطحي من كل من الداني والقاصي نهايات لبدء مفاغرة. (الشكل 2 -Pr). تدوير في وقت واحد المشابك الأوعية الدموية 180 درجة.
- إعادة تأسيس التوتر على ترسيخ الغرز. إضافة إضافي (5-6) توقف الغرز لالدانية والقاصية ينتهي على الجانب استدارة من TEV.
- مرساة الأول أربع نقاط من TEV إلى الشريان الأصلي عن طريق وضع اثنين الصورة معارضةtitches على حد سواء القريبة والبعيدة نهايات (الشكل 2 -Di). عقد كل مرساة تدرس استخدام المرقأة.
- مرة واحدة يتم خياطة TEV في مكان آمن، وتناوب عليه مرة أخرى إلى الوضع الأصلي وإزالة الأوعية الدموية المشابك واحد في وقت واحد، المشبك البعيدة أولا. نزيف طفيف في مواقع مفاغرة هو شائع. وهذا قد حل بشكل طبيعي بعد عدة دقائق من إطلاق المشبك وreclamping أو تتطلب وضع خيوط إضافية. وضع مسبار تدفق دوبلر (الشكل 3-FL) مرة أخرى على الداني الشريان الأصلي إلى تدفق الدم دخول TEV ومعدل التدفق الشاشة.
ملاحظة: نتوقع معدلات تدفق السباتي الأيمن والأيسر للتوازن بعد ما يقرب من 15 دقيقة. إذا كان معدل تدفق على الشريان السباتي مع زرع TEV قطرات باطراد، فمن الممكن أن TEV هو تخثر. ويمكن أن يعزى تشوهات أخرى محتملة بشأن تدفق إلى انقباض في الشرايين القريبة الأصلي أو البعيدة إلى TEV. إذا حدث هذا، واستخدام الأوعية الدموية ارتخاء العضلات الملساء إضافية يمكن تطبيقها، ويجب أن تعود السفينة الأم إلى نغمة القاعدية بعد 30-60 دقيقة بعد إغلاق الأنسجة اكثر من موقع الكسب غير المشروع.- إذا رغبت في ذلك، استئصال الشريان السباتي المقابل وخياطة مرة أخرى في مكان ك "الشام" السيطرة. هذا هو أكثر أهمية سريريا من ترك الشريان السباتي الأيمن وحده، وربط فقط مسبار التدفق، بلورات بالموجات فوق الصوتية، والقسطرة. إذا كان يريد السيطرة على الشام، تنفيذ هذا قبل المتابعة إلى الخطوة 2.11.
- خياطة 1 مم بلورات بالموجات فوق الصوتية (الشكل 3 -cr1 CR2) إلى معارضة الجانبين من TEV باستخدام 7-0 البرولين. الموضوع خياطة من خلال رئيس الكريستال بالموجات فوق الصوتية وغرزة فقط إلى الطبقة السطحية للTEV.
- يقثطر الشريان باستخدام المعدلة 18 G القسطرة مع placket تفلون المنسوجة (الشكل 3- الكالسيوم والشكل 4A). ضع القاصي القسطرة إلى TEV على أنسجة الشرايين الأم.
- خياطة placket إلى جدران الشرايين مع 5/0 Ethibond للسيطرة على أي نزيف. استخدام سيكلوهكسانون التمسك أنابيب microbore إلى القسطرة التي تم مسح بمحلول ملحي. استخدام أنابيب كخط التمديد.
- استخدام 20 G لور العقب محول مع حقن التوصيل Surflo لاغلاق نهاية exteriorized من أنابيب (الشكل 4B). للحفاظ على المباح من القسطرة، يجب الحصول على حجم فتيلة من الخط ومسح هذا مع 10 مل من محلول ملحي ثم 5،000 U / مل من حقن الهيبارين الصوديوم كل 2-3 أيام.
