Summary
Un protocole étape par étape pour le placement inter-position des navires de l'ingénierie tissulaire (de TeV) dans l'artère carotide d'un mouton en utilisant une anastomose de bout en bout et l'évaluation numérique en temps réel in vivo jusqu'au sacrifice des animaux.
Abstract
Le développement des navires de l'ingénierie tissulaire (TeV) de est avancé par la capacité de TeV routinière et efficacement implant (4-5 mm de diamètre) dans un grand modèle animal. Un protocole étape par étape pour le placement inter-position de l'évaluation numérique TEV et en temps réel de la TEV et les artères carotides indigènes est décrite ici. Surveillance in vivo est rendue possible par l'implantation de sondes de flux, cathéters et des cristaux à ultrasons (capable d'enregistrement des variations de dynamiques de diamètre TeV implantés et les artères carotides natifs) au moment de la chirurgie. Une fois implantées, les chercheurs peuvent calculer modèles artères de la circulation sanguine, pression artérielle invasive et diamètre de l'artère rendement paramètres tels que la vitesse de l'onde de pouls, l'indice d'augmentation, les pressions d'impulsions et de conformité. L'acquisition des données est réalisée en utilisant un programme informatique pour l'analyse unique pendant toute la durée de l'expérience. Ces données inestimable donne un aperçu de TEV remodelage de la matrice, sa resemblanCE pour les contrôles natifs / faux et la performance globale de TEV in vivo.
Introduction
L'objectif principal pour le développement de TeV a été de fournir un substitut pour le remplacement de greffe autologue lorsque les navires autologues ne sont pas disponibles et de limiter les donateurs de vue de la morbidité. Par exemple, le nombre de pontages coronariens de l'artère par année a dépassé 350 000 aux Etats-Unis, et la source idéale de greffons appropriés reste la gauche artère mammaire interne, descendante antérieure gauche artère coronaire et une veine saphène. Depuis de nombreuses personnes qui souffrent de maladies vasculaires peuvent ne pas avoir les artères et les veines convenables pour le remplacement de greffe autologue, le développement de TeV est ainsi devenue un champ intense de la recherche depuis des décennies 1-6. Alors que l'ingénierie et l'optimisation de nouveaux TeV ont subi de nombreux progrès, les rapports sur les techniques chirurgicales employées pour implanter les TeV eux n'a pas été un sujet d'une telle discussion intense. Plutôt, les protocoles concernant l'implantation de TeV dans des modèles animaux sont largement laisséesjusqu'à enquêteurs recherche.
Le manuscrit suivant montre comment implanter TeV en utilisant une approche de bout-en-bout anastomose. Cette procédure a été optimisé par l'utilisation d'un modèle spécifique de suture anastomotique, stabilisant technique de suture, l'optimisation de la tension longitudinale et l'addition d'instrumentation suivi in vivo. Cette méthode est en contraste avec certaines des nombreuses variantes qui ont été utilisés précédemment. En outre, cette procédure décrit comment acquérir des paramètres tels que la pression artérielle, TEV diamètre / la conformité et le débit à travers la TEV après la chirurgie jusqu'à l'explantation. Cette collection de données comprend une analyse de la TEV indispensable alors qu'il est dans le processus de remodelage.
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Protocol
NOTE: Ce protocole a été approuvé par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux à l'Université d'État de New York à Buffalo.
Préparation 1. Pré-chirurgicale
- Utilisez moutons (Dorset croisé, femelle, âgé d'environ 1-3 ans avec un poids de 40-60 kg) pour l'étude suivante. Administrer la cyclosporine A (200 mg / jour), l'aspirine (975 mg / jour), et coumadin (20-30 mg / jour) par voie orale, en commençant 3 jours avant la chirurgie et se poursuivre pendant la durée de toutes les études.
- Assurer le mouton a jeûné 12 heures avant la chirurgie (alimentation normale = 1,8 kg de foin et de grain 0,4 kg).
- Stériliser tous les fournitures chirurgicales utilisant un autoclave à vapeur à 121 ° C et 15 psi pendant 30 min.
- Placez les éléments suivants dans un dessiccateur 48 h paraformaldehyde avant la chirurgie: 4 mm sondes de flux Doppler, 1 mm de cristaux ultrasoniques, cathéters à demeure artérielles, des tubes d'extension, et 42 "Tygon.
REMARQUE: Un tableau de matériel médical pertinentes nécessaires pour lala chirurgie et pour la stérilisation est répertorié dans le tableau 1. Pré-placement de l'instrumentation dans le tuyau Tygon à cette étape permettra de gagner du temps pendant la chirurgie.- Étiqueter chaque extrémité des sondes, cathéters et les cristaux comme gauche et à droite, le cas échéant.
2. Opération chirurgicale
- Provoquer des moutons pour l'anesthésie avec le diazépam (0,5 mg / kg) et la kétamine (4 mg / kg) par voie intraveineuse (IV). Vous pouvez également utiliser Telazol (4 mg / kg) IV.