- وتسجيل المسافة بين المسبار التدفق وبلورات بالموجات فوق الصوتية، وكذلك المسافة بين المسبار التدفق والقسطرة. وهذا سيمكن نبض موجة سرعة يتم حسابها بالتعاون مع برنامج. إذا لم يكن هناك حاجة لمثل هذه الحسابات، لا زرع قسطرة.
- الحصول على القراءة أثناء العملية إذا رغبت لضمان جميع الأجهزة مزروع هو وظيفي (انظر القسم 3).
- تأمين خطوط وأسلاك زرع لعضلات المجاورة باستخدام 2/0 الحرير وإبرة تفتق (الشكل 3).
- ضع الأوعية الدموية التحقيق تدفق الأسلاك بالتوازي مع السفينة، مع الذيلية التحقيق وسلك تمديد cranially، ومن ثم اتخاذ "U-تشغيل" تجاه الجهاز العضلي الجانبي. تأمين السلك إلى عضلات المجاورة، وذلك باستخدام 2-0 الحرير على إبرة تفتق في موقعين، بحيث السلك أو تدفق التحقيق ليست قادرة على وضع أي الضغط على السفينة. مما لا شك فيه ودافئ الغرز ولكن لا على تشديد وخنق musculaالبنية (الشكل 3).
- خياطة خط الأسلاك وضوح الشمس والشرايين القسطرة إلى الجهاز العضلي الجانبي، والسماح ل~ سم 1.5 من الركود، على غرار الخطوات السابقة لتأمين تحقيق التدفق (الشكل 3).
- المجموعة جميع الأسلاك وخطوط معا وترسيخها في الجهاز العضلي فقط قبل أن تخرج من خلال نفق تحت الجلد، على غرار الخطوات السابقة.
- إغلاق موقع الجراحية مع 2-0 Vicryl خياطة في طبقات باستخدام نمط خياطة تعمل على بها أمام وتحت الجلد، وتشغيل فراش غرزة على الجلد (بها أمام، غير قطع إبرة، الجلد، وقطع إبرة). إغلاق 1.5 سم شق في الرقبة الظهرية حول الأسلاك وخطوط exteriorized باستخدام 2/0 Vicryl وإبرة القطع.
- مكان الأسلاك التحقيق التدفق، وخطوط القسطرة، وأسلاك الكريستال بالموجات فوق الصوتية في الحقيبة (10 سم × 10 سم) التي تخاط بشكل آمن على الجلد من الأغنام (الشكل 5 - بعد الشفاء).
- تدريجيا فطم الخراف من التخديروحجم التنفس الصناعي المد والجزر ثم ينزع الأنبوب الخراف عند استئناف التنفس التلقائي. إزالة angiocath إدراجها في الوريد رأسي وضمادة إذا لزم الأمر.
- ضمادة الرقبة باستخدام مرهم مضاد حيوي الثلاثي على شقوق، وسادة Telfa، تمتد الشاش لفة، وelasticon.
- إدارة التسكين بعد العملية: ميجلومين فلونيكسين 2.2 ملغ / كغ IM مرة واحدة خلال الانتعاش، ثم 1.1 ملغ / كغ IM مرة واحدة في اليوم لمدة يومين، البوبرينورفين 0،005-،01 ملغ IV أو IM مرتين في اليوم لمدة يوم واحد.
3. في فيفو المراقبة
- وضع الأغنام إلى عربة متنقلة لضمان ضبط النفس السليم. وهذا يسمح للأغنام إلى التزام الهدوء واعية دون المساس الأجهزة. قد تحتاج إلى تأقلم الأغنام إلى السلة 2 أو 3 مرات لمدة 30 دقيقة قبل الحصول على تسجيلات الأجهزة.
- إزالة جميع الأسلاك وخطوط من الحقيبة والاتصال إلى أجهزة الرصد. ربط مسبار التدفق إلى مقياس الجريان، بلورات 1 ملم بالموجات فوق الصوتية متصلة TRBمربع -USB، والقسطرة خطوط لمحولات الضغط. ويرد الرسم البياني لهذا الإعداد (الشكل 6).
- معايرة تحقيقات التدفق ومحولات الضغط قبل الحصول على البيانات.
ملاحظة: نظرا لتقلب محتمل بين إصدارات البرامج والاختلافات في المعدات المستخدمة، المعايرة والضبط سوف تختلف من حالة إلى أخرى. - استخدام الذبذبات لضبط قياس الكريستال Sonometrics، وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
- بيانات السجل باستخدام برامج الكمبيوتر (الشكل 7). آثار في النصف العلوي من الشكل 7 في اللون الأبيض يتوافق مع TEV المزروع، بينما آثار في النصف السفلي في اللون الأحمر يتوافق مع الشام / الأصليين. لكل من TEV والشام معدل التدفق (مل / دقيقة)، ضغط الدم الشرياني (ملم زئبق) وقطر (ملم) يتم تسجيلها مباشرة.
- سجل ل1 دقيقة على الأقل مع عدم وجود اضطرابات. تصدير هذه البيانات لتحليل أكثر تفصيلا. بعد التسجيل، disconnإلخ جميع الأسلاك ومكان مرة أخرى في الحقيبة تخاط على رقبة الغنم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خضعت أكثر من 30 الأغنام تقنية جراحية وصفها في هذا التقرير لغرس TEVs (تحت الطبع) 9. يتم عرض جدول يلخص عمليات الأغنام أحدث بعد بروتوكول الأمثل في الجدول 2. جميع الأغنام تعافى بعد TEV زرع مع أي مضاعفات تهدد الحياة. في بعض الحيوانات، لوحظ تليف في الشريان الأصلي بالقرب من طرف القسطرة سكنى الشرياني. لم يلاحظ وجود زيادة كبيرة في التهاب مع وجود الأجهزة المضافة. نادرا (1 من 18 القسطرة)، وقد تسبب القسطرة عرقلة تدفق الدم من خلال TEV. حدثت هذه العرقلة واحدة بعد شهر واحد. وتشمل المضاعفات الطفيفة من القسطرة الملطف للإشارة الشرياني وعدم القدرة على نضح الدم. الأكثر شيوعا البيانات عند متابعة البحث في مجال التنمية TEV وعادة ما تكون معدلات المباح، ومعدلات التدفق والامتثال. يوضح هذا البروتوكول أنه من POSSالمرئي للحصول على هذه البيانات القيمة طوال مدة التجربة. ورغم أن هذا التقرير يركز على اكتساب معدل التدفق والقطر والضغط الشرياني. ويمكن أيضا أن تحسب الامتثال، ومؤشر زيادة ونبض موجة السرعة.