- Effectuer intubation orotrachéale avec une sonde endotrachéale de 8,5 à 10,0 mm de diamètre interne menottées 7.
- Administrer une anesthésie d'inhalation à travers un circuit de régénération d'air avec un ventilateur de marée de volume (7-10 ml / kg) ou un ventilateur à régulation de pression (15 à 20 cm H 2 O). Utilisez un vaporisateur de précision pour administrer l'isoflurane ou le sévoflurane à un montant approprié (3% -4% initialement) pour atteindre un milieu à l'étape de l'anesthésie chirurgicale profonde. La concentration alvéolaire minimale pourmoutons est de 1,4% ou 1,9%, respectivement 8.
- Évaluer profondeur de l'anesthésie en observant la réponse motrice à un stimulus, réflexe palpébral, position de l'œil, et le rythme cardiaque. Surveiller la saturation en oxygène du sang (95% -100%) en utilisant l'oxymétrie de pouls, la concentration de CO 2 (45-55 mm de Hg) dans les gaz expiratoires utilisant capnographie et maintenir la température du corps au cours de la procédure (38,5 à 39,5 ° C) à l'aide d'une couverture chauffante à réglage automatique.
- Rasez la laine de l'ensemble du cou du mouton, et plus d'un veine céphalique, en utilisant une lame # 40 sur tondeuses standard. Préparer la peau de deux sites pour la chirurgie en utilisant 70% d'alcool isopropylique et 7,5% de la bétadine gommage gaze saturé. Commencer avec de la gaze à l'alcool pour faciliter l'élimination des huiles de la peau. Alternez entre la gaze de la bétadine et de l'alcool gaze trois fois.
- Passer mouton sur la table d'opération en décubitus dorsal sur une couverture chauffante. Passez un tube orogastrique de taille moyenne pour permettre l'expulsion passive de contenu de l'estomac. Étendre ladu cou et de brebis utiliser rembourrage de soutien au besoin pour maintenir le placement.
- Effectuez un gommage aseptique final en utilisant 7,5% de la bétadine gaze imbibée et laisser reposer pendant 5 minutes avant la chirurgie.
- Administrer des liquides IV (la de solution de Ringer lactate ou saline à 0,9%) à 10 ml / kg / h à travers un angiocath placé dans la veine céphalique. Administrer des antibiotiques peropératoires et l'analgésie: pénicilline G procaïne 6600 U / kg par voie intramusculaire (IM), la gentamicine 1,6 mg / kg IM, et de 0,005 à 0,01 mg buprénorphine IV ou IM.
- Faire une incision cm ~ 12 longueur sur le col de la ligne médiane ventrale aide d'une coagulation électro. Isoler gauche et droite artères carotides (~ 6 cm) en enlevant du tissu conjonctif en utilisant une technique de dissection émoussé. Attacher et cautériser micro-vaisseaux de ramification des artères carotides de minimiser le saignement.
- Maintenir la stérilité en utilisant (un non-stérile) infirmière en chirurgie pour aider à terriers tout le câblage et les tubes (sonde de débit, fils de cristal ultrasonset un tube de cathéter) dans la couche sous-cutanée de la peau. Utilisez un trocart émoussée, qui sort par l'incision chirurgicale préparée au niveau du cou dorsolatéral.
- Atteindre sous le champ stérile et tourner la tête de la brebis de sorte que le côté du cou peut être visualisé sous le drap.
- Utiliser une pince hémostatique courbe de 8 cm de tunnel à travers l'espace sous-cutané entre l'incision du col de la ligne médiane ventrale et du côté du cou. Ouvrez et fermez la pince hémostatique à disséquer carrément un espace pour le tube ~ 1,5 cm de large. Les conseils de la pince hémostatique doivent résider mi-chemin entre la tête et les épaules, environ 10 cm caudale à l'oreille gauche ou droite. Tournez la pince hémostatique sorte que les pointes sont dirigées vers la peau superficielle.
- Atteindre sous le champ stérile et faire une incision de 1,5 cm à travers la peau, sur les conseils de la pince hémostatique stérile avec un n ° 11 lame. Visualisez les conseils de la pince hémostatique pour confirmer une sortie claire à travers la peau.
- Passez le tube Tygon contenant unll câblage et les tubes à travers le tunnel sous-cutanée. Maintenez les fils et les tubes au-dessus du champ stérile.
- Atteindre sous le drap pour retirer le tube Tygon externe du goulot, ce qui expose le câblage implanté à la sortie du col du mouton. Tirez des lignes individuelles de manière à minimiser tout mou dans l'espace sous-cutanée. Laissez suffisamment de distance pour fixer correctement l'instrumentation à l'artère.
- Placez les sondes de flux Doppler 4 mm sur les deux artères carotides et d'atteindre une première lecture (Figure 1). Administrer 100 U / kg d'héparine IV 30 min avant le clampage de l'artère.