الشكل 1. الشريان السباتي المعزولة. ويظهر الشريان السباتي المعزولة مع تولي التحقيق التدفق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. زرع TEV. يوضح الشكل 2-دي الجانب البعيد من TEV مع 2 من أصل أربع نقاط الربط المستخدمة لترسيخ TEV في المكان. مرة واحدة يرتكز على TEV، إضافة الخا IONAL غرز كما هو مبين في الشكل 2-العلاقات العامة، والذي يدل على الجانب القريب من TEV. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الأجهزة من TEV. 1 مم ومخيط بلورات بالموجات فوق الصوتية على كل جانب من TEV المزروع (CR1 وCR2). دي يدل على الجانب البعيد من TEV بينما العلاقات العامة يدل على الأقرب. يتم وضع flowprobe (فلوريدا) القريبة من TEV بينما يتم وضع القسطرة (CA) البعيدة. ومخيط التحقيق التدفق والقسطرة لعضلات المجاورة (بيضاوي منقط). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
و"SRC =" / الملفات / ftp_upload / 52354 / 52354fig4.jpg "/>
الشكل 4A. القسطرة المستخدمة في الأجهزة من TEV. القسطرة إلى جانب وجود plaquet تفلون قبل أن يوضع البعيدة لTEV على أنسجة الأم. الشكل 4B. التجميع النهائي للقسطرة قبل الزرع. قسطرة تمديد مع أنابيب Tygon (الرمز بواسطة مربع) جنبا إلى جنب مع 20 G لور العقب محول مع Surflo حقن المكونات (الرمز بواسطة البيضاوي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. الحقيبة حصلت على جلد الغنم. يتم تأمين الحقيبة إلى الرقبة من الأغنام لحماية الأسلاك من 1 ملم بلورات بالموجات فوق الصوتية، وتدفق التحقيق والقسطرة عندما لا تكون قيد الاستعمال. الرجاء المبادرة القطريةCK هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. مخطط تدفق الالكترونيات المستخدمة لتسجيل المسافات الكريستال بالموجات فوق الصوتية، وتدفق الدم والضغط الشرياني. تدفق الرسم البياني من الإعداد المستخدم لتسجيل المسافات بين بلورات بالموجات فوق الصوتية، وتدفق الدم الشرياني وضغط الدم. * استخدام الذبذبات قد تساعد في وضوح الإشارات الواردة من 1 ملم بلورات بالموجات فوق الصوتية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. تسجيل في الوقت الحقيقي مسافات الكريستال بالموجات فوق الصوتية، وتدفق الدم وضغط الدم على برامج الكمبيوتر. آثار الأبيض اللون INDالتسجيلات icate من TEV. T01 R02، R01 T02 وتشير التواصل بين بالموجات فوق الصوتية CR1 الكريستال لCR2 وCR2 إلى CR1 على التوالي. ARP يشير سجلت الضغط الشرياني بينما ABF يشير تدفق الدم الشرياني. يتم استخدام التدوين نفسه لآثار حمراء اللون الذي هو الأصلي / زائفة الشريان السباتي. المسافة المسجلة بين بلورات بالموجات فوق الصوتية خلال الضغط نبض سجلت ضغط الدم تشير إلى الامتثال في المئة من TEV / الشام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| معدات طبية | ||||
| معدات | الشركة المصنعة | مسلسل / كتالوج # | كمية | ملاحظات |
| Transd الضغطucer | بيكتون ديكنسون | P23XL-1 | 1+ (1 لكل الشريان) | استخدامها مع القباب الحجاب الحاجز مملوءة بالماء |
| مكبر للصوت ومحول مربع | غولد | 5900 الإشارة مكيف قفص | 1 | وينبغي إدراج اثنين من محولات ومكبرات الصوت في القفص. في حين أن هذا وحدة محددة ويجوز إيقاف، وغيرها من محولات الضغط المتاحة تجاريا مع BNC الانتاج / التناظرية التواصل مع المعدات Sonometrics. |
| وحدة التحكم T403 مع TS420 وحدة مقياس الجريان المحيطة بالأوعية (X2) | نظم TRANSONIC | وحدة T403 وTS420 (X2) | 1 | سوف تحقيقات تدفق قياس تدفق من خلال كل من الشرايين السباتية ربط إلى كل من وحدات TS420. |
| الرقمية وحدة قياس بالموجات فوق الصوتية | Sonometrics | TR-USB | ||
| تدفق التحقيق الدقة S-سلسلة 4 مم TRANSONIC سيستمز | MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA | 2 | ||
| 1 مم Sonometrics بلورات | نظم Sonometrics | 1R-38S-20-NC-SH | 2-4 (2 لكل الشريان) | |
| القسطرة لزرع | BD (بيكتون ديكنسون) | 381447 | 1+ (1 لكل الشريان) | هو قطع القسطرة وتأمين لmicrobore الأنابيب، ويستخدم stylette للإدراج. |
| Tygon Microbore الأنابيب | نورتون الأداء بلاستيك | (AAQ04127) صياغة S-54-HL | NA (قطع لطول لمجموعة التمديد) | |
| بالتركيبة العقب محول | BD (بيكتون ديكنسون) | 427564 (20 G) | 1+ (1 لكل قسطرة الشرايين) | |
| Surflo حقن التوصيل | تيرومو SR-IP2 | 1+ (1 لكل قسطرة الشرايين) | ||
| Meadox | PTFE (تفلون) فيلت | 019306 | NA (خفض لحجم) | شعرت PTFE المستخدمة في دراساتنا تم وقفها. ومع ذلك، وشركات مماثلة مثل "شبكة الجراحية" عرض المنتجات التي هي ما يعادلها. |
الجدول 1. الجدول جميع المعدات ذات الصلة المستخدمة لإجراء العمليات الجراحية.
| نتائج الإجراءات الجراحية | ||||
| الأجهزة | TEV | زائف | عدد الأغنام | الإجراء الوقت (ساعات) |
| لا | نعم يا | لا | 8 | 2.61 ± 0.25 |
| لا | نعم يا | نعم يا | 3 | 4.17 ± 0.28 |
| نعم يا | نعم يا | نعم يا | 10 | 6.26 ± 0.75 |
الجدول 2. الجدول يلخص الأغنام الأخير الذي خضعت TEV و / أو زرع الشام. ويلخص الجدول التالي يزرع TEV لدينا أحدث. عاش كل الأغنام من خلال عملية جراحية وليس لديه مضاعفات ما بعد الانتعاش.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والغرض من هذا التقرير هو توفير إجراءات وموثوقة وقابلة للتكرار لTEVs زرع الاهتمام في الشريان السباتي الأغنام. وكانت الشرايين السباتية الأم من الحيوانات المستخدمة في هذا النموذج ،5-0،75 ملم في سمك و4،5-5 ملم وقطرها الخارجي. وكانت تقنية جراحية وصفها هنا ناجحة لزرع TEVs من هندستها متفاوتة قياس ،25-1 مم في السمك، 4-5 ملم خارج القطر و 4 سم في الطول مع نجاحا كبيرا تثبت فعاليتها تصل إلى 3 أشهر والمدة، ونقطة النهاية المقصود. وقد مكن استخدام هذه التقنية الجراحية الحصول على البيانات ليكون من الأسهل لجمع وأكثر اتساقا.
وعلاوة على ذلك، وقد وصفت القدرة على قياس المعلمات في الوقت الحقيقي من الجسم الحي في إعادة عرض. ويمكن استخدام أقطار مختلفة بنجاح في هذا النموذج اعتمادا على مجموعة المرجوة من عدم تطابق وتصميم TEV المزروع، كذلك، يجوز تمديد مدة زرع أو بعد 1 نعمص.