- Continuer l'administration d'héparine à 100 U / kg / h jusqu'à la fin de la chirurgie. Fixer l'artère carotide en utilisant non-broyage clamps vasculaires et exciser une partie (environ 4 cm de longueur). Le débit de la carotide controlatérale augmentera 50% à 100% pour maintenir le flux sanguin vers le cerveau.
NOTE: Il est possible de limiter étirage longitudinal par recul du vaisseau natif en supprimantsegments plus courts que d'être remplacés et / ou étirement de l'artère native avec vasculaire pinces de raccourcir écart jusqu'à ce que la procédure anastomotique complet est terminé. Cela aidera à limiter la tension sur les sutures de maintien individuels et le greffon implanté. - Suturer la TEV en place en utilisant des points de suture interrompues simples avec 7-0 proline ethalloy à double suture monofilament armé. Si nécessaire, appliquer des relaxants musculaires vasculaires lisses comme les papavérine (15 mg / ml) ou la nicardipine (1,25 mg / ml) par voie topique sur le système vasculaire natif afin de prévenir la vasoconstriction qui gênerait suture anastomotique.
REMARQUE: commencer à placer des sutures avec un espacement d'environ 1 mm. Cela peut considérablement varier d'un cas à l'autre. La composition et l'épaisseur TEV affecteront la distance effective entre les sutures. Comme l'épaisseur du tissu natif ou TEV diminue, il peut être nécessaire de placer les fils de suture à se rapprocher.- Première ancre quatre points de la TEV à l'artère native en plaçant deux s opposéestitches sur les deux extrémités proximale et distale (figure 2 -di). Maintenez chaque ancrage enseigné en utilisant des pinces hémostatiques.
REMARQUE: descriptions proximale et distale sont en référence à la direction du flux sanguin à travers le papier. - 6.5 Ajouter plusieurs sutures sur le côté superficiel des deux extrémités proximale et distale pour commencer l'anastomose. (Figure 2-Pr). Simultanément tourner vasculaire pinces 180 degrés.
- Rétablir la tension sur les sutures d'ancrage. Ajouter additionnel (5-6) interrompue sutures à extrémités proximale et distale sur le côté tourné du TEV.
- Première ancre quatre points de la TEV à l'artère native en plaçant deux s opposéestitches sur les deux extrémités proximale et distale (figure 2 -di). Maintenez chaque ancrage enseigné en utilisant des pinces hémostatiques.
- Une fois que la TEV est solidement suturée en place, tournez de nouveau à la position initiale et retirez la vasculaire pinces un à la fois, pince distale en premier. Un léger saignement au niveau des sites d'anastomose est commun. Cela peut naturellement résoudre après plusieurs minutes de serrage de presse et resserrage ou exiger le placement des sutures supplémentaires. Placer la sonde de débit Doppler (Figure 3-Fl) De retour sur proximale de l'artère native à l'écoulement de sang entrant dans la VET et le débit du moniteur.
REMARQUE: Attendez les taux de la carotide gauche et à droite flux se équilibrer après environ 15 min. Si le débit de l'artère carotide avec TEV implanté diminue régulièrement, il est possible de la TEV est de coagulation. Autres anomalies possibles concernant flux peuvent être attribués à la constriction des artères proximales de maternelle ou en aval de la TEV. Si cela se produit, l'utilisation de plus lisse vasculaire relaxant musculaire peut être appliquée, et le navire natif devrait revenir à un ton de base après 30 à 60 minutes après la fermeture de tissu sur le site de la greffe.- Si vous le souhaitez, exciser l'artère carotide controlatérale et suturer le remettre en place comme un contrôle «Sham». Ce est plus cliniquement pertinente de laisser l'artère carotide droite et la seule fixation de la sonde seulement d'écoulement, des cristaux à ultrasons, et le cathéter. Si un contrôle factice est voulu, effectuer cette avant de continuer à l'étape 2.11.
- Suturer une mm cristaux à ultrasons (Figure 3 -cr1 CR2) à des côtés opposés de la TEV en utilisant 7-0 Proline. Enfilez suture à travers la tête de cristal ultrasons et coudre uniquement à la couche superficielle de la TEV.
- Cathétériser l'artère en utilisant un cathéter G 18 modifié avec une patte de Téflon tissé (Figure 3- Ca et figure 4A). Placez l'extrémité distale du cathéter à la TEV sur le tissu artériel natif.
- Suturer la patte à la paroi artérielle avec 5/0 Ethibond à contrôler les saignements. Utilisation cyclohexanone pour faire adhérer le tube microbore au cathéter qui a été rincé avec une solution saline. Utilisez la tubulure comme une ligne d'extension.