واحد من أعظم التطورات في الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول هو استخدام نهاية إلى نهاية anastomoses باستخدام تقنية خياطة انقطاع. تصميم TEV الحالية المستخدمة في إعداد هذا التقرير استخدمت في البداية من النهاية إلى النهاية anastomoses باستخدام تشغيل تقنية خياطة مما أدى إلى ارتفاع نسبة الفشل (ن = 3). السبب الدقيق لهذا لا يزال غير معروف، إلا أنه كان من المحتمل كان بسبب تأثير تضيق أو غير متوافقة طفيف لخياطة تعمل في موقع توصيلي. في البحث عن وسائل بديلة لتحسين العملية الجراحية تبين أن التقنيات الجراحية عنها سابقا وصفها في المؤلفات غامضة إلى حد ما. ومن المقرر في المقام الأول إلى القيود التي تفرضها كلمة المجلات مما اضطر الباحثون أن يقدم أساليبهم الجراحية بطريقة موجزة وغامضة هذا. بعض التقارير تفيد ببساطة أن الحيوانات خضعت TEV زرع 10-12. وتفيد الآخرين استخدام نهاية إلى الجانب 3،5،13،14، أونهاية إلى نهاية 4،6 مفاغرة. وأخيرا، والبعض الآخر يذكر على وجه التحديد استخدام توقف 4 أو المستمر تشغيل خياطة 15. هذا النقص في التفاصيل يجعل من الصعب إعادة إنتاج أو تحسينها البحث الأوعية الدموية التي تتطلب عملية جراحية، وتحديدا على نماذج حيوانية كبيرة. في حين ليس هناك فرق كبير عنها في المباح بين نهاية إلى نهاية، ونهاية إلى جانب تقنية 16، في نموذج حيواني كبير ذكرت هنا، نهاية إلى نهاية هو مفيد عندما تعمل على الشريان السباتي بسبب التشريح و طول TEVs تقييم شائع. ومع ذلك، إذا عدم تطابق كبير بين الشريان الأصلي وTEV هو الحاضر، قد يكون مثاليا لاعتماد تقنية نهاية إلى الجانب الذي أظهر وعد في الفئران (17).
التأكد من أن هذه التقنية الجراحية ليست سببا لعدم TEV يسمح للباحثين للتركيز على تفسيرات أخرى ممكنة للانسداد. إذا المباح على المدى القصير والتعرض لالظروف الفسيولوجية مثل الدموالضغط هو الفائدة الوحيدة، مخطوطة ذكر سابقا هو متاح. هنا، واستخدام والأغنام خارج الحي الشرايين والأوردة نموذج تحويلة تهدف الى تقييم TEV implantability وقد تم تحسين 18. وقد أثبت هذا النموذج أن تكون فعالة جدا في اختبار بسرعة TEVs متعددة مع حيوان واحد قبل الالتزام زرع TEV للدراسات على المدى الطويل.
إذا تقييم سلامة من TEV زرعها هو المطلوب، للأسف التقنيات التقليدية لها عيوب. حاليا الموجات فوق الصوتية أو التصوير وعائية هي الأساليب الوحيدة المستخدمة لتقييم سلامة TEV في الجسم الحي 3،5،6،10-14. التصوير بالموجات فوق الصوتية لا توفر عادة القرار اللازمة لمراقبة التغيرات الامتثال للTEV. تصوير الأوعية الدموية غير الغازية، ومكلف ويتطلب تخدير للحيوان. ومع ذلك، من خلال زرع مجسات التدفق، والقسطرة الشريانية وبلورات بالموجات فوق الصوتية الكثير من هذه البيانات يمكن الحصول عليها بطريقة أكثر بساطة. هذا فيstrumentation من TEV زرع يسمح أيضا للالمعلمات مثل سرعة النبض الموجة ومؤشر زيادة أن تكون محسوبة.
وميزة استخدام الأغنام لTEV غرس أيضا يضفي قوة لترجمة TEVs في عملية إعداد سريرية. نماذج حيوانية صغيرة مثل الفئران والجرذان والأرانب لا تقدم مواز واقعية لتلك التي من إعداد سريرية والنماذج الحيوانية بالتالي الكبيرة يجب أن تستكشف 19. ومع ذلك، في حين أن نموذج حيواني كبير هو نموذج أكثر موثوقية وذات الصلة سريريا، توجد مخاوف بشأن الأنواع المستخدمة لزرع TEV. الكلاب والخنازير على سبيل المثال، في حين غالبا ما تستخدم في أبحاث الأوعية الدموية، endothelialize بسرعة كبيرة. الأغنام من ناحية أخرى فقط endothelialize قريبة من مواقع مفاغرة، وليس عفويا داخل TEV. هذا أكثر شبها الشفاء من البشر 14،19-22.
لفهم أبعد ما حدث مع الاحترام لاستضافة إعادة عرض، لTEV يجب explanted وفحصها، وذلك لوصف الهجرة الخلية، تجميد والتمايز. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن إضافة صبغ محبة للدهون مثل ديل وكذلك استخدام GFP + الخلايا البطانية وطرق موثوقة لتقييم مصير الخلايا المزروعة على TEV 5،6. وقد أظهرت مجموعتنا أيضا أن SRY تلطيخ (منطقة البروتين Y-تحديد الجنس) ضد كروموسوم Y الذكور وسيلة فعالة لتتبع الذكور الخلايا المزروعة في مجموعة الإناث (تحت الطبع). كما يمكن قياس الكولاجين والإيلاستين المحتوى بعد explanted الأنسجة، وتسليط المزيد من الضوء على مدى في الجسم الحي التجديد. ومن الممكن أيضا لتحديد ما إذا كان ما قبل الزرع وكذلك الأنسجة explanted يمكن أن تستجيب لvasoconstrictors وموسعات عند وضعها في حمام الأنسجة الجهاز. وأخيرا، يمكن أيضا اختبار TEVs لتحديد الخصائص الميكانيكية لها مثل معامل يونج، في نهاية المطاف قوة الشد، وسلالة الشد 6،9،23،24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد القومي للقلب والرئة (R01 HL086582) وصندوق العلوم الخلايا الجذعية نيويورك (NYSTEM، عقد # C024316) إلى STA وDDS الرسوم التوضيحية المستخدمة في إن الرب فيديو تم الانتهاء من جون نيكويست. المصور الطبية من جامعة ولاية نيويورك في بوفالو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pressure Transducer | Becton Dickinson | P23XL-1 | Quantity: 1+ (1 for each artery). Used with water-filled diaphragm domes. |
| Amplifier and transducer box | Gould | 5900 Signal Conditioner Cage | Quantity: 1. Two transducers and amplifiers should be included in cage. While this specific unit may be discontinued, other commercially available pressure transducers with a BNC/analog output will communicate with the Sonometrics equipment. |
| T403 Console with TS420 perivascular flowmeter module (x2) | Transonic Systems | T403 module and TS420 (x2) | Quantity: 1. Flow probes measuring flow through each of the carotid arteries will connect to each of the TS420 units. |
| Digital ultrasonic measurement unit | Sonometrics | TR-USB | Quantity: 1 |
| Flow Probe Precision S-Series 4 mm | Transonic Systems Inc. | MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA | Quantity: 2 |
| 1 mm Sonometrics Crystals | Sonometrics Systems | 1R-38S-20-NC-SH | Quantity: 2-4 (2 for each artery) |
| Catheter for implantation | BD (Becton Dickinson) | 381447 | Quantity: 1+ (1 for each artery). Catheter is cut and secured to microbore tubing, stylette is utilized for insertion. |
| Tygon Microbore Tubing | Norton Performance Plastics | (AAQ04127) Formulation S-54-HL | Cut to length for an extension set |
| Luer Stub Adapter | BD (Becton Dickinson) | 427564 (20 gauge) | Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter) |
| Surflo Injection Plug | Terumo | SR-IP2 | Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter) |
| Meadox | PTFE (Teflon) Felt | 19306 | Cut to size. The PTFE felt used in our studies was discontinued. However, comparable companies such as “Surgical Mesh” offer products which are equivalent. |
References
- Goldman, S., et al. Long-term patency of saphenous vein and left internal mammary artery grafts after coronary artery bypass surgery: Results from a Department of Veterans Affairs Cooperative Study. Journal of the American College of Cardiology. 44, 2149-2156 (2004).
- Achouh, P., et al. Long-term (5- to 20-year) patency of the radial artery for coronary bypass grafting. The Journal of Thoracic And Cardiovascular Surgery. 140, 73-79 (2010).
- Conklin, B. S., Richter, E. R., Kreutziger, K. L., Zhong, D. S., Chen, C. Development and evaluation of a novel decellularized vascular xenograft. Medical Engineering & Physics. 24, 173-183 (2002).