- Utilisez un G Luer Stub adaptateur 20 avec un bouchon d'injection Surflo pour sceller la fin extériorisé de tubes (figure 4B). Pour maintenir la perméabilité du cathéter, obtenir le volume d'amorçage de la ligne et le rincer avec 10 ml de solution saline et ensuite 5,000 U / ml d'héparine sodique injection tous les 2-3 jours.
- Enregistrer la distance entre la sonde d'écoulement et les cristaux à ultrasons, ainsi que la distance entre la sonde d'écoulement et le cathéter. Cette vitesse permettra d'onde de pouls à être calculée en conjonction avec le logiciel. Si ces calculs ne sont pas nécessaires, ne pas implanter un cathéter.
- Obtenir une lecture peropératoire si désiré pour assurer tout le matériel implanté est fonctionnel (voir section 3).
- Fixez lignes et fils implantés à proximité musculature utilisant 2/0 soie et une aiguille conique (Figure 3).
- Positionner la sonde de flux vasculaire fil parallèle au navire, à l'caudale de la sonde et le fil se étendant crânienne, et ensuite faire un «U-Turn» vers la musculature latérale. Fixez le fil à la musculature adjacente, en utilisant 2-0 soie sur une aiguille conique à deux endroits, de sorte que la sonde de fil ou flux ne est pas en mesure de placer ne importe quelle souche sur le navire. Soyez sûr sutures sont bien ajustées, mais ne pas trop serrer et étrangler musculature (figure 3).
- Suture de la ligne des fils de cristal et cathéter artériel à la musculature latérale, ce qui permet de ~ 1,5 cm de mou, analogue aux étapes précédentes pour fixer la sonde de débit (Figure 3).
- Groupe tous les fils et les lignes ensemble et de les ancrer à la musculature juste avant de sortir à travers le tunnel sous-cutanée, similaires aux étapes précédentes.
- Fermez le site chirurgical avec une suture Vicryl 2-0 en couches utilisant un dessin de surjet sur planche de bord et sous-cutané, la course matelas le point sur la peau (planche de bord, l'aiguille non-coupe, la peau, l'aiguille de coupe). Fermez le 1,5 cm incision au niveau du cou dorsale autour des fils extériorisées et lignes en utilisant 2/0 Vicryl et une aiguille de coupe.
- La place des fils de sonde d'écoulement, les lignes de cathéters et de fils de cristal ultrasonore dans une poche (10 cm x 10 cm) qui est solidement suturées sur la peau du mouton (Figure 5 - après récupération).
- Se sevrer progressivement les brebis hors anesthésieet le ventilateur de volume courant puis extubation les moutons lorsque la respiration spontanée est reprise. Retirez le angiocath inséré dans la veine céphalique et un bandage si nécessaire.
- Bander le cou à l'aide triple onguent antibiotique sur les incisions, un pad Telfa, gaze de rouleau étirement et elasticon.
- Administrer l'analgésie post-opératoire: méglumine de flunixine 2,2 mg / kg IM une fois lors de la récupération, puis 1,1 mg / kg IM une fois par jour pendant deux jours, la buprénorphine 0,005-0,01 mg IV ou IM deux fois par jour pendant une journée.
3. In Vivo surveillance
- Placez moutons dans chariot mobile pour assurer la retenue appropriée. Cela permet aux moutons de rester calme et consciente sans compromettre le matériel. Peut-être besoin de se acclimater moutons au panier 2 ou 3 fois pendant 30 minutes avant d'obtenir des enregistrements d'instrumentation.
- Retirez tous les fils et les lignes de la poche et se connecter à des dispositifs de surveillance. Connectez sonde de débit à un débitmètre, cristaux 1 mm à ultrasons relié à TRB-USB Boîte, et des lignes à cathéter transducteurs de pression. Un organigramme de cette configuration est fourni (Figure 6).
- Calibrer sondes de flux et des transducteurs de pression avant l'acquisition de données.
NOTE: En raison de la variabilité potentielle entre les versions de logiciels et les différences dans les équipements utilisés, les étalonnages et les réglages varient d'un cas à l'autre. - Utiliser un oscilloscope pour affiner la mesure de cristal Sonometrics, selon le protocole du fabricant.
- Enregistrer les données en utilisant un logiciel informatique (figure 7). Traces dans la moitié supérieure de la figure 7 dans la couleur blanche correspond à la TEV implanté, tandis que des traces dans la moitié inférieure de couleur rouge correspond à la Sham / autochtone. Dans les deux cas la TEV et Sham le débit (ml / min), la pression artérielle (mm Hg) et le diamètre (mm) sont enregistrées en temps réel.
- Dossier pendant au moins 1 min sans perturbations. Exporter ces données pour une analyse plus détaillée. Après l'enregistrement, DISCONNect tous les fils et le lieu de retour dans la poche suturé sur le cou du mouton.
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Representative Results
Plus de 30 moutons ont subi la technique chirurgicale décrite dans le présent rapport pour l'implantation de TeV (sous presse) 9. Un tableau résumant les plus récentes opérations de moutons après optimisation des protocoles sont présentés dans le tableau 2. Tous les moutons récupérés après TEV implantation sans complications potentiellement mortelles. Chez certains animaux, la fibrose a été observée dans l'artère native près de la pointe de la sonde à demeure artérielle. Une augmentation significative de l'inflammation à la présence d'instrumentation ajoutée n'a pas été observée. Rares (1 cathéters de 18), le cathéter a fait obstruction à l'écoulement de sang à travers le détendeur. Cette une obstruction se est produite après un mois. Les complications mineures du cathéter comprennent un amortissement du signal artériel et de sang incapacité d'aspiration. Les plus fréquemment rapportés données lorsque poursuivent des recherches dans le développement TEV sont généralement des taux de perméabilité, des débits et de la conformité. Ce protocole démontre qu'il est possble d'obtenir de telles données de valeur pendant toute la durée de l'expérience. Bien que ce rapport se concentre sur l'acquisition de débit, le diamètre et la pression artérielle; le respect, l'indice de l'augmentation et de la vitesse des ondes de pulsation peuvent également être calculées.
Figure 1. isolé l'artère carotide. Isolé l'artère carotide est représenté avec sonde de débit ci-joint. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Implantation de TEV. La figure 2 illustre le Di-côté distal de la TEV avec deux des quatre points d'ancrage originaux utilisés pour ancrer la TEV en place. Une fois que la TEV est ancrée, ajouter Addit ional assemble comme le montre la figure 2-Pr, qui désigne le côté proximal de la TEV. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Instrumentation de TEV. 1 mm cristaux ultrasoniques sont cousus sur chaque côté de la TEV implanté (CR1 et CR2). Di indique le côté distal de la TEV Pr désigne tout proximale. Le flowprobe (Fl) est placée à proximité de la TEV tandis que le cathéter (Ca) est placé distale. sonde de débit et le cathéter sont cousus à la musculature proximité (ovale en pointillés). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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La figure 4A. Cathéter utilisé pour l'instrumentation de TEV. Cathéter couplé avec un Plaquet téflon avant d'être placé en aval de TEV sur tissu natif. Figure 4B. L'assemblage final du cathéter avant l'implantation. Cathéter étendue avec Tygon (désigné par carré) avec 20 G Luer Stub adaptateur avec prise d'injection Surflo (notée ovale). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Pouch fixé à la peau de moutons. Pouch est fixé au cou de moutons pour protéger le câblage de 1 mm de cristaux à ultrasons, le débit sonde et le cathéter lorsqu'il ne sert pas. Se il vous plaît click ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Diagramme de l'électronique utilisées pour enregistrer les distances de cristal à ultrasons, le flux sanguin et la pression artérielle. Diagramme de configuration utilisé pour enregistrer les distances entre les cristaux à ultrasons, la circulation sanguine artérielle et la pression artérielle. * Aide d'un oscilloscope peut aider à la clarté des signaux reçus des 1 mm cristaux à ultrasons. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. Enregistrement des distances en temps réel de cristal ultrasons, le flux sanguin et la pression artérielle sur le logiciel de l'ordinateur. Traces de couleur blanche indEpreuve Rejetée enregistrements de TEV. R02 T01, T02 et R01 indiquent la communication entre les cristaux à ultrasons CR1 CR2 et de CR1 CR2 à respectivement. ARP indique enregistré la pression artérielle tout ABF indique le flux sanguin artériel. La même notation est utilisée pour des traces de couleur rouge qui est la carotide imposture artère native /. La distance enregistrée entre les cristaux à ultrasons lors de la pression d'impulsion enregistrée de la pression artérielle indiquer la conformité pour cent de TEV / Sham. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Équipement Médical | ||||
| Le Matériel | Fabricant | Serial / Catalogue # | Quantité | Remarques |
| TRANSD de pressionUcer | Becton Dickinson | P23XL-1 | 1+ (1 pour chaque artère) | Utilisé avec des dômes de diaphragme remplis d'eau |
| boîte de Amplificateur et le transducteur | Gould | 5900 conditionneur de signal Cage | 1 | Deux transducteurs et amplificateurs doivent être inclus dans la cage. Bien que cette unité spécifique peut être arrêté, d'autres capteurs de pression disponibles dans le commerce avec une sortie / analogique BNC seront communiquer avec l'équipement Sonometrics. |
| T403 Console avec TS420 module de débitmètre périvasculaire (x2) | Transonic Systems | module T403 et TS420 (x2) | 1 | sondes de mesure de débit écoulement à travers chacune des artères carotides se connecter à chacune des unités TS420. |
| Unité de mesure à ultrasons numérique | Sonometrics | TR-USB | ||
| Sonde de débit de précision S-Series 4 mm Transonic Systems Inc. | MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA | 2 | ||
| Cristaux de 1 mm | Systèmes Sonometrics | 1R-38S-20-NC-SH | 2-4 (2 pour chaque artère) | |
| Cathéter destiné à être implanté | BD (Becton Dickinson) | 381447 | 1+ (1 pour chaque artère) | Le cathéter est coupé et fixé au tube microbore, stylet est utilisé pour l'insertion. |
| Tygon Microbore Tubing | Norton Performance Plastics | (AAQ04127) Formulation S-54-HL | N / A (Coupé à la longueur pour un ensemble d'extension) | |
| Luer Stub Adaptateur | BD (Becton Dickinson) | 427564 (20 G) | 1+ (Une pour chaque cathéter artériel) | |
| Bouchon d'injection Surflo | Terumo SR-IP2 | 1+ (Une pour chaque cathéter artériel) | ||
| Meadox | PTFE (téflon) Felt | 019306 | N / A (Coupé à la taille) | Le PTFE se sentait utilisé dans nos études a été abandonnée. Cependant, les sociétés comparables tels que "Mesh" chirurgicale offrent des produits qui sont équivalentes. |
Tableau 1. Tableau de tous les équipements appropriés utilisé pour la procédure chirurgicale.