- Zhu, C., et al. Development of anti-atherosclerotic tissue-engineered blood vessel by A20-regulated endothelial progenitor cells seeding decellularized vascular matrix. Biomaterials. 29, 2628-2636 (2008).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 9214-9219 (2011).
- Kaushal, S., et al. Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo. Nat Med. 7, 1035-1040 (2001).
- Galatos, A. D. Anesthesia and Analgesia in Sheep and Goats. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 27, 47-59 (2011).
- Okutomi, T., Whittington, R. A., Stein, D. J., Morishima, H. O. Comparison of the effects of sevoflurane and isoflurane anesthesia on the maternal-fetal unit in sheep. J Anesth. 23, 392-398 (2009).
- Swartz, D. D., Russell, J. A., Andreadis, S. T. Engineering of fibrin-based functional and implantable small-diameter blood vessels. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 288, H1451-H1460 (2005).
- Niklason, L. E., et al. Functional arteries grown in vitro. Science. 284, 489-493 (1999).
- Dahl, S. L. M., et al. Readily Available Tissue-Engineered Vascular Grafts. Science Translational Medicine. 3, 68ra69 (2011).
- Wu, W., Allen, R. A., Wang, Y. Fast-degrading elastomer enables rapid remodeling of a cell-free synthetic graft into a neoartery. Nature Medicine. 18, 1148-1153 (2012).
- Saami, K. Y., Bryan, W. T., Joel, L. B., Shay, S., Randolph, L. G. The fate of an endothelium layer after preconditioning. Journal of vascular surgery : Official Publication, the Society for Vascular Surgery [and] International Society for Cardiovascular Surgery, North American Chapter. 51, 174-183 (2010).
- Ueberrueck, T., et al. Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses. Journal of Surgical Research. 124, 305-311 (2005).
- Labbé, R., Germain, L., Auger, F. A. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. The FASEB Journal. 12, 47-56 (1998).
- Samaha, F. J., Oliva, A., Buncke, G. M., Buncke, H. J., Siko, P. P. A clinical study of end-to-end versus end-to-side techniques for microvascular anastomosis. Plastic and Reconstructive Surgery. 99, 1109-1111 (1997).
- Huang, H., et al. A novel end-to-side anastomosis technique for hepatic rearterialization in rat orthotopic liver transplantation to accommodate size mismatches between vessels. European Surgical Research. 47, 53-62 (2011).
- Peng, H., Schlaich, E. M., Row, S., Andreadis, S. T., Swartz, D. D. A Novel Ovine ex vivo Arteriovenous Shunt Model to Test Vascular Implantability. Cells, Tissues, Organs. 195, 108 (2011).
- Zilla, P., Bezuidenhout, D., Human, P. Prosthetic vascular grafts: Wrong models, wrong questions and no healing. Biomaterials. 28, 5009-5027 (2007).
- Berger, K., Sauvage, L. R., Rao, A. M., Wood, S. J. Healing of Arterial Prostheses in Man: Its Incompleteness. Annals of Surgery. 175, 118-127 (1972).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. C. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. Journal of Vascular Surgery : Official Publication, the Society for Vascular Surgery [and] International Society for Cardiovascular Surgery, North American Chapter. 52, 176-195 (2010).
- Swartz, D. D., Andreadis, S. T. Animal models for vascular tissue-engineering. Current Opinion in Biotechnology. 24, 916-925 (2013).
- Liang, M. -S., Andreadis, S. T. Engineering fibrin-binding TGF-β1 for sustained signaling and contractile function of MSC based vascular constructs. Biomaterials. 32, 8684-8693 (2011).
- Han, J., Liu, J. Y., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. Molecular and functional effects of organismal ageing on smooth muscle cells derived from bone marrow mesenchymal stem cells. Cardiovascular Research. 87, 147-155 (2010).