| Chirurgicaux Résultats de procédure | ||||
| Instrumentation | TEV | Comédie | Nombre de moutons | Procédure temps (heures) |
| Pas De | Ben Oui | Pas De | 8 | 2,61 ± 0,25 |
| Pas De | Ben Oui | Ben Oui | 3 | 4,17 ± 0,28 |
| Ben Oui | Ben Oui | Ben Oui | 10 | 6,26 ± 0,75 |
Tableau 2. Tableau récapitulatif des moutons le plus récent qui ont subi TEV et / ou l'implantation Sham. Le tableau suivant résume nos implants de TEV les plus récentes. Tous les moutons vécu opération chirurgicale et ne avait pas de complications post récupération.
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Discussion
Le but de ce rapport est de fournir une procédure fiable et reproductible pour TeV implants d'intérêt dans l'artère carotide ovine. Les artères carotides indigènes des animaux utilisés dans ce modèle étaient 0,5 à 0,75 mm d'épaisseur et de 4,5 à 5 mm de diamètre extérieur. La technique chirurgicale décrite ici a été un succès pour l'implantation de différentes géométries TeV mesure de 0,25 à 1 mm d'épaisseur, 4-5 mm de diamètre extérieur et 4 cm de longueur avec un grand succès prouvant efficace jusqu'à trois mois la durée, le point final prévu. L'utilisation de cette technique chirurgicale a permis l'acquisition de données d'être plus faciles à recueillir et plus uniforme.
En outre, la capacité de mesurer les paramètres de temps réel de remodelage in vivo a été décrite. Différents diamètres peuvent être utilisés avec succès dans ce modèle en fonction de gamme désirée de décalage et la conception de TEV implanté, ainsi, la durée d'implantation peut être prolongée au-delà de 1 ou ouir.
Un des plus grands progrès dans l'optimisation de ce protocole est l'utilisation des anastomoses de bout en bout en utilisant une technique de suture interrompue. La conception de TEV courant utilisé dans la préparation de ce rapport d'abord utilisé anastomoses bout en bout en utilisant une technique de surjet qui a abouti à un taux d'échec élevé (n = 3). La raison précise pour cette demeure inconnue, mais il aurait pu potentiellement été en raison de la faible effet sténose ou non conforme d'un surjet au site de l'anastomose. Dans la recherche de méthodes alternatives pour optimiser l'intervention chirurgicale il a été constaté que les techniques chirurgicales signalés précédemment décrits dans la littérature sont assez vagues. Cela est principalement dû à des limitations de mots imposés par les revues forçant les chercheurs à déclarer leurs techniques chirurgicales de façon brève et obscure. Certains rapports indiquent simplement que les animaux ont subi TEV implantation 10-12. D'autres rapportent l'utilisation de bout-en-côté 3,5,13,14 oude bout en bout 4,6 anastomose. Enfin, d'autres affirment spécifiquement l'utilisation de quatre interrompue ou continue la course suture 15. Ce manque de détail, il est difficile de reproduire ou d'améliorer la recherche vasculaire nécessitant une intervention chirurgicale, en particulier sur les grands modèles animaux. Bien qu'il n'y ait pas de différence significative rapporté dans la perméabilité entre de bout en bout et bout-à-face technique 16, dans le modèle animal grand rapportés ici, de bout en bout est avantageuse lors de l'utilisation sur l'artère carotide du fait de l'anatomie et longueur des TeV couramment évaluée. Toutefois, si un grand décalage entre l'artère native et TEV est présent, il peut être idéal pour adopter une technique de bout en face qui a montré des résultats prometteurs chez le rat 17.
Veiller à ce que la technique chirurgicale ne est pas une cause d'échec TEV permet aux chercheurs de se concentrer sur d'autres explications possibles pour occlusion. Si la perméabilité à court terme et l'exposition à des conditions physiologiques tels que le sanget la pression est le seul intérêt, un manuscrit précédemment rapporté est disponible. Ici, l'utilisation d'un ovin modèle ex vivo de shunt artério-veineux destiné à évaluer TEV implantabilité 18 a été optimisée. Ce modèle se est avéré être très efficace pour tester rapidement plusieurs TeV avec un animal avant de se engager à implanter une TEV pour les études à long terme.
Si l'évaluation de l'intégrité d'une TEV implanté est souhaitée, des techniques classiques malheureusement des inconvénients. Actuellement échographie ou imagerie par angiographie sont les seules méthodes utilisées pour évaluer l'intégrité de la TEV in vivo 3,5,6,10-14. L'échographie ne fournit généralement pas la résolution nécessaire pour observer les changements de mise en conformité de la TEV. L'angiographie est invasive, coûteuse et nécessite une anesthésie de l'animal. Cependant, en implantant des sondes de flux, cathéters artériels et cristaux à ultrasons beaucoup de ces données peuvent être acquises de façon plus simplifiée. Celastrumentation de la TEV implanté permet aussi de paramètres tels que la vitesse des ondes de pulsation et de l'indice de renforcement à être calculés.
L'avantage d'utiliser moutons pour la TEV implantation prête aussi la force pour la traduction de TeV dans un cadre clinique. Petits modèles animaux tels que les souris, les rats et les lapins ne offrent pas un parallèle réaliste à celles d'un milieu clinique et donc de grands modèles animaux doivent être explorées 19. Cependant, tandis qu'un grand modèle animal est un modèle plus fiable et cliniquement pertinente, il existe des préoccupations concernant les espèces utilisées pour les implantations TEV. Chiens et porcs par exemple, bien que souvent utilisé dans la recherche vasculaire, endothélialiser très rapidement. Moutons d'autre part que endothélialiser près des sites d'anastomose, et pas spontanément dans le TEV. Cela ressemble davantage à la guérison de l'homme 14,19-22.
Pour mieux comprendre ce qui se est produit à l'égard d'accueillir remodelage, leTEV doit être expiante et examiné, afin de décrire la migration cellulaire, l'immobilisation et la différenciation. Des travaux antérieurs ont montré que l'addition d'un colorant lipophile tel que Dil ainsi que l'utilisation de cellules endotheliales GFP + sont des méthodes fiables pour évaluer le sort des cellules implantées sur la TEV 5,6. Notre groupe a également montré que SRY coloration (Sex-région déterminant la protéine Y) contre le chromosome masculin Y est une méthode efficace pour suivre les cellules implantées de mâles dans un hôte femelle (sous presse). Le collagène et l'élastine de contenu peuvent également être mesurées après tissu est explantées, perdant plus de lumière sur l'étendue de remodelage in vivo. Il est également possible de déterminer si oui ou non de pré-implant, ainsi que des tissus explantées peuvent répondre à des vasoconstricteurs et vasodilatateurs lorsqu'il est placé dans un bain de tissu d'organe. Enfin, TeV peuvent également être testés pour déterminer leurs propriétés mécaniques telles que le module de Young, Résistance à la traction et la déformation de traction 6,9,23,24.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut National Heart and Lung (R01 HL086582) et le Fonds pour la science des cellules souches de New York (NYSTEM, contrat # C024316) à STA et DDS illustrations utilisées dans JoVE vidéo ont été réalisées par John Nyquist; Illustrateur médical de l'Université d'État de New York à Buffalo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pressure Transducer | Becton Dickinson | P23XL-1 | Quantity: 1+ (1 for each artery). Used with water-filled diaphragm domes. |
| Amplifier and transducer box | Gould | 5900 Signal Conditioner Cage | Quantity: 1. Two transducers and amplifiers should be included in cage. While this specific unit may be discontinued, other commercially available pressure transducers with a BNC/analog output will communicate with the Sonometrics equipment. |
| T403 Console with TS420 perivascular flowmeter module (x2) | Transonic Systems | T403 module and TS420 (x2) | Quantity: 1. Flow probes measuring flow through each of the carotid arteries will connect to each of the TS420 units. |
| Digital ultrasonic measurement unit | Sonometrics | TR-USB | Quantity: 1 |
| Flow Probe Precision S-Series 4 mm | Transonic Systems Inc. | MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA | Quantity: 2 |
| 1 mm Sonometrics Crystals | Sonometrics Systems | 1R-38S-20-NC-SH | Quantity: 2-4 (2 for each artery) |
| Catheter for implantation | BD (Becton Dickinson) | 381447 | Quantity: 1+ (1 for each artery). Catheter is cut and secured to microbore tubing, stylette is utilized for insertion. |
| Tygon Microbore Tubing | Norton Performance Plastics | (AAQ04127) Formulation S-54-HL | Cut to length for an extension set |
| Luer Stub Adapter | BD (Becton Dickinson) | 427564 (20 gauge) | Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter) |
| Surflo Injection Plug | Terumo | SR-IP2 | Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter) |
| Meadox | PTFE (Teflon) Felt | 19306 | Cut to size. The PTFE felt used in our studies was discontinued. However, comparable companies such as “Surgical Mesh” offer products which are equivalent. |
References
- Goldman, S., et al. Long-term patency of saphenous vein and left internal mammary artery grafts after coronary artery bypass surgery: Results from a Department of Veterans Affairs Cooperative Study. Journal of the American College of Cardiology. 44, 2149-2156 (2004).
- Achouh, P., et al. Long-term (5- to 20-year) patency of the radial artery for coronary bypass grafting. The Journal of Thoracic And Cardiovascular Surgery. 140, 73-79 (2010).
- Conklin, B. S., Richter, E. R., Kreutziger, K. L., Zhong, D. S., Chen, C. Development and evaluation of a novel decellularized vascular xenograft. Medical Engineering & Physics. 24, 173-183 (2002).
- Zhu, C., et al. Development of anti-atherosclerotic tissue-engineered blood vessel by A20-regulated endothelial progenitor cells seeding decellularized vascular matrix. Biomaterials. 29, 2628-2636 (2008).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 9214-9219 (2011).
- Kaushal, S., et al. Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo. Nat Med. 7, 1035-1040 (2001).
- Galatos, A. D. Anesthesia and Analgesia in Sheep and Goats. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 27, 47-59 (2011).
- Okutomi, T., Whittington, R. A., Stein, D. J., Morishima, H. O. Comparison of the effects of sevoflurane and isoflurane anesthesia on the maternal-fetal unit in sheep. J Anesth. 23, 392-398 (2009).
- Swartz, D. D., Russell, J. A., Andreadis, S. T. Engineering of fibrin-based functional and implantable small-diameter blood vessels. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 288, H1451-H1460 (2005).
- Niklason, L. E., et al. Functional arteries grown in vitro. Science. 284, 489-493 (1999).
- Dahl, S. L. M., et al. Readily Available Tissue-Engineered Vascular Grafts. Science Translational Medicine. 3, 68ra69 (2011).
- Wu, W., Allen, R. A., Wang, Y. Fast-degrading elastomer enables rapid remodeling of a cell-free synthetic graft into a neoartery. Nature Medicine. 18, 1148-1153 (2012).
- Saami, K. Y., Bryan, W. T., Joel, L. B., Shay, S., Randolph, L. G. The fate of an endothelium layer after preconditioning. Journal of vascular surgery : Official Publication, the Society for Vascular Surgery [and] International Society for Cardiovascular Surgery, North American Chapter. 51, 174-183 (2010).
- Ueberrueck, T., et al. Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses. Journal of Surgical Research. 124, 305-311 (2005).
- Labbé, R., Germain, L., Auger, F. A. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. The FASEB Journal. 12, 47-56 (1998).
- Samaha, F. J., Oliva, A., Buncke, G. M., Buncke, H. J., Siko, P. P. A clinical study of end-to-end versus end-to-side techniques for microvascular anastomosis. Plastic and Reconstructive Surgery. 99, 1109-1111 (1997).
- Huang, H., et al. A novel end-to-side anastomosis technique for hepatic rearterialization in rat orthotopic liver transplantation to accommodate size mismatches between vessels. European Surgical Research. 47, 53-62 (2011).
- Peng, H., Schlaich, E. M., Row, S., Andreadis, S. T., Swartz, D. D. A Novel Ovine ex vivo Arteriovenous Shunt Model to Test Vascular Implantability. Cells, Tissues, Organs. 195, 108 (2011).
- Zilla, P., Bezuidenhout, D., Human, P. Prosthetic vascular grafts: Wrong models, wrong questions and no healing. Biomaterials. 28, 5009-5027 (2007).
- Berger, K., Sauvage, L. R., Rao, A. M., Wood, S. J. Healing of Arterial Prostheses in Man: Its Incompleteness. Annals of Surgery. 175, 118-127 (1972).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. C. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. Journal of Vascular Surgery : Official Publication, the Society for Vascular Surgery [and] International Society for Cardiovascular Surgery, North American Chapter. 52, 176-195 (2010).
- Swartz, D. D., Andreadis, S. T. Animal models for vascular tissue-engineering. Current Opinion in Biotechnology. 24, 916-925 (2013).
- Liang, M. -S., Andreadis, S. T. Engineering fibrin-binding TGF-β1 for sustained signaling and contractile function of MSC based vascular constructs. Biomaterials. 32, 8684-8693 (2011).
- Han, J., Liu, J. Y., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. Molecular and functional effects of organismal ageing on smooth muscle cells derived from bone marrow mesenchymal stem cells. Cardiovascular Research. 87, 147-155 (2010).
